REPLICACION DEL DNA

Mucho antes de que se conociese la estructura del DNA, los cientficos ya se haban preguntado
acerca de la capacidad de los organismos para crear copias fieles de si mismos y, mas tarde
acerca de la capacidad de las clulas para producir muchas copias idnticas de macromolculas
grandes y complejas.
La especulacin sobre estos problemas se centr alrededor del concepto molde, una estructura
que hara posible alinear las molculas en un orden especifico y luego unirlas para crear una
macromolcula con una estructura y una funcin nica.
La dcada de 1940 trajo el descubrimiento de que el DNA era una molcula que almacenaba la
informacin gentica, pero no fue hasta que James Watson Y Francis Crick dedujeron su
estructura que result claro de qu forma el DNA actuaba como molde para la replicacin y la
transmisin de la informacin gentica : cada una de las cadenas complementarias de la otra.
Las estrictas relas del apareamiento de bases implican que cada cadena sirva de molde para una
cadena hermana, cuya secuencia es predecible y complementaria.
Las propiedades fundamentales de la replicacin de DNA y los mecanismos utilizados por los
enzimas que la catalizan han resultado ser bsicamente idnticos en todos los organismos. Esta
unidad mecanstica ser un tema fundamental cuando pasemos de la propiedades generales del
proceso de replicacin a los enzimas que lo catalizan en E. coli y en los eucariotas..
La replicacin de DNA esta gobernada por un conjunto de reglas fundamentales
Los primeros estudios sobre la replicacin de DNA bacteriano y sus enzimas contribuyeron al
establecimiento de una serie de propiedades bsicas que son aplicables a la sntesis del DNA de
todos los organismos.
La replicacin de DNA es semiconservadora Cada cadena de DNA acta como molde para la
sntesis de una nueva cadena. El resultado son dos molculas de DNA nuevas, cada una con una
cadena nueva y otra vieja. Este proceso se denomina replicacin semiconservadora.
La hiptesis de la replicacin semiconservadora puesta por Watson y Crick poco despus de la
publicacin de su artculo sobre la estructura del DNA en 1953, esta hiptesis fue confirmada en
1957 mediante ingeniosos experimentos diseados por Matthew Meselson y Franklin Sthal.
Estos investigadores cultivaron clulas de E. coli durante varias generaciones en un medio cuya
fuente de nitrgeno (NH4Cl) contena 15N, el isotopo pesado del nitrgeno en lugar del
isotopo ligero normal ms abundante, el 14N. EL SNA aislado de estas clulas tena una
densidad un 1% mayor que el [ 14N] DNA normal. Aunque la diferencia es pequea, se puede
separar la mezcla de [15N]DNA pesado y [14N]DNA ligero por equilibrio de sedimentacin en
gradiente de densidad de cloruro de cesio.
Clulas de E. coli cultivadas en un medio con 15N se transfirieron a un medio que contena
solamente el isotopo 14N donde se las dejo crecer hasta la duplicacin de la poblacin celular.
El DNA aislado de esta primera generacin de clulas formo una nica banda en el gradiente de
cloruro de cesio en una posicin que indicaba que las molculas de DNA de doble hlice de las
clulas hijas eran hbridos que contenan una cadena nueva con 14N y una cedena parenatl
con14N.
Este resultado contradeca la replicacin conservadora una hiptesis alternativa segn la cual
una molcula de DNA de la progenie estara formada por dos cadenas de DNA recin
sintetizadas, mientras que la otra contendra las dos cadenas parentales; este mecanismo no
dara molculas de DNA hibridas en el experimentode meselson y Stahl. La hiptesis de la
replicacin semiconservadora se confirmo en la siguiente etapa del experimento. Se permitio
que las celulas volviesen a doblar su numero en el medio con 14N. el DNA aislado de este
segundo ciclo de replicacin mostro 2 bandas en el gradiente de densidad, una con una densidad
igual a la del DNA ligero y la otra con la densidad del DNA hibrido observado despus de la
primera duplicacin celular.
La replicacin empieza en un punto de origen y normalmente avanza en forma
bidireccional Confirmado el mecanismo semiconservador de la replicacin, se plantearon un
buen numero de preguntas. Se desenrollan totalmente las cadenas de DNA parental antes de
que cada una sea replicada? Empieza la replicacin en sitios al azar o en nico punto?
Despus de iniciada la replicacin en un punto del DNA, transcurre en una direccin o en
ambas?

John Cairns, mediante autorradiografia, proporciono una primera indicacin de que la

replicacin era un proceso altamente coordinado, en el que las cadenas parentales se
desenrollaban yy replicaban simultneamente. Cairns incorpor radiactividad en el DNA de E.
coli, cultivando las clulas en un medio que contena timidina marcada con tritio (3H). El DNA,
cuidadosamente aislado y extendido, fue cubierto con una emulsion fotogrfica durante varias
semanas .la desintegracin del 3H de la timidina impresiono la emulsin, formando una imagen
de la molcula de DNA. Estas imgenes mostraron que el cromosoma intacto de E.coli es un
gran circulo sencillo de ua longitud de 1,7 m. el DNA radiactivo aislado en clulas en proceso
de replicacin ostro un lazo extra. Cairns lleg a la conclusin de que el lazo en el DNA era el
resultado de la formacin de dos cadenas hijas radiactivas, cada una complementaria de una
cadena parental.
Uno o ambos extremos del lazo son puntos dinmicos llamados horquillas de replicacin,
donde el DNA parental es desenrollado y las cadenas separadas son rpidamente replicadas. Los
resultados y las cadenas separadas son rpidamente replicadas. Los resultados de Cairns
demostraron que las dos cadenas del DNA se replican simultneamente. Una variante de este
experimento indico que la replicacin de los cromosomas bacterianos es bidireccional: los dos
extremos del lazo tienen horquillas de replicacin activas.
Para deterinar si los lazos se originan en un nico punto del DNA, se necesitaban seales de
referencia a lo largo de la molecula de DNA. Estas seales las proporciono una tcnica
denominada cartografiado de desnaturalizacin, desarrollada por Ross Inman y
colaboradores. Utilizando el cromosoma del bacterifago de 48.502 pares de bases, Inman
demostr que las secuencias ricas en pares de bases A==T pueden ser desnaturalizadas forman
burbujas de cadena sencilla. De forma similar se pueden desnaturalizar parcialmente DNA
aislados que contengan bucles de replicacin. Es posible medir la posicin y el progreso de las
horquillas de replicacin utilizando las regiones desnaturalizadas como puntos de referencia.
Esta tcnica revelo que los lazos de replicacin siempre se incian en un punto nico
denominado origen. Tambin confirmo observaciones anteriores que indicaban que la
replicacin es normalmente bidireccional. En las molesculas de DNA circular, las horquillas de
replicacin vuelven a encontrarse en un punto del circulo, en el lado opuesto al origen.
Desde entonces se han identificado y caracterizado orgenes de replicacin especficos en las
bacterias y en eucariotas inferiores.
La sntesis de DNA progresa en direccin 5 3 y es semidiscontinua
Las cadenas de DNA siempre son sintetizadas en al direccin 5 3 , siendo el 3 -OH libre el
punto de elongacin del DNA. Debido a que las dos cadenas de DNA son antiparalelas, la
cadena que sirve de molde es leida del extremo 3 al 5.
Si la sisntesis transcurre siempre en la direccin 5 3, Cmo pueden sintetizarse las dos
cadenas simultneamente?
Si las dos fuesen sintetizadas continuamente a medida que se desplaza la horquil de replicacin,
una tendra que ser sintetizada en direccin 3 5. Este problema fue resuelto por Reiji
Okazaki y colaboradores en la dcada de 1960. Okazaki descubri que en una de las cadenas
nuevas de DNA se sintetiza en forma de trozos cortos, denominados fragmentos de okazaki.
Ese trabajo condujo finalmente a la conclusin de que en una de s cadenas es sinteizada de
modo continuo y la otra de modo discontinuo. La cadena continua, o cadena conductora, es
aquella cuya sntesis en direccin 5 3 transcurre en direccin opuesta a direccin del
movimiento de la horquilla. Los fragmentos de Okazaki tienen una longitud de entre unos
pocos centenares y unos pos millares de nucletidos, segn el tipo celular. Tal como veremos
ms adelante, la sntesis de la hebra conductora y la hebra rezagada estn estrechamente
coordinadas.
EL DNA ES DEGRADADO POR NUCLEASAS
Para explica la enzimologa de la replicacin de DNA, empezaremos con las enzimas que lo
degradan, en lugar de con aquellos que lo sintetizan. Estos enzimas se denominan nucleasas o
DNasas si son especficas de DNA en lugar de RNA. Todas las clulas contienen varias
nucleasas diferentes, que pueden clasificarse en dos amplias clases: exonucleasas y
endonucleasas. Las exonucleasas degradan a los cidos nucleicos desde un extremo de la
molcula. Muchas actan solo en direccin 5 3 o bien en direccin 3 5, eliminando

nucletidos solo del extremo 5 o del 3 respectivamente, de una cadena de cido nucleico de
cadena doble o sencilla. Las endonucleasas pueden empezar a degradar en sitios internos
especficos de una cadena o molcula de acido nucleico, reducindola a fragmentos cada vez
ms pequeos. Unas pocas exonucleasas y endonucleasas degradan exclusivamente DNA de
cadena sencilla. Hay unas cuantas clases de endonucleasas de gran importancia que degradan
secuenias de nucletidos especficas.
El DNA ES SINTETIZADO POR DNA POLIMERSAS
La bsqueda de una enzima que pudiese sintetizar DNA empez en 1955. El trabajo de Arthur
Komberg y colaboradores culmino en la purificacin y caracterizacin de la DNA polimerasa de
E. coli, un enzima con una sola cadena polipeptidica, conocido actualmente como DNA
polimeraza I (M, 103.000 codificada por el gen polA). Mucho despus, se han encontrado en E.
coli al menos otras cuatro DNA polimerasas distintas ms adelante.
Los estudios detallados sobre la DNA polimerasa I revelaron caractersticas del proceso de
sntesis del DNA que se ha visto que son comunes a todas las de DAN polimerasas. La reaccin
fundamental es una transferencia de grupo fosforlo. El nuclefilo es el grupo 3 hidroxilo del
nucletido en el extremo 3 de la cadena en crecimiento. El ataque nucleofilico se produce sobre
el fosforo del desoxinuclesido 5 trifosfato entrante. En la reaccin se libera pirofosfato
inorgnico la ecuacin general de la reaccin es:

Donde Dnmp y dNTP son desoxinucleosidos 5 monofosfato y 5 -trifosfato , respectivamente.

La reaccin tiene aparentemente lugar con solo una variacin minima de energa libre, puesto
que se forma un enlace fosfodiester a expensas de un anhdrido fosfato menos estable. Sin
embargo, las interacciones no covalentes de apilamiento y de apareamiento de las bases
estabilizan el DNA alargado en relacin con el nucletido libre. Adems, formacin de
productos en la celula esta favorecida por los 19 kJ/mol generados por la hidrolisis posterior del
pirofosfato por el enzima pirofosfatasa.
Los trabajos iniciales sobre la DNA polimerasas requieren un molde. La reaccin de
polimerizacin esta dirigida por una cadena molde de DNA segn las regla de apareamiento de
bases predichas por Watson y Crick: donde hay una guanina en el molde se aade un
desoxinucleosido de citosina ala nueva cadena y asi sucesivamente. Este fue yn decubrimiento
especialmente mportante, no solo porque proporciono una base qumica para la replicacin
semiconservadora del DNA, sino tambin porque represento el primer ejemplo de utilizacin
de un molde para guiar una reaccin biosintetica.
Segundo , es necesario un cebador. Un cebador es un segmento de cadena (complemetario del
molde) con un grupo 3 -hidroxilo libre al cual pueden aadirse nucleotidos a una cadena
preexistente. Los cebadores son a menudo oligonucletidos de RNA, en lugar de DNA;
enzimas especializados sintetizan los cebadores donde y cuando son requeridos.
Despus de aadir un nucletido a una cadena en crecimiento de DNA, la DNA polimerasa se
disocia o bien se traslada a lo largo del molde y se aade otro nucletido. La disociacin y la
reasociacin de la polimerasa. El proceso es generalmente ms rpido si la polimerasa aade
nucletidos sin disociarse del molde. El nuero medio de nucletidos aadidos antes de que una
polimerasa se disocie define su procesividad. Las DNA polimerasas muestran una gran
variacin procesividad; algunas solo aaden unos pocos nucletidos antes de disociarse,
mientras que otras aaden muchos millares.
La replicacin es muy precisa
La replicacin tiene lugar con un grado extraordinario de fidelidad. En E. coli, se comete un
error solo cada 109 o 1010 nucletidos incorporados. Dado que el cromosoma de E. coli tiene
unos 4,6 x 106 pares de bases, esto significa que se comete un error cada 1000 a 10.000
replicaciones. Durante la polimerizacin, la discriminacin entre nucletidos correctos e
incorrectos se basa no solamente en los puentes de hidrogeno que especifican el apareamiento
correcto entre bases complementarias, sino tambin en la geometra comn de los pares de bases

estndar A=T y G=C. el centro activo de la DNA polimerasa I acomoda solamente pares de
bases con esta geometra. Un nucletido incorrecto puede ser capaz de formar puentes de
hidrogeno con una base del molde, pero generalmente no encajara en el centro activo. Las bases
incorrectas pueden ser desechadas antes de que se forme el enlace fosfodiester.
La precisin de la reaccin de polimerizacin es, no obstante insuficiente para explicar el
elevado grado de fidelidad de la replicacin meticulosas medidas in vitro han demostrado que
las DNA polimerasas insertan un nucletido incorrecto de cada 10 4 a 105 correctos. Estos errores
se cometen a veces, porque una base esta momentneamente una forma tautomrica infrecuente,
que permite el apareamiento con una base incorrecta. La tasa de error disminuye in vivo gracias
a mecanismos enzimticos adicionales.
Un mecanismo intrnseco de virtualmente todas las DNA polimerasa es una actividad
exonucleoitica 3 5
independientemente, que hace posible realizar una segunda
comprobacin de cada nucletido una vez a sido aadido. Esta actividad nucleasas permite
eliminar un nucletido recin incorporado y es altamente especfica para pares de bases
incorrectos, se inhibe la translocacin de la enzima a la posicin donde a de incorporarse el
siguiente nucletido. Esta pausa cintica proporciona una oportunidad para la correccin. La
actividad exonucleasa 3 5 elimina el nucletido mal apareado y la polimerasa vuelve a
empezar .Esta actividad, denominada correccin de pruebas, no es simplemente la inversa de la
polimerizacin, puesto que no interviene el pirofosfato. Las actividades de polimerizacin y de
correccin de pruebas de una sola DNA polimerasa se pueden medir separadamente. La
correccin de pruebas mejora la precisin inherente de la reaccin de polimerizacin en un
factor de 102 a 103. .En la DNA polimeraza I monomerica, las actividades de polimerizacin y de
correccin de pruebas tienen centros activos separados en el mismo polipptido.
Con la seleccin de bases y la correccin de pruebas combinadas, la DNA polimerasa deja tras
de sin un error cada 106 a 108 bases aadidas. Sin embargo, la precisin observada en la
replicacin en clulas de E. coli s todava mayor. La precisin adicional se debe a un sistema
enzimtico separado que repara los pares de bases incorrectos que permanecen despus de la
replicacin.
E.COLI POSEE AL MENOS CINCO DNA POLIMERASAS.
Mas del 90% de la actividad DNA polimerasa de los extractos de E.coli se debe a la DNA
polimerasa I. no obstante, poco despus de su aislamiento en 1955, se empezaron a acumular
pruebas de que esta enzima no es adecuado para la replicacin del cromosoma de E. coli.
Primero su velocidad (600 nucletidos aadidos/min) es demasiado lenta, en un factor de 100 a
mas, para explicar la velocidad del movimiento de la horquilla de replicacin en las clulas
bacterianas. Segundo la DNA polimerasa I tienen una procesividad relativa baja. Tercero,
estudios genticos han demostrado que en la replicacin intervienen muchos genes y, por tanto,
muchas protenas: claramente la DNA polimerasa i alterado, que produca un enzima inactivo.
Esta cepa era anormalmente sensible a los agentes que daaban DNA y, no obstante era viable.
La bsqueda de otras polimerasa llevo al descubrimiento de la DNA polimerasa II y de la DNA
polimerasa II en E. coli a principio de la dcada de 1970. La DNA polimerasa II es una enzima
implicada en un tipo de reparacin del DNA. La DNA polimerasa III es el enzima principal de
la replicacin en E. coli. Las DNA polimerasas IV Y V, identificadas en 1990, estn implicadas
en un tipo de reparacin poco habitual.
La DNA polimerasa I no es, pues, el enzima principal de la replicacin; en cambio, realiza una
multitud de funciones de limpieza durante la replicacin, la recombinacin y la reparacin.
Estas funciones especiales estn potenciadas por su actividad exonucleasa 5 3, el fragmento
restante (Mr 68.000), denominado fragmento grande o de klenow, retiene las actividades
exonucleasas 5 3 de la DNA polimerasa I intacta es capaz de remplazar un segmento de
DNA (o RNA) apareado con la hebra mlde, en un proceso denominado translacin de la mella.
La mayora de las DNA polimerasas restantes carecen de actividades exonucleasas 5 3.
La DNA polimerasa III, con diez tipo de subunidades, es mucho mas compleja que la DNA
polimerasa I.
Sus actividades de polimerizacin y de correccin de pruebas residen en las subunidades y
(psilon), respectivamente.

La sub unidad se asocia con las subunidades y para formar la polimerasa nucleo, capaz de
polimerizar el DNA pero de procesividad limitada. Dos polimerasas ncleo se pueden unir
mediante otro conjunto de subunidades, un complejo de carga de la abrazadera, o complejo
consiste en seis subunidades de cuatro subtipos diferentes 2. Las polimerasas ncleo se
unen a travs de las subunidades (tau). Dos subunidades adicionales, (chi) y (psi), estn
unidas al complejo de carga de la abrazadera. El conjunto de completo de 13 subunidades (de
nueve tipos diferentes) se denomina DNA polimerasa III
La DNA polimerasa III* puede polimerizar DNA, pero con una procesividad mucho menor que
la necesaria para replicar el cromosoma completo. El necesario aumento de procesividad se
debe a la unin de las subunidades , cuatro de las cuales completan el holoenzima de la DNA
polimerasa III. Las subunidades se asocian por pares para formar una estructura toridal que
rodea al DNA y que acta como abrazadera. Cada dmero se asocia con un ncleo de
polimerasa III* (una abrazadera dimerica por ncleo) y se desliza a lo largo del DNA a medida
que avanza la replicacin. La abrazadera deslizante impide la disociacin de la DNA
polimerasa III del DN, lo cual aumenta la procesividad en un factor de mas de 500.000.
LA REPLICACION DEL DNA REQUIERE MUCHOS ENZIMAS Y FACTORES
PROTEICOS
La replicacin de E. coli necesita no solo una DNA polimerasa, sino tambin 20 o mas enzimas
y protenas diferentes, cada una con una tarea especifica. El conjunto se ha denominado sistema
DNA replicasa o replisoma la complejidad enzima de la replicacin refleja los requerimientos
que la estructura del DNA y la necesaria fidelidad imponen al proceso. Trataremos las clases
principales de enzimas de la replicacin desde punto de vista de las tareas que tienen que
resolver.
El acceso a las cadenas de DNA que han de actuar como molde requiere la separacin de las dos
cadenas parentales.
Esto se consigue generalmente mediante enzimas denominadas helicasa, que se desplazan a los
largo del DNA y separan las cadena utilizando la energa qumica del ATP. La sepaacion de las
cadenas crea una tencin topolgica en la estructura helicoidal del DNA, que se relaja por
accin de las topoisomerasas. Las cadenas separadas son estabilizadas por protenas de unin
al DNA. Tal como se ha mencionad anteriormente, los cebadores, segmentos cortos de RNA
sintetizados por enzimas denominadas primasas, han de estar unidos al DNA antes de que las
DNA polimerasas puedan empezar la sntesis. Finalmente, los cebadores de RNA son
eliminados y remplazados por DNA. En E. coliesta es una de muchas funciones de la DNA
polimerasa I. Despus de la eliminacin del cebador de RNA y del relleno del hueco con DNA,
queda una medalla en la cadena azcar- fosfato, en forma de un enlace fosfodiester roto. Estas
mellas son selladas por enzimas denominadas DNA ligasas. Todos estos procesos han de estar
coordinados y regulados E.coli es el sistema donde las interconexiones entre los diferentes
componentes se conocen mejor.