21.

ANALIZA
INSTRUMENTALNA

Instrumentalna analiza chemiczna powstaa dziki konstruowaniu precyzyjnych aparatw pomiarowych, ktre pozwalaj wykorzysta wasnoci fizykochemiczne zwizkw do ich analizy jakociowo-ilociowej. Spord rnych technik
analizy instrumentalnej omwiono tylko niektre, podstawowe z zakresu technik
optycznych, elektrycznych i chromatograficznych.

ABSORPCJOMETRIA
Iwona ak, Beata Sarecka
Absorpcjometria jest analityczn technik optyczn, wykorzystujc zdolno substancji chemicznych bdcych w roztworze do pochaniania wiata ca
sw objtoci oraz pomiar natenia wizki wiata. Czsteczki zwizkw zdolnych do absorpcji promieniowania wietlnego s ukadami rezonansowymi, zdolnymi do drga z czstotliwoci zgodn z czstotliwoci drga fal elektromagnetycznych o okrelonej dugoci fali. Rne substancje pochaniaj promieniowanie
zwykle o odmiennej dugoci fali, jeli jednak pochaniaj fale tej samej dugoci,
to z rn intensywnoci.
Substancje mog pochania promieniowanie elektromagnetyczne w zakresie wiata widzialnego (VIS od ang. visible), tzn. o dugoci od 400 do 750 nm
(zakres kolorymetrii), lub nadfioletu (UV od ang. ultra violet), tzn. o dugoci od
200 do 400 nm, czy te podczerwieni (IR od ang. infra red), obejmujcej obszar
powyej 750 nm: podczerwie bliska zakres dugoci fal 7502500 nm; podczerwie 2,525 m.; podczerwie daleka powyej 25 m do uamkw milimetra. Promieniowanie o dugoci fal 0,4200 nm to daleki nadfiolet, ktry charakteryzuje si tym, e jest pochaniany przez atomy tlenu, dlatego analizy w spektrofotometrze z tym zakresem wykonuje si po usuniciu z niego powietrza, czyli w
prni.
rdem promieniowania mog by lampy spektralne (np. deuterowe, wodorowe, rtciowe, sodowe), lasery lub lampy arowe. Lampy spektralne i lasery daj
353

widmo liniowe, natomiast lampy arowe widmo cige. W celu otrzymania okrelonej dugoci fali uywa si odpowiednich monochromatorw. W monochromatorze znajduje si ukad (pryzmat, siatka dyfrakcyjna lub filtry), ktry przez odpowiednie ustawienie na szczelin wyjciow pozwala skierowa wizk promieniowania o danej dugoci fali. Ze szczeliny wyjciowej wizka monochromatyczna
wpada do pomieszczenia pomiarowego, w ktrym przechodzi przez odpowiednie
naczynie (kuwet) z roztworem zawierajcym analizowany zwizek.
Kuwety powinny by wykonane z materiau przezroczystego dla okrelonych dugoci fal. Najpowszechniejszym materiaem przezroczystym jest kwarc,
stosowany dla fal o dugoci: 200400 nm, 400750 nm oraz 7502500 nm. Poza
tym, dla fal o dugoci 400750 nm stosuje si rwnie wysokojakociowe szko,
a dla duszych fal podczerwieni krysztay: NaCl (w zakresie 2,515 m), KBr (do
25 m), CsBr (w zakresie 2540 m) i specjalne gatunki polietylenu przezroczystego dla fal o dugoci w granicach 15300 m.
Podstaw kolorymetrycznego oznaczania stenia substancji w roztworze
stanowi zaleno midzy intensywnoci zabarwienia roztworu, a steniem zawartej w nim substancji. Metoda ta suy do oznaczania stenia substancji majcych wasn barw. Barwa substancji zaley od selektywnej absorpcji okrelonej
dugoci wiata widzialnego i jest barw dopeniajc do pochonitej. Na zabarwienie roztworu skadaj si fale elektromagnetyczne nie zaabsorbowane przez
analizowan substancj, czyli promieniowanie przepuszczone. Przykadowo, czerwona barwa roztworu substancji moe by wynikiem pochaniania zieleni, ktra
jest barw dopeniajc do czerwieni lub zdolnoci analizowanej substancji do
przepuszczania wycznie promieniowania czerwonego. Podobnie ta barwa roztworu substancji moe by wynikiem pochaniania fal niebieskich, ktre s barw
dopeniajc do tej lub zdolnoci analizowanej substancji do przepuszczania
wycznie promieniowania tego.
Roztwory substancji bezbarwnych to takie, w ktrych aden z rodzajw
promieni widzialnych nie ulega pochoniciu.
Substancje bezbarwne mona oznacza ilociowo metod kolorymetyczn,
lecz po przeprowadzeniu ich w barwne pochodne na drodze stechiometrycznych
reakcji chemicznych, ktre powinny przebiega szybko i do koca, powinny by
powtarzalne i specyficzne oraz atwe do przeprowadzenia. Specyficzno reakcji
zwykle okrela uyty odczynnik barwicy, ktry powinien reagowa tylko z badan substancj i nie powinien wchodzi w reakcj z adn inn substancj obecn
w roztworze. Powstaa barwa powinna by: trwaa, niewraliwa na wiato, niepodatna na zmiany pH, niezalena od zmian temperatury i nadmiaru odczynnika barwicego.
Efekty absorpcji w zakresie wiata widzialnego i ultrafioletu obserwuje si
w widmach zwizkw zawierajcych grupy chromoforowe oraz ugrupowania
354

atomw z wielokrotnymi sprzonymi wizaniami nienasyconymi. Niektre z nich

przykadowo przedstawiono poniej.

\
C
/
\
C
/

\
C
/
C

/
C

\
C
/

\
C

Na intensywno barwy zwizku wpywaj rwnie podstawniki, zwane

grupami auksochromowymi, ktre przykadowo przedstawiono poniej. Maj
one zdolno przesuwania maksimum absorpcji w kierunku fal duszych, zjawisko
to zwane jest efektem batochromowym.
CH3,

NH2,

OH,

OCH3,

SH,

Cl,

Br

Absorpcj promieniowania przez roztwory opisuje prawo Beera. Natenie

(Io) wizki promieniowania, ktr przepuci si przez warstw roztworu substancji
pochaniajcej wiato, spada do wartoci (I), gdy przejdzie przez roztwr. Stosunek I do Io nazywa si transmitancj (T) lub przepuszczalnoci, wyraan zwykle w procentach promieniowania przechodzcego przez analizowany roztwr:
T=

I
I0

T% =

I
100
I0

Transmitancja moe przyjmowa wartoci od 0 do 100. Warto T bdzie

najwiksza (100% przepuszczalnoci wiata), gdy nie bdzie absorpcji wiata
przez roztwr, najmniejsza warto T (0% przepuszczalnoci wiata) oznacza
cakowit absorpcj promieniowania.
Transmitancja nie jest prostoliniow funkcj stenia substancji pochaniajcej wiato w przeciwiestwie do absorbancji (A), innej wielkoci pozwalajcej
oceni spadek natenia wizki wiata po przejciu przez warstw roztworu substancji pochaniajcej wiato. Absorbancja to logarytm odwrotnoci transmitancji:
A = log

I
1
= log 0 = c 1
T
I

gdzie:
wspczynnik absorpcji; c stenie roztworu; l grubo warstwy roztworu absorbujcego w cm.

355

Absorbancja (A), zwana te ekstynkcj (E) lub gstoci optyczn (D),

rwna si logarytmowi stosunku natenia promieniowania padajcego (Io) do
natenia promieniowania przepuszczonego (I).
Prawo Bouguera-Lamberta-Beera stanowi podstawowe prawo absorpcjometrii, zgodnie z ktrym absorbancja substancji pochaniajcej wiato jest wprost
proporcjonalna do stenia i gruboci warstwy roztworu, ktrego matematyczny
zapis to: A = cl. Jeli stenie roztworu (mol/l) i grubo jego warstwy (w cm) s
rwne jednoci, to wwczas wspczynnik absorpcji () rwna si wartoci mierzonej absorbancji, A = , dlatego nazywa si molowym wspczynnikiem absorpcji. Dla bardzo wielu substancji bezporedni pomiar A przy steniu 1 mol/l
jest niemoliwy, dlatego warto molowego wspczynnika absorpcji oblicza si
z pomiaru absorbancji przy steniu znacznie niszym, korzystajc z zalenoci:
=

A
l / mol cm
cl

to

c=

l/ mol cm

Jeeli stenie substancji pochaniajcej promieniowanie jest wyraone

w gramach na litr, wwczas wspczynnik nosi nazw waciwego wspczynnika
absorpcji (). Molowy wspczynnik absorpcji zaley od dugoci fali, temperatury i uytego rozpuszczalnika. Im wiksz warto ma molowy wspczynnik
absorpcji danej substancji, tym mniejsz ilo tej substancji mona oznaczy kolorymetrycznie.
Znajc warto molowego wspczynnika absorpcji analizowanej substancji
i absorbancj roztworu o nieznanym steniu tej substancji mona obliczy jej
stenie (wyraone w mol/l) na podstawie matematycznego zapisu prawa Bouguera-Lamberta-Beera, jednak obliczenia takie stosuje si rzadko, zwykle odczytuje
si je ze sporzdzonego wykresu kalibracyjnego.
W celu stwierdzenia, czy dana substancja pochania promieniowanie w danym zakresie dugoci fal, naley dokona pomiarw absorbancji dla kadej dugoci fali z tego zakresu. Z otrzymanych pomiarw sporzdza si wykres zalenoci
absorbancji od dugoci fali, ktry jest charakterystycznym dla danej substancji
widmem absorpcyjnym, w danym zakresie dugoci fal. Na widmie znajduje si
maksymalna warto absorbancji dla okrelonej dugoci fali, przy ktrej nastpnie
dokonuje si pomiarw absorbancji roztworw wzorcowych i badanych danej substancji. Jeeli substancja nie pochania wiata w danym zakresie dugoci fal, wartoci absorbancji s rwne lub bliskie zeru.
Najwiksz zalet absorbancji jest jej wprost proporcjonalna zaleno od
stenia. Wykres tej zalenoci w dostatecznie szerokim zakresie ma ksztat krzywej logarytmicznej. W pocztkowym odcinku kadej pojedynczej wartoci absorbancji mona przyporzdkowa tylko jedn warto stenia. W miar, jak wykres
356

staje si asymptot krzywej, niemoliwe okazuje si przyporzdkowanie pojedynczej wartoci absorbancji tylko jednego stenia, bo w miar postpu krzywej,
jednej wartoci absorbancji mona przyporzdkowa nieskoczenie wiele ste.

3
1
ABSORBANCJA

STENIE
Prawo Bouguera-Lamberta-Beera stosuje si tylko do pocztkowego odcinka
wykresu zalenoci absorbancji do stenia. Jest on prostoliniowy i nazywa si
wykresem kalibracyjnym (1), z ktrego mona odczyta szukane stenie roztworu po zmierzeniu wartoci jego absorbancji. W wykresie kalibracyjnym mog
zdarza si odchylenia od prostoliniowej zalenoci, mianowicie: ujemne (2)
gdy absorbancja zwiksza si wolniej wraz ze zwikszaniem stenia, ni wynikaoby to z proporcjonalnej zalenoci, lub dodatnie (3) gdy absorbancja zwiksza si znaczniej wraz ze zwikszaniem stenia, ni wynikaoby to z proporcjonalnej zalenoci. Przyczynami odchyle od prawa Lamberta-Beera mog by
takie zjawiska, jak: dimeryzacja, dysocjacja lub asocjacja, ktre mog wpywa na
wasnoci optyczne substancji oraz zale od stenia. Wykres kalibracyjny wykorzystuje si w zakresie prostoliniowej zalenoci.
Ponadto, stenie substancji, speniajcej prawo Bouguera-Lamberta-Beera
w zakresie ste, dla ktrych zaleno absorbancji od stenia jest prostoliniowa,
mona oznaczy bez sporzdzania wykresu kalibracyjnego. W tym celu mierzy si
warto absorbancji roztworu analizowanej substancji o znanym steniu (wzorzec) oraz roztworu analizowanego o nieznanym steniu. Stenie oznaczane
oblicza si po przeksztaceniu nastpujcej proporcji:
Aw : Ax = cw : cx

cx = cw Ax / Aw

gdzie:
Aw absorbancja roztworu o znanym steniu (wzorca); Ax absorbancja roztworu analizowanego o nieznanym steniu; cw stenie znane, wzorca; cx stenie oznaczane
357

Aparaty suce do pomiaru absorbancji to absorpcjometry. Stenie zwizkw barwnych oceniano pierwotnie przez intensywno zabarwienia, czyli koloru,
std wywodzi si wci uywana nazwa kolorymetria, odnoszca si do absorpcjometrii w wietle widzialnym. Przyrzdem sucym do tego typu pomiarw jest
kolorymetr, ktry mona traktowa jako uproszczony spektrofotometr.
Przyrzdy stosowane do pomiaru absorpcji promieniowania mona najoglniej podzieli na:
1) fotokolorymetry w ktrych wiato monochromatyczne uzyskuje si
przez specjalne filtry wietlne;
2) spektrofotometry zawierajce pryzmaty lub siatki dyfrakcyjne do uzyskiwania monochromatyzacji wiata.
Na oglny schemat budowy tych aparatw skada si: a) rdo wiata, b)
regulator natenia wizki promieniowania, c) monochromatory, d) pojemnik na
roztwr badany, e) detektor, f) wskanik pomiaru.
Przy pomiarze absorbancji pierwsz czynnoci, jak naley wykona jest
nastawienie aparatu na wymagan dugo fali. Nastpnie trzeba przepuci wizk
wiata monochromatycznego (przy ustawieniu wskanika cyfrowego na 100%
przepuszczalnoci) przez kuwet zawierajc roztwr porwnawczy (np. woda lub
uywany rozpuszczalnik) bd tzw. prb lep (jest to roztwr o takim samym
skadzie i pH, jak roztwr badany, nie zawierajcy jednak oznaczanego skadnika).
Jest to podstawowa zasada oznacze absorpcjometrycznych, pozwalajca na wyeliminowanie wpywu odczynnikw i zawartych w nich zanieczyszcze na ostateczny wynik pomiaru. Kolejny etap to przeczenie wskanika cyfrowego na
absorbancj, ktra powinna wynosi 0,00. Dopiero po wyzerowaniu aparatu na
prbie lepej mona odczyta absorbancj roztworu badanego, umieszczonego
w identycznej kuwecie.
Metody kolorytmetryczne nale do najatwiejszych i najszybszych metod
analitycznych, s uniwersalne, dokadne i czue.

POLARYMETRIA
Iwona ak, Izabela Szotysek-Bodys
Polarymetria to technika analityczna, ktra wykorzystuje zjawisko skrcania
paszczyzny wiata spolaryzowanego do wykrywania lub oznaczania stenia
substancji optycznie czynnej, m.in. w analizie rodkw leczniczych. Przyrzdem
sucym do oznaczania kta skrcenia paszczyzny wiata spolaryzowanego jest
polarymetr. Wizk wiata liniowo spolaryzowanego otrzymuje si po przepusz-

358

czeniu wizki wiata monochromatycznego (lampy sodowej) przez pryzmat Nicola (nikol).
Pryzmat Nicola to dwuomny kryszta szpatu islandzkiego (krystaliczny
CaCO3), ktry szlifuje si pod ktem 68, przecina wzdu przektnej, po czym
obie powki skleja balsamem kanadyjskim o wspczynniku zaamania rwnym
1,54; gwny przekrj jest paszczyzn polaryzacji pryzmatu.
balsam kanadyjski
90

68

promie nadzwyczajny

promie zwyczajny

Schemat dziaania pryzmatu Nicola

Wchodzcy do pryzmatu Nicola promie wiata rozszczepia si na dwa
promienie: zwyczajny i nadzwyczajny. Promie zwyczajny pada na warstw balsamu kanadyjskiego pod ktem wikszym od granicznego, dlatego ulega odbiciu
i wygaszeniu, promie nadzwyczajny za pod ktem mniejszym od granicznego,
dlatego przechodzi bez zmian.
Spolaryzowane promienie nadzwyczajne po opuszczeniu pryzmatu Nicola
biegn dalej w tym samym kierunku, co promienie padajce na ten pryzmat. Zatem
pryzmat Nicola przepuszcza drgania fali elektromagnetycznej tylko w jednej paszczynie, natomiast wygasza drgania w innych paszczyznach.
Po przepuszczeniu wiata monochromatycznego przez dwa pryzmaty Nicola, ustawione jeden za drugim, natenie wiata spolaryzowanego zaley od ustawienia drugiego.

wiato spolaryzowane wykazuje maksymalne natenie, gdy paszczyzny

polaryzacji obu pryzmatw Nicola s do siebie ustawione rwnolegle. W przypadku, gdy jeden zostanie obrcony wok swej osi mona obserwowa coraz wiksze
zaciemnienie w polu widzenia, tj. wygaszanie wiata wychodzcego z polarymetru.
Maksymalne zaciemnienie, czyli wygaszenie wiata ma miejsce, gdy kt
obrotu pryzmatu Nicola osignie 90, wwczas paszczyzny polaryzacji (gwne
przekroje) obu pryzmatw s do siebie prostopade (skrzyowane). W takim uoe359

niu drugi pryzmat Nicola nie przepuszcza wizki wiata spolaryzowanego wychodzcego z pierwszego. Wizka odbija si od warstwy balsamu w drugim pryzmacie
i dalej biegnie jako wizka promieni zwyczajnych.
Schemat budowy polarymetru

gdzie:
1 rdo wiata; 2 filtr ty dajcy wiato monochromatyczne; 3 soczewka dajca
wizk promieni rwnolegych; 4 polaryzator; 5 pytka kwarcowa; 6 rurka polarymetru; 7 analizator; 8 okular

W polarymetrach pierwszy pryzmat Nicola jest nieruchomy i nosi nazw polaryzatora, poniewa suy do wytwarzania wizki wiata spolaryzowanego.
Drugi to analizator, ktry jest ruchomy wok osi optycznej i sprzony ze skal
ktow, suc do odczytu wielkoci kta skrcenia.
Zasada dziaania polarymetru opiera si na tym, e jeli midzy pryzmatami
Nicola (skrzyowane) umieci si substancj optycznie czynn, ktra skrca paszczyzn wiata spolaryzowanego o kt , to pole widzenia w okularze rozjani si
proporcjonalnie do stenia tego zwizku.
W celu osignicia pierwotnego zaciemnienia naley obrci analizator dokadnie o kt . W przypadku jednych zwizkw optycznie czynnych, analizator
naley obrci w prawo (substancje prawoskrtne), w przypadku drugich w lewo
(substancje lewoskrtne). Kt skrcenia odczytuje si na skali ktowej z dokadnoci do 0,05 za pomoc noniusza.
Najczciej uywane s polarymetry pcieniowe: dwucieniowe (dwupolowe) lub trjcieniowe (trjpolowe), ktre umoliwiaj porwnanie natenia wiata
opuszczajcego polaryzator z nateniem wiata przechodzcego przez analizator.
W polarymetrach tych cz wizki wiata przepuszcza si przez dodatkowy pryzmat lub pytk kwarcow, ktre rozdzielaj pole widzenia w okularze. Dziki
temu w okularze moe ukaza si jednoczenie pole maksymalnie jasne obok pola
ciemniejszego.
Polarymetr jest tak uregulowany, e jeli w rurce polarymetru nie ma substancji optycznie czynnej i zerowa kreska podziaki ktowej pokrywa si z zerow
kresk podziaki noniusza, wtedy wszystkie czci pola widzenia w okularze s
jednolicie szaro owietlone (wygaszone), tak jak w pozycji b na rysunku, przedstawiajcym rodzaje pl widzenia w polarymetrze.

360

Jeli w rurce polarymetrycznej umieci si substancj optycznie czynn lewoskrtn, wwczas pojawi si pasek jasny w rodkowej czci pola widzenia,
ktremu towarzysz po bokach pola ciemne, tak jak w pozycji a na rysunku.
Rodzaje pl widzenia w polarymetrze

lewoskrtna
substancja

wygaszenie cakowite

prawoskrtna
substancja

Jeeli w rurce polarymetrycznej umieci si substancj prawoskrtn, wwczas pojawia si pasek ciemny w rodkowej czci pola widzenia, ktremu towarzysz po bokach pola jasne, tak jak w pozycji c na rysunku.
Podstaw polarymetrii jest zaleno wyraona wzorem:
= []D c l
gdzie:
zmierzony kt skrcenia paszczyzny wiata spolaryzowanego; []D skrcalno
waciwa; c stenie zwizku optycznie czynnego, w g/ml roztworu; l grubo warstwy
roztworu, przez ktr przechodzi wizka wiata spolaryzowanego, w dm

Warto mierzonego kta skrcenia paszczyzny wiata spolaryzowanego

przez zwizek optycznie czynny zaley od stenia substancji, od gruboci warstwy roztworu tej substancji, przez ktr przechodzi wiato spolaryzowane oraz od
rodzaju substancji, jej budowy, iloci i rozmieszczenia jej centrw chiralnoci.
Dan substancj optycznie czynn charakteryzuje warto skrcalnoci waciwej.

Skrcalno waciwa danej substancji to kt, o jaki skrcaaby paszczyzn

wiata spolaryzowanego jednodecymetrowa warstwa roztworu danej substancji
o steniu 1g/ml. Jej warto zaley od dugoci fali promieni spolaryzowanych,
temperatury i rodzaju rozpuszczalnika, dlatego przy zapisie wartoci skrcalnoci
waciwej podaje si te parametry:

361

20
D

c(g / ml) l(dm)

gdzie:
[]D20 skrcalno waciwa rozpuszczonej substancji wyraona w stopniach; indeks
grny 20 oznacza temperatur pomiaru; indeks dolny D wiato monochromatyczne, czyli
linia D lampy sodowej (589,3 nm); zmierzony kt skrcenia paszczyzny wiata spolaryzowanego wyraony w stopniach; c stenie roztworu wyraone w g/ml; l grubo
warstwy roztworu, wyraona w dm, przez ktr przechodzi wiato spolaryzowane.

Po dokonaniu pomiaru kta skrcenia paszczyzny wiata spolaryzowanego

przez substancj o znanej wartoci skrcalnoci waciwej mona okreli jej stenie, wyraone w g/ml, na podstawie matematycznej zalenoci:
c=

20
D

l (dm)

W technice polarymetrii stenie wyznacza si z pomiaru kta skrcenia na

podstawie prostej matematycznej zalenoci, ktrej warunki stosowania mona
atwo zapewni. Zwizek midzy steniem a odpowiadajcym mu ktem skrcenia wyznacza warto skrcalnoci waciwej, ktr odczyta mona z odpowiednich zestawie tabelarycznych w poradnikach fizykochemicznych.
Iloczyn skrcalnoci waciwej i masy molowej (M) podzielony przez 100
okrela si jako skrcalno molowa []:
F =

M
100

Pozwala ona na porwnywanie zdolnoci do skrcania wiata spolaryzowanego w skali molowej. Poniewa warto iloczynu skrcalnoci waciwej i masy
molowej byaby liczb zbyt du, niewygodn w uyciu, zostaa podzielona przez
100.

CHROMATOGRAFIA
Iwona ak
Chromatografia jest metod suc do rozdzielania mieszanin substancji,
w ktrej wykorzystywane s rne fizykochemiczne oddziaywania rozdzielanych
substancji z dwoma fazami: ruchom i nieruchom. Faz nieruchom moe by
362

ciao stae (w chromatografii adsorpcyjnej) lub ciecz, unieruchomiona w staym

noniku (w chromatografii podziaowej), faz ruchom bywa ciecz lub gaz.

Chromatografia adsorpcyjna
W chromatografii adsorpcyjnej wykorzystuje si zjawisko adsorpcji, ktre
jest nastpstwem czsteczkowych oddziaywa dyspersyjnych, tworzenia si sabych wiza chemicznych, wodorowych, doprowadzajcych do nagromadzania si
substancji rozpuszczonej na powierzchni ciaa staego, zwanego adsorbentem.
Wielko adsorpcji okrela si stosunkiem iloci masy substancji zaadsorbowanej,
zwanej adsorbatem, przypadajcej na jednostk masy adsorbenta. Wielko ta zaley od temperatury oraz rodzaju adsorbatu i adsorbenta. Adsorbentami mog by:
el skrobiowy, sacharoza, wglan wapniowy, fosforan wapniowy, fosforan magnezowy, tlenek magnezowy, el krzemionkowy, wgiel aktywny i inne. Adsorbenty
mona podzieli na dwie zasadnicze grupy, tj. polarne, np. el krzemionkowy,
i niepolarne, np. wgiel aktywny. Faz ruchom uywan do elucji s zwykle cieke zwizki organiczne o rnych stopniach polarnoci, od wglowodorw po alkohole i kwasy organiczne. Moc elucyjn poszczeglnych rozpuszczalnikw mona okreli, wyznaczajc warto wspczynnika Rf (rate of flow szybko przepywu) dla substancji testowanej, zachowujc jednakowe warunki dowiadczalne
(te same: adsorbent, adsorbat i temperatura).

Rf =

DROGA PRZEBYTA PRZEZ SUBSTANCJ

DROGA PRZEBYTA PRZEZ ROZPUSZCZALNIK

Rf jest to stosunek odlegoci przebytej przez migrujc substancj do odlegoci przebytej przez czoo rozpuszczalnika w tym samym czasie.
W chromatografii adsorpcyjnej rozdzielenie mieszaniny substancji odbywa
si gwnie dziki rnicom w ich adsorpcji przez adsorbent. Substancje sabiej
adsorbowane przez adsorbent s wymywane przez rozpuszczalnik wczeniej. Natomiast silniej adsorbowane przez adsorbent pozostaj z nim zwizane. Czasami
dla ich wymycia z adsorbentu naley zastosowa wiele rozpuszczalnikw o rosncej mocy eluowania (zdolnoci wymywania) lub elucj gradientow, polegajc na
cigym zwikszaniu mocy rozpuszczalnika wymywajcego.

Chromatografia podziaowa
W chromatografii podziaowej rozdzielenie mieszaniny opiera si na rnej
rozpuszczalnoci jej zwizkw w dwch nie mieszajcych si rozpuszczalnikach.
Jeden z rozpuszczalnikw, unieruchomiony na noniku, stanowi faz nieruchom,
natomiast drugi przemieszcza si wzgldem pierwszego i stanowi faz ruchom.
Rozdzielane substancje dziel si pomidzy faz ruchom i nieruchom zgodnie
363

z ich rozpuszczalnoci w tych fazach. Substancje, ktre lepiej rozpuszczaj si

w fazie nieruchomej, migruj wolniej i to wanie prowadzi do rozdziau. Na podstawie polarnoci poszczeglnych faz wyrniamy:

chromatografi podziaow zwyk, w ktrej faz nieruchom jest woda (lub

roztwr buforowy albo rozpuszczalnik organiczny nasycony wod) osadzona na
nieaktywnym noniku (np. bibua), a faz ruchom jest rozpuszczalnik organiczny;
chromatografi podziaow z faz nieruchom, mniej polarn od wody, np. hydrofilny rozpuszczalnik organiczny nie mieszajcy si z faz ruchom;
chromatografi podziaow z odwrconymi fazami, w ktrej nonik jest silnie
hydrofobowy i utrzymuje nieruchom faz organiczn. Zrnicowanie szybkoci wdrowania skadnikw rozdzielanej mieszaniny wynika z rnych wartoci
wspczynnikw podziau dla poszczeglnych skadnikw.
Wspczynnik podziau substancji (k) jest to stosunek stenia substancji
rozpuszczonej w fazie ruchomej do jej stenia w fazie nieruchomej, ktry w stanie
rwnowagi i w danej temperaturze ma wielko sta.

k=

STENIE W FAZIE RUCHOWEJ

STENIE W FAZIE NIERUCHOMEJ

Najszybciej wdruj skadniki posiadajce najwiksz warto wspczynnika podziau. Podczas chromatografii podziaowej, poza podziaem skadnikw
midzy dwie fazy cieke, czsto maj miejsce zjawiska zwizane w mniejszym lub
wikszym stopniu z adsorpcj skadnikw z nonikiem. Siy adsorpcji hamuj ruch
podczas procesu chromatograficznego.
Rozdzielane substancje w danych warunkach chromatograficznych charakteryzuje rna szybko wdrowania, okrelona wspczynnikiem Rf.
Substancje, ktre maj identyczne wartoci wspczynnikw Rf, nie mog
by rozdzielone w danych warunkach chromatograficznych.
Jeli substancja ma wspczynnik szybkoci przepywu Rf = 1, to oznacza,
e wdruje ona wraz z czoem rozpuszczalnika, czyli jest bardzo dobrze rozpuszczalna w fazie ruchomej, a nierozpuszczalna w fazie nieruchomej.
Jeeli natomiast substancja ma warto Rf = 0, to oznacza, e substancja ta
jest na tyle sabo rozpuszczalna w fazie ruchomej, e pozostaa na linii startowej,
nie bdc w stanie migrowa.
W chromatografii podziaowej najczciej stosowanymi technikami s chromatografie: bibuowa, kolumnowa i cienkowarstwowa.
W chromatografii bibuowej nonikiem fazy nieruchomej jest bibua, w ktrej kierunek wkien celulozowych moe czasami mie niekorzystny wpyw na
zdolno rozdzielcz tego nonika.
364

W chromatografii kolumnowej lub cienkowarstwowej nonikami s ele

krzemionkowe, celulozowe, ziemia okrzemkowa i inne obojtne, porowate materiay, ktre albo wypeniaj kolumny, albo naniesione s w postaci cienkiej warstwy na pytkach szklanych lub plastikowych. Wymienione noniki s hydrofilowe,
dlatego faza na nich unieruchomiona jest zawsze polarna, najczciej woda lub
wodne roztwory metanolu, kwasu octowego, buforw i inne. Jako faz ruchomych
uywa si rozpuszczalnikw organicznych lub ich mieszanin, niekiedy z dodatkiem
polarnych substancji, np. kwasu octowego. Noniki o charakterze hydrofobowym
(np. celulozy acetylowane lub kauczuk w obecnoci benzenu lub chloroformu)
wykorzystuje si w chromatografii podziaowej z odwrconymi fazami, gdzie stosuje si niepolarn faz nieruchom.
W chromatografii kolumnowej na pionowo ustawion kolumn, wypenion
nonikiem zrwnowaonym faz nieruchom, nanosi si roztwr mieszaniny przeznaczonej do rozdzielenia, ktry wnika w kolumn. Skadniki mieszaniny, gwnie
dziki rnym wspczynnikom podziau, wdruj z rn prdkoci wraz z faz
ruchom. Wymywane z kolumny poszczeglne skadniki mieszaniny zbierane s
do probwek znajdujcych si w kolektorze frakcji, automatycznie przesuwajcym
probwki, zalenie od nastawionego przedziau czasowego lub objtoci zbieranej
frakcji.
W chromatografii bibuowej i cienkowarstwowej wyrniamy dwie podstawowe techniki: chromatografi wstpujc i zstpujc. W tej pierwszej faza ruchoma wraz z rozdzielanymi substancjami wdruj wskutek si kapilarnych warstwy nonika. W technice zstpujcej faza ruchoma wraz z rozdzielanymi substancjami wdruj wskutek si cikoci.
Po zakoczeniu migracji na chromatogramie naley uwidoczni i zidentyfikowa rozdzielone zwizki, jeli nie s one barwne. Waciwe uycie wzorcw,
odpowiednich odczynnikw identyfikujcych i metod fizykochemicznych wraz
z pomiarem wartoci Rf pozwala na rozpoznanie substancji tworzcych plamki na
chromatogramie. Sposb wywoania chromatogramu zaley od celu danej analizy.

Chromatografia na sitach molekularnych

W chromatografii na sitach molekularnych, zwanej sczeniem molekularnym lub filtracj elow, rozdzielanie mieszaniny czsteczek odbywa si na podstawie ich wielkoci i ksztatu.
Nonikami fazy ruchomej, czyli sitami molekularnymi w tej metodzie, s
usieciowane poprzecznie, nierozpuszczalne polimery wglowodanowe, typu dekstran (Sephadex) lub agaroza (Sepharose), oraz polimery poliakrylamidowe (BioGel). S one wysoce uwodnionymi ziarnami o strukturze porowatej, ktrych wielko porw jest charakterystyczna dla danego rodzaju sita, a poszczeglne rodzaje
sit rni si rozmiarami porw. Wielko porw okrela rozmiar kanalikw
365

w ziarnach, np. im bd one wiksze, tym wiksze czsteczki bd do nich wnikay. Przykadowo, zdolnoci rozdzielcze Sephadexw serii G (G-15 G-200) s
rne, np. na Sephadexie G-75 najlepiej rozdzielane s substancje o masach czsteczkowych mieszczcych si w zakresie 3000150 000, a np. na Sephadexie
G-200 o masach w zakresie 5000800 000.
Techniki z uyciem sit molekularnych s podobne do stosowanych w przypadku chromatografii podziaowej, mianowicie technika kolumnowa lub cienkowarstwowa. W obu przypadkach, zasada rozdzielania polega na tym, e czsteczki
mniejsze od wielkoci porw wchodz do kanalikw w poszczeglnych ziarnach
sit, natomiast czsteczki od nich wiksze lub o wyduonym ksztacie nie mog
wej do wntrza kanalikw w ziarnach. Czsteczki wiksze wystpuj tylko
w pynie otaczajcym ziarna, maj wic krtsz drog do przebycia, ni czsteczki
mniejsze, ktre znajduj si w pynie o wikszej objtoci (jest to pyn otaczajcy
porowate ziarna, jak i wypeniajcy kanaliki w ziarnach), dlatego maj dusz
drog do przebycia od czsteczek wikszych. Czsteczki wiksze przemieszczaj
si przez sita molekularne szybciej i ulegaj elucji jako frakcje pocztkowe, natomiast mniejsze poruszaj si znacznie wolniej, poddajc si elucji jako frakcje pniejsze.
Sczenie molekularne czsto wykorzystywane jest do odsalania roztworw
biaek izolowanych z materiau biologicznego metodami wysalania. Podczas rozdziau czsteczki soli wnikaj do kanalikw ziaren i eluowane s znacznie pniej
od frakcji biaek, ktre nie majc moliwoci wejcia do kanalikw ziaren, szczeglnie Sephadexu G-25, wczenie wymywane s z kolumny niemal z objtoci
swobodn kolumny (Vo), czyli objtoci rozpuszczalnika wypeniajcego przestrze midzy ziarnami.
Sita molekularne najczciej stosuje si do rozdziau biaek, peptydw, kwasw nukleinowych i innych zwizkw, zarwno w badaniach analitycznych, jak i
w celach preparatywnych. Sczenie molekularne mona take wykorzysta do
wyznaczenia masy czsteczkowej, np. biaek. W tym celu naley wyznaczy objto elucyjn (Ve) dla danego biaka i objto swobodn kolumny (Vo). Midzy
okrelon wzgldn objtoci elucyjn biaka (Ve/Vo) a logarytmem jego masy
czsteczkowej wystpuje zaleno liniowa. Dziki temu, po wystandaryzowaniu
sita molekularnego wzorcowymi biakami o znanej masie czsteczkowej, wykrela
si krzyw wzorcow (zalenoci Ve/Vo do log10 masy czsteczkowej), z ktrej
mona odczyta mas czsteczkow badanego biaka, znajc jego wzgldn objto elucyjn.

Chromatografia jonowymienna
W metodzie tej nonikiem s wymieniacze jonowe (jonity), wysokoczsteczkowe, usieciowane zwizki nierozpuszczalne, ktre posiadaj atwo dysocju366

jce grupy chemiczne, kwane lub zasadowe. W cile okrelonych warunkach (pH
i mocy jonowej roztworu) mog one wiza jony z roztworu oraz oddawa je
w przypadku zmiany tych warunkw.

Kationity zawieraj dysocjujce grupy kwane (obdarzone adunkiem ujemnym), np. COO-H+, SO3-H+, fenolowe lub fosforanowe, ktre na zasadzie podwjnej wymiany, przyczaj z roztworu rozdzielanej mieszaniny kationy, np.
Ca++, oddajc atom wodoru.
Anionity zawieraj dysocjujce grupy zasadowe, np. N(CH3)3+OH-, lub aktywne ugrupowania amin I-, II- lub III-rzdowych (obdarzone adunkiem dodatnim), ktre przyczaj z roztworu rozdzielanej mieszaniny aniony, np. Cl-.
W chromatografii jonowymiennej podstaw rozdziau mieszaniny czsteczek jest
ich cakowity adunek. Dlatego na kolumnie kationitowej z rozdzielanej mieszaniny zostan zatrzymane tylko kationy, natomiast aniony i czsteczki obojtne nie
mog by zwizane, dlatego wypyn z kolumny wraz z frontem rozpuszczalnika.
Zwizane z jonitem kationy mona nastpnie wymy z kolumny przez przemycie
roztworem jonw dodatnich, np. Na+ o wzrastajcym gradiencie, ktre konkuruj
z badanymi kationami o wizanie z obdarzonymi adunkami ujemnymi grupami
jonitu, lub te uwolni je poprzez zwikszenie pH buforu elucyjnego. Miar pojemnoci wymieniacza jest stenie aktywnych (obdarzonych adunkiem) grup
wymieniacza na jednostk masy jonitu.
W chromatografii jonowymiennej nonikami mog by te sita molekularne,
zawierajce dodatkowo obdarzone adunkiem dodatnim grupy dietyloaminoetylowe (DEAE), np. DEAE-Sephadex, DEAE-celuloza, s one anionitami czsto wykorzystywanymi do rozdziau i oczyszczania biaek o wypadkowym adunku ujemnym (biaek anionowych). Sita molekularne zawierajce obdarzone adunkiem
ujemnym grupy karboksymetylowe (CM), np. CM-Sephadex, CM-celuloza, s kationitami, czsto wykorzystywanymi do rozdziau i oczyszczania biaek o wypadkowym adunku dodatnim (biaek kationowych).

Chromatografia powinowactwa
Chromatografia powinowactwa wykorzystuje specyficzne, niekowalencyjne
i o wysokim powinowactwie wizanie si biaka z inn czsteczk zwan ligandem, dlatego umoliwia wyodrbnienie jednego biaka z mieszaniny wielu rnych
biaek. Przykadowo, czstymi kombinacjami specyficznych par ligandw i oczyszczanych biaek s np.: hormon jako ligand w celu oczyszczenia rozpoznawanego
i wicego go specyficznie receptora; lektyna w celu oczyszczenia glikoproteiny; przeciwciao, aby wyizolowa antygen, inhibitor do oczyszczenia enzymu.
Specyficzne ligandy s zwykle unieruchomione na porowatych nonikach (sitach
molekularnych) na Sepharose, Sephadexie, jak np. konkanawalina A-Sephadex.
Mieszanin biaek nakada si na immobilizowane ligandem sita molekularne,
367

uformowane na ksztat zoa wypeniajcego kolumn. Na noniku zostanie zatrzymane jedynie biako specyficznie wice si z ligandem, natomiast wszystkie
pozostae biaka pozostan w buforze elucyjnym, ktry opuci kolumn. Biako
zwizane z ligandem na kolumnie mona uwolni w dwojaki sposb: albo przez
przemycie kolumny roztworem zawierajcym woln form liganda lub poprzez
zmian pH, czy te stenia soli w buforze elucyjnym.

ELEKTROFOREZA
Iwona ak
Elektroforeza jest technik rozdzielania zwizkw obdarzonych adunkiem,
ktra wykorzystuje zjawisko ruchu czstek w polu elektrycznym. Pod wpywem
pola elektrycznego czstki obdarzone adunkiem dodatnim, czyli kationy, wdruj
do katody, tzn. elektrody ujemnej, w procesie zwanym kataforez. Czstki obdarzone adunkiem ujemnym aniony wdruj w polu elektrycznym do anody, tj.
elektrody dodatniej, w procesie zwanym anaforez. Podstaw rozdziau elektroforetycznego czstek jest ich zrnicowana szybko wdrwki w polu elektrycznym, manifestujca si tym, e w jednakowym czasie odmienne czstki przewdruj rne odlegoci.
Szybko przemieszczania czstek obdarzonych adunkiem w polu elektrycznym zaley od trzech zasadniczych grup czynnikw, mianowicie: 1) wasnoci czstek wdrujcych; 2) wasnoci rodowiska, w ktrym czstki wdruj; 3) od
parametrw charakteryzujcych przepywajcy prd.
Wasnoci czstek wdrujcych w polu elektrycznym, ktre maj najwikszy
wpyw na szybko przemieszczania, to wielko wypadkowego adunku elektrycznego, masa i ksztat czstek. Wielko masy i wypadkowego adunku czstek
dziaaj przeciwstawnie na szybko wdrwki. Im wikszy wypadkowy adunek
czstek, tym szybciej si poruszaj, ale im wiksza masa, tym wolniejsza wdrwka czstek. Zatem szybko migracji czstek w polu elektrycznym zaley od stosunku adunek/masa. Ksztat czstek wpywa na szybko ich przemieszczania,
dziki obnianiu lub wzmaganiu oporu rodowiska, ktry przeciwdziaa ruchowi
czstek. Opr rodowiska dla czstek o ksztacie bliskim kuli (globularnym) bdzie
mniejszy (dziki czemu ruch tych czstek jest szybszy) ni tych o rozpostartej konformacji przestrzennej.

rodowisko, w ktrym czstki wdruj, rodzaj uytego buforu i jego waciwoci, takie jak lepko, sia jonowa, pH i temperatura, wpywaj na rozdzia
elektroforetyczny. Im wiksza lepko, tym wikszy opr rodowiska ma do pokonania przemieszczajca si czstka. Natomiast od siy jonowej i pH buforu elektroforetycznego moe zalee wielko adunku rozdzielanej czstki.
368

Zastosowanie buforu o wartoci pH odpowiadajcej wartoci pI rozdzielanych czstek uniemoliwi ich rozdzia, poniewa w tych warunkach czstki wystpuj w formie jonu obojnaczego i nie poruszaj si w polu elektrycznym. Dla czstek rozpuszczalnych w rodowisku zasadowym najwaciwszy bdzie bufor o pH
wyszym od pI kadej rozdzielanej czstki mieszaniny. Przykadowo, bufor elektroforetyczny o wartoci pH okoo 9 stwarza warunki, w ktrych wikszo biaek
wykazuje ujemny wypadkowy adunek i w polu elektrycznym wdruje w kierunku
anody.
Nie bez znaczenia jest rodzaj nonika, ktrego pory s wypenione buforem
z czstkami obdarzonymi adunkiem elektrycznym. Nonikiem do elektroforezy
moe by bibua (rnego rodzaju), inny nonik celulozowy, w tym octan celulozy
oraz obecnie powszechnie stosowane rne ele obojtne (agarozowy, poliakrylamidowy) w przypadku elektroforezy elowej. Bibua jest nonikiem o duej opornoci, natomiast ele cechuje maa oporno oraz niska adsorpcja czstek. Dodatkowo, ele s sitami molekularnymi, w zwizku z tym przez kanaliki w elu mae
czstki przechodz swobodnie, natomiast wiksze s zatrzymywane. Usieciowanie
elu, np. poliakrylamidowego, decydujce o wielkoci kanalikw w elu, mona
kontrolowa stosownie do potrzeb przez wybr odpowiednich ste akrylamidu
i odczynnika sieciujcego metylenobisakrylamidu, tworzcego wizania poprzeczne. W elu bd tym mniejsze kanaliki, im wiksze zastosuje si stenie akrylamidu.
Nie bez znaczenia dla rozdziau s wskaniki charakteryzujce przepywajcy prd, czyli wielko przyoonego napicia, a waciwie jego spadek wzdu
drogi wdrwki czstek, wielko natenia. Przyoenie niskiego napicia prdu
sprawia, e niskie jest jego natenie i wydzielanie ciepa, lecz szybko wdrwki
czstek okazuje si wolna. W takich warunkach wydua si czas potrzebny do
osignicia rozdziau elektroforetycznego. Zbyt dugi czas trwania rozdziau moe
by niepodany ze wzgldu na towarzyszce niekorzystne procesy, m.in. dyfuzj,
ktra powoduje rozmycie brzegw rozdzielonych stref. Pod wzgldem wielkoci
przyoonego napicia rozrnia si elektroforez niskonapiciow, w ktrej spadek napicia wynosi do kilkunastu V/cm, oraz elektroforez wysokonapiciow
przy spadku napicia rzdu 50 V/cm i wicej.

Elektroforeza w elu poliakrylamidowym (PAGE) charakteryzuje si

szczeglnie du rozdzielczoci, ktra w poczeniu z wysok czuoci metod
detekcji rozdzielanych substancji pozwala na analizowanie mikrogramowych iloci
rozdzielanych mieszanin. Powszechnie stosuje si j do rozdzielania i oczyszczania
biaek oraz kwasw nukleinowych. Elektroforez na elu poliakrylamidowym
w obecnoci siarczanu dodecylu sodu (SDS) (PAGE-SDS) wykorzystuje si do
wyznaczania masy czsteczkowej biaek. W metodzie tej stosuje si biaka, wczeniej poddane denaturacji termicznej (100C) w obecnoci SDS i redukcji poprzez
dziaanie -merkaptoetanolu w celu zerwania wiza disiarczkowych. Efektem
369

tych dziaa jest cakowite rozwinicie struktury biaka. Czsteczki anionowego

detergentu SDS s silnie ujemne i opaszczaj zdenaturowane biako, tworzc wyduone micelle, we wntrzu ktrych znajduje si czsteczka biaka.
W warunkach tych wszystkie biaka wykazuj wypadkowy adunek ujemny
i identyczny stosunek adunku do masy. W obecnoci SDS wszystkie biaka posiadaj podobny wkienkowy ksztat prtopodobny i ich dugo jest wwczas
proporcjonalna do dugoci acucha polipeptydowego, tym samym do masy czsteczkowej biaka. Podczas PAGE-SDS podstaw rozdziau stanowi jedynie rnica wielkoci mas czsteczkowych rozdzielanych biaek.
Wariantem elektroforezy na elu poliakrylamidowym jest ogniskowanie
izoelektryczne, czyli elektroforeza PAGE w gradiencie pH, utworzonym przez
poliamfolity pod wpywem pola elektrycznego. W tych warunkach rozdzia elektroforetyczny biaek polega na tym, e kade biako wdruje w polu elektrycznym
tylko do tych miejsc elu, w ktrych rodowisko pod wzgldem pH odpowiada
wartoci jego punktu izoelektrycznego i w tych miejscach zatrzymuje si w postaci
wskiego prka.
Uwidocznienie w elu rozdzielonych czstek polega na wykonaniu specyficznych reakcji barwienia, charakterystycznych dla tych zwizkw. Czsto biaka
wybarwia si barwnikiem Coomassie brillant blue a kwasy nukleinowe bromkiem
etydyny lub azotanem srebra.

370