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UNIDAD DE TRABAJO N 4.
PREPARACIONES MICROSCPICAS Y
OBSERVACIONES DIVERSAS.
NDICE.
1. INTRODUCCIN.
2. TIPOS DE PREPARACIONES MICROSCPICAS.
3. PREPARACIONES PARA EXAMEN EN FRESCO.
3.1.-Montaje hmedo o tcnica de la cmara hmeda.
3.2.-Tcnica de la gota pendiente.
3.3.-Utilidad de las preparaciones hmeda y en gota pendiente.
3.4.- Otras tcnicas de examen en fresco
4. PREPARACIONES PARA EXAMEN EN FRESCO LIGERAMENTE MODIFICADAS.
4.1.-Tincin vital.
4.2.-Preparacin con KOH al 10%.
4.3.-Azul de lactofenol.
4.5.-Tincin con tinta china para criptococos.
5. PREPARACIONES FIJADAS Y TEIDAS.
5.1.-Pasos a seguir en la preparacin de una muestra fijada y teida.
5.2.-Colorantes.
5.3.-Fundamento del proceso de tincin.
5.4.-Factores que influyen en la tincin.
5.5.-Procedimiento de aplicacin del colorante.
5.6.-Tipos de tinciones.
5.7.-Principales tinciones simples.
5.7.1.-Tincin de azul de metileno.
5.7.2.-Tincin con violeta de genciana.
5.7.3.-Tincin con fuchsina.
5.8.-Principales tinciones diferenciales.
5.8.1.-Tincin de Gram.
5.8.2.-Tincin de Zielh-Neelsen.

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1. INTRODUCCIN.
Para realizar observaciones de los microorganismos presentes en una muestra es necesario
manipular previamente dicha muestra. Esta manipulacin permite obtener una preparacin
microscpica, que es el material que finalmente se colocar en la pletina del microscopio. Esta
preparacin constar obligatoriamente de un portaobjetos y podr o no incluir un cubreobjetos y
otros materiales. Las preparaciones microscpicas se obtienen de modos diversos que dependen de
la naturaleza de la muestra y de los parmetros que queremos observar.

2. TIPOS DE PREPARACIONES MICROSCPICAS.

Hay distintos criterios que pueden utilizarse para clasificar las diferentes preparaciones
microscpicas existentes. El criterio que vamos a seguir aqu permite establecer tres grupos:

Preparaciones para examen en fresco sin modificar.

Preparaciones para examen en fresco ligeramente modificadas.

Preparaciones fijadas y teidas.

Independientemente del tipo de preparacin utilizada, la muestra a partir de la cual se

obtiene debe ser una muestra directa fresca o un cultivo reciente, pues la utilizacin de muestras y
cultivos envejecidos y no conservados adecuadamente puede hacer que las caractersticas
observadas no correspondan a la realidad.
En los siguientes apartados estudiaremos las principales caractersticas de estos tres grupos y
describiremos las preparaciones ms importantes incluidas en cada uno de ellos.

3. PREPARACIONES PARA EXAMEN EN FRESCO.

Entendemos por preparaciones en fresco sin modificar o simplemente preparaciones en
fresco aquellas en las que la muestra se examina directamente sin modificar o, como mucho, se
diluye o concentra. Se realiza un estudio in vivo de la muestra y se denomina observacin vital.
Presentan las ventajas siguientes:
1. Permiten observar la movilidad de los microorganismos vivos, dato que en
ocasiones tiene inters analtico.
2. Algunas son preparaciones que se elaboran de forma rpida simple y econmica.
Sus inconvenientes son estos:
1. No tienen validez universal: muchos microorganismos no son observables de este
modo.
2. Hay caractersticas interesantes de los microorganismos que no son observables
de este modo.

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Vamos a estudiar dos tcnicas que permiten obtener preparaciones para examen en fresco:

montaje hmedo
tcnica de la gota pendiente

Estas tcnicas hacen posible observar diversos microorganismos en condiciones de vida

normal suspendidos en un medio acuoso.
La observacin de un montaje hmedo o de una cmara con gota pendiente mediante el
microscopio de campo claro en muchos casos proporciona resultados aceptables. Sin embargo, el
microscopio de contraste de fase suele ofrecer visiones de mayor calidad.

3.1.-Montaje hmedo o tcnica de la cmara hmeda.

Consiste en verter una gota del lquido que contiene los microorganismos en el centro de un
portaobjetos (limpio y seco) y cubrirlo despus con un cubreobjetos, sin apretar demasiado para no
adelgazar excesivamente la lmina de lquido incluida entre porta y cubre.

La evaporacin acorta la vida de esta preparacin. Puede disminuirse la velocidad de

evaporacin sellando con vaselina o una sustancia similar el espacio que hay entre portaobjetos y
cubreobjetos.

Una muestra slida, semilquida o lquida demasiado espesa para su observacin (por
ejemplo: una porcin de una colonia de un cultivo puro de bacterias, normalmente de consistencia
cremosa; levadura prensada; heces; yogurt; etc.) puede tambin examinarse de este modo
diluyndola previamente con agua estril que puede contener alguna sal (suero salino estril)*.
.
* La utilizacin de agua con sales se hace para que la presin osmtica del medio no sea demasiado baja, pues el
empleo de agua destilada puede ocasionar la deformacin de las clulas por absorcin de agua de un medio hipotnico:
las clulas se hinchan y pueden incluso romperse. En muestras clnicas y tambin con otros tipos de muestras suele
utilizarse como diluyente NaCl 0,9 %, que es isotnico con el plasma humano.

La observacin suele hacerse con el objetivo de 40 aumentos. No debe utilizarse el objetivo

de inmersin, pues al desplazar la preparacin el cubreobjetos permanece adherido al objetivo y
esto crea turbulencias en el lquido de la preparacin.
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En otras ocasiones la muestra no se diluye, sino que se concentra, como sucede con las
muestras de sedimento urinario, obtenidas concentrando 10 veces los elementos formes presentes en
la orina mediante centrifugacin.
La tcnica del montaje hmedo es, con diferencia, la tcnica microscpica ms utilizada
para el examen en fresco.
3.2.- Tcnica de la gota pendiente.
Se utilizan portaobjetos especiales con una excavacin en el centro del mismo . La tcnica
consiste en:
1. En el centro de un cubreobjetos perfectamente limpio y desengrasado se coloca una gota de
la suspensin del microorganismo con un asa previamente esterilizada.
2. Invertir sobre el cubreobjetos el portaobjetos excavado untando con vaselina alrededor del
pocillo, colocndolo de forma que la gota quede centrada en la depresin.
La vaselina adhiere el cubre al porta, de modo que forman una cmara que evita la
evaporacin de la gota.
3. Dar rpidamente la vuelta a la preparacin.
4. Observar al microscopio con objetivo de 40X.

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3.3.-Utilidad de las preparaciones hmedas y en gota pendiente.

Las preparaciones hmeda y en gota pendiente son preferibles en las situaciones siguientes:

1. Cuando los elementos formes que queremos observar (microorganismos, clulas

2.

3.
4.
5.

humanas, cristales, etc.) se observan suficientemente bien en fresco. Ventajas

adicionales son el ahorro de tiempo y reactivos que supone la utilizacin del montaje
hmedo.
En la determinacin de la movilidad o inmovilidad de las bacterias investigadas: para
ello deben estar suspendidas en un medio que les permita moverse y que las
mantenga vivas. En una preparacin seca o tratada con colorantes txicos los
microorganismos mviles perdern su movilidad.
En el estudio de bacterias cuya morfologa se altera cuando se desecan y se tien.
Esto sucede con el Treponema palidum (una espiroqueta, causante de la sfilis).
En la observacin de determinados fenmenos microscpicos, tales como divisin
celular (clulas animales, levaduras, etc.) o formacin de esporas.
En la observacin de algunas inclusiones celulares, tales como vacuolas grasas, etc..

La tcnica de la gota pendiente ofrece como ventaja principal frente al montaje hmedo el
ofrecer un mayor volumen lquido a los microorganismos para que estos se muevan con mayor
libertad. An as, esta ventaja no suele compensar la mayor simplicidad y rapidez de preparacin
del montaje hmedo, por lo que este sigue siendo el ms utilizado para realizar observaciones en
fresco.
3.4.-Consideraciones en la observacin de la movilidad segn estas
tcnicas
Hay que tener en cuenta cuando observamos la movilidad de los microorganismos in vivo
que, por las condiciones de estas dos tcnicas ya estudiadas, podemos distinguir tres tipos de
movimientos:
Movimiento del fluido, donde los microorganismos siguen todos un movimiento
comn como en un ro fluido, esto es debido a algunas corrientes del lquido en el
que se encuentran.
Movimiento Browniano (al azar), es un movimiento de vibracin y traslacin sin
ninguna direccin clara que se produce por la propia interaccin de las partculas
(microorganismos) con las molculas del fluido en el que se encuentran.

Movimiento flagelar, o el producido por los flagelos contenidos en la pared de

los microorganismos. Se distingue perfectamente de los dems.

3.5-Otras tcnicas de examen en fresco.

Existen otras tcnicas de examen en fresco. La mayora son de uso menos frecuente que las
ya vistas y tiene finalidades muy especficas como la tcnica de examen en fresco con
nigrosina.
Esta tcnica consiste en aadir nigrosina, se prefiere a la tinta china, al objeto de estudio.
Con esta tcnica se puede distinguir bacterias incoloras sobre fondo negro. Se utiliza sobre todo
para el estudio de detalles estructurales como cpsulas y flagelos. Se utiliza el objetivo de
inmersin.
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4. PREPARACIONES PARA EXAMEN EN FRESCO LIGERAMENTE

MODIFICADAS.
En la U.T. 3 se dijo que como la mayora de los microorganismos tienen ndices de
refraccin similares a los del medio acuoso en el que estn suspendidos, resultan difcilmente
visibles a menos que ellos o la tcnica sufran alguna modificacin. Antes vimos cmo podamos
modificar la tcnica microscpica. Aqu estudiaremos las modificaciones ligeras a que podemos
someter a los microorganismos en una muestra fresca.
En primer lugar diremos qu entendemos por preparacin para examen ligeramente
modificada: nos referimos a preparaciones en fresco en las que a la muestra se le ha agregado una
sustancia que facilita o mejora la observacin de los microorganismos. Son principalmente
montajes hmedos tratados con un solo colorante o reactivo. Suelen usarse colorantes, aunque no
siempre esa as. Al agregar colorantes estamos realizando una tincin o coloracin. Ms adelante
trataremos este aspecto con mayor detenimiento.
Hay distintos tipos de preparaciones para examen en fresco ligeramente modificadas. Unas
tienen aplicacin a muy diversas muestras y microorganismos y se dice que son de utilidad general.
Otras tienen utilidad especfica. Estudiaremos las siguientes:

Tincin vital.

Hidrxido potsico al 10% para hongos.

Azul de lactofenol.

Blanco de calcoflor.

Tincin con tinta china para criptococos.

4.1.-Tincin vital.
La tincin vital, tambin llamada tincin o coloracin supravital, es un procedimiento
intermedio entre el examen en fresco sin modificacin y las tcnicas de fijacin seguida de
tincin.
Tiene por objeto poner de relieve detalles estructurales o de movilidad de los
microorganismos que no es posible observar en fresco ni tras realizar modificaciones fsicas y
qumicas profundas, como sucede con la fijacin seguida de tincin.

Se prepara del mismo modo que un montaje hmedo, pero antes de cubrir la gota de
muestra con el cubreobjetos se agrega una gota de un colorante que no mate los
microorganismos, se mezcla con el asa y se cubre con el cubreobjetos. Los microorganismos
que nos interesa observar absorbern el colorante ms que el medio y que los otros
elementos formes (si el colorante est bien elegido). Al observarlos en campo claro
absorbern ms la luz y aparecern coloreadas ms intensamente que otros elementos
formes y que el medio que los rodea.
Tambin puede prepararse por difusin: en el espacio entre el portasobjetos y cubreobjetos
de una preparacin en fresco se pone una gota de colorante que penetra en la muestra por
capilaridad.

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Los colorantes usados suelen ser los mismos que se utilizan para las tinciones simples (se
vern ms adelante) aunque muy diluidos. Esto se hace porque los colorantes son txicos
para las clulas. La dilucin disminuye su toxicidad y esto permite observar
microorganismos teidos y vivos, motivo por el cual a esta tincin se la llama vital o
supravital. No hay que olvidar, sin embargo, que la superior dilucin del colorante no
anular su toxicidad; tan slo retrasar la muerte de los microorganismos.
Los colorantes ms usados son:
1. Azul de metileno. Se usa con fines generales. Existen distintas variantes. Las ms
usadas contienen entre 0,5 y 0,75 % de colorante. Tambin se usan diluciones
superiores para tincin vital: alrededor de 1/10.000. Ver anexo.
2. Lugol (KI al 10% y yodo al 5% en agua). Se usa para visualizar quistes de
parsitos en heces.
3. Otros: rojo neutro, azul de tripn, nigrosina, verde Jans fisiolgico, etc
4. Violeta de genciana. Se usa como el azul de metileno

4.2.-Preparacin con KOH al 10%.

El empleo de KOH al 10% en agua permite distinguir los elementos estructurales de los
hongos miceliformes en muestras frescas. El lcali digiere parcialmente las protenas presentes
(tanto del hongo como de las clulas infectadas y del medio) pero no acta sobre los polisacridos
de las paredes celulares de los hongos.
La preparacin se realiza colocando una pequea cantidad de muestra sobre un portaobjetos.
Se agrega una gota de KOH 10%. Se cubre con un cubreobjetos y se presiona ligeramente el
portaobjetos con el cubreobjetos ( esto se realiza sobre papel de filtro para eliminar el exceso de
lquido). La preparacin puede observarse despus de esperar varios minutos (de 3 a 10) a
temperatura ambiente. No es conveniente calentar para acelerar la protelisis, pues puede
deteriorarse la muestra.
4.3.-Azul de lactofenol.
Este colorante mejora el contraste en las preparaciones de hongos miceliformes, permitiendo
observar los detalles estructurales. Puede emplearse solo o agregndolo en pequea proporcin al
KOH 10%
4.4.-Blanco de calcoflor.
Es otro colorante muy usado para visualizar hongos u otros microorganismos cuyas paredes
contengan quitina.
4.5.- Tincin con tinta china para criptococos.
A una gota de muestra (especialmente lquido cefalorraqudo) en la que se sospecha la
presencia Criptococcus neoformans puede agregrsele una gota de tinta china (Pelikn) o de
nigrosina. Esta levadura patgena posee una cpsula de polisacridos que repelen las partculas de
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tinta china (es una suspensin, no una disolucin). Tras cubrir con un cubreobjetos y observar al
microscopio, la cpsula aparecer como un halo claro rodeado de tinta (oscura). Tambin se utiliza
como colorante la nigrosina

5. PREPARACIONES FIJADAS Y TEIDAS.

La morfologa bacteriana puede ser estudiada de dos formas distintas:
1) Por visualizacin de los microorganismos vivos sin teir, lo que nos permite
adems observar su posible movilidad.
2) Por visualizacin de los microorganismos teidos mediante colorantes, con
una concentracin tal que hacen morir a la bacteria y no permiten observar su
movilidad, pero sin embargo se mejora notablemente la visualizacin de su
morfologa y otras estructuras segn el tipo de tincin llevada a cabo.
En general todas las bacterias vivas son prcticamente incoloras, no presentando suficiente
contraste con el medio acuoso donde se encuentran suspendidas, con lo cual no pueden ser
observadas con claridad. Pero si se tien se produce un gran contraste con respecto al medio que las
rodea. Adems, alguno de estos colorantes puede tambin teir estructuras internas de la bacteria, lo
que nos sirve para su identificacin.
Por todo esto, las principales ventajas de las tcnicas de tincin son:

Observar ms adecuadamente su morfologa.

Proporcionar el contraste preciso y suficiente en cada caso, lo que permitir diferenciar
distintos tipos morfolgicos.
Establecer una informacin complementaria sobre sus estructuras internas y/o externas
que no podran ser observadas por examen en fresco.
Conocer sus caractersticas tintoriales orientndonos hacia un grupo taxonmico u otro
en la clasificacin bacteriana.

Para observar las caractersticas de las bacterias y tambin de otras clulas las
preparaciones fijadas y teidas son las que se emplean con mayor frecuencia.

5.1.- Pasos a seguir en la preparacin de una muestra fijada y teida.

I.-Obtencin del frotis bacteriano (la muestra bacteriana se fija al
portaobjetos) que se realiza en tres pasos:
Primero.- Se realiza una extensin de la muestra. A esta extensin tambin
se le llama frote, frotis o pelcula. Debe ser suficientemente delgada y lo ms
homognea posible.
Se puede obtener de la forma siguiente:
Supongamos que tenemos un cultivo bacteriano en un medio slido (agar).y
queremos teir las bacterias que crecen en una colonia que nos ha llamado la
atencin y para ello comenzamos por obtener una extensin de esta colonia. Se pone
una gota muy pequea de suero salino (NaCl 0,9%) o de agua destilada en un
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portaobjetos. Se toma con el asa una porcin muy pequea de la colonia, se

emulsiona en la gota de lquido y se extiende de modo que ocupe 1 o 2 cm2 .

Segundo.- Se deja secar

al aire o agitndola a unos 20-35 cm encima de la llama del mechero

Bunsen, de modo que el aire caliente que asciende tenga una temperatura que
el operador pueda soportar (no ms de 40C). No debe calentarse ms porque
podra estropearse la muestra.
Tercero.- Se fija la extensin:.

Se pasa el portaobjetos (con la extensin hacia arriba) por la llama del

Bunsen dos o tres veces rpidamente. Debe averiguarse si se ha calentado
demasiado golpeando el portaobjetos sobre el dorso de la mano y
comprobando que no quema. Este tratamiento coagula las protenas
bacterianas y fija las clulas al vidrio, haciendo menos probable que las
bacterias sean arrastradas por los lquidos que se agregan para teir, siendo
este el principal motivo que hace necesaria la fijacin.

Debe tenerse en cuenta que en la extensin fijada an pueden quedar grmenes viables (vivos y
capaces de reproducirse), por lo que debe tratarse como material infeccioso.

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II.-Tincin. Ms adelante se describen los procedimientos concretos para cada tipo de tincin.

Durante la tincin los microorganismos captan el colorante. Teir supone una reaccin de
intercambio de iones de colorante a lugares activos de la superficie o interior de las estructuras
de la clula. Esto permitir, contrastar mucho ms el microorganismo con respecto al medio que
le rodea.
III.-Lavado. Permite eliminar el exceso de colorante. Una vez teida la extensin, se lava con

agua (dejando resbalar un chorro suave aplicado a un extremo del portaobjetos para que no arrastre
la extensin teida).

IV.-Secado. Permite eliminar el exceso de agua que dificultara una adecuada observacin

microscpica.

a. Para secar la extensin el portaobjetos puede escurrirse colocndolo de

canto sobre papel de filtro. Despus se deja secar sobre la mesa o bien se
seca rpidamente sobre la columna de aire tibio (no ms de 40C) que
despide un Bunsen.
b. Otra posibilidad consiste en absorber con un papal absorbente
(normalmente papel de filtro) la mayor parte del agua colocando el papel
sobre la extensin y presionando ligeramente. Despus se termina en el
aire caliente del Bunsen. Sin embargo, hay que ser muy cuidadoso con
este procedimiento, pues es fcil que la extensin quede adherida al papel

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absorbente.

5.2.-Colorantes.
Para teir los microorganismos se dispone de un gran nmero de colorantes. Estos son
sustancias orgnicas cuya estructura molecular suele ser compleja. Todas tienen en comn la
siguiente caracterstica: un coeficiente de extincin molar muy elevado en un determinado intervalo
de longitud de onda del espectro visible. Esto hace que incluso a muy bajas concentraciones posean
una notable capacidad de colorear estructuras.
Los colorantes se combinan qumicamente con el protoplasma bacteriano, si la clula no ha
muerto, el proceso mismo de la tincin la mata.
Los colorantes ms comnmente usados son sales, compuestas de un ion positivo y otro
negativo, uno de los cuales es coloreado y denominado cromforo.
Los bsicos consisten en un catin coloreado unido a un anin incoloro (ejemplo: cloruro de
azul de metileno), mientras que los cidos constituyen exactamente lo contrario (ejemplo: eosinato
de sodio).
Las clulas bacterianas son ricas en cidos nucleicos, los cuales portan cargas negativas en
forma de grupos fosfato, stos se combinan con los colorantes bsicos cargados positivamente, lo
cual les hace ser de los ms usados en citologa bacteriana.
Los colorantes cidos no tien la clula bacteriana y, por lo tanto, pueden ser usados para
proporcionar al fondo un color de contraste.
Los colorantes bsicos tien la clula bacteriana uniformemente a menos que antes sea
destruido el RNA del citoplasma. Sin embargo existen tcnicas especiales para teir selectivamente
flagelos, membranas, ncleos, grnulos, etc.
Es imprescindible utilizar colorantes de alta calidad. La presencia de impurezas puede hacer
que varen las caractersticas del colorante y con ello las caractersticas de la tincin. Tambin es
relativamente frecuente que aparezcan partculas slidas que se depositan sobre la extensin y son
confundidas con grmenes u otros elementos formes por lo que es aconsejable que estn bien
disueltos y que, una vez acabado el proceso de disolucin se filtre la preparacin para evitar
artefactos producidos en la observacin con los cristales de colorante sin disolver.
Tanto a los colorantes anormales como a los elementos formes observados que no proceden
de la muestra se les llama artefactos.
5.3.-Fundamento del proceso de tincin.
En general puede decirse que el proceso de tincin consiste en una unin del colorante a
determinados sitios activos de la superficie o del interior de la clula. El colorante suele formar un
enlace inico con estos sitios activos de la clula. Se trata de una reaccin de intercambio inico,
pues la molcula cargada del colorante desplaza a otros iones de igual carga. Por ejemplo, un
colorante como el azul de metileno, que es bsico, forma cationes coloreados y se unen a puntos de
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la clula que tienen carga negativa. Los colorantes cidos se cargan negativamente y se unen a
puntos de la clula con carga positiva. Estos colorantes pueden ser desplazados por disoluciones
con caractersticas que dependen del tipo de colorante: pH extremos, baja constante dielctrica para
hacer que el colorante deje de estar disociado y se libere, etc.
Los colorantes ms usados son derivados de la anilina y tiene un carcter bsico, como el
azul de metileno, violeta de genciana, cristal violeta y la fuchsina. Su basicidad permite teir bien el
citoplasma bacteriano debido a que es muy rico en cidos nucleicos (especialmente ARN), que son
polianiones y por lo tanto se unirn con facilidad a cationes grandes como las molculas de estos
colorantes.
5.4.-Factores que influyen en la tincin.
Hay una serie de parmetros que es necesario conocer y controlar para obtener una tincin
adecuada de la muestra, pues el desvo de los valores ptimos produce una tincin inadecuada y la
aparicin de artefactos, como son

1. La pureza de colorantes y reactivos: deben ser de alta calidad. Ya se ha hablado antes

2.

3.

4.
5.

6.

7.
8.

9.

de esto.
La concentracin del colorante: frecuentemente se encuentran entre el 0,2 y el 2 %
existiendo un valor ptimo para cada colorante en cada procedimiento de tincin.
Concentraciones superiores a la ptima aceleran el procedimiento de tincin, pero
pueden ocasionar la aparicin de artefactos. Concentraciones inferiores ocasionan
coloraciones dbiles que a veces se interpretan de modo errneo.
El pH de la disolucin colorante: es fundamental su control, pues influye sobre el
grado de fijacin del colorante. A veces se utilizan disoluciones tamponadas para
disolver el colorante. Otras veces simplemente se utiliza agua destilada y es el propio
colorante por su naturaleza cida o bsica quien ajusta el pH al valor ptimo.
Conservacin del colorante, que deber ubicarse siempre en lugares frescos, secos y
oscuros, adecuadamente envasados y etiquetados.
Elaboracin. Aunque en muchos casos estos colorantes ya vienen preparados,
generalmente dicha elaboracin se lleva a cabo a travs de disoluciones acuosas o
hidroalcohlicas a partir de polvo de colorante en las cantidades precisas que permitan
su solubilidad.
Tcnica empleada. Se deber ser escrupuloso a la hora de realizar una tincin; por
ejemplo, los portaobjetos y cubreobjetos debern estar siempre limpios y
desengrasados, nunca se mezclarn unos colorantes con otros, se seguir
rigurosamente paso a paso cada tcnica de coloracin, etc.
Cantidad de muestra. Deber ser representativa y homognea pero en ningn caso
muy grande, porque se apelotona y no se visualiza el microorganismo, ni tampoco
demasiado pequea, porque se corre el riesgo de no observar nada.
Realizar correctamente el frotis. Si se pretende visualizar una muestra ha de fijarse
previamente y, salvo excepciones, suele hacerse con calor. De no ser as, los
grmenes no quedan adheridos al portaobjetos y a la hora de adicionar colorantes
mordientes y decolorantes dichos microorganismos son arrastrados y no se podr
visualizar nada.
La temperatura: por regla general, la tincin es tanto ms rpida cuanto mayor es la
temperatura. La mayora de las tinciones se realiza a temperatura ambiente, aunque
algunas se hacen en caliente. Debe seguirse el procedimiento tcnico rutinario
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recomendado y no introducir cambios, pues pueden ofrecer resultados inesperados

que conduzcan a error.
10.Los reactivos adicionales: en determinados procedimientos se hace uso de reactivos
secundarios, mordientes, etc. Un ejemplo notable es el empleo del fenol (junto con
violeta de genciana, azul de metileno, etc.). Adems puede usarse un mordiente
suplementario, como el lugol en la tincin de Gram (se estudiar ms adelante).
11.El tiempo de tincin: a medida que avanza el tiempo de contacto entre extensin y
colorante, el proceso de tincin progresa. En general oscila entre 30 segundos y 10
minutos.
Adems de los factores citados, es necesario indicar que en muchos procedimientos de
tincin existe un factor aleatorio e impredecible. Pongamos un ejemplo: un microbilogo
experimentado normalmente obtendr tinciones de Gram de calidad diferente en dos laboratorios
distintos. La razn estriba en pequeos pero mltiples cambios experimentados en las condiciones
de tincin de un emplazamiento a otro. Para obtener tinciones de calidad en algunas de las tcnicas
que vamos a estudiar (entre las que se incluye la tincin de Gram) es necesario ms que respetar de
modo estricto tiempos y temperaturas, desarrollar una especie de sexto sentido, un cierto arte o
habilidad para realizar bien una tincin. Esto puede alcanzarse por medio de la prctica.
5.5.-Procedimiento de aplicacin de colorante.
Una vez fijada la extensin, puede someterse al proceso de tincin simple o diferencial
elegido. Hay que tener presente que es imprescindible dejar enfriar la extensin antes de aplicar el
colorante. De lo contrario, el colorante puede precipitar sobre la extensin, estropendola.
Podemos diferenciar entre dos procedimientos distintos para aplicar el colorante:
a) Procedimiento de inmersin: los portaobjetos con las extensiones se
sumergen en una cubeta que contiene el colorante durante el tiempo requerido.
b) Procedimiento de vertido: los portaobjetos con las extensiones se colocan
sobre un puente de tincin (doble barra paralela horizontal). Sobre ellos se
aplican unas gotas de colorante hasta que toda la extensin est cubierta.
Este es el procedimiento ms utilizado en microbiologa. Permite economizar
colorante y utilizar colorante nuevo para cada preparacin.
Se distinguen dos tipos:
Tincin en condiciones normales:
Sigue la tcnica general de tincin: extensin, desecacin, fijacin, tincin,
lavado del colorante y secado. La tincin se realiza colocando el porta con la
extensin ya fijada sobre unas barras paralelas colocadas sobre un
cristalizador. Se aaden el colorante y otros productos y los residuos se
recogen sobre el cristalizador.
Tincin en condiciones drsticas: Se utiliza cuando no
se tien en condiciones normales. Se recurre a la tincin con emisin de
vapores. Un ejemplo es la tincin de esporas y de bacilos cido-alcohol
resistentes.

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5.6.-Tipos de tinciones.
Podemos distinguir:
a) Tincin simple. Se caracteriza por:

Necesita fijacin previa.

Se utiliza un solo colorante.
Permite la visualizacin de la morfologa bacteriana.

Las tinciones simples se pueden clasificar a su vez en: tinciones simples con colorantes
bsicos, cidos o neutros.

b) Tincin negativa. Es un tipo de tincin simple pero con ciertas diferencias, ya que nos
permite observar caractersticas estructurales de la bacteria adems de su morfologa. sta se
caracterizar por:

No necesita fijacin previa.

Se utiliza un solo colorante (de ah que la tincin sea simple).
Nos permite visualizar sobre un fondo oscuro la forma de la bacteria
adems de alguna otra caracterstica estructural, como es la presencia de
cpsulas.

c) Tinciones diferenciales. Las tinciones diferenciales presentan las siguientes caractersticas:

Se necesitar fijacin previa generalmente por calor.

Se utilizarn dos colorantes, siendo el ltimo el colorante de contraste.
Nos permite visualizar su morfologa y otras caractersticas, como pueden
ser la composicin de la pared bacteriana, su resistencia a la decoloracin
cida, etc.; como sucede en la tincin de Gram y en la tincin de Ziehl Neelsen.

d) Tinciones estructurales. Las tinciones estructurales presentan las siguientes caractersticas:

Requiere fijacin previa, generalmente por calor.

Utiliza al menos dos colorantes.
Nos permite observar su morfologa.
Nos permite visualizar otras caractersticas de carcter estructural. Entre
las tinciones estructurales ms importantes est la tincin de endosporas
(tincin que se da en unas condiciones drsticas), la tincin de cpsulas,
la tincin de flagelos y cilios, la tincin de corpsculos metacromticos,
etc. Esta ltima requiere un solo colorante.

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Tanto la tincin simple como la tincin diferencial las describiremos con detalle en los guiones
de prcticas
Hay que puntualizar que los mtodos de tincin descritos en los guiones de prcticas no estn
universalmente aceptados en cuanto a las concentraciones de los reactivos y los tiempos de
aplicacin. En laboratorios distintos es corriente encontrar modificaciones de los mtodos
realizadas segn las preferencias personales de los analistas y microbilogos. Incluso algunos
reactivos y colorantes pueden haberse sustituido por otros. Describiremos los protocolos de ms
amplia aceptacin.
Describimos, a continuacin, el procedimiento de Tincin Negativa que no aparece en los guiones
de prcticas
TINCIN NEGATIVA
Objetivos:

Determinacin morfolgica rpida (la preparacin no requiere fijacin previa).

Evidenciar la presencia de cpsulas.

Fundamento:
Consiste en la aplicacin de un colorante cido (cargado negativamente). Por ello, los
microorganismos, que tambin estn cargados negativamente, no van a captar el colorante,
quedando claros y brillantes sobre un fondo teido oscuro. Este mtodo es menos utilizado en
bacteriologa que otras tcnicas de tincin, pero proporciona una visin muy exacta de las
clulas bacterianas y se consigue una imagen ms real de su forma y tamao, adems de
permitirnos observar si presentan o no cpsulas.
Material:

El material sera anlogo al de la tincin simple a excepcin de que, al no requerir fijacin

previa, no necesita calor y, por lo tanto, no hace falta mechero Bunsen.
El colorante utilizado para esta tincin es tinta china o solucin acuosa de nigrosina al 1 %.
Tcnica:

Tomar con el asa de siembra previamente esterilizada una cantidad de muestra y

pasarla a un portaobjetos previamente limpio y desengrasado.
A la muestra del portaobjetos se le aade una gota de solucin de nigrosina al 1 % y se mezcla
cuidadosamente con el asa de siembra formando una capa fina. Si pretendemos obtener una
capa muy fina nos ayudaremos con el borde de otro portaobjetos, graduando de esta forma el
grosor, ya que si es demasiado gruesa impedir el paso de luz del microscopio adems de
formarse grietas al secarse la nigrosina. Tampoco conviene un frotis demasiado fino ya que no
proporcionar demasiado contraste entre el medio y las clulas bacterianas.
Una vez adicionada la nigrosina en la muestra se deja secar al aire.
Ya seca se examinar con objetivo de inmersin.
Resultados:

Se observarn las clulas bacterianas incoloras y un tanto brillantes sobre un fondo oscuro.
Se podrn tambin observar las cpsulas si las presentase en forma de un halo ms claro que
rodea el cuerpo de la bacteria.

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