CUESTIONARIO PRCTICA 3

1. Representa las rectas patrones para Bradford y Lowry

.Calcula las concentraciones de protena de la muestra
problema para ambos mtodos , segn los datos
obtenidos en los experimentos realizados.

En la grfica anterior puede verse en absicsas las concentraciones y

en ordenadas las absorbancias. Se representa la recta patrn
generada con los datos de las concentraciones y las absorbancias
medidas. Tambin se representa el valor de absorbancia igual a 0,994
calculada como la media aritmtica de las tres mediciones realizadas
con la muestra y la recta interpolada a partir del patrn que pasa por
dicho punto. A partir de su ecuacin empleando la absorbancia se
calcula la concentracin, obteniendo un valor de 0,6424 mg/ml

Se repite el mismo procedimiento de clculo que en la cuantificacin

de Lowry con los datos de absorbancia obtenidos en este caso. Los
resultados obtenidos son: la absorbancia de la muestra es de 0,418 y
la concentracin de 0,5162 mg/ml

2. Las rplicas de la muestra problema dan el mismo

valor ? Por qu ?

No, dan diferente valor y con diferente variabilidad en el rango

de medidas. En la cuantificacin de Lowry la variacin de las
medidas observadas es de un 11,74 % .En cambio en la
cuantificacin de Bradford la variacin es de 6,7 % . Esta
diferencia se debe a la mayor dificultad del procedimiento de
Lowry que da lugar a errores en su ejecucin, mientras que la
variacin observada en Braford es atribuible a la variabilidad
estadstica causada por errores de medicin ,instrumentacin
,etc
3. Calcula el coeficiente de extincin molar (M-1.Cm-1) de la
BSA y la concentracin de la muestra problema, segn
los datos obtenidos mediante la lectura de la
absorbancia a 280nm.
Segn la ecuacin de Lambert-Beer:
A =.c. L, donde
A: absorbancia
: coeficiente de extincin, M-1 cm-1
L: longitud del medio (cubeta), cm
Calculamos del patrn BSA a partir de la concentracin y la
medicin de la absorbancia: c= 0,25 mg/ml, A=0,056
0,25 mg/l x 103ml/1l x 1g/103mg x 1 mol BSA/66.463 g =
3,76149x10-6M
= A/c.L = 0.056/3,76149x10-6 = 14.887 M-1 cm-1
Y a continuacin calculamos la concentracin de la muestra
problema:
c = A/ .L = 0,023/14.887 = 1,54x10-6 M
1,54x10-6 M x 66.463 = 0,1024 mg/ml
Los valores obtenidos presentan errores significativos:
- El coeficiente de extincin de BSA es muy inferior al que se
encuentra en la literatura, que es de 43824 M-1 cm-1
- El error en la determinacin de del patrn BSA se propaga
al clculo de la concentracin obtenindose un valor entre 5
y 6 veces inferior a los valores obtenidos con los otros
mtodos. Pero si se empleara el valor correcto de , la
concentracin an sera menor. Por tanto se deduce que el
valor de las absorbancias medidas presenta un error
sistemtico significativo.

4. Podramos usar el valor E de la BSA para calcular la

concentracin de otra muestra de protena desconocida?

No ya que el coeficiente de extincin molar es caracterstico de

cada protena en condiciones definidas de longitud de onda,
solvente y temperatura.
Tambin depende de las
caractersticas del instrumento utilizado. Por esta razn,
normalmente no se utilizan valores predeterminados del
coeficiente de extincin para anlisis cuantitativo. En su lugar,
se utiliza una solucin patrn con concentraciones conocidas de
analito.
5. Describe el principio qumico en el que se basan los
mtodos Bradford y Lowry. Porque usamos la longitud de
onda de 750 nm para Lowry y 595 nm para Bradford?
El mtodo Bradford se basa en el cambio de colorante en
respuesta a diferentes concentraciones de protenas . Este
compuesto
interacciona
con
aminocidos
bsicos
(especialmente arginina ) y aromticos (mediante enlaces
electrostticos y de Wan der Waals), segn el contenido de
estas dos componentes la intensidad de absorcin variar. Esta
unin del colorante con las protenas provoca un cambio del
pico de absorcin del colorante desde 465nm a 595nm . Por eso
se emplea la longitud de onda a 595nm. Por lo tanto, este
mtodo se basa en la propiedad del Azul Brillante de Coomasie
G-250 de presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo
y azul. La forma roja se convierte en azul cuando el colorante se
une a la protena ( por eso , en el blanco encontramos una
coloracin marrn)
En el mtodo Lowry es un mtodo colorimtrico de valoracin
cuantitativa de las protena en el que el color azul fuerte lo
crean 2 reacciones:
1) reduccin de los iones Cu++ bajo condiciones alcalinas forma
un complejo con enlaces pptidos de las protenas y se
reduce a Cu+ ( reaccin Biuret )
2) Reduccin del agente Folin-Ciocalteu por el complejo CobrePeptido que subsecuentemente provoca un cambio de color
en la solucin hacia azul con una absorcin detectable en un
espectrofotmetro en el rango de 650 a 750 nm . Por eso se
emplea la longitud de onda de 750nm
6. Por qu usamos cubetas de metacrilato para medir
absorbancias a 595 y 750nm ,y cubetas de cuarzo para
medir la absorbancia a 280nm ?
Las cubetas de cuarzo se emplean para medir la absorbancia a
280nm porque por debajo de 320nm el cristal y los plsticos

(metacrilato) absorben mayor parte de la luz y se interferira en

el resultado . En cambio , las de metacrilato son adecuadas
para longitudes de onda entre 380 y 780nm.
7. Compara los resultados obtenidos para los tres mtodos
de cuantificacin y discute sobre las posibles
interferencias.
Una vez realizadas las 3 cuantificaciones se obtienen los
siguientes resultados :
Bradford : 0,5161588 mg /ml de concentracin problema
Lowry: 0,642427 mg/ ml de concentracin problema
Lambert Beer : 0,102 mg/ml de concentracin problema (
error en absorbancia ).
Discusin de resultados :
Los mtodos de Bradford y Lowry se han realizado siguiendo el
procedimiento sin cometer errores importantes . Las rplicas de
la muestra problema han sido parecidas sin observarse una
dispersin importante de valores para una misma muestra. Sin
embargo la propia dificultad procedimental, especialmente en el
caso de Lowry, nos ha inducido a cometer pequeos errores que
acumulados dan lugar a la diferencia de los valores.
Respecto el clculo de la concentracin de Lambert Beer se
observa un resultado anmalo debido a las posibles
interferencias en la metdica ,una mala ejecucin del protocolo,
fallos en la instrumentacin o falta en la homogenizacin de los
reactivos .. que han provocado que la absorbancia de las
muestras fuera errneo.
8. Haz una lista de ventajas y desventajas de los tres
mtodos :
Mtodo de Bradford :
Ventajas :
o Es muy sensible , puede detectar 1-20 g de
protena
o Es muy rpido
o Hay pocos materiales que interfieran
o No tiene incubaciones
o Capacidad de
identificar
bastantes
aminocidos

o Permite utilizar cubeta metacrilato.

Inconvenientes :
o Los detergentes interfieren , incluso trazas de los
productos de limpieza pueden invalidar los
resultados .
o Depende fuertemente de la composicin de los
aminocidos.
o Tie las cubetas empleadas.
Mtodo Lowry :
Ventajas :
o Es bastante sensible y es capaz de detectar hasta 1
ug de protena .
o Permite utilizar cubeta metacrilato.
Inconvenientes :
o Requiere bastante tiempo
o Algunas protenas no responden al mtodo.
o Lo puede perturbar bastantes materiales, por
ejemplo, sulfato de amonio , glicina y mercaptanos.
o El tiempo de incubacin es critico
o Sensible a muchas interferencias
o Es ms adecuado para comparar diversas
soluciones de una misma protena que para realizar
mediciones absolutas.
Ecuacin de Lambert Beer :
Inconvenientes :
o La ley L-B solo es vlida para soluciones diluidas
porque para concentraciones altas varia con la
concentracin debido a fenmenos de dispersin
de la luz, cambios de medio, agregacin de
molculas , etc.
o Requiere la utilizacin de cubetas de cuarzo
o Se ve influenciada por interferencias de los
materiales que absorben UV
Ventajas :
o Es un mtodo rpido
o No se pierde la muestra utilizada
9. Discute el efecto del tween 20 , el SDS y del Bmercaptoetanol sobre los mtodos de Bradford y de
Lowry. Coinciden estos resultados con el listado de
ventajas y desventajas de ambos mtodos?
A continuacin se da una tabla con las absorbancias obtenidas
al aadir estos productos restando el valor de la absorbancia
del blanco.

PRODUCTO
B-mercaptoetanol
Tween20
SDS
Blanco

BRADFORD
0,037
Interferencia elevada
0,142
0

LOWRY
0,105
-0.073
0,004
0

El B-mercaptoetanol debido a su accin reductora rompe los

puentes de disulfuro entre las protenas y esto da lugar a una
interferencia que es ms significativa en el caso de Lowry que
en Bradford.
Se puede comprobar que tal como indica la bibliografa los
detergentes invalidan el empleo del mtodo de Bradford ya que
producen una interferencia elevada, principalmente el Tween
20. En el caso del SDS se nota menos debido a que el producto
est bastante ms diluido, aunque de todas formas se obtiene
una absorbancia claramente superior al blanco. Por el contrario
el mtodo de Lowry es bastante robusto frente a la presencia de
detergentes i las absorbancias son bastante similares a las del
blanco. Estos resultados tambin son coherentes con la
bibliografa.
.

10.
En el caso de que se necesitara cuantificar la
concentracin total de una mezcla de protenas, qu
mtodo sera el ms adecuado? por qu ?
En general el mtodo ms adecuado depende de la composicin
de la mezcla y sus propiedades, por ejemplo el espectro de
absorcin de la luz para identificar la longitud de onda ms
adecuada. En general el mtodo de Lowry presenta una mayor
sensibilidad pero es vlido para un rango menor de protenas
que el mtodo de Bradford. Tambin es fundamental conocer los
componentes de la mezcla para identificar posibles
interferencias. Sin embargo, en caso de no disponer de ninguna
informacin, el ms adecuado sera el de Bradford por su mayor
generalidad y porque el de Lowry es ms adecuado para
comparar diversas soluciones de una misma protena que para
realizar mediciones absolutas.