VIRUS, MQUINAS LETALES

MICROSCPICAS!
GEL DE PROTEINAS
Instructora: PhD. Daniela Silva
Ayala

Colaboradores:
Castillo Lpez Estrella Del Mar
Flores Guillermo
Lpez Bermdez Irma Daniela
Nez Tavares Vicente
Pacheco Arrona Luis Enrique
Prez Servn Irving
Ponce Roberto

 GEL DE PROTEINAS

INTRODUCCIN
Las protenas son molculas cuya carga neta depende del
contenido de una serie de aminocidos (fundamentalmente
cido glutmico, cido asprtico, lisina, arginina e histidina).
Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (PAGE). Se utiliza
mayoritariamente para la separacin de protenas, aunque
tambin puede ser til para cidos nucleicos. Los geles de
poliacrilamida son soportes restrictivos del tipo II, por lo que,
adems de evitar la conveccin y minimizar la difusin,
participan directamente en el proceso de separacin. Se
preparan de modo que sus poros sean de un tamao
comparable al de las protenas, de manera que produzcan un
efecto de tamizado molecular; la separacin electrofortica
depende entonces de la densidad de carga de las molculas y
de su tamao, por lo que dos protenas con idntica densidad
de carga, pero de tamao diferente pueden ser separadas, ya
que el soporte dificulta ms el avance de la de mayor tamao.
Son qumicamente inertes frente a las molculas biolgicas,
transparentes y estables en un amplio intervalo de valores de
pH, temperatura y fuerza inica; son tambin resistentes a
agentes desnaturalizantes (urea, detergentes), no presentan
efecto EEO y son mecnicamente estables, por lo que pueden
ser deshidratados y reducidos a una fina pelcula, lo que facilita
su almacenamiento.
OBJETIVO
Evaluar y cuantificar la cantidad y expresin de protenas
virales a distintos tiempos de infeccin.

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 GEL DE PROTEINAS

TCNICA
Se tienen muestras de clulas de rin de
mono MA104 en cajas petri hasta obtener
una confluencia en ellas con tripsina
durante 5 minutos.
Se
activa
el
virus
con
tripsina al 1% durante 1 hora. Se deja
incubando por 24 hrs.
Se le realiza un lavado con medio de
DMEM con una concentracin de
Penicillium (1000/ml) y Streptomicina
(100 ug/ml).
Posteriormente se retira el medio
para inocular el virus (450 ul) por
cuatro veces con intervalos de una
hora y se incubaron a 37C durante
12 horas aproximadamente.
Se retira el medio y se trasladan a
otras placas para dejar congelando a
-20C aproximadamente 20 min. Se
deja descongelar durante 5 minutos y
nuevamente se traslada al congelador otros 20 minutos ms.
Se vuelve a descongelar la solucin, los pozos con el
sobrenadante y se tom 30 ul y 10 ul de buffer betamercaptoetanol y se depositan en tubos eppendor.

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 GEL DE PROTEINAS

En los pozos de monocapa se realiza una preparacin de 60 ul

PBS ms 180 ul de buffer beta-mercaptoetanol, y se aade
inicialmente a cada pozo 40 ul de solucin (no fue suficiente as
que se agregaron 55 ul ms), de cada pozo se tom toda la
muestra para colocarlos a sus respectivos tubos eppendor
previamente etiquetados.
Y se deja a bao mara durante 10 minutos. Tomamos 10
muestras que se introdujeron a un carril de electroforesis
respectivamente durante 1 hora a 130 volts constante, se retira
el gel y se deja en una caja petri con azul de comasir durante
10 minutos. Se extrae el gel y se coloca en una caja petri con
metanol y cido actico, acelerando el desteimiento en la
microondas por 2 minutos 30 segundos y se colocaron papeles
absorbentes en la caja donde se encontraba el gel,
posteriormente se llev dicho gel a un escner de fluorescencia.

RESULTADOS

Los resultados fueron los esperados ya que encontramos un

acumulamiento de protenas virales dentro de nuestro espacio
intracelular a medida que la infeccin avanzaba.

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 GEL DE PROTEINAS

REFERENCIAS
Cultek, (2006). Soluciones Electroforesis. 1st ed. [ebook] pp.1-2. Available
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-Electroforesis-protocolos.pdf
[Accessed 9 Aug. 2016].

at:

INMUNOPEROXIDASA
Se tienen muestras de clulas de rin de mono MA104 en cajas petri
hasta obtener un confluencia en ellas con tripsina durante 5 minutos,
posteriormente se activa el virus con tripsina al 1% durante 1 hora. Se
deja incubando por 24 hrs. Una vez incubadas las clulas se hizo un
lavado con medio de DMEM, posteriormente se retir el medio para
inocular con el virus realizando diluciones seriadas y se incuba durante 1
hora

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 GEL DE PROTEINAS

Retirar el virus y agregar 100 ul de medio y se incuba a 37C

aproximadamente 12 horas.
Se realiza una solucin de acetona al 80% para posteriormente retirar el
medio y agregar 50 ul de acetona por 30 minutos, despus se realizan dos
lavados de 5 minutos cada uno con 50 ul de PBS y se agrega 100 ul de
solucin de anticuerpo primario (Anti TPL) diluido en PBS 20 ml de PBS y
20 ul de Anti TPL) y despus incubar durante 1 hora a 37C.
Se retira la solucin de PBS y el Anti TPL y se realizan 3 lavados de 5
minutos con 50 ul de PBS.
Se realiza una disolucin de 6ml de PBS cloruro de amonio y 12 ml de
Anticuerpo secundario. Se agrega 50 ul a cada pozo y se incuba a 37C
durante 1 hora, posteriormente se realizan dos lavados con PBS con
intervalos de 5 minutos.
Y se llevan a un escner de fluorescencia y se escanearon.

RESULTADOS
No se obtuvieron resultados positivos ya que la fluorescencia de la caja
donde se encontraban las muestras era ms fuerte que la seal que
emitan las muestras.

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