Fernandez Ordoez, Ronald

Nizama Salazar, scar Pedro

Ros Gamboa, Mario Isaac
Santisteban Obregon, Karen Anais

13100007
14100063
13100111
14100072

Prctica N2: Criopreservacin | UNMSM

OBJETIVOS
Criopreservar clulas de testculos de alpaca.

Materiales.

Material biolgico: Testculos de alpaca

Enzimas: hialuronidasa, colagenasa, DNA

asa

Maquina centrifugadora

Eppendorfs

Medio de cultivo MEM

Azul de Tripan

Soluciones crioprotectoras

Equipo de diseccin

Guantes, mascarilla

Pipetas Pasteur

Procedimiento.
UNMSM

Prctica N2: Criopreservacin | UNMSM

* Para el congelamiento:
-

Los testculos de alpaca sern cortados en tiritas de 0.5 cm de

longitud por 0.2 cm de grosor.

Se colocaran en micro tubos con la las soluciones

crio protectoras.

Se deja enfriar durante 15 min. en la

congeladora.

Luego se congela a 4C por 130 min.

Se utiliz un software para controlar en descenso de temperatura de
la muestra.

Las muestras sern

dejadas en vapores
de nitrgeno lquido
durante 12 horas.

Finalmente
almacenadas en NL.

* Para el
descongelamiento:
Se removi la tnica
y el rete testis. Se
moli
el
parnquima, el cual
contiene
a
los
tbulos
seminferos en la malla
metlica.
Al

fluido se le agreg medio

Mem, se coloc en un
eppendorf y se centrifug por 5 minutos a 40 RPM.

Se decant el sobrenadante y se re suspendi en medio Mem y se

repite la centrifugacin.

UNMSM

Prctica N2: Criopreservacin | UNMSM

Se tom una pequea muestra, a la cual se le agreg azul de tripan, y
se observ al microscopio.
Al resto de la muestra se le aplic la primera digestin enzimtica y
se puso a la incubadora por 20 minutos.
Despus de sacarla se centrifug y se tom un poco de muestra para
ver al microscopio con azul de tripan.
El resto se decant y se lav medio Mem, este proceso se repite una
vez ms.
Se aplic la segunda digestin enzimtica y se volvi a incubar por 20
minutos.
Finalmente se vuelve a centrifugar y la muestra resultante se observa
al microscopio con azul de tripan.

Resultados.
Vitalidad sin tratamiento enzimtico:

1 foto
Clulas
30
vivas
2 foto
Clulas
1
Clulas
26
muertas
vivas
Clulas
5
muertas

UNMSM

Prctica N2: Criopreservacin | UNMSM

3 foto
Clulas
vivas
Clulas
muertas
4 foto
Clulas
vivas
Clulas
muertas

UNMSM

31
0

23
3

Prctica N2: Criopreservacin | UNMSM

5 foto
Clulas
9
vivas
Clulas
10
muertas

UNMSM

Prctica N2: Criopreservacin | UNMSM

Clulas vivas
Clulas muertas
Total

Cantidad
119
19
138

Porcentaje
86.2 %
13.8 %
100 %

Vitalidad con el tratamiento enzimtico 1:

UNMSM

Prctica N2: Criopreservacin | UNMSM

1 foto
Clulas
7
vivas
Clulas
5
muertas

2 foto
Clulas
6
vivas
Clulas
5
muertas

UNMSM

Prctica N2: Criopreservacin | UNMSM

3 foto
Clulas
2
vivas
Clulas
1
muertas

UNMSM

Prctica N2: Criopreservacin | UNMSM

4 foto
Clulas
4
vivas
Clulas
3
muertas

5 foto
Clulas
1
vivas
Clulas
1
muertas

UNMSM

Prctica N2: Criopreservacin | UNMSM

Clulas vivas
Clulas muertas
Total

Cantidad
18
15
33

Porcentaje
54.5
45.5
100%

Vitalidad con el tratamiento enzimtico 2:

UNMSM

10

Prctica N2: Criopreservacin | UNMSM

1 foto
Clulas
2
vivas
Clulas
1
muertas

2 foto
Clulas
3
vivas
Clulas
2
muertas

UNMSM

11

Prctica N2: Criopreservacin | UNMSM

3 foto
Clulas
3
vivas
Clulas
2
muertas

UNMSM

12

Prctica N2: Criopreservacin | UNMSM

4 foto
Clulas
4
vivas
Clulas
7
muertas

UNMSM

13

Prctica N2: Criopreservacin | UNMSM

5 foto
Clulas
3
vivas
Clulas
1
muertas

Clulas vivas
Clulas muertas
Total

Cantidad
15
13
28

Porcentaje
53.7 %
46.3 %
100 %

Cuadro resumen:

Evaluacin de la vitalidad 2

UNMSM

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Prctica N2: Criopreservacin | UNMSM

Sin digestin
enzimtica

1 Digestin
enzimtica

2 digestin
enzimtica.

Cantidad

Porcentaje

Cantidad

Porcentaje

Cantidad

Porcentaje

Clulas
vivas

119

86.2 %

18

54.5 %

15

53.7 %

Clulas
muertas

19

13.8 %

15

45.5 %

13

46.3 %

Resultados del primer grupo de prctica:

Evaluacin de la vitalidad 1
Sin digestin
enzimtica

1 Digestin
enzimtica

2 digestin
enzimtica.

Cantidad

Porcentaje

Cantidad

Porcentaje

Cantidad

Porcentaje

Clulas
vivas

49

65.3 %

146

65.7 %

890

90.8 %

Clulas
muertas

26

34.7 %

76

34.3 %

90

9.2 %

Grfica.

UNMSM

15

Prctica N2: Criopreservacin | UNMSM

Discusin de resultados.
Luego de la descongelacin de la muestra, como se observa en la
imagen, luego de echado el azul de tripan, observamos clulas vivas
y muertas. Las vivas se encuentran claras, mientras que las muertas
azules, dado que estas permiten la entrada del colorante.

En esta primera toma de

la muestra podemos ver
a todas las clulas claras,
indicador que se
encuentran vivas. En la
central podemos ver un
cmulo amorfo, esto
vendran a ser impurezas
de la muestra.

UNMSM

16

Prctica N2: Criopreservacin | UNMSM

En la segunda toma, vemos
a varias clulas de color
azul, por lo que en esta
toma, todas las clulas se
encontraban muertas.
Con estos datos podemos
determinar que el
proceso de
criopreservacin no fue
completamente eficiente,
al encontrarse gran
cantidad de clulas
muertas.

Al comparar los resultados con el otro grupo de prctica notamos que en los
resultados de la primera y segunda digestin ellos encontraron una mayor
cantidad de clulas vivas en relacin con las clulas muertas, esto se deba
quiz a una mejor manipulacin del material.

Conclusiones.
El azul de tripan permite diferenciar clulas vivas de clulas muertas,
pues estas timas permiten el ingreso del colorante por la ruptura
de su membrana.
Las digestiones enzimticas para nuestro experimento redujeron la
cantidad de clulas vivas, mientras que en el primer grupo de
prctica aumentaron.
En base a nuestros resultados podemos concluir que el protocolo de
criopreservacin no fue muy eficiente ya que encontramos una alta
cantidad de clulas madre muertas.

UNMSM

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Prctica N2: Criopreservacin | UNMSM

Bibliografa.

Fertilidad Y Reproduccion Asistida. 2009. Maria Teresa Urbina - Jorge

Lerner Biber

Efecto de la adicin de dos anlogos de la superxido dismutasa

(Tempo y TEMPOL) para el semen de alpaca extensor para la
crioconservacin. Alexei Santiani Acosta, Shirley Evangelista Vargas,
Martha Valdivia Cuya, Jennie Risopatrn Gonzlez, Ral Snchez
Gutirrez.

Efecto de dilutores en base a tris, tes y leche descremada en la

criopreservacin de espermatozoides obtenidos del epiddimo de
alpaca. Jorge Banda, Shirley Evangelista, Luis Ruiz, Roco Sandoval,
Claudia Rodrguez, Martha Valdivia, Alexei Santiani.

UNMSM

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