SZKOA WIOSENNA 2005: GENETYCZNE PODSTAWY CHORB NEURODEGENERACYJNYCH (11-03-2005)

PROTEAZY ASPARTYLOWE W CHOROBIE ALZHEIMERA

Barbara NAWROT*
Centrum Bada Molekularnych i Makromolekularnych PAN, d

Choroba Alzheimera (Alzheimers disease, AD) to zesp zaburze neurodegeneracyjnych

mzgu prowadzcy do demencji. Schorzenie to statystycznie dotyka co dziewit osob po 80tym roku ycia, a wedug ocen ekspertw do roku 2025 na caym wiecie bdzie 22 mln
chorych.1 Problem jest tym bardziej istotny, e stale powiksza si liczba ludnoci na Ziemi i
wydua si redni czas ycia czowieka. Konsekwencj jest wzrost populacji ludzi starych - a
podeszy wiek stanowi najwikszy czynnik ryzyka wystpienia tej choroby.
AD towarzysz patologiczne zmiany w mzgu, prowadzce do neurodegeneracji i powstania
tzw. splotw neurofibrylarnych (ang. neurofibrillary tangles, NFT) oraz pytek starczych
(ang. senile plaques). Sploty NFT utworzone s z prawo- lub lewoskrtnych, podwjnych,
helikalnych filamentw (ang. paired helical filaments, PHF), skadajcych si z ubikwityny,
triady biaek neurofilamentw, peptydw beta-amyloidowych oraz hiperfosforylowanego biaka
tau, nalecego do tzw. biaek MAP (ang. microtubule-associated proteins).2 Pytki starcze,
zwane te

blaszkami lub zogami amyloidowymi, posiadaj

rdze

zbudowany z -

amyloidu, dystroficznych neurytw oraz komrek astro- i mikrogleju. Generalnie, nazwa amyloid okrela grup peptydw i biaek, zwykle glikozylowanych, charakteryzujcych si
wsplnym motywem strukturalnym, zawierajcym struktury -fadowe rwnolege albo
prostopade do osi wkien. Blaszki amyloidowe maj szkodliwy wpyw na neurony, powodujc
ich uszkodzenie na drodze niewyjanionych do dzi mechanizmw. Uwaa si, e na skutek
akumulacji blaszek amyloidowych zostaje zaburzona rwnowaga jonowa w komrkach
nerwowych, co prowadzi m.in. do uszkodzenia przewodzenia sygnau nerwowego i zmienionej
aktywnoci kanaw wapniowych w synapsach. Zogi -amyloidu mog te powodowa
uszkodzenia mitochondriw oraz uwalnianie wolnych rodnikw. Efektem tych procesw jest
niszczenie i obumieranie komrek nerwowych. Procesy degradacji pogbia reakcja zapalna
organizmu wywoana przez obecne w mzgu komrki mikrogleju i astrocyty.3
Molekularne podoe choroby Alzheimera (formy rodzinnej) zwizane jest z mutacjami w
trzech genach. Pierwszym z nich jest gen APP (ang. Amyloid Precursor Protein), znajdujcy si

*Adres korespondencyjny : Doc. dr hab. Barbara nawrot, Centrum Bada Molekularnych i Makromolekularnych
PAN, Zakad Chemii Bioorganicznej, Sienkiewicza 112, 90-363 d
e-mail: bnawrot@bio.cbmm.lodz.pl

SZKOA WIOSENNA 2005: GENETYCZNE PODSTAWY CHORB NEURODEGENERACYJNYCH (11-03-2005)

na chromosomie 21, kodujcy biako prekursorowe amyloidu. W wyniku kilku moliwych drg
skadania (ang. alternative splicing) mRNA biaka APP tworzce si matryce translacyjne
zawieraj od 16 do 18 eksonw. Fragmenty eksonw 16 i 17 koduj sekwencj -amyloidu. APP
jest biakiem transbonowym obecnym w wikszoci organelli komrkowych. Jedna z drg jego
proteolizy prowadzi do powstawania szkodliwego -amyloidu, gromadzcego si w pytkach
starczych. Mutacje w genie APP s odpowiedzialne za niewielki odsetek rodzinnych postaci AD
o pnym pocztku.
Wczesne otpienie starcze (<40 roku ycia) obserwowane u osb z zespoem Downa,
ktrego przyczyn jest trisomia chromosomu 21, spowodowane jest nadmiern ekspresj tego
biaka. Wikszo rodzin obcionych AD o wczesnym pocztku (<30 roku ycia) jest
nosicielami mutacji w dwch kolejnych genach, presenilinie 1 i presenilinie 2 (PS1 i PS2). Do
chwili obecnej zidentyfikowano ponad 100 rnych mutacji w genach PS1 i PS2. Pod koniec lat
dziewidziesitych w genie PS1 wykryto pierwsz mutacj nazywan polsk.4 Ostatnie badania
dotyczce wpywu mutacji w genach presenilin odpowiedzialnych za wczesne przypadki AD
doprowadziy do wykrycia dwch nowych mutacji polskich w genie PS1 oraz jednej w genie
PS2.5 Preseniliny s duymi biakami obecnymi w bonach siateczki rdplazmatycznej i aparatu
Golgiego. Zaangaowane s w transport transbonowy oraz w hydroliz biaka APP (jako
skadniki sekretazy).
Ze sporadycznymi lub pnymi przypadkami rodzinnej choroby Alzheimera wie si
polimorfizm genu apolipoproteiny (ApoE), ktrego locus znajduje si na chromosomie 19.
Stwierdzono, e czsto wystpowania allelu apoE4 (4) u pacjentw ze sporadyczn form
AD jest znacznie wysza, ni u pacjentw z dziedziczn chorob AD. Stwierdzono, e izoforma
biaka ApoE4 (4) moe stanowi patologiczny chaperon wspomagajcy tworzenie
trzeciorzdowej struktury -amyloidu, uczestniczcego w formowaniu zogw amyloidowych
(przewaga struktury -fadowej nad -helikaln). Druga hipoteza zakada, e -amyloid stanowi
dla biaka 4 tzw. escort protein, tzn. jest fenotypowym markerem pierwotnej roli 4.
Kolejnym genem ryzyka, wywierajcym wpyw na rozwj AD, jest gen kodujcy enzym
zaliczany do metaloendopeptydaz rozkadajcych insulin (ang. insulin-degrading enzyme,
IDE) oraz inne mae peptydy. Biako IDE bierze udzia w degradacji -amyloidu wydzielanego
do przestrzeni midzykomrkowej. Zaburzenia rwnowagi tworzenia -amyloidu i jego
usuwania na drodze degradacji s czynnikiem ryzyka wystpienia AD.
W patogenezie choroby Alzheimera gwn rol odgrywa biako prekursorowe betaamyloidu APP. Proteoliza biaka APP zachodzi na jednej z dwch moliwych drg (wedug
schematu na rysunku).
10

SZKOA WIOSENNA 2005: GENETYCZNE PODSTAWY CHORB NEURODEGENERACYJNYCH (11-03-2005)

Na
drodze
nieamyloidogennej
proteoliza zachodzi za pomoc - i sekretazy,
za
na
drodze
amyloidogennej udzia bior - i sekretaza.
W pierwszej z tych drg sekretaza
hydrolizuje acuch polipeptydowy
APP pomidzy Lys687 i Leu688, w
wyniku czego powstaje rozpuszczalny peptyd -APPs, oraz zwizany
z bon peptyd C83 o masie 9-10
kDa. Peptyd C83 jest dalej
rdbonowo hydrolizowany przez sekretaz dajc nietoksyczne peptydy
P3 i P7 (CTF). Jest to droga
dominujca; 90 % biaka prekursorowego beta-amyloidu jest hydrolizowane przez -sekretaz.
Na drodze amyloidogennej biako APP hydrolizowane jest za pomoc sekretazy
pomidzy aminokwasami Met671 i Asp672. Produktem tej hydrolizy jest rozpuszczalne biako
-APPs, oraz zakotwiczony w bonie peptyd C99 o masie 11-12 kDa. Ten ostatni jest dalej
hydrolizowany za pomoc sekretazy , dajc w efekcie peptyd -amyloidowy o masie ~4 kDa
oraz produkt CTF.
Czsteczki A s w wikszoci peptydami o dugoci 39 i 40 aminokwasw (A39, A40),
ale powstaje take pewna pula peptydu zawierajcego 42 aminokwasy (A42). A42 jest
bardziej hydrofobowy ni krtsze peptydy, co determinuje jego wiksze zdolnoci do tworzenia
agregatw (zogw) - gwnych skadnikw pytek starczych.
Powizanie przyczyn AD z proteoliz APP pozwolio na pocztku lat dziewidziesitych
sformuowa hipotez kaskady amyloidowej,6,7 wedug ktrej zogi amyloidowe powstajce w
mzgu powoduj najwczeniejsze i krytyczne zmiany istotne dla rozwoju choroby Alzheimera.
Kilka lat pniej sformuowano hipotez starzenia si biaek w AD,8 wedug ktrej peptyd A
odgrywa gwn rol w genezie AD, jednak o jego toksycznoci decyduj zmiany
konformacyjne

zachodzce

w acuchu

(spontaniczna,

chemiczna

modyfikacja

reszt

asparaginianowych zachodzca w rozpuszczalnej formie A). Zatem wedug obu hipotez

obecno beta-amyloidu ma decydujcy wpyw na rozwj AD.

11

SZKOA WIOSENNA 2005: GENETYCZNE PODSTAWY CHORB NEURODEGENERACYJNYCH (11-03-2005)

Charakterystyka proteaz biaka APP

Proteoliza biaka APP na drodze nieamyloidogennej zachodzi pod wpywem - i sekretazy. -Sekretaza jest metaloproteinaz dezintegryny zalen od jonw cynku. Jest to
najprawdopodobniej biako TACE [ADAM17 lub ADAM10]. Aktywno proteolityczna tego
enzymu znacznie wzrasta w obecnoci aktywatorw kinazy biakowej C (PKC), takich jak estry
forbolu. Aktywacja receptorw PKC moe prowadzi do zwikszenia stopnia hydrolizy APP w
miejscu i obnienia proteolizy w miejscu . Badania przeprowadzone na myszach
pozbawionych genu TACE wykazay cakowity zanik aktywnoci -sekretazy w proteolitycznej
hydrolizie biaka APP. Tak genetycznie zmienione myszy nie doyway narodzin, co
wskazywaoby na istotn rol biaka TACE w metabolizmie komrki i, co bardziej istotne, e
TACE nie moe stanowi terapeutycznego celu w projektowaniu lekw przeciwko AD.
-Sekretaza jest to transbonowy kompleks biakowy o aktywnoci proteazy aspartylowej,
katalizujcy proteoliz biaka APP wewntrz bony reticulum endoplazmatycznego (ER) i
aparatu Golgiego. Kompleks ten skada si z heterodimerw presenilin 1 i 2 (PS1 i PS2),
odpowiedzialnych za aktywno proteolityczn APP, glikozylowanej formy nikastryny (ang.
nicastrin, NCT), biorcej udzia w tworzeniu aktywnego kompleksu, oraz biaek Aph-1a/Aph-1b
i Pen-2, ktre prawdopodobnie stabilizuj cay kompleks i bior udzia w tworzeniu aktywnej
formy presenilin (heterodimerw).9
Biaka PS1 i PS2 maj bardzo zblion topologi; przecinaj wielokrotnie bon
komrkow. Posiadaj 8 domen transmembranowych poczonych ptlami wystajcymi do
przestrzeni wewntrz- i zewntrzkomrkowej. Preseniliny s proteazami katalizujcymi reakcj
wewntrz bon (I-CliPs, ang. intramembrane-cleaving proteases).10 Prowadz proteoliz kilku
rnych biaek transbonowych: APP, receptora Notch, receptora Erb-B4 i E-kadheryny.11
Fragment CTF biaka PS1 tworzy kompleksy z kalsenilinami oraz -kateninami. Kalseniliny s
neuronalnymi biakami wicymi jony wapnia, degradowanymi przez kaspazy. Obnienie
poziomu kalsenilin moe prowadzi do zaburze transdukcji sygnau z udziaem jonw Ca2+.
Mnogo funkcji jakie speniaj preseniliny raczej wyklucza zastosowanie skutecznego
inhibitora aktywnoci -sekretazy zwizku o potencjalnych waciwociach terapeutycznych nie wywoujcego skutkw ubocznych.
W 1999 r. metodami biologii molekularnej zidentyfikowano gen biaka o aktywnoci sekretazy. -Sekretaza jest proteaz aspartylow Asp 2, zwan take biakiem BACE1 (ang.

-site APP Cleaving Enzyme) lub memapsyn 2.12 Biako to wykazuje okoo 30 % homologi z
biakami rodziny pepsyn. Zidentyfikowano take biako BACE2 (memapsyna 1, Asp1)
posiadajce 64 % homologi z biakiem BACE (nazywanym teraz BACE1). Oba te biaka
12

SZKOA WIOSENNA 2005: GENETYCZNE PODSTAWY CHORB NEURODEGENERACYJNYCH (11-03-2005)

stanowi now grup transbonowych proteaz aspartylowych13. Wiadomo ju, e biako BACE2
w przeciwiestwie do biaka BACE1 nie odgrywa zasadniczej roli w procesie generowania amyloidu. Drzewo rodziny proteaz aspartylowych pokazane jest na schemacie.

Biako BACE jest przede wszystkim obecne w bonach otaczajcych takie organelle jak
aparat Golgiego czy endosomy, ale moe by zlokalizowane take w bonie cytoplazmatycznej.
BACE skada si z 501 aminokwasw; na N-kocu znajduje si 21 aminokwasowy peptyd
sygnaowy oraz pomidzy aminokwasami 22-45 sekwencja propeptydu. W wietle organelli
komrkowych pozostaje region pomidzy aminokwasami 46 i 460. Bliej C-koca
zlokalizowana jest domena transbonowa, utrzymujca biako w membranie (pomidzy
aminokwasami 461-478), za ktr pozostaje 24-aminokwasowy ogon cytoplazmatyczny. W
obrbie regionu pozostajcego w wietle organelli BACE posiada dwa miejsca aktywne, zawarte
w sekwencjach aminokwasowych 93-96 i 289-292. Regiony te zawieraj aminokwasy o silnie
konserwatywnej sekwencji charakterystycznej dla proteaz aspartylowych: kwas asparaginowy,
glicyn i seryn lub treonin.
BACE charakteryzuje si waciwociami typowymi dla biaek z rodziny proteaz
aspartylowych. Proteazy te hydrolizuj wizanie peptydowe z wykorzystaniem dwch reszt
asparaginianu, przy czym jedna z nich musi by zjonizowana. Kwasowo-zasadowa funkcja
katalityczna reszt Asp polega na tym, e aktywuj one znajdujc si midzy nimi czsteczk
wody i dziaaj jak akceptory i donory protonw. Schemat reakcji katalizowanej przez t rodzin
proteaz aspartylowych przedstawiony jest poniej.

13

SZKOA WIOSENNA 2005: GENETYCZNE PODSTAWY CHORB NEURODEGENERACYJNYCH (11-03-2005)

Udane prby wykrystalizowania biaka BACE w kompleksie z inhibitorem peptydowym

OM99-214 pozwoliy ustali struktur tego biaka. Poznanie sekwencji genu oraz struktury
trzeciorzdowej -sekretazy znacznie uatwio poszukiwania inhibitorw tego biaka. Z drugiej
strony wykazano, e myszy pozbawione genu BACE (BACE knock-out) nie wykazyway
aktywnoci -sekretazy i nie produkoway A.15 Transgeniczne myszy przeyway, byy podne
i nie wykazyway defektw rozwojowych.
Wyniki powyszych bada sugeruj bezpieczestwo terapii, majcych na celu obnienie
aktywnoci -sekretazy, a wic wskazuj, e -sekretaza moe by dobrym celem
terapeutycznym.
Wiele grup badawczych, szczeglnie z amerykaskich firm farmaceutycznych prowadzi
poszukiwania nowych lekw zapobiegajcych bd leczcych chorob Alzheimera w grupie
inhibitorw

hamujcych

aktywno

-sekretazy.

Poszukiwania

inhibitorw

BACE

prowadzone s w obrbie peptydowych analogw substratu, tj. peptydomimetykw o sekwencji

homologicznej do sekwencji biaka APP, rozpoznawanej przez -sekretaz. Jednym z nich jest
inhibitor OM99-2, o sekwencji Glu-Val-Asn-(Leu-Ala)-Ala-Glu-Phe. Inhibitor ten cakowicie
hamuje aktywno -sekretazy (IC50 = 2,0 nM). Jego due powinowactwo do BACE pozwolio
na krystalizacj i rozwizanie struktury biaka z rozdzielczoci 1,9 .

Istniej jednak pewne ograniczenia w uzyskaniu skutecznego inhibitora biaka BACE.

Dotychczas wytworzone niskoczsteczkowe inhibitory -sekretazy nie wykazuj koniecznych
waciwoci leku, chociaby dlatego, e nie przekraczaj bariery krew-mzg (ang. blood-brain
barrier, BBB), oraz s inhibitorami innych proteaz aspartylowych takich jak katepsyna D,
koniecznych dla prawidowego funkcjonowania komrki. Dlatego te problem znalezienia
dobrego inhibitora biaka BACE, speniajcego wymagania stawiane lekom, jest wci otwarty.
Zaprezentowane powyej podejcie opiera si na poszukiwaniach niskoczsteczkowych
inhibitorw biaek blokujcych niepodan aktywno (poprzez tworzenie funkcjonalnie
nieaktywnych kompleksw biako / lek).

14

SZKOA WIOSENNA 2005: GENETYCZNE PODSTAWY CHORB NEURODEGENERACYJNYCH (11-03-2005)

Aktywno biaka moe by take obniona bd zniesiona poprzez ograniczenie

ekspresji jego genu. Od ponad 25 lat rozwijane s rnego rodzaju podejcia zmierzajce do
wykorzystania fragmentw kwasw nukleinowych, zarwno syntetycznych jak i wytwarzanych
wewntrzkomrkowo, do sekwencyjnie specyficznego hamowania ekspresji genw na poziomie
potranskrypcyjnym. Wrd nich najwiksze znaczenie maj:
1. Terapia antygenowa (ang. antigene) wykorzystuje oligonukleotydy TFO (ang. triplex
forming oligonucleotides) do hybrydyzacji z dwuniciowym DNA i utworzenia trwaego
trypleksu hamujcego proces transkrypcji.
2. Terapia antysensowa (ang. antisense) polega na tworzeniu komplementarnych
dupleksw antysensowy DNA / mRNA i aktywacji RNazy H degradujcej RNA w takich
kompleksach. Konsekwencj jest inhibicja ekspresji genu na etapie translacji.
3. Efekt niszczenia matrycy translacyjnej mona osign wykorzystujc rybozymy i
deoksyrybozymy. Czsteczki te rozpoznaj komplementarn sekwencj substratu w
sposb analogiczny do oligonukleotydw antysensowych i degraduj mRNA poprzez
katalityczn hydroliz lub trans-estryfikacj wizania internukleotydowego.
4. Najnowsz, bardzo atrakcyjn strategi terapeutyczn wyciszania ekspresji genw na
etapie potranskrypcyjnym jest wykorzystanie zjawiska interferencji RNA. Syntetyczne
dupleksy RNA (ang. short interfering RNA, siRNA) podawane do komrek ssaczych
wywouj efekt wyciszania genu komplementarnego do antysensowej nici siRNA. W
procesie tym bierze udzia kompleks biakowy RISC zawierajcy zarwno helikazy RNA
jak i rybonukleazy.
Strategie hamowania ekspresji genw i aktywnoci niepodanych biaek za pomoc
syntetycznych oligonukleotydw, fragmentw DNA i RNA pokazane s na rysunku poniej.

Oligomery CpGimmunostymulacja
aptamery

miRNA-regulacja
translacji

15

SZKOA WIOSENNA 2005: GENETYCZNE PODSTAWY CHORB NEURODEGENERACYJNYCH (11-03-2005)

Znajomo sekwencji kodujcej -sekretazy otworzya take moliwoci wykorzystania

dostpnych strategii terapeutycznych do hamowania ekspresji tego biaka. W Zakadzie Chemii
Bioorganicznej CBMiM PAN w odzi prowadzone s badania nad inhibitorowymi kwasami
nukleinowymi, skierowanymi na gen -sekretazy. W ostatnim czasie uzyskano analogi kwasw
nukleinowych, ktre, podane do ludzkich komrek embrionalnych nerki (ang. human embryonal
kidney cells) HEK293 lub ludzkich komrek neuroblastomy SH-SY5Y, wywouj zahamowanie
ekspresji genu biaka BACE i w konsekwencji obniaj ilo wydzielanego pozakomrkowo
peptydu beta-amyloidowego.12,16,17,18 Zwizki te s testowane jako potencjalne czynniki antyamyloidowe o waciwociach terapeutycznych.
Badania realizowane s w ramach grantu zamawianego PBZ-KBN /059/T09/09.
Pimiennictwo
1. www.alzforum.org
2. Liberski PP. Biologia molekularna chorb neurozwyrodnieniowych czowieka. XVII Zimowa
Szkoa Instytutu Farmakologii PAN Genetyka Molekularna Chorb Ukadu Nerwowego
Mogilany 2001, 63-84.
3. St George-Hyslop P. H., Otpienna ukadanka. wiat Nauki (Scientific American), 2001, 2, 56-63
4. Wisniewski Th., Dowjat W. K., Buxbaum J.D., Khorkova O., Efthimiopoulos S., Kulczucki J.,
Lojkowska W., Wegiel J., Wisniewski H. M., Frangione B.: A novel Polish presenilin-1 mutation
(P117L) is associated with familial Alzheimers disease and leads to death as early as the age of
28 years. NeuroReport, 1998, 9, 217-221
5. ekanowski C., Styczyska M., Peposka B., Gabryelewicz T., Religa D., Ilkowski J.,
Kijanowska-Haadyna B., Kotapka-Minc S., Mikkelsen S., Pfeffer A., Barczak A., uczywek E.,
czkowski J., Sobw T., Kunicki J., Barcikowska M., 2003, Mutations in presenilin 1,
presenilin 2 and amyloid precursor protein genes in patients with early-onset Alzheimers disease
in Poland, Exp. Neurol., 184, 991-996
6. Selkoe D.J., The molecular pathology of Alzheimers disease. Neuron, 1991, 6, 487-498
7. Hardy J., Allslop D. 1991, Amyloid deposition as the central event in the etiology of Alzheimers
disease. Trends Pharmacol Sci, 12, 383-388
8. Orpiszewski J., Schorman N., Kluve-Beckerman B., Liepnieks J. J., Benson M. D.: Protein aging
hypothesis of Alzheimer disease, FASEB J., 2000, 14, 1255-1263
9. LaVoie M.J., Fraering P.C., Ostaszewski B.L., Ye W., Kimberly W.T., Wolfe M.S., Selkoe D.J,
Assembly of the gamma-secretase complex involves early formation of an intermediate subcomplex of Aph-1 and Nicastrin. J. Biol Chem. 2003 Jul 11, 10.1074/jbc.M303941200
10. Wolfe M.S., Selkoe D.J., intramembrane Proteases Mixing oil and Water. Science, 2002, 296,
2156-2157
11. De Strooper B., Annaert W., Cupers P., Saftig P., Craessaerts K., Mumm J.S., Schroeter E.H.,
Schrijvers V., Wolfe M.S., Ray W.J., Goate A., Kopan R., A presenilin-1-dependent gammasecretase-like protease mediates release of Notch intracellular domain. Nature, 1999, 398, 518522
12. Nawrot B.: Targeting BACE with small inhibitory nucleic acids a future for Alzheimers
disease therapy? Acta Biochim. Pol. 2004, 51 (2), 431-444.
13. Citron M., -secretase As a Target for the Treatment of Alzheimers Disease. J. Neurosci. Res.,
2002, 70, 373-379 .

16

SZKOA WIOSENNA 2005: GENETYCZNE PODSTAWY CHORB NEURODEGENERACYJNYCH (11-03-2005)

14. Hong L., Koelsch G., Lin X., Wu S., Terzyan S., Ghosh A.K., Zhang X.C., Tang J., Structure of
the protease domain of memapsin 2 (beta-secretase) complexed with inhibitor. Science, 2000,
290, 150-153
15. Roberds S.L., et al., BACE knock-out mice are healthy despite lacking the primary beta-secretase
activity in brain. Implications for Alzheimers disease therapeutics. Hum. Mol. Genet., 2001, 10,
1317-1324
16. B. Nawrot, S. Antoszczyk, M. Maszewska, G. Rebowski, T. Kuwabara, M. Warashina, K.Taira,
W.J. Stec: Modulation of beta-Secretase Gene Expression by Action of Catalytic Nucleic Acids
Nucleic Acids Res. Suppl. No 2, 2002, 105-106.
17. Nawrot B., Antoszczyk S., Maszewska M., Kuwabara T., Warashina M., Taira K., Stec W.J.:
Efficient Inhibition of -Secretase (BACE) Gene Expression in HEK293T Cells by
tRNAVal/CTE-Driven Hammerhead Ribozymes. Eur. J. Biochem. 2003, 270, 3962-3970.

18. Nawrot B., Sipa K., Sierant M., Maszewska M., Taira K., BACE-directed silencing
efficiency of siRNA expressed under tRNAVal promoter. Annals of the Polish Chemical
Society, 2004, 625-628.

17