Anticuerpos monoclonales de conejo.

Estudio comparativo entre una nueva categora de inmunoreactivos y los correspondientes

anticuerpos monoclonales de ratn.
Abstracto.
Los anticuerpos monoclonales de conejo representan una nueva categora de
inmunoreactivos, que pueden combinar las mejores propiedades de los AMC de ratn y el suero de
conejo. En el intento por verificar el desempeo de esta nueva clase de Ac en tejidos embebidos
(incluidos) en parafina, se realizarn pruebas en distintos tipos de tumores, as como en tejidos
normales, con AMC de conejo para: receptor de estrgeno, receptor de progesterona, Ki-67,
ciclina D1, CD3, CD5, CD23 y sinaptofisina. Los resultados fueron comparados con los obtenidos
con los clsicos AMC de ratn contra los mismos antgenos.
Los AMC de conejo parecen ofrecer un incremento de la sensibilidad sin una prdida
aparente de especificidad. En la rutina estos nos permiten aumentar la dilucin de trabajo (5 a 10
veces en promedio), lo que significa una importante mejora en trminos de eficiencia en el
laboratorio. La importancia (o validez) de los AMC de conejo, se demostr adems por el hecho de
que en algunos casos la tincin ptima (o marcacin) puede obtenerse incluso sin la recuperacin
de antgenos. En consideracin al alto desempeo observado, el uso de AMC de conejo puede
contribuir significativamente a la estandarizacin de los procesos de diagnostico en IHQ.

Durante los ltimos 30 aos, a habido un inters creciente por los AMC de ratn sobre el
antisuero policlonal, debido a las propiedades nicas de uniformidad, pureza y disponibilidad
indefinida en el tiempo. Los AMC de ratn, son generados por el mtodo de hibridoma in vitro,
originalmente desarrollado por Kohler, este mtodo consiste en la fusin de cells del bazo de un
ratn que ha sido inmunizado con una lnea celular de mieloma no secretora de murina. Los AMC
de ratones han sido utilizados ampliamente y han cumplido un rol fundamental en el diagnostico y
ms recientemente en ajustes teraputicos. Sin embargo, es bien conocido que algunos
inmungenos estimulan pobremente al respuesta de Ac en ratones.
Por otro lado, el antisuero policlonal est caracterizado por propiedades distintas de
aquellos generados en ratn. Porque el antisuero policlonal esta dirigido contra diferentes epitopos o
contra diferentes secuencias de amino cidos de un epitopo de un mismo antgeno dado, estos
tienden a exhibir una afinidad mayor que los AMC de ratn.
Entre varios animales, el conejo es conocido por producir altos ttulos (cantidad) de
anticuerpos de alta afinidad, incluso contra antgenos que no son inmunognicos en AMC de ratn.
Considerando esto, algunos PA de conejo a menudo exhibieron una mayor sensibilidad contra
cortos polipeptidos sintticos que los AMC de ratn.
Tericamente, los AMC de conejo pueden combinar las mejores propiedades de los AMC
de ratn y los atributos ms deseables de antisuero de ratn, y por lo tanto, durante los ltimos 20
aos, varios grupos han tratado de generar AMC de conejo. Debido a que los plasmocitomas son
desconocidos en conejos y las cell B de conejo (LB) presentan serias dificultades para
transformarlas in vitro por viruses, se gener un hibridoma de ratn-conejo. Sin embargo, estos
heterohibridomas son altamente inestables, difciles de clonar, e incapaces de generar anticuerpos
por un periodo prolongado. La generacin de conejos transgnicos c-myc/v-abl , llev a la
produccin de lneas celulares de plasmocitomas de conejo, que han sido utilizados exitosamente
como asociados de fusin para crear hibridomas conejo-conejo. Eventualmente los AMC de conejo
contra cilina D1 fueron usados exitosamente en el diagnostico del linfoma de cells del manto.

En un intento de verificar el desempeo de esta nueva clase de Ac en una fijacin de rutina

y en muestras de tejido embebidas en parafina (incluidas), se probaron AMC de conejo en una serie
de distintos tipos de tumores y en tejidos normales contra: receptor de estrgeno (ER), receptor de
progesterona (PR), Ki-67, ciclina D1, CD3, CD5, CD23 y sinaptofisina. Los resultados fueron
comparados por los obtenidos por los clsicos AMC de ratn contra los mismos antgenos.
Materiales y mtodos

Se recuperaron 38 casos de carcinoma de mamas, 12 casos de leucemia/linfoma cronica de celulas B

linfociticas (LLC-B), 12 casos de linfoma de celulas del manto (LCM), 6 casos de linfoma folicular (FL), 8
casos de linfomas de zonas marginales (MZL), 2 muestras de medula osea de mieloma multiple (MM), 5
amigdalas no neoplasicas, 21 tumores neuronales o neuroendocrinos (meduloblastoma, 5; paraganglioma, 1;
carcinoma neuroendocrino, 3; carcinoma de pulmon de celulas pequeas, 12) y 14 carcinomas de pulmon de
celulas no pequeas (carcinoma de celulas escamosas, 8, adenocarcinoma, 4, carcinoma bronquioloalveolar,2)
de los archivos del departamento de patologia quirurgica del hospital regional de Treviso, Italia y la
universidad de Brescia, Italia. Los 12 casos de LLC-B seleccionados para el estudio, incluyen 2 muestras de
los ganglios linfaticos y 101 muestras de biopsia de medula osea.
Los 12 casos de LCM (10 de tipo clasico y 2 de tipo blastoide) incluyeron 7 muestras de ganglios linfaticos, 3
a partir de biopsias de medula osea y 2 de biopsias gastricas. Los casos de MZL incluyen 3 muestras de bazo
y 5 biopsias de la medula de los huesos.
La recuperacion antigenica (AR) se realizo de la siguiente manera: Bao de incubacion en tampon EDTA a
pH 9 o en buffer citrato a pH 7, durante 40 minutos a 98C, en la incubacion en horno de microondas a 750W
en 10 mmol/L de buffer citrato a pH 6 o7 durante 30 minutos.
Las muestras de carcinooma de mama inmunoteidas con RabMAbs contra ER (clon SP1), PR (clon SP2) y
Ki67 (clon SP6). Las muestras de los mismos tumores fueron inmunoteidas con MMAs contra la ER (clon
6F11), PR (clon 636), y Ki-67 (clon MIB-1). Las inmunotinciones ER y PR tambien se repitieron sin AR. Los
datos sobre clones, dilucion, metodo AR, la concentracion de anticuerpos y la fuente, estan resumindos en la
tabla 1.
Muestras de 5 amigdalas normales y 12 casos de LLC-B y 12 casos de LCM se inmunotieron con
RabMAbs contra CD5(clon SP19), CD3 (clon SP7) y CD23 ( clon SP23). Cortes de las mismas muestras
fueron inmunoteidas con MMAs contra CD5 (clon 4C7), CD3 (clon F7.2.38) y CD23 (clon 1B12).
Muestras de todos los casos de LCM, LLC-B, MZL, FL y MM se inmunotieron con RabMAbs para ciclina
D1 ( clon SP4) y MMAs para ciclina D1 (clon DCS6).
Muestras de 21 neoplasias neuronales o neuroendocrinas y 14 carcinomas de pulmon de celulas no pequeas,
fueron utilizados como muestras control, fueron inmunteidos con RabMAbs contra sinaptofisina (clon SP11)
y un MMA contra el mismo antigeno (clon SY38).

Todas las inmunotinciones se realizaron en un sistema automatizado (DakoCytomation Autostainer, Glostrup,

Dinamarca). La inmunohistoquimica se realizo con un polimero sensible basado en un sistema de deteccion
(Envision Plus, DakoCytomation). La positividad se indica por la presencia de coloracion nuclear marron
oscura con ER, PR, Ki-67 y ciclina D1 y por la presencia de tincion citoplasmatica o de membrana para
CD3, CD5, CD23 y sinaptofisina. A la menos 100 tumores celulares fueron considerados. La intensidad de la
tincion (clasificado de 0 a +3) y el porcentaje de celulas positivas fueron evaluados a ciegas por 3
investigadores (SR, FC, APDT)

Resultados:
Los resultados de la comparacion de los marcadores de cancer de mama se resumen en la tabla 2.
Resultados de la inmunohistoquimica de ER:
Ambos anticuerpos tieron 36 de 38 casos, resultando negativa en 2 casos. Es interesante que cuando era
utilizada RabMAb SP1, una media de 88% de celulas positivas y se registrouna puntuacion de intensidad
media de 2.5. En cambio, cuando se utilizo 6F11, tanto los valores medios fueron de menor porcentaje celulas
positivas, el 73%, y la intensidad de puntuacion de 2.0. Incluso sin la AR, el SP1 RabMAb reconocido en 36
casos positivos de 38, con un porcentaje medio de celulas positivas de 74% y una puntuaciond e intensidad
media de 2.0, por el contrario, cuando se utilizo la MMA 6F11 sin AR se observo positividad debil en 30 de
38 casos, con un valor medio de 18% de celulas positivas. Imagen 1.

Tabla 2: Los valores medios del porcentaje de celulas positivas y la intensidad de la tinicion. Resultados en
38 casos de carcinoma de mama sometidos a prueba de receptor estrogeno, receptor progesterona y Ki-67.

Resultados de la inmunohistoquimica de PR:

Ambos anticuerpos tieron 36 de 38 casos, resultando negativa en 2 casos. No se observan diferencias
relevantes en la produccion del numero de celulas positivas y en la puntuacion de la intensidad media entre
los 2 Mab. Cuando no se realizo la AR, solo se observo inmunopositividad con la RabMAb SP2 ( porcentaje
medio de celulas positivas 42%, con una puntuacion de intensidad media 1.5)

Hallazgos inmunohistoquimicos con Ki-67:

La comparacion de los valores medios de Ki-67de celulas positivas (13% para RabMAb y 11% de MMA) y
de la intensidad de puntuacion media (2.4 para RabMAb; 2.2 para MMA) mostro un discreto aumento de la
sensibilidad con RabMAb SP6. Hay que notar que en 2 casos MIB-1 en celulas neoplasicas las membranas
fueron teidas, este fenomeno no se observo con RabMAb. Imagen 2.

Estudio Histoquimico de CD3, CD5 y CD23

RabMAbs y MMAS contra CD3, CD5 y CD23, mostro resultados concordantes. CD3/ Imagen 3/ y CD5 muy
bien identificados los linfocitos T en las amigdalas. Como era de esperar en MCL y CLL-B, la RabMAb
contra CD5 mostro muy bien el patron tipico representado por las celulas B neoplasicas teidas debilmente,
en comparacion con las celulas T reactivas fuertemente teidas./imagen 4/. El CD23 tio 12 de 12 casos de
CLL-B, como se esperaba, mientras que todos los casos de MCL y MZL fueron negativos.

Imagen 1: comparacin de los resultados de la inmutincion del recetor de estrogeno.

Anticuerpos monoclonales de conejo con SP1 (A, x 20) y sin recuperacion antigenica (B x 20). Anticuerpo
monoclonal de raton 6F11 con AR ( C x 230) y sin AR ( D x 20). Exposiciones de SP1,aumento la
sensibilidad de ambas condiciones. Mayor informacion en tabla 1.

Hallazgos inmunohistoquimicos de ciclina D1:

De los 12 casos de LCM, incluyendo un tipo blastoide, fueron negativos con MMA DCS6 y positivo con el
SP4 RabMAb. /imagen 5/. En 4 de 12 casos, una mayor proporcion de nucleos positivos y una fuerte
intensidad de tincion se detecto en los cortes marcados con el SP4. En 4 casos no se han observado grandes
diferencias entre SP4 y el rendimiento DCS6. EL DCS6 fue teido en un mayor numero de celulas solo en 1
caso. Sin embargo, en este caso tambien se observo tincion de fondo. Entre el grupo de control de la ciclina
D1 de las neoplasias, 2 casos de MM fueron positivos con la RabMAb y MMA, como se esperaba. Por el
contrario, 6 FLS, 10 CLL-B y 8 MZLs no expresan la ciclina D1, lo que confirma la especificidad de
RabMAb. El resumen del estudio histoquimico de la ciclina D1 en la tabla 3.

Hallazgos inmunohistoqumicos de Sinaptofisina:

De los 21 casos, 4 (1 meduloblastoma y 3 carcinomas de clulas pequeas del pulmn) fueron positivos con
RabMAb SP11, pero totalmente negativa con MMA SY38 Imagen 6. Entre los 16 casos positivos
concordantes, una media del porcentaje de clulas positivas del 70% y una puntuacin de intensidad media de
2,0 se observaron con
RabMAb SP11. Por el contrario, con el MMA SY38, una media del porcentaje de clulas positivas de 46% y
una puntuacin media de intensidad de 1,0 se observaron. Uno de los casos de carcinoma de pulmn de
clulas pequeas no se mancha con el SP11 o SY38. Es de notar que la AR no afecta al rendimiento de
RabMAb SP11. Entre los 14 casos de control de carcinoma de pulmn de clulas no pequeas, la mayora
eran negativo con ambos anticuerpos. Sin embargo, 4 y 3 casos fueron focalmente positiva con SP11 y SY38,
respectivamente. Mientras que el porcentaje de clulas positivas fue similar, la intensidad de la tincin fue
ms fuerte con el RabMAb (1,0 para el MMA y 2.0 para RabMAb). Hallazgos inmunohistoqumicos de
Sinaptofisina se resumen en la Tabla 4.

Discusin
Durante los ltimos 30 aos, la tecnologa aplicada al diagnstico del anlisis inmunohistoqumico se ha
centrado principalmente en tratar de aumentar la sensibilidad global de las diferentes clases de sistemas de
deteccin. El advenimiento de calor inducido por AR ha permitido la expansin dramtica de la cantidad de
anticuerpos monoclonales adecuados para el anlisis inmunohistoqumico de material fijado en formol. La
generacin de RabMAbs, una nueva categora de inmunorreactivos, que conjugan la especificidad de las
MMAs con la sensibilidad de la PA, sin duda representa otro paso fundamental hacia el logro de una
sensibilidad ptima y, por consiguiente, hacia una mayor estandarizacion de procedimientos diagnsticos de
inmunohistoqumica.

Imagen 2 Ki-67 etiquetado con el anticuerpo monoclonal de conejo SP6 (A, x 20) supera la tincin
de membrana rara vez se observa con MIB-1 (B, x 20). Para informacin de propiedad exclusiva,
vase la Tabla 1.

Imagen 3 anti-CD3 SP7 tincin de conejo anticuerpo monoclonal patrn de las amgdalas en un
reactivo ( 20). Para informacin de propiedad exclusiva, vase la Tabla 1.
Imagen 4 linfoma de clulas del manto inmuno teidas con anti-CD5 SP19 conejo anticuerpo
monoclonal. Reactiva las clulas T presentan tincin fuerte intensidad de las clulas B neoplsicas
(x 20). Por propiedad de la informacin, vase la Tabla 1.
Para verificar el funcionamiento de esta nueva categora de inmunorreactivos, hemos probado un panel de
RabMAbs disponibles en el mercado, elegido entre los productos ms utilizados, y los compar con MMAs
correspondientes. La determinacin de la condicin de ER y PR en el cncer de mama representa uno de los
parmetros de prediccin ms importantes, y su relevancia clnica es irrefutable. Sin embargo, la
reproducibilidad ptima todava representa un objetivo sin precedentes. La comparacin de RabMAbs contra
la ER, PR, y Ki-67 en una serie de los carcinomas de mama con los correspondientes MMAs claramente ha
demostrado un aumento significativo en trminos de sensibilidad. SP1, en particular, exhibi un rendimiento
ptimo a una dilucin 10 veces mayor que la de 6F11.

Imagen 5 En este caso de linfoma de clulas del manto, el anti-ciclina D1 SP4 anticuerpo
monoclonal de conejo marcada mayora de las clulas neoplsicas (A, X 20), mientras que el

anticuerpo monoclonal de ratn DCS6 fue completamente negativa (B, x 20). Para informacin de
propiedad exclusiva, vase la Tabla 1.
Tabla 3
Expresin de ciclina D1 Evaluado por RabMAb SP 4 y MMA DCS6 *
Casos positivos con:
RabMAb SP4
MMA DCS6
Histotipos
Linfoma clulas del manto (n=12)
12
8
Mieloma mltiple (n=2)
2
2
Linfoma/leucemia de clulas B linfocticas. (n=12)
0
0
Linfoma folicular (n=6)
0
0
Linfoma de zona marginal (n=8)
0
0
MMA, mouse monoclonal antibody; RabMAb, rabbit monoclonal antibody.
* For proprietary information, see Table 1

Tincin aceptable se obtuvo con el SP1, incluso en ausencia de AR, una condicin en la que la
sensibilidad de 6F11 cay dramticamente. Inmuno tincin PR no mostraron diferencias
significativas en trminos de porcentajes de clulas positivas y la intensidad de la tincin, sin
embargo, el RabMAb permitido una mayor dilucin de trabajo. Inmuno marcaje Ki-67 tambin es
considerado como un parmetro importante de pronstico en una variedad de tumores. La
comparacin entre SP6 y MIB-1mostr que el RabMAb tenda a manchar mayores porcentajes de
clulas neoplsicas. Es interesante que la presencia de tincin de membrana, un fenmeno
observado a veces con el anticuerpo MIB-1, desapareci cuando se utiliza el SP6 RabMAb.

Imagen 6 Carcinoma de clulas pequeas de pulmn exhiben fuerte tincin con antisynaptophysin
SP11 (sin recuperacin de antgenos; A, 20) e inmuno negatividad con anticuerpo monoclonal de
ratn SY38 (B 20). Para informacin de propiedad exclusiva, vase la Tabla 1.

(Tabla 4) Expresin de sinaptofisina en 21Neoplasias neuronal / neuroendocrino y 12 de control

carcinomas pulmonares de clulas no pequeas. Evaluado por RabMAb SP11 y MMA SY38
Casos positivos con:
Histotipos
El carcinoma de clulas pequeas de pulmn (n = 12)
Meduloblastoma (n = 5)
Carcinoma neuroendocrino (n = 3)

RabMAb SP11
11
5
3
1
4

MMA SY38
8
4
3
1
3

Paraganglioma (n = 1)
carcinoma de pulmn de clulas no pequeas (n = 14)

MMA, anticuerpo monoclonal de ratn; RabMAb, anticuerpo monoclonal de conejo.

* Para informacin de propiedad exclusiva, vase la Tabla 1.

Otro campo en el cual tiene un papel fundamental el anlisis rutinario de diagnstico

inmunohistoqumico, est representado por el diagnstico diferencial de clulas pequeas en los
linfomas no Hodgkin. Tradicionalmente, algunos de los marcadores usados rutinariamente en este
contexto, tales como CD5, CD23, y ciclina D1 en particular, han representado un desafo tcnico
importante. El reconocimiento preciso de MCL se basa principalmente en la sobreexpresin en la
deteccin de ciclina D1. Sin embargo, el DCS6 MMA siempre muestra los lmites significativos en
la sensibilidad y fiabilidad. El correspondiente RabMAb SP4, mostr una sensibilidad ptima,
tambin la tincin de los casos de MCL que haban resultado negativo con DCS6. Antes que SP4
estuviera disponible, la nica manera de mejorar la sensibilidad de la inmuno tincin ciclina D1
estuvo representada por la aplicacin de pH alto calor inducido por la recuperacin eptopo.
Sin embargo, a pesar de todos los esfuerzos, la inmuno tincin ciclina D1 sigue siendo tcnicamente
difcil. Como han demostrado recientemente Cheuk y compaeros de trabajo, el uso de RabMAb no
slo ofrece una mayor sensibilidad, sino tambin permite el uso de tampones de pH ms bajos, que
permita una mejor preservacin de las caractersticas morfolgicas celulares. En cuanto a CD3,
CD5, y CD23, RabMAbs en paralelo el rendimiento de los MMAs correspondientes en la
especificidad. No obstante, es de notar que los mismos resultados podran ser lograrse a diluciones
de trabajo mucho ms altas.
Sinaptofisina representa un marcador neuronal y neuroendocrino ampliamente utilizado.
Tradicionalmente, se considera especfica a la sinaptofisina, pero no es muy sensible,
principalmente debido a la mala resistencia a la fijacin con formalina.de los eptopos. SP11 exhibe
significativamente una mayor sensibilidad para la deteccin de diferenciacin neuroendocrina en
los carcinomas de clulas pequeas de pulmn. Es interesante que la alta sensibilidad de SP11 ha
hecho AR totalmente intil. En cuanto a la especificidad, se refiere a la tincin focal de
sinaptofisina en una minora de los carcinomas de clulas escamosas, esperado encontrar, y los
mismos casos tambin result positiva con el MMAs correspondientes.
RabMAbs representan una nueva categora de productos de diagnstico, que cuando se comparan
con los correspondientes MMAs parecen ofrecer una mayor sensibilidad sin prdida aparente de
especificidad. En el uso de rutina, permiten mayores diluciones de trabajo (5 a 10 veces en
promedio), mejora significativa que permite en el laboratorio eficiencia. La solidez de esta nueva
clase de inmunorreactivos tambin se demuestra por el hecho de que en algunos casos, la tincin
ptima se puede lograr tambin sin AR. Teniendo en cuenta el papel crucial del anlisis
inmunohistoqumico en el ajuste del diagnstico y en el mbito de la determinacin del pronstico y
los parmetros de prediccin, RabMAbs podra contribuir para lograr una mejor estandarizacin y,
en consecuencia, reproducibilidad aceptable.