CROMATOGRAFIA

INTRODUCCION A LAS SEPARACIONES CROMATOGRAFICAS

En general, los mtodos para el anlisis qumico son, en el mejor de los
casos, selectivos; pocos, si es que los hay, son verdaderamente especficos.
En consecuencia, la separacin del analito de las posibles interferencias es
a menudo una etapa de vital importancia en los procedimientos analticos.
Hasta mediados del siglo XX, las separaciones analticas se llevaban a cabo
en su mayor parte por mtodos clsicos corno precipitacin, destilacin y
extraccin. Ahora, sin embargo, las separaciones analticas se realizan, en
la mayora de los casos, por cromatografa y electroforesis, especialmente
en el caso de mezclas complejas y multicomponentes.

La cromatografa es un poderoso mtodo de separacin que tiene aplicacin

en todas las ramas de la ciencia. La cromatografa en columna fue
inventada y denominada as, a principios del siglo XX por el botnico ruso
Mikhail Tswett. Al emplear la tcnica para separar varios pigmentos
vegetales, tales como clorofilas y xantofilas, haciendo pasar disoluciones de
estos compuestos a travs de una columna de vidrio rellena con carbonato
de calcio finamente dividido. Las especies separadas aparecan como
bandas coloreadas en la columna, lo que justifica el nombre que eligi para
el mtodo (del griego chroma que significa color, y graphein que significa
escribir).

Las aplicaciones de la cromatografa han aumentado en gran manera en los

ltimos cincuenta aos, debido, no solo al desarrollo de nuevos y diversos
tipos de tcnicas cromatograficas, sino tambin a las necesidades
crecientes, por parte de los cientficos, de mejores mtodos para la
caracterizacin de mezclas complejas. El tremendo impacto de esos
mtodos en la ciencia se confirmo al otorgarse el Premio Nobel de 1952 a
A. J. P. Martin y R. L. M. Synge por sus descubrimientos en este campo.
Ms impresionante es, quizs, la lista de doce Premios Nobel concedidos

entre 1937 v 1972, los cuales se basaron en trabajos en los que la

cromatografa tenia un papel vital hoy por hoy, indudablemente, esta lista
ha aumentado.

DESCRIPCION GENERAL DE LA CROMATOGRAFIA

La

cromatografa

es

un

mtodo

fsico

de

separacin

para

la

caracterizacin de mezclas complejas, la cual tiene aplicacin en todas las

ramas de la ciencia y la fsica. Es un conjunto de tcnicas basadas en el
principio de retencin selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos
componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las
cantidades de dichos componentes.
Las tcnicas cromatograficas son muy variadas, pero en todas ellas hay una
fase mvil que consiste en un fluido (gas, lquido o fluido supercrtico) que
arrastra a la muestra a travs de una fase estacionaria que se trata de un
slido o un lquido fijado en un slido. Los componentes de la mezcla
interaccionan en distinta forma con la fase estacionaria. De este modo, los
componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se
van separando. Despus de que los componentes hayan pasado por la fase
estacionaria, separndose, pasan por un detector que genera una seal que
puede depender de la concentracin y del tipo de compuesto.
Tipos de cromatografa
Dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase mvil se
pueden distinguir distintos tipos de cromatografa:

a) Cromatografa slido-lquido. La fase estacionaria es un slido y la

mvil un lquido.
b) Cromatografa lquido-lquido. La fase estacionaria es un lquido
anclado a un soporte slido.
c) Cromatografa lquido-gas. La fase estacionaria es un lquido no
voltil impregnado en un slido y la fase mvil es un gas.

d) Cromatografa slido-gas. La fase estacionaria es un slido y la mvil

un gas.
Segn el tipo de interaccin que se establece entre los componentes de la
mezcla y la fase mvil y estacionaria podemos distinguir entre:
a) Cromatografa de adsorcin. La fase estacionaria es un slido polar
capaz de adsorber a los componentes de la mezcla mediante
interacciones de tipo polar.
b) Cromatografa de particin. La separacin se basa en las diferencias
de solubilidad de los componentes de la mezcla en las fases
estacionaria y mvil, que son ambas lquidas.
c) Cromatografa de intercambio inico. La fase estacionaria es un
slido que lleva anclados grupos funcionales ionizables cuya carga se
puede intercambiar por aquellos iones presentes en la fase mvil.

CROMATOGRAFIA DE GASES
En cromatografa gaseosa, la fase mvil es un gas que fluye a travs de una
columna que contiene a la fase fija. Esta fase fija puede ser un slido poroso
(cromatografa gas-slido o
CGS), o bien una pelcula lquida delgada que recubre un slido particular o
las paredes de
la columna (cromatografa gas-lquido o CGL). En el primer caso, el proceso
que produce la separacin es la adsorcin de los componentes de la mezcla
sobre la superficie slida y en el segundo, la particin de los mismos entre
las fases lquida y gaseosa.
La idea de esta tcnica se basa en la volatilizacin de la muestra y su
posterior inyeccin en la cabeza de una columna cromatografa. Para la
elucin de la muestra se usa un gas inerte como fase mvil, de esta manera
la fase mvil no interacciona con las molculas del analito, simplemente
transporta el analito a travs de la columna. Existen dos tipos de
cromatografa de gases

PRINCIPIOS DELA CROMATOGRAFIA GAS-LIQUIDO

La fase estacionaria son molculas de lquido inmovilizadas sbrela

superficie de un gas inerte. Esta es la que se usa ms ampliamente.GSC la
fase estacionaria es slida y la retencin de los analitos en ella se produce
mediante el proceso de adsorcin. Precisamente este proceso de adsorcin,
que no es lineal, es el que ha provocado que este tipo de cromatografa
tenga aplicacin limitada, ya que la retencin del analito sobre la superficie
es semipermanente y se obtienen picos de elucin con colas. Su nica
aplicacin es la separacin de especies gaseosas de bajo peso molecular. La
GC es un sistema compuesto de gas portador, sistema de inyeccin de
muestra, columna (generalmente dentro de un horno), y detector.

INSTRUMENTOS PARA LA CROMATOGRAFIA GAS-LIQUIDO

Gas portador: entre los gases portadores, que deben ser qumicamente
inertes, se encuentran el helio, el nitrgeno y el hidrogeno. La eleccin d los
gases esta con frecuencia determinada por el tipo de detector que se
utiliza. Estos deben contener un tamiz molecular para eliminar el agua u
otras impurezas.
Sistema de inyeccin de muestra
La eficacia de la columna requiere que la muestra sea de un tamao
adecuado y que sea introducida como un tapn de vapor; por lo que se usa
micro jeringas para inyectar una muestra liquida o gaseosa atreves de una
goma de silicona, en una cmara de vaporizacin instantnea en la cabeza
de la columna ( la cmara de muestra normalmente esta a 50C por encima
del punto de ebullicin del componente menos voltil de la muestra ).

Sistema de deteccin
Durante el desarrollo de la cromatografa de gases se han investigado y
utilizado docenas de detectores. Estos son dispositivos espectrofotmetros
se tiene diferentes detectores en las imgenes se muestran algunos
Detector de ionizacin

Detector de emisin atmica

COLUMNAS
Y
FASES
CROMATOGRAFIA DE GASES

ESTACIONARIAS

PARA

LA

a) Columnas de relleno:
Son tubos de vidrio, metal inerte o tefln de 2 o 3 metros de longitud y 2 a
4 mm de dimetro interno el material de relleno del interior consiste en
partculas esfricas para interaccionar con el analito. Normalmente se usan
diatomeas puesto que es un material ideal para la adsorcin.Columnas capilares o WCOT:
b) Pared recubierta:
Son tubos capilares donde la pared interna est recubierta con una fina
capa de fase estacionaria son ms eficaces.
c) Soporte recubierto:
Tienen una capa en su lado interno de superficie adsorbente donde se
acopla la fase estacionaria. Tienen mayor capacidad de carga.
d) Fase estacionaria:
Una fase estacionaria requiere:
Caractersticas de reparto
Baja volatilidad.
Baja reactividad.
Estabilidad trmica. Algunos de las fases estacionarias ms comunes son:-

Polidimetilsiloxano: fase no polar de uso general para hidrocarburos,

drogas y esteroides.

Poli(fenilmetidifenil)siloxano:

para

steres

metlicos

de

cidos

grasos, alcaloides, drogas ycompuestos halogenados.

Poli(fenilmetil)siloxano: drogas, esteroides, pesticidas y glicoles.

Poli(trifluoropropildimetil)siloxano:

para

aromticos

clorados,

nitroaromticos, bencenosalquilsustituidos.

Polietilenglicol: para compuestos como glicoles, alcoholes, teres y

aceites esenciales.

Poli(dicianoalildimetil)siloxano: para cidos grasos poli insaturados,

cidos libres y alcoholes.

APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFIA
a) Tecnologa

de

alimentos

Productos

Naturales.-

Puede

realizarse la caracterizacin de Aceites Esenciales y Aromas,

los cuales son empleados en la elaboracin de saborizantes,

aromatizantes, licores, perfumes, artculos de aseo, y como
materias primas para productos farmacuticos.
b) Control Ambiental.- Dentro de los contaminantes posibles de
ser estudiados estn: los hidrocarburos aromticos, BTEX,
pesticidas organoclorados y organofosforados en muestras de
aguas superficiales, subterrneas, suelos y lodos.
c) Qumica Forense.- Es posible la aplicacin de la cromatografa
de gases y la espectrometra de masas en la deteccin y
cuantificacin de analitos de inters en la qumica forense. Por
ejemplo la determinacin, cuantificacin de alcohol en sangre,
anlisis de licores, entre otros

CROMATOGRAFIA GAS-SOLIDO
La cromatografa gas solido se basa en la adsorcin de sustancias gaseosas
sobre superficies solidas. Los coeficientes de distribucin son generalmente
mucho mayores que en la cromatografa gas liquido. En consecuencia la
cromatografa gas-solido es til para separacin de especies que no se
retienen en columnas de gas liquido tales como los componentes del aire,
sulfuro de hidrogeno, disulfuro de carbono, xidos de nitrgeno, monxido
de carbono, dixido de carbono y gases nobles.
La cromatografa gas solido s lleva acabo tanto en columnas de relleno
como en columnas abiertas. En estas ltimas se fija

en las paredes del

capilar una delgada capa del adsorbente; estas columnas a veces se

denominan columnas abiertas de pared porosa o columnas PLOT.
Para este tipo de cromatografa podemos utilizar dos tipos de adsorbentes;
Los tamices moleculares y los polmeros porosos

CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS DE ALTA RESOLUCION (H.P.L.C)

Los avances obtenidos en el desarrollo de la instrumentacin cientfica
consiguieron que al final de la dcada de 1960 fuese posible el anlisis de
mezclas complejas por cromatografa de gases en cuestin de minutos o
incluso segundos, pudindose detectar, en las condiciones ms favorables,
cantidades de sustancias del orden de los nano-gramos, y algunas veces de
los pico-gramos. Sin embargo, para muestras no voltiles, la cromatografa
lquida clsica, a pesar de haber demostrado un gran poder de separacin,

no alcanzaba la eficiencia y la sensibilidad de la CG, ya que, en muchas

ocasiones, era necesario invertir horas para la elucin, recoger fracciones
de forma manual conteniendo miligramos o gramos de material eluido y
utilizar litros de disolvente. Era, pues, necesario lograr que la CL
proporcionase unas prestaciones similares a las logradas con la CG. Para
ello, tena que acelerarse, automatizarse y adaptarse a muestras mucho
ms pequeas. Como consecuencia de los esfuerzos efectuados en estas
direcciones, surgi la moderna Cromatografa Lquida de Alta Resolucin
(CLAR o HPLC)

CAMPO DE APLICACION DE LA H.P.L.C

La cromatografa de lquidos de alta eficiencia es la tcnica analtica de
separacin ms ampliamente utilizada, debido a que esta tcnica es muy
sensible, su fcil adaptacin a determinaciones cuantitativas exactas, su
idoneidad para la separacin de especies no voltiles o termolbiles y sobre
todo su gran aplicabilidad a sus tcnicas que son de inters en la industria,
en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos
ejemplos de estos materiales incluyen: aminocidos, protenas,

cidos

nuclecos, hidrocarburos, carbohidratos, antibiticos, esteroides, frmacos,

especies organometlicas y una variedad de sustancias orgnicas.
Sus campos de aplicacin se refieren. As, para solutos con masa
moleculares superiores a 10.000, a menudo se utiliza la cromatografa de
exclusin por tamao, tambin se puede tratar estos compuestos con
cromatografa de reparto en fase inversa. Para especies inicas de masa
molecular

ms pequea, se utiliza con frecuencia la cromatografa de

intercambio inico. Para compuestos no polares se usa la cromatografa de

adsorcin.

INSTRUMENTACION PARA LA CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS

Sistema de bombeo
Resistente a qumicos
Poca variabilidad
Presiones de 30 as 400 atm
Flujo constante (libre de pulsos)
Buen mezclado de los solventes
Reproducibilidad en la formacin de los gradientes
Tipos de bombas
Jeringa
Pistn recproco
Diafragma
Presin constante
Detectores
Detectores de UV-Visible que pueda leer 2 o ms longitudes de onda al
mismo tiempo
Detector de arreglo de diodos. Espectro de 200 a 600 nm en menos de 1
segundo.

OTROS TIPOS DE CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS

Cromatografa de fase qumicamente unida (CFQU)
Esta tcnica surgi como consecuencia de problemas asociados con la CLL.
Dado que su fase estacionaria esta qumicamente unida a la superficie de
un soporte, la fase mvil difcilmente produce deterioro alguno en la
columna. Si se vara la naturaleza de los grupos funcionales de la

fase

estacionaria

es

posible

obtener

diferentes

tipos

de

selectividad.
Dichos grupos pueden ser de naturaleza polar, como el grupo amino y el
grupo nitrilo en el caso de la cromatografa de fase normal, o bien no polar
como el grupo octilo, octadecilo, fenilo, etc.; en el caso de la cromatografa
de fase inversa, esta tiene innumerables aplicaciones.
Su inconveniente es que en la cantidad de fase estacionaria que es posible
unir a la superficie de un soporte (partculas de slice), es limitada y como
consecuencia los tamaos de muestra separados en esta columna son
reducidos, por lo comn menor de 1 mg.
Este mecanismo de separacin es complejo, cuyas caractersticas son
similares a la de la CLL y es el ms utilizado.
Cromatografa de adsorcin o CLS
Se basa en la afinidad de adsorcin es la forma clsica de la cromatografa
de lquidos. Ha sufrido algunas transformaciones que la han convertido en
un mtodo importante de la HPLC.
Las nicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografa son la slice y
la almina, siendo la primera la preferida.
Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas
moleculares inferiores a 5000. Los mtodos de la cromatografa de
adsorcin y reparto tienden a ser complementarios, aunque en algunos
casos se superponen.
En general la CLS es mas adecuada para muestras que son solubles en
disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en disoluciones
acuosas que son las que se utilizan en cromatografa de reparto en fase
inversa. En este tipo de cromatografa tambin se pueden separar
compuestos con diferentes grupos funcionales. Una caracterstica particular
de este mtodo es su capacidad para diferenciar compuestos ismeros en
mezclas.
El mecanismo de separacin de esta, se basa en la competencia que
existe entre las molculas de la muestra y de la fase mvil o
disolvente por ocupar los sitios activos en la superficie de un slido
(almina y gel de slice).
En conclusin, este tipo de cromatografa es muy til y se aplica a
molculas de baja o media polaridad.

ANEXOS

EQUIPO COMPLETO PARA LA CROMATOGRAFA HPLC

EQUIPO PARA CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS DE ALTA RESOLUCION

(H.P.L.C)