ACARA I

PEMBUATAN LARUTAN STOK, MEDIA KULTUR DAN STERILISASI

ALAT
A. Pendahuluan
1. Latar Belakang
Kultur jaringan merupakan salah satu metode perbanyakan
tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan terus berkembang dari
mengkulturkan biji berkembang dengan mengkulturkan jaringan dan terus
berkembang hingga mampu mengkulturkan satu sel dari tanaman.
Penggunaan kultur jaringan mempunyai kelebihan yaitu mampu
memproduksi bibit yang seragam dalam jumlah banyak dan dalam waktu
yang relatif singkat. Oleh karena itu kultur jaringan sering dijadikan
solusi sebagai metode perbanyakana tanaman dan juga dapat digunakan
sebagai

suatu

metode

penyimpanan

plasma

nutfah

yang tidak

membutuhkan tempat yang besar.

Pada metode kultur jaringan menghendaki kondisi yang aseptik,
sehingga alat dan media yang digunakan harus steril. Komposisi
formulasi dari suatu media, harus mengandung nutrient esensial makro
dan mikro serta sumber tenaga. Biasanya ditambah zat pengatur tumbuh,
seperti hormon-hormon dan zat penyangga seperti agar. Media merupakan
faktor penentu dalam perbanyak secara kultur jaringan. Media kultur
jaringan tanaman harus berisi semua zat yang diperlukan untuk menjamin
pertumbuhan eksplan yang ditanam. Media tersebut harus berisi garam
mineral berupa unsur makro dan mikro, gula, protein, vitamin dan
hormon.
Keberhasilan dari kultur jaringan sangat bergantung dari
ketepatan konsentrasi nutrisi yang berada di dalam media kultur.
Ketepatan konsentrasi ini menyangkut pada ketersediaan nutrisi bagi
eksplan tanaman. Kelebihan nutrisi dari tanaman akan menyebabkan
tanaman mengalami keracunan unsur hara. Oleh karena itu, pembuatan

larutan stock dan sterilisasi media dianggap penting untuk diketahui

sebagai sarana penenunjang kebutuhan informasi akan kultur jaringan.
2. Tujuan Praktikum
Praktikum acara I Pembuatan Larutan Stock, Media Kultur, dan
Sterilissi Alat mempunyai tujuan yaitu :
a. Mengetahui langkah-langkah dalam pembuatan larutan stock
b. Mengetahui langkah-langkah dalam pembuatan media kultur jaringan
c. Mengetahui prosedur sterilisasi alat-alat penanaman
B. Tinjauan Pustaka
Penggunaan larutan stok dalam pembuatan media akan mengurangi
jumlah perkejaan yang sifatnya berulang-ulang, sehingga kesalahan manusia
atau percobaan (human atau experimental error) dapat dikurangi. Selain itu,
penimbangan secara langsung dari bahan-bahan pembuat media, seperti hara
mikro dan ZPT, yang membutuhkan dalam jumlah yang sangat sedikit
(miligram atau mikrogram) pada formulasi akhir tidak akan diperoleh secara
akurat. Oleh karena itu sudah menjadi prosedur baku untuk komponenkomponen tersebut dibuat dalam larutan stok (Sriyanti 2002).
Pelaksanaan teknik kultur jaringan memerlukan berbagai prasyarat
untuk mendukung kehidupan jaringan yang dibiakkan. Yang paling esensial
adalah wadah dan media tumbuh yang steril. Media adalah tempat bagi
jaringan untuk tumbuh dan mengambil nutrisi yang mendukung kehidupan
jaringan. Media tumbuh menyediakan berbagai bahan yang diperlukan
jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya (Hendra 2007).
Media kultur merupakan salah satu komponen penting dalam
penanaman sel dan metode kultur jaringan. Aplikasi yang sukses dalam
prosedur kultur jaringan tanaman bergantung pada media kultur dengan
komposisi yang tepat. Medium hara untuk kultur jaringan tanaman
mengandung lima kelompok senyawa yaitu garam organik, sumber karbon,
vitamin, pengatur tumbuh, dan pelengkap organik. Media kultur yang
memenuhi syarat adalah media yang mengandung nutrien makro mikro dalam
kadar

dan

perbandingan

tertentu,

serta

sumber

energi

(umumnya

menggunakan sukrosa), serta mengandung satu atau dua macam vitamin dan
zat pengatur tumbuh (Evans et al 2003).
Sebagai syarat mutlak suksesnya kultur jaringan tanaman, biasanya
sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoklaf. Pada autoklaf yang
programmable (memiliki program yang dapat diatur), panas ini diatur secara
atomatis. Untuk media kultur jaringan (kuljar) yang tidak mengandung
bahan-bahan yang Heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf pada
temperatur 121C, tekanan antara 15-17.5 psi dengan waktu antara 20-25
menit tergantung dari volume wadah dan volume media. Untuk 15 ml media
dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 75ml, sterilisasi dilakukan
tekanan 15 psi dengan waktu 20 menit. Dalam sterilisasi aquadest dan media,
setelah waktu sterilisasi yang diinginkan sudah tercapai, autoklaf tidak boleh
diturunkan tekanannya secara mendadak. Bila tekanan diturunkan mendadak,
maka mengakibatkan cairan didalamnya mendidih dan meluap (Bubbled up).
Botol-botol/ tabung reaksi/ erlenmeyer yang dipergunakan sebagai wadah
kultur jaringan biasanya disterilisasi dalam autoklaf (Wattimena 2005).
Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur
jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman
yang akan diperbanyak. Media kultur yang baik seharusnya menyediakan
unsur hara baik makro maupun mikro, sumber vitamin dan asam amino,
sumber karbohidrat, zat pengatur tumbuh, senyawa organik sebagai tambahan
seperti air kelapa, ekstrak buah, dll. Bahan pemadat yaitu agar-agar, gelrite
dan juga menyediakan arang aktif untuk kasus tertentu untuk tanaman
(Mariska 2004).
Ada dua penggolongan media tumbuh: media padat dan media cair.
Media padat pada umumnya berupa padatan gel, seperti agar, dimana nutrisi
dicampurkan pada agar. Media cair adalah nutrisi yang dilarutkan di air.
Media cair dapat bersifat tenang atau dalam kondisi selalu bergerak,
tergantung kebutuhan. Komposisi media yang digunakan dalam kultur
jaringan dapat berbeda komposisinya. Perbedaan komposisi media dapat
mengakibatkan perbedaan pertumbuhan dan perkembangan eksplan yang

ditumbuhkan secara in vitro. Media Murashige dan Skoog (MS) sering

digunakan karena cukup memenuhi unsur hara makro, mikro dan vitamin
untuk pertumbuhan tanaman (Gale 2000).
Unsur hara makro dan mikro diberikan dalam bentuk garam-garam
anorganik. Pada umumnya biasa diberikan dalam komposisi tertentu seperti
komposisi media MS, WPM, B5, White, dan lain-lain tergantung dari jenis
tanaman yang akan dikulturkan. Vitamin yang banyak digunakan adalah
vitamin B12 (thiamin), Nicotinic Acid, vitamin B6 (pyridoxine), dan vitamin E
atau C yang digunakan sebagai antioksidan. Asam amino dipakai sebagai
sumber N organik, yang biasa digunakan adalah glycine, asparagin, glutanin,
alanin, dan threonin (Phang 2008).
C. Metode Praktikum
1. Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum acara I Pembuatan Larutan Stock, Media Kultur dan
Sterilisasi Alat dilaksanakan pada hari Kamis 2 April 2013, bertempat di
Laboratorium Fisiologi Tumbuhan dan Bioteknologi, Fakultas Pertanian
Universitas Sebelas Maret Surakarta.
2. Alat
a. Peralatan untuk penanaman eksplan, meliputi :
1) Laminar Air Flow Cabinet (LAFC), lengkap dengan lampu
bunsen yang berisi spirtus
2) Petridish
3) Botol-botol kultur
4) Pinset besar/kecil
5) Pisau pemes
6) Gunting eksplan
Alat-akat penanaman, yaitu petridish dan peralatan diseksi dibungkus
dengan kertas, kemudian disterilisasi di alam autoklaf pada tekanan
1,5 kg/cm2 selama 45 menit. Setelah disterilisasi, alat-alat tersebut
disimpan di dalam oven.

b. Peralatan untuk pembuatan madia, meliputi :

1) Timbangan analitik
2) Botol-botol kultur
3) Magnetik stirer
4) pH meter
5) Gelas piala
6) Pipet
7) Plastik pp 0,3 mm
8) Karet gelang
9) Kertas label
3. Bahan
a. Aquadest
b. Larutan stock, terdiri dari hara makro, hara mikro, vitmin, dan ZPT
c. Agar-agar
d. Gula
e. NaOH 1 N
f. HCl 1 N
4. Cara Kerja
a. Pembuatan larutan stock
1) Larutan stock media
a) Menimbang bahanbahan kimia yang telah dikalikan menjadi
beberapa kali konsentrasi, misalnya untuk unsur hara makro
dikalikan 20 dan unsur hara mikro dikalikan 100 kali
konsentrasi.
b) Melarutkan bahan-bahan kimia tersebut ke dalam aquadest
dengan volume tertentu, misalnya 500 ml.
c) Memasukkan masing-masing larutan ke dalam botol dan
menyimpannya ke dalam refigerator.

2) Larutan stock zat pengatur tumbuh

a) Menghitung kebutuhan bahan BAP 100 ppm sebanyak 300 ml
adalah sebagai berikut : 100 ppm = 100 mg/l
= 30 mg/0,1 l
= 30 mg/300 ml
b) Menghitung kebutuhan bahan IBA 100 pmm sebanyak 100 ml
adalah sebagai berikut: 100 ppm = 100 mg/l
= 10 mg/0,1 l
= 10 mg/100 ml
c) Melarutkan bahan dengan alkohol atau NaOH 1 N kemudian
ditambah dengan aquadest sampai 300 ml untuk BAP dan 100
ml untuk IBA
d) Memasukkan masing-masing larutan tersebut ke dalam botol
dan menyimpannya ke dalam refigerator
b. Pembuatan Media
1) Mengambil masing-masing larutan stok sesuai dengan ukuran
yang telah ditentukan dan memasukkannya kedalam gelas piala.
2) Mengambil larutan stok ZPT sesuai dengan perlakuan.
3) Menambah aquadest sampai 1000 ml dalam labu takar.
4) Menambah gula sebanyak 30 gr.
5) Mengatur pH dengan kisaran 5,6-6,3 dengan menambahkan
beberapa tetes NaOH untuk menaikkan pH atau HCl untuk
menurunkan pH. Pada saat pengukuran pH, larutan media diaduk
dengan magnetik stirer.
6) Menambahkan agar-agar 8 gr kemudian dididihkan.
7) Menuangkan larutan media ke dalam botol-botol kultur kurang
lebih 25 ml tiap botol.
8) Menutup botol berisi larutan media dengan plastik.
9) Memasukkan botol-botol berisi media ke dalam autoklaf untuk
proses sterilisasi pada tekanan 1,5 kg/cm2 selama 45 menit.

D. Hasil Pengamatan dan Pembahasan

1. Hasil Pengamatan
Tabel 1.1 Hasil Pengamatan Pembuatan Media Kultur
No Teknik Pembuatan Media
Gambar
1
Persiapan
alat
yang
telah
disterilisasi
dan
bahan-bahan
pembuatan media kultur
2

Pencampuran berbagai bahan-bahan

pembuatan media kultur

Pengukuran pH berkisar 5,8 6,3

Pemasakan media kultur setelah

dituangkan agar powder dan larutan
homogen.

Menuangkan larutan
dalam botol kultur

Menutup botol kultur dengan plastic

Sterilisasi botol kultur berisi media

ke dalam autoklaf

8.

Menyimpan media
penyimpanan media

Sumber : Laporan Sementara

media

pada

ke

rak

2. Pembahasan
Kultur in vitro merupakan suatu budidaya dalam botol. Salah satu
kegiatan dalam kultur in vitro adalah kultur jaringan yaitu budidaya in
vitro yang menggunakan jaringan sebagai bahan tanamnya. Kultur
jaringan tanaman adalah suatu upaya mengisolasi bagian-bagian tanaman,
kemudian dikulturkan pada nutrient buatan yang steril dibawah kondisi
lingkungan yang terkendali, sehingga bagian-bagian tersebut dapat
beregenerasi menjadi tanaman lengkap. Perbanyakan tanaman secara in
vitro memberikan keefektifan dalam perbanyakan perkecambahan dan
prosedur reproduksi dalam melindungi tanaman yang punah dan ketika
terjadi hambatan secara genetik.
Manfaat utama dari aplikasi kultur jaringan tanaman adalah
perbanyakan klon atau perbanyakan massal dari tanaman yang sifat
genetiknya identik satu sama lain. Di samping itu, teknik kultur jaringan
bermanfaat dalam beberapa hal khusus seperti perbanyakan klon secara
cepat, keseragaman genetik, kondisi aseptik, seleksi tanaman, stok
tanaman mikro, lingkungan terkendali, pelestarian plasma nutfah,
produksi tanaman sepanjang tahun, dan memperbanyak tanaman yang
sulit diperbanyak secara vegetatif.
Salah satu media yang sering digunakan dalam kultur jaringan
adalah media Murashige dan Skoog yang dikemukakan oleh Toshio
Murashige pada tahun 1962. Medium yang dikembangkan oleh
Murashige dan Skoog (MS) untuk kultur jaringan tanaman digunakan
secara luas untuk kultivasi kalus pada agar demikian juga kultur suspensi
sel dalam medium cair. Media Murashige dan Skoog yang dikenal dengan
nama MS mengandung 40 mM nitrogen dalam bentuk NO3 dan 29 mM
dalam bentuk NH4+. Kandungan N ini, lima kali lebih tinggi dari N total
yang terdapat pada media Miller, 15 kali lebih tinggi dari media tembakau
Hildebrant, dan 19 kali lebih tinggi dari media white (Zulkarnain 2009).
Pada umumnya komposisi utama media tanam kultur jaringan,
terdiri dari hormon (zat pengatur tumbuh) dan sejumlah unsur yang

biasanya terdapat di dalam tanah yang dikelompokkan ke dalam unsur

makro, unsur mikro. Hasil yang lebih baik akan dapat kita peroleh apabila
kedalam media tersebut, ditambahkan vitamin, asam amino, dan hormon,
bahan pemadat media (agar), glukosa dalam bentuk gula maupun sukrosa,
air destilata (akuades), dan bahan organik tambahan. Media yang sudah
jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yang
digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan
autoklaf. Pada praktikum kali ini media yang digunakan adalah media
Murashige dan Skoog (MS) yang dimodifikasi dengan penambahan ZPT
BAP 2 ppm dan IBA 0,5 ppm. Keistimewaan medium ini yaitu
kandungan nitrat, kalium dan amoniumnya yang tinggi.
Vitamin dibutuhkan untuk pertumbuhan dan pengembangan
untuk tanaman sintesis seperti karbohidrat dan asam nukleat. Agar dan
gula diperlukan untuk pembuatan media. Bubuk agar perlu untuk media
pembuatan menjadi semi padat. Diperlukan pemanas untuk mencairkan
bubuk agar dan media MS cair sampai mendidih. Gula berfungsi ganda di
dalam media yaitu berfungsi sebagai sumber energi dan sebagai
penyeimbang tekanan osmotik media. Dari 4/5 bagian potensial osmotik
dalam media White disebabkan oleh gula, sedangkan dalam media MS
hanya 1/2 dari potensial osmotiknya disebabkan adanya gula.
Dalam media kultur jaringan diperlukan penambahan zat pengatur
tumbuh untuk mendukung pertumbuhan eksplan. Salah satu zat pengatur
tumbuh yang sering digunakan adalah zat pengatur tumbuh yang berasal
dari kelompok sitokinin. Sitokinin berpengaruh terhadap inisiasi tunas.
Jenis sitokinin yang yang paling sering dipakai adalah 6-Benzyl Amino
Purine (BAP) karena efektivitasnya tinggi (Yusnita 2003).
Sterilisasi merupakan segala kegiatan dalam kultur jaringan harus
dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar air flow dan
menggunakan alat-alat yang steril pula. Sterilisasi juga dilakukan
terhadap peralatan, yaitu menggunakan alkohol yang disemprotkan secara
merata pada peralatan yang digunakan. Praktikan yang melakukan kultur

10

jaringan juga harus steril. Medium dan alat-alat yang digunakan terlebih
dahulu disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121C, tekanan 1,5 kg/cm2
selama 45 menit. Peralatan kultur disterilkan secara aseptik dengan
perendaman pada alkohol dan pembakaran pada setiap kali pemakaian.
Tujuan dari sterilisasi agar tidak terjadi atau meminimalisir terjadinya
kontaminasi. Media yang terkontaminasi kemungkinan disebabkan karena
kondisi laboratorium dan ruang pertumbuhan yang kurang steril serta
tabung kultur yang tidak steril. Kondisi laboratorium yang tidak pernah
dilakukan sterilisasi menggunakan kemungkinan juga mempengaruhi
proses pembiakan secara kultur jaringan.
Peralatan yang harus steril adalah LAFC, alat-alat diseksi, tabung
kultur dan lain-lain. Pada laminar sudah dilengkapi dengan blower, lampu
UV sehingga dapat mensterilkan ruangan dalam laminar. Akan tetapi
sebelum menggunakan laminar sebaiknya disemprot menggunakan
alkohol 70 %. Alat-alat diseksi juga perlu adanya sterilisasi, apabila alatalat tersebut tidak disterilisasi kemungkinan terjadinya kontaminasi akan
besar karena bekas-bekas eksplan ataupun media yang tersisa pada alatalat diseksi akan mejadi sumber kontaminan. Oleh karena itu alat-alat
diseksi juga perlu disterilisasi.
Media sangat baik pada pH 5,8 jika pH kurang dari 5 media agar
akan terlalu lemah, tetapi jika pH di atas 7 media agar terlalu padat dan
tidak bisa penanaman eksplan dengan baik. Faktor penting adalah pH
yang harus diatur sedemikian rupa sehingga tidak mengganggu fungsi
membran

sel

dan

pH

dari

sitoplasma.

Pengaturan

pH

selain

memperhatikan kepentingan fisiologi sel, juga harus mempertimbangkan

faktor-faktor yaitu sebagai berikut :
a. Kelarutan dari garam-garam penyusun media
b. Pengambilan (uptake) dari zat pengatur tumbuh dan garam-garam lain
c. Efisiensi pembekuan agar.

11

Menghindarkan perubahan pH yang cukup besar. Murashige dan

Skoog menyarankan agar dilakukan pemanasan untuk melarutkan agaragar dan memanaskan media di dalam autoklaf selama beberapa menit,
baru diadakan penetapan media disterilkan dalam autoklaf. Dalam wadah
yang besar, media disterilkan dan kemudian dititrasi dengan NaOH/HCl
steril sampai pH yang diinginkan. Setelah itu media dituang ke dalam
wadah kultur steril yang telah dipersiapkan di dalam Laminar Air Flow
cabinet. Keuntungan dari pemakaian agar adalah sebagai berikut :
a. Agar membeku pada temperatur 45oC dan mencair pada temperatur
100oC, sehingga dalam kisaran temperatur kultur, agar akan berada
dalam keadaan beku yang stabil.
b. Tidak dicerna oleh enzim yang dihasilkan oleh jaringan tanaman.
c. Tidak bereaksi dengan persenyawaan-persenyawaan penyusun media.
E. Kesimpulan dan Saran
1. Kesimpulan
Berdasarkan uraian diatas dapat ditarik kesimpulan sebagai
berikut:
a. Kultur jaringan tanaman adalah suatu upaya mengisolasi bagianbagian tanaman, kemudian dikulturkan pada nutrient buatan yang
steril dibawah kondisi lingkungan yang terkendali, sehingga bagianbagian tersebut dapat beregenerasi menjadi tanaman lengkap.
b. Manfaat utama dari aplikasi kultur jaringan tanaman adalah
perbanyakan klon atau perbanyakan massal dari tanaman yang sifat
genetiknya identik satu sama lain.
c. Medium yang dikembangkan oleh Murashige dan Skoog (MS) untuk
kultur jaringan tanaman digunakan secara luas untuk kultivasi kalus
pada agar demikian juga kultur suspensi sel dalam medium cair.
d. Sterilisasi merupakan segala kegiatan dalam kultur jaringan harus
dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar air flow dan
menggunakan alat-alat yang steril pula.

12

e. Media sangat baik pada pH 5,8 jika pH kurang dari 5 media agar akan
terlalu lemah, tetapi jika pH di atas 7 media agar terlalu padat dan
tidak bisa penanaman eksplan dengan baik.
2. Saran
Dalam pelaksanaan pembuatan media harus dilakukan dengan
hati-hati. Peralatan yang akan digunakan harus selalu dijaga kesterilannya
agar dapat terbebas dari mikrobia-mikrobia yang tidak diharapkan.
Praktikan yang melaksanakan praktikum harus selalu menjaga kebersihan
dan sterilitas alat dan media.

13

DAFTAR PUSTAKA
Evans, D. E., J.O.D. Coleman, and A. Kearns. 2003. Plant Cell Culture. Bios
Scientific Publisher. London. 194 p.
Gale, M. D. 2000. Genetic Variation for Hormonal Activity and Yield. Journal of
Agric 90 : 121-145.
Hendra, T. 2007. Kultur Jaringan. http://lelos66.blog.friendster.com.htm. Diakses
pada tanggal 6 Mei 2013.
Mariska, I., E. Sjamsudin, D. Soepandie, S. Hutami, A. Husni, M. Kosmiatin, A.
Vivi. 2004. Peningkatan Ketahanan Tanaman Kedelai terhadap
Aluminium Melalui Kultur In Vitro. J Litbang. Vol 23 (2) : 46-52.
Phang, T.H., G. Shao and H.M. Lam. 2008. Salt tolerance in Soybean. Journal of
Integrative Plant Biology. Vol 50 (10) : 1196-1212.
Sriyanti, Daisy P. dan Wijayani, A 2002. Teknik Kultur Jaringan : Pengenalan
dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif-Modern. Kanisius,
Yogyakarta.
Wattimena, G. A. 2005. Teknik Pembuatan Media Kultur Jaringan dan
Pentingnya Sterilisasi Media. Kanisius. Jakarta.
Yusnita. 2004. Kultur Jaringan : Cara Memperbanyak Tanaman Secara Efisien.
Agromedia Pustaka. Jakarta.
Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman, Solusi Perbanyakan Tanaman Budi
Daya. PT. Bumi Aksara : Jakarta