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UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DEL

USUMACINTA

DIVISIN:
Procesos alimentarios, biotecnolgicos y paramdico.

CARRERA:
TSU-Qumica rea Biotecnologa.

ASIGNATURA:
Biologa Molecular II

UNIDAD:
Marcadores Genticos

REPORTE DE PRCTICA

ALUMNOS:
Nicols Bernab Reyes Peralta.

MAESTRO:
M.C. Manuela del Jess Cambranes Chi

5to CUATRIMESTRE

Emiliano Zapata, Tabasco


15-Marzo-2015

INTRODUCCIN
La extraccin de ADN requiere una serie de etapas bsicas en primer lugar tienen
que romperse la membrana plasmtica de la clula eucariota para poder acceder
al ncleo de la clula. En el caso de los vegetales tambin habr que romper la
pared celular. A continuacin debe romperse tambin la membrana nuclear para
dejar libre el ADN. Por ltimo hay que proteger el ADN de enzimas que puedan
degradarlo y para aislarlo hay que hacer que precipite en alcohol.
La extraccin consiste en el aislamiento y purificacin de molculas de ADN y se
basa en las caractersticas fisicoqumicas de la molcula. El ADN est constituido
por dos cadenas de nucletidos unidas entre s formando una doble hlice. Los
nucletidos estn integrados por un azcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una
base nitrogenada (adenina, guanina, timina o citosina). La unin de los nucletidos
ocurre entre el grupo fosfato y el azcar, mediante enlaces fosfodister, dando
lugar al esqueleto de la molcula. Las bases de cadenas opuestas se unen
mediante puentes de hidrgeno y mantienen estable la estructura helicoida.
A lo largo del tiempo se han diseado distintos protocolos con la finalidad de
obtener una cantidad y calidad de ADN adecuados, as como garantizar la
eliminacin de inhibidores potenciales que dificulten el tratamiento posterior de la
molcula. Los mtodos tradicionales, desarrollados en los aos 50, utilizan
solventes orgnicos para separar a las protenas del ADN y, una vez suspendido
en la fase acuosa, aislarlo por precipitacin con etanol. Estos mtodos requieren
preparar soluciones y la extraccin puede tomar desde unas horas hasta varios
das por los numerosos pasos que deben realizarse. En general, los protocolos
tradicionales consisten de cinco etapas principales: homogeneizacin del tejido,
lisis celular, separacin de protenas y lpidos, precipitacin y redisolucin del
ADN.
OBJETIVO
Que el alumno realice la extraccin correcta del ADN para su posterior lectura.

MATERIALES
Para realizar la prctica se necesitaron los siguientes materiales, reactivos y
equipos.
Reactivos
Buffer
de
CTAB
Cloroformo

Equipos
extraccin Bao Mara
Centrifuga

Alcohol isoamlico
Isoprapanol
Etanol 80%

Uv-visible

H2O MQ
Agarosa
Agua destilada (esteril)

Materiales
Tubo falcon
Puntillas
amarillas,
azules
y
blancas
(estriles)
Micropipeta
Tubo eppendorf
Mortero
con
pistilo
(esteril)
Varilla de vidrio
Hoja de maguey

METODOLOGA DE EXTRACCIN DEL ADN


En la realizacin para la extraccin de ADN e sigui con la siguiente metodologa.
Extraccin de ADN, vegetal
1. Precalentar un volumen de CTAB buffer de extraccin: 3% p/v CTAB. 1.4 M
NaCl, 0.2 % v/v 2 mercaptoenol, 20 Mm EDTA, 100 Mm TRIS-HCL (pH 8)
en un tubo falcon a 60 en bao-Mara de 15 a 30 minutos.
NOTA: El CTAB se coloca cuando se va a poner a precalentar el buffer y el
mercaptoetanol una vez que se ha disuelto el CTAB.
El volumen de buffer es variable segn el nmero de muestras.
2. Triturar 0.3 gr de material vegetal en mortero con nitrgeno lquido o en
tubo eppendorf.
Adicionar 100 L de buffer de extraccin para homogenizar bien y al
trmino agregar 400 L ms despus de poner en el tubo eppendorf,
mezclar manualmente.
3. Incubar la muestra a 60 C por 30 minutos. Realizar una agitacin manual a
los 15 minutos.
4. Realizar la extraccin con 500 L de cloroformo: alcohol isoamlico, mezclar
ligeramente. Centrifugar a 14000 rpm durante 10 minutos a 20 C.

5. Extraer la fase superior acuosa y colocarla en otro tubo eppendorf y


adicionar un volumen igual de isopropanol frio, mezclar ligeramente para
precipitar los cidos nucleicos.
6. Colocar el tubo a 20 C por un periodo de 30 minutos o toda la noche. Nota:
si se observa el DNA precipitado inmediatamente extraerlo con una varilla
de vidrio.
7. Centrifugar a 14000 rpm durante 10 minutos a 4 C. decantar desechar
sobrenadante.
8. Lavar la pastilla de DNA con etanol al 80 % 2 veces y dejar secar a
temperatura ambiente.
9. Resuspender la pastilla de DNA en H2O MQ (50-100 L).
10. Fraccionar el DNA en gel, si fuera necesario.
Nota: para observar los resultados del proceso se hace una electroforesis en gel
de agarosa al 0.8% para detectar su integridad, aparece en bandas algunas veces
bien definidas acompaadas de otras de menor peso que suelen ser de RNA, en
algunos casos cuando falla el proceso tambin se puede detectar impurezas o
barridos por degradacin del DNA debido a un descuido de la manipulacin de la
muestra o el proceso. Tambin es posible observar restos de carbohidratos en los
posos del gel.

Determinacin de concentracin del DNA


Una vez que el DNA se a resuspendido, procede a determinar su concentracin y
calidad por medicin espectrofotomtrica y electroforesis en minigel de agarosa al
0.8-1% con las siguientes instrucciones.
11. Coloca 999 + 1 L de ADN en una celda para UV, calibre a 0 el
espectrofotmetro y aada 1 L de la muestra, mezcle bien por inversin,
tome las lecturas a 260-280 nm de absorbancia.
12. La calidad del DNA se determina dividiendo la lectura a 260nm entre la
lectura a 280nm. Un DNA de buena calidad deber dar un valor entre 1.8 y
2.0.
13. Las lecturas a 260nm sirven para calcular la concentracin de cidos
nucleicos. La razn de las lecturas a 260nm y 280nm [A260/A280] permite
estimar el grado de pureza de los cidos nucleicos.
14. Las preparaciones puras de DNA y RNA darn una razn entre 1.8 y 2.0.
15. En el caso de contaminacin con protenas o fenol, la proporcin ser
menor y no se podr realizar la cuantificacin adecuada.

Electroforesis en gel de agarosa.


El siguiente protocolo ser dividido en tres etapas.

16. Preparacin de gel agarosa en la concentracin adecuada para la


separacin del DNA a estudiar.
17. Aplicacin de las muestras de DNA y fraccionamiento electrofortico.
18. Como paso final, posterior al fraccionamiento electrofortico, tincin del gel
con bromuro de etidio y observacin en el transiluminador de luz UV.
Resultados (espectrofotmetro).
MUESTRAS
999 de TAE y 1 l de

260 NM
0.125

280 NM
0.151

DNA
Clculos que se realzan para determinar la calidad del ADN
Factor de dilucin: volumen + total de la celda
v. de la muestra
999: 1000 l = 1 l
1000 l
Concentracin DNA= (factor de dilucin) (lectura 260 nm)
20
260 nm
280 nm
999 nm (1000 ul) (0.125 nm) = 6.25 ug/ul
(1000 ul) (0.151 nm) = 7.55 ug/ul
20
20
Calidad del DNA
Dividir ondas de 260 nm/ 280 nm
0.125nm /0.151 nm = 0.827 nm.
ANEXOS

Fig. 1: En esta imagen se observa el flotador con las distintas


muestras que sern colocadas a bao mara a 60C.

Fig. 2: Se muestra toma de la muestra de DNA donde esta pasara


a ser mezclada con el naranja G, para colocar en la cmara de
electroforesis.

Fig 3. Muestra el proceso de colocacin de SB (buffer de corrida


en la cmara de electroforesis).

CONCLUSIN
El resultado obtenido de la calidad del DNA es algo buena, debido a que hubo una
probabilidad de contaminacin al momento de realizar la prueba y con los
resultados mostrados con anterioridad pude darme cuenta que de acuerdo a los
resultados que se muestran en la prctica esta fuera de lo normal.
Es muy importante saber el objetivo del porque realizamos todo esto en el
laboratorio donde interactuamos con algo muy importante ya que el ADN lo
contemos todos los seres vivos y a partir de este podemos saber mucho de lo que
en si somos, porque as nos percatamos de saber cmo nuestro material gentico
es expresado teniendo ms rasgos de nuestros padre o tal vez de nuestra madre,
en si es muy importante porque a partir de estos estudios que nosotros como
biotecnologos en formacin podemos realizar cosas con el ADN ya sea creando
un fruto con el mejor el color, olor, sabor o personas con mejores rasgos, color de
piel, ojos, etc.

BIBLIOGRAFA

Laura Patricia Alejos Velzquez. (2009). Extraccin y purificacin de ADN.


Diciembre

2015,

de

Universidad

Politecnica

Sitio

http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/extraccion.pdf

web:

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