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DE MANAB
TEMA:
DETECCIN Y CUANTIFICACIN DE AMINOCIDOS PPTIDOS Y PROTENAS
Fecha:
09/08/2016
AO 2016- PERODO 1
INTRODUCCION
Los aminocidos son la base de todo proceso vital ya que son absolutamente necesarios en
todos los procesos metablicos.
Los aminocidos son las unidades qumicas o elementos constitutivos de las protenas que a
diferencia de los dems nutrientes contienen nitrgeno.
Para entender la importancia de los aminocidos se debe conocer cul es las protenas en
nuestro organismo. Las protenas proporcionan la estructura a todos los seres vivos.
Despus del agua, las protenas constituyen la porcin ms grande de nuestro peso, ya que
forman los msculos, ligamentos, tendones, rganos, glndulas, uas, cabellos, fludos
corporales y son indispensables para la formacin del hueso.
Las protenas estn compuestas por cadenas de aminocidos unidos por enlaces ppticos.
Tanto los aminocidos que las componen, como la secuencia en que stos estn
organizados, es lo que otorga a cada protena sus caractersticas y funciones individuales.
Los aminocidos, pptidos y protenas que contienen aminas primarias producen, con
fluorescamina, un derivado altamente fluorescente con una mxima emisin a 475 nm
cuando la excitacin se hace a 390 nm. Este mtodo se puede utilizar para cuantificar
aminocidos, protenas y pptidos. Es mucho ms sensible y no tiene las desventajas de la
ninhidrina. El grupo amino que ha reaccionado puede ser recuperado con alto rendimiento
por hidrlisis cida y puede ser identificado por anlisis subsecuentes. El exceso de
fluorescamina es inestable en presencia de agua, se hidroliza a productos no fluorescentes y
no reactivos, lo que permite que los pptidos detectados con fluorescamina puedan ser
analizados directamente.
Reaccin con orto-ftalaldehdo: La reaccin de aminocidos con O-ftalaldehdo (1,2benzeno dicarbonal) en la presencia de 2-mercaptoetanol produce un derivado fluorescente
que tiene una excitacin mxima a 380 nm y una emisin de fluorescencia mxima a 450
nm [Ec. 8]. Es tan sensible que es posible cuantificar aminocidos a niveles de picomoles
(10-12 mol). La ninhidrina, fluorescamina y O-ftalaldehdo no son especficos para
protenas porque estos reaccionan con otros grupos amino
Este anlisis se efecta por mtodos de cromatografa de intercambio inico con dos
resinas, una catinica y otra aninica, con capacidad de separar las molculas del
aminocido por su afinidad. El paso previo es la hidrlisis de la protena a sus aminocidos
constituyentes, en condiciones muy drsticas, tanto cidas como alcalinas. En el primer
caso se somete la protena a una temperatura de 120C, con HCl 6N durante 10-24 horas.
En estas condiciones, los enlaces peptdicos se hidrolizan totalmente.
La hidrlisis en medio alcalino se lleva a cabo con NaOH a temperatura de ebullicin. La
principal ventaja de este mtodo es que el Trp no se destruye, pero se produce una fuerte
racemizacin de la mayora de los aminocidos y la destruccin de un porcentaje de Cys,
cistina, Ser, Thr Asn, Gln y Lys. Este mtodo se emplea ms bien cuando se desea
determinar Trp.
Cuantificacin de protenas
Existen diversos mtodos para la cuantificacin de las protenas, todos ellos basados en
alguna de sus propiedades tpicas, como puede ser la absorbancia de los grupos aromticos
a 280 nm, la reactividad del enlace peptdico o el contenido de nitrgeno total.
Absorbancia a 280 nm
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Las protenas purificadas son fcilmente detectadas y cuantificadas por sus propiedades de
absorbancia en UV a 280 nm, la que depende del nmero y posicin de sus residuos de
aminocidos aromticos Phe, Tyr, y Trp as como de puentes disulfuro entre los residuos de
Cys; se debe conocer el coeficiente de absorcin molar para poder calcular su
concentracin. Se debe considerar que todos los aminocidos, por su estructura qumica,
absorben a 210 nm y se encontrarn interferencias si en la solucin existen otras especies
qumicas que posean absorbancia en UV. Este mtodo tiene una ventaja adicional porque la
absorbancia de una protena puede aumentar cuando se depliega, expone sitios aromticos
que en condiciones normales no absorberan a 280 nm. El desplegamiento hace posible
calcular el coeficiente de absorcin molar si se conoce el nmero de puentes disulfuro y el
contenido de aminocidos aromticos.
La reaccin de biuret
Es especfica para la medicin del enlace peptdico, por lo que slo se recomienda para la
cuantificacin de protenas, mas no de hidrolizados, a menos que se conozcan los tamaos
moleculares y se adapte la protena estndar de la curva. Se utiliza una solucin diluida de
sulfato cprico en tartrato fuertemente alcalino, sta se adiciona a la solucin de protena,
resultando un compuesto de color entre prpura y violeta que absorbe a 540 nm, obtenido
probablemente por el acomplejamiento del Cu12 con dos enlaces peptdidos adyacentes.
El mtodo de Kjeldahl
BIBLIOGRAFIA
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