DEPARTAMENTO DE PROTECCION VEGETAL

MICROBIOLOGA ANIMAL
Ciclo I 2013

Lic. Rosmery Erroa

APENDICE
MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS EN LAS PRCTICAS DE LABORATORIO
Papa Glucosado Agar.
Medio de cultivo utilizado para el aislamiento y recuento de hongos y levaduras en muestras
clnicas, alimentos, cosmticos y otros materiales.
Fundamento
Tanto la glucosa (o Dextrosa) presente como la infusin de papa favorecen el desarrollo
exuberante de hongos y levaduras, mientras que el desarrollo bacteriano es inhibido con el
agregado de cido tartrico luego de la esterilizacin hasta alcanzar un pH: 3.5 0.2. Una vez
agregado el cido no se puede recalentar ya que el agar se hidroliza.
Frmula (en gramos por litro)
Infusin de papa
4.0
Glucosa
20.0

Agar

15.0

Instrucciones
Disolver 39 g de polvo en un litro de agua
destilada.
Dejar reposa
0x5 minutos. Calentar hasta ebullicin con
agitacin continua.
Esterilizar a 121C durante 15 minutos.
Si se desea ajustar el pH a 3.5 agregar
aproximadamente 14 ml de una solucin
estril de cido tartrico al 10 %, cuando
el agar se encuentra entre 45-50 C.

pH final: 5.6 0.2

Siembra
- Tcnica De Pour Plate: sembrar 0.1 o 1 ml y agregar 15 ml del Papa Glucosado Agar fundido y
enfriado a 45-50 C
- En superficie: por estriado
Incubacin
En aerobiosis, a 22-25 C 30-32 C segn el mtodo seguido, durante 5 das o mayor tiempo.
Resultados
Microorganismos

Aspergillus niger
Candida albicans
Sacharomyces cerevisiae

Crecimiento
Bueno
Bueno
Bueno

Caractersticas del medio

Medio preparado: mbar claro ligeramente opalescente.

Lcda. Rosmery Erroa, Ciclo I 2013

Almacenamiento:
Medio deshidratado: a 10-35 C.
Medio preparado: a 2-8 C.

Nutritivo Caldo
Medio de cultivo utilizado para propsitos generales, para el desarrollo de microorganismos con
escasos requerimientos nutricionales.
Su uso est descripto en muchos procedimientos para el anlisis de alimentos, aguas y otros
materiales de importancia sanitaria.
Fundamento
Medio no selectivo, contiene pluripeptona y extracto de carne que constituyen la fuente de carbono
y nitrgeno necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano. Puede ser utilizado adems, como
pre enriquecimiento en la bsqueda de Salmonella spp. A partir de alimentos, ya que permite
recuperar clulas daadas, diluir metabolitos txicos y sustancias inhibitorias.
Frmula (en gramos por litro)
Pluripeptona
5.0

Instrucciones
Emplear 8 g de polvo por litro de agua
destilada.
Si es necesario, calentar hasta disolver.
3.0
Distribuir y esterilizar en autoclave a 118121C durante 15 minutos.
pH final: 6.9 0.2

Extracto de carne

Siembra
Por inoculacin directa de la muestra o del microorganismo en estudio.
Incubacin
En aerobiosis, a 35-37 C durante 24 horas.
Resultados
Examinar los tubos para evaluar el crecimiento por turbiedad. Cuando sea necesario, subcultivar en
medios slidos apropiados y realizar la identificacin bioqumica.
Microorganismos

Crecimiento

P. mirabilis * ATCC 43071

E. coli ATCC 25922
S. aureus ATCC 25923
S. epidermidis ATCC 14990
S. typhimurium ATCC 14028
P. aeruginosa ATCC 27853

Bueno
Bueno
Bueno
Bueno
Bueno
Bueno

Caractersticas del medio

Medio preparado: mbar claro.

Lcda. Rosmery Erroa, Ciclo I 2013

Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 C.
Medio preparado: a 2-8 C.
*American Type Culture Collection

Mac Conkey Agar.

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil desarrollo, aerobios y
anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clnicas,
de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.
Fundamento
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo
bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal
violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva.
Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del
color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en las colonias, y la precipitacin de las sales
biliares.
Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.
Frmula (en gramos por litro)
Instrucciones
Peptona
17.0 Suspender 50 g del polvo por litro de agua
Pluripeptona
3.0
destilada.
Lactosa
10.0 Reposar 5 minutos y mezclar hasta
Mezcla de sales biliares
1.5
uniformar.
Calentar suavemente y hervir 1 a 2
Cloruro de sodio
5.0
Agar
13.5 minutos hasta disolver.
Rojo neutro
0.03 Esterilizar en autoclave a 121C durante
Cristal violeta
0.001 15 minutos.
pH final: 7.1 0.2
Siembra
- Sembrar en superficie.
- Utilizando la tcnica de Pour Plate: sembrar 1 ml de muestra y agregar aproximadamente 15 ml
de medio de cultivo fundido y enfriado a 45 50 C.
Incubacin
Durante 18-48 horas, a 35 37 C, en atmsfera aerbica

Lcda. Rosmery Erroa, Ciclo I 2013

Resultados
Microorganismos

Escherichia coli ATCC 25922

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603
Salmonella typhimurium ATCC 14028
Shigella flexneri ATCC 12022
Proteus mirabilis ATCC 43071
Enterococcus faecalis ATCC 29212

Colonias
Rojas con halo turbio
Rosadas mucosas
Incoloras, transparentes
Incoloras, transparentes
Incoloras, transparentes
Diminutas, incoloras, opacas

Caractersticas del medio

Medio preparado: rojo prpura
Almacenamiento:
Medio deshidratado: a 10 35 C.
Medio preparado: a 2 8 C.

TCBS Medio
Medio selectivo para el aislamiento y cultivo de Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus y otras
especies de Vibrio a partir de heces, agua y alimentos contaminados.
Tambin es conocido como Agar Tiosulfato Citrato Bilis Sacarosa, o como Agar Selectivo
para Vibrios.
Fundamento
En el medio de cultivo, el extracto de levadura, la peptona de carne y la triptena aportan nutrientes
para el desarrollo bacteriano. Es este, el medio selectivo ms adecuado para el aislamiento de las
especies de Vibrio, e inhibidor para la mayora de las enterobacterias. Esta inhibicin se basa en las
altas concentraciones de tiosulfato y citrato, la presencia de bilis y un pH fuertemente alcalino. La
degradacin de la sacarosa es variable entre las especies de Vibrio y las colonias son verdes para
las cepas que no la utilizan y amarillas para aquellas que producen cido a partir de este azcar.
Esto es debido al viraje del color de los indicadores de pH azul de timol y azul de bromotimol, del
color azul al amarillo en medio cido. Es importante tener en cuenta, que la proporcin de sacarosa
en el medio est equilibrada de forma tal que no inhiba el crecimiento bacteriano por exceso de
cido.
El cloruro de sodio favorece el crecimiento de microorganismos. El tiosulfato de sodio aporta azufre
y junto con el citrato frrico permiten la deteccin de produccin de cido sulfhdrico.
Aumentando la concentracin de cloruro de sodio y disminuyendo la temperatura de incubacin,
pueden aislarse especies marinas sin importancia sanitaria.

Lcda. Rosmery Erroa, Ciclo I 2013

Frmula (en gramos por litro)

Extracto de levadura
5.0
Peptona de carne
5.0
Triptena
5.0
Citrato de sodio
10.0
Tiosulfato de sodio
10.0
Bilis de buey
8.0
Sacarosa
20.0
Cloruro de sodio
10.0
Citrato frrico
1.0
Azul de bromotimol
0.04
Azul de timol
0.04
Agar
15.0
pH final:

Instrucciones

Suspender 89 g del polvo en un litro de

agua destilada.
Calentar hasta ebullicin y hervir de 1 a 2
minutos.
NO AUTOCLAVAR.
Distribuir en placas de Petri estriles.

8.6 0.2

Siembra
1- Materiales clnicos:
a. Materia fecal: suspender 1 gramo de heces o el contenido del hisopo en 10 ml de
Agua Peptonada Alcalina e incubar de 6 a 8 horas a 35-37C, en aerobiosis.
b. Materiales provenientes de infecciones extraintestinales: no es necesario realizar
enriquecimiento previo en Agua Peptonada Alcalina.
2- Agua: Filtrar de 1 a 10 litros (el volumen deseado) de agua con membrana de
0.22.Colocar la membrana en un recipiente conteniendo Agua Peptonada Alcalina e
incubar de 6 a 8 horas a 35-37C, en aerobiosis.
3- Alimentos: Licuar 25 g de la muestra con 225 ml de Agua Peptonada Alcalina (B02-15905, B02-159-06) e incubar de de 6 a 8 horas a 35-37C, en aerobiosis.
En todos los casos sembrar una alcuota del caldo de enriquecimiento en la superficie
de una placa de TCBS, por estriado, para el aislamiento de colonias.
Incubacin
En aerobiosis, durante 18-24 horas a 35 37 C.
Resultados
Microorganismo

Crecimiento

Vibrio cholerae

Bueno

V. parahaemolyticus

Bueno

V. alginolyticus
Aeromonas spp.
E. coli

Bueno
Inhibido
Inhibido

Lcda. Rosmery Erroa, Ciclo I 2013

Caractersticas de las
colonias
Amarillas de 2-3 mm de
dimetro, de borde traslcido
Centro verde azulado, borde
traslcido
Amarillas grandes
---

Caractersticas del medio

Medio preparado: verde azulado.
Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10 35 C.
Medio preparado: a 2 8 C.
Tripteina Soya Agar o Tripticasa soya
Medio utilizado para propsitos generales, favorece el desarrollo y aislamiento de una gran variedad
de microorganismos aerobios, y anaerobios facultativos y estrictos. El agregado de sangre, permite
el aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente exigentes y la
observacin de reacciones de hemlisis. Tambin, este medio de cultivo, puede utilizarse como
medio
base
para
preparar
el
medio
agar
chocolate.
Fundamento
La triptena y la peptona de soya aportan nutrientes ricos en pptidos, aminocidos libres, bases
pricas y pirimdicas, minerales y vitaminas. La peptona de soya aporta tambin carbohidratos que
estimulan el crecimiento de muchos microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance
osmtico.
Adicionado con 5-10% sangre, se logra un medio enriquecido y adecuado para observar reacciones
de hemlisis.
Cuando se prepara como agar chocolate, es til para el cultivo de Neisseria spp., Haemophilus
influenzae y microorganismos exigentes similares. Incubado en forma anaerobia, permite el
crecimiento de Clostridium spp. y anaerobios NO esporulados. Es un medio adecuado para cultivar
y mantener cepas de Aeromonas, y aumentando el porcentaje de cloruro de sodio, para mantener
cepas de algunos Vibrios (excepto V. cholerae).
Frmula (en gramos por litro)
Triptena

15.0

Peptona de soya

5.0

Cloruro de sodio
Agar

5.0
15.0
pH final: 7.3 0.2

Instrucciones
Disolver 40 g de polvo deshidratado por litro de agua destilada. Mezclar y dejar reposar 5 minutos.
Calentar suavemente agitando y hervir durante 1 o 2 minutos hasta su disolucin. Distribuir y
esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 118-121C.
Preparacin de la placa de Agar Sangre: aadir en forma asptica un 5% de sangre estril
desfibrinada a temperatura ambiente, el agar debe estar a 45C.
Preparacin de Agar Chocolate: despus de aadir la sangre y agitando frecuentemente se
mantiene el medio de cultivo a 80C por 10 minutos hasta que adquiera un color pardo
chocolatado.

Lcda. Rosmery Erroa, Ciclo I 2013

Siembra
Por inoculacin directa del material en estudio, sobre la superficie del medio de cultivo.
Incubacin
Las condiciones de temperatura, tiempo y atmsfera de incubacin, sern acuerdo al material a
estudiar.
Resultados
Microorganismos

E. coli
ATCC 25922
S. aureus ATCC 25923
S. pyogenes ATCC 19615
S. pneumoniae ATCC 6305
S. pneumoniae ATCC 49619

Crecimiento
Abundante
Abundante
Abundante
Abundante
Abundante

Hemlisis
-Beta
Beta
Alfa
Alfa

Caractersticas del medio

Medio preparado: mbar.
Medio preparado con 5% de sangre: rojo cereza.
Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10 35 C.
Medio preparado: a 2 8 C.
Tripteina Soya Caldo o Tripticasa soya
Medio adecuado para el desarrollo de microorganismos exigentes.
Fundamento
La triptena y la peptona de soya aportan nutrientes ricos en pptidos, aminocidos libres, bases
pricas y pirimdicas, minerales y vitaminas. La peptona de soya aporta carbohidratos que
estimulan el crecimiento de muchos microorganismos.
El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. El fosfato dipotsico otorga capacidad buffer y la
glucosa es la fuente de energa.
Frmula (en gramos por litro)
Triptena
17.0
Peptona de soya
3.0
Cloruro de sodio
5.0
Fosfato dipotsico
2.5
Glucosa
2.5
pH final:

Instrucciones
Suspender 30 g del polvo por litro de agua
destilada.
Mezclar y calentar hasta disolver.
Distribuir y esterilizar en autoclave a 118121C durante 15 minutos.
7.3 0.2

Siembra
Inocular directamente el material en estudio.
Incubacin
Las condiciones de temperatura, tiempo y atmsfera de incubacin, sern acuerdo al material a
estudiar.

Lcda. Rosmery Erroa, Ciclo I 2013

Resultados
Microorganismos

S. aureus ATCC 25923

S. epidermidis ATCC 14990
S. pyogenes ATCC 19615
S. pneumoniae ATCC 6305
S. pneumoniae ATCC 49619

Crecimiento
Bueno
Bueno
Bueno
Bueno
Bueno

Caractersticas del medio

Medio preparado: mbar claro.
Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10 35 C.
Medio preparado: a 2 8 C.
Cary Blair Medio de Transporte.
Medio recomendado para la recoleccin, transporte y conservacin de muestras aptas para estudios
microbiolgicos. Es especialmente til para la bsqueda de Vibrio spp. a partir de muestras fecales
y rectales.
Fundamento
El primer medio utilizado para el transporte de muestras para estudios microbiolgicos fue el medio
de Stuart. En 1964 Cary y Blair describieron un nuevo medio para el transporte de muestras
fecales. Tena un bajo contenido de nutrientes, un bajo potencial de oxidoreduccin y un alto pH.
En los estudios de Cary y cols., Salmonella y Shigella fueron recuperadas luego de 45 das de
inoculacin. Otros autores han demostrado la eficacia de ese medio de transporte para estudios
microbiolgicos en gastroenteritis. El medio de transporte Cary Blair, es semislido debido a la
baja concentracin de agar. Tiene un mnimo aporte de nutrientes que permite la recuperacin de
los microorganismos sin que haya replicacin. El tioglicolato de sodio se incluye para proveer un
bajo potencial redox; y el pH relativamente alto minimiza la destruccin bacteriana por
acidificacin.
Frmula (en gramos por litro)
Tioglicolato de sodio
1.5
Fosfato disdico
1.1
Cloruro de sodio
5.0

Agar

Lcda. Rosmery Erroa, Ciclo I 2013

Instrucciones
Suspender 12,6 g del polvo en 991 ml de
agua destilada.
Reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar.
Calentar agitando frecuentemente y hervir 1
minuto hasta disolver.
Enfriar a 50C y agregar 9 ml de una sol. de
CaCl2 al 1% preparada recientemente. Ajustar
5.0
el pH si es necesario.
Distribuir y esterilizar 15 minutos a vapor
fluente.
pH final: 8.4 0.2

Siembra
1-Utilizando un hisopo estril, recolectar la muestra segn la metodologa apropiada para ensayos
microbiolgicos.
2-Colocar el hisopo en el tercio superior del medio de cultivo. Si una parte de la varilla sobresale,
cortarla e inmediatamente tapar el tubo. Enviar lo ms pronto posible al laboratorio para su
procesamiento, dentro de las 4-6 horas de recolectada la muestra.
Incubacin
Mantener a temperatura ambiente durante su envo al laboratorio.
Resultados
Los tubos con medio de transporte se subcultivan en medios slidos apropiados segn la muestra y
el microorganismo que se quiera aislar. Luego de la incubacin, debe haber escasa o nula
reduccin de la viabilidad de los microorganismos.
Microorganismos

Crecimiento

S. flexneri ATCC 12022

Salmonella typhimurium ATCC 14028
Vibrio cholerae

+
+
+

Control Negativo

Resultado

Medio sin inocular

Sin cambio

Caractersticas del medio

Medio preparado: mbar claro. Puede presentar escasa opalescencia.
Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10 35 C.
Medio preparado: a 2 8 C.
Stuart Medio de Transporte
Medio destinado a la recoleccin, transporte y preservacin de muestras clnicas aptas para
exmenes bacteriolgicos. Es til para mantener la viabilidad de gonococos y de otros
microorganismos de difcil desarrollo.
Fundamento
Medio semislido, no nutritivo. Contiene tioglicolato de sodio, el cual provee un ambiente reducido
y es til para suprimir cambios oxidativos en el medio de transporte, y azul de metileno, que es el
indicador de oxido reduccin. De esta manera se favorece la viabilidad de los microorganismos
durante su envo al laboratorio. Cooper encontr que usando hisopos impregnados con carbn
bacteriolgico se recuperan en forma exitosa numerosos patgenos entricos y respiratorios.

Lcda. Rosmery Erroa, Ciclo I 2013

Frmula (en gramos por litro)

Tioglicolato de sodio
0.9
Glicerofosfato de sodio
10.0
Cloruro de calcio
0.1
Azul de metileno
0.002
Agar

3.0

Instrucciones
Suspender 14,1 g del polvo por litro de agua destilada.
Reposar 5 minutos. Calentar a ebullicin hasta disolucin
total.
Distribuir en tubos con cierre a rosca (para evitar
oxidacin) llenndolos hasta 2/3 del tubo.
Esterilizar 15 minutos a 121C.
Dejar solidificar en posicin vertical.
pH final: 7.4 0.2

Siembra
1. Utilizando un hisopo estril, recolectar la muestra segn la metodologa apropiada para
ensayos microbiolgicos.
2. Colocar el hisopo en el tercio superior del medio de cultivo. Si una parte de la varilla
sobresale, cortarla e inmediatamente tapar el tubo. Rotular, y enviar lo ms pronto posible
al laboratorio para su procesamiento, dentro de las 8 horas de recolectada la muestra. Se
recomienda que las muestras transportadas se cultiven sin demora luego de ser recibidas
en el laboratorio.
Incubacin
Mantener los hisopos a temperatura ambiente durante su envo al laboratorio.
Resultados
Los tubos con medio de transporte se subcultivan en medios slidos apropiados segn la muestra y
el microorganismo que se quiera aislar. Luego de la incubacin, debe haber escasa o nula
reduccin de la viabilidad de los microorganismos. Entre los microorganismos que han sido
transportados con escasa o nula reduccin de la viabilidad en el medio transporte de Stuart dentro
de un perodo de 8 horas figuran:
Microorganismos

Crecimiento

N. gonorrhoeae ATCC 49226

S. pneumoniae ATCC 6305
H. influenzae tipo B
S. pyogenes ATCC 19615

+
+
+
+

Control Negativo
Medio sin inocular

Resultado
Sin cambio

Los microorganismos ms resistentes pueden permanecer viables durante perodos mayores a 72

horas.
Caractersticas del medio
Medio preparado: ligeramente opalescente con tonalidad azul dependiendo del grado de oxidacin.
Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10 35 C.
Medio preparado: a 2 8 C.

Lcda. Rosmery Erroa, Ciclo I 2013

10