Mtodos de Extraccin:

RNA

DNA

Mariana Itzel Valencia Quintana

Ingeniera Agroindustrial
9A

Mtodo de extraccin de DNA

Extraccin de DNA vegetal

Ruptura de tejidos y pared celular

Para poder obtener una adecuada extraccin de DNA vegetal, es
importante primero romper los tejidos y pared celular de la planta.
1.- Pulverizar una pequea muestra fra de material vegetal, con
ayuda de un mortero.
2.- Agregar en el mortero 1 mL de buffer CTAB 2X, seguir moliendo.
3.- Homogenizar y verter tubos eppendorf; introducir a centrifuga a 8000
xg durante 8 min a 4C.
Ruptura de membranas
Por medio del reactivo CTAB se rompen las membranas celulares
para poder liberar el DNA.
1.- Eliminar el sobrenadante y se re suspender con 600 L de CTAB como
accin detergente para romper las membranas celulares y liberar el
DNA.
2.- Incubar a 60C durante 10 min.
Inhibicin de enzimas, separacin de protenas y lpido
Para poder precipitar el DNA es importante inhibir la actividad
enzimtica, separando las protenas y lpidos por medio del
cloroformo:octano.
1.- Agregar solucin de cloroformo:octanol 24:1 y homogenizar;
centrifugar a 5000 xg durante 12 min a 4C.
2.- Trasladar el sobrenadante a un tubo nuevo sin tomar la interfase.
3.- Agregaron 2/3 del volumen final isopropanol fro, para precipitar el
ADN.
4.- Dejar reposar toda la noche a -20C.
Extraccin de contaminantes
1.- Centrfuga a 8000 xg durante 5 min.
2.- Extraer el sobrenadante por decantacin.
3.- Para limpiar el DNA agregar 1 mL de etanol al 70% fro, centrifugar a
7000 xg por 5 min.

4.- Eliminar el sobrenadante y re suspender con 100 L de buffer TE.

Extraccin de RNA
Extraccin
Para la extraccin es necesario romper las paredes y membranas
celulares, adems es importante trabajar rpido y en frio (por eso el uso
de nitrgeno) para evitar la degradacin de RNA por accin enzimtica.
1.- Pulverizar 150mg de material vegetal con Nitrgeno lquido.
2.- Homogenizar el material vegetal con 1.5ml de buffer de maceracin
CTAB e incubar durante 10min a 65C.
Inhibicin enzimtica
Importante inhibir la actividad enzimtica, pues esta puede degradar el
RNA a extraer.
1.- Adicionar un volumen igual de cloroformo:isoamilalcohol (24:1 v/v) y
centrifugar durante 15min a 12000rpm a 4C. Transferir la fase acuosa a
un tubo de reaccin nuevo.

Precipitacin
Purificacin y precipitacin de RNA, para la obtencin de un RNA puro y
limpio.
1.- Adicionar un volumen igual de LiCl 4M e incubar toda la noche a 4C.
2.- Centrifugar durante 30min a 12000rpm a 4C y eliminar el
sobrenadante.
3.- Re suspender el pellet en 1ml de buffer TE-SDS.
4. Adicionar 100l NaCl 5M y 300l de isopropanol e incubar durante
30min a -20C.
5.- Centrifugar durante 10min a 12000rpm a 4C y eliminar el
sobrenadante.
6.- Lavar el pellet con 1ml de etanol absoluto, agitar vigorosamente,
centrifugar durante 5min a 7500rpm a 4C y eliminar el sobrenadante.
7.- Adicionar 1ml de etanol 70%, agitar vigorosamente, centrifugar
durante 5min a 7500rpm a 4C y eliminar el sobrenadante.
8.- Dejar secar el pellet y re suspender con 30l de agua tratada con
DEPC.
9.- Almacenar los extractos a -20C hasta su procesamiento.