Professional Documents
Culture Documents
Introduccin
La congelacin del embrin equino es un desafo. Desafo para los investigadores y desafo para los
veterinarios de campo debido a los pobres resultados obtenidos (ndices de preez decepcionantes
despus de la transferencia de embriones congelados), la dificultad de la tcnica y su costo. En 2010, y a
diferencia de otras especies, solamente 2% de los embriones colectados fueron crioconservados en el
mundo (Stout, 2012). Sin embargo, la crioconservacin de embriones permitira liberarse de la
sincronizacin costosa, pesada y poco eficaz entre donantes y receptoras, y aplazar la transferencia de
los embriones a fin de programar los nacimientos en la mejor poca del ao. De manera general, la
crioconservacin de embriones permite salvaguardar especies silvestres amenazadas, creando
criobancos de embriones, y desarrollar el intercambio de material gentico. La primera cra nacida
proveniente de la transferencia de un embrin congelado mediante congelacin lenta fue reportada en
1982 por Yamamoto. Desde entonces, han sido muchas las investigaciones para conseguir una tcnica
rpida, sencilla, fiable y de bajo costo que permitiese obtener unos ndices de preez y de partos
aceptables. Casi 30 aos despus del primero nacimiento fue reportado el nacimiento de una cra
proveniente de la transferencia de un embrin vitrificado por Scherzer en 2011, 17 aos despus de la
primera preez luego de la transferencia de un embrin vitrificado (Hochi et al, 1994). Por qu es tan
complicado lograr la crioconservacin de los embriones equinos? Cules son los daos debidos a la
congelacin y cules son los medios de proteccin? Cules son las tcnicas a la disposicin del
veterinario de campo? Cules son las particularidades del embrin equino que podran explicar la
dificultad de la tcnica y los ltimos avances en investigacin?
Cules son las particularidades del embrin equino que podran explicar la
dificultad de la tcnica?
Calidad del embrin
La calidad del embrin recuperado es importante, ya que slo son aptos para la congelacin los
embriones de grado I (excelente) o grado II (bueno), segn la clasificacin de Mckinnon y Squires (1988).
Afortunadamente, la gran mayora de los embriones recuperados son de buena calidad.
Tamao y edad del embrin
El tamao y el estado de desarrollo del embrin recuperado son factores claves en el xito de la
congelacin de embriones equinos. En efecto, los mejores resultados se obtienen cuando se congelan
mrulas o blastocistos tempranos, con un dimetro medio menos de 300 m comparativamente a los
blastocistos y blastocistos expandidos con un dimetro de ms de 300 m.
A los 5,5-6 das despus de la ovulacin, el embrin equino, en estado de mrula, entra en el tero y
empieza una fase de mitosis intensa (eso supone que las mitocondrias y el citoesqueleto son ms
expuestos a los daos debidos a la congelacin). La mrula evoluciona en blastocisto temprano con el
inicio de la formacin del blastocele. Tambin, al entrar en el tero, una capa glicoproteica se forma
entre el trofoblasto y la zona pelcida adelgazada: la capsula.
Entonces, los embriones recuperados por lavado tero a un medio de 6,5 das despus de la ovulacin
miden menos de 300 m, no tienen desarrollados el blastocele ni la capsula. Al contrario, los
blastocistos recuperados por lavado a los 7-8 das miden ms de 300m, tienen un blastocele grande y
una capsula espesa. Estas caractersticas tienen mucha importancia, ya que los cambios de volumen del
embrin, la cantidad de agua y la permeabilidad a los crioprotectores vara enormemente a medida que
el embrin se va desarrollando. Los embriones ms grandes (blastocisto y blastocisto expandido) no
toleran bien el proceso de congelacin-descongelacin, producto de un mayor ndice de muerte celular
y alteracin de las orgnulos. Estos daos son debidos a la presencia de la capsula glicoproteica que
rodea al embrin a partir del estado de blastocisto, impidiendo la adecuada difusin del crioprotector a
las clulas de la masa interna (Kingma et al, 2011). Los estudios sobre la capsula demuestran que un
tratamiento enzimtico de la capsula permite una mejor penetracin del crioprotector pero una menor
viabilidad in vivo tras transferencia (Legrand et al, 2003). Adems, el desarrollo del blastocele,
condiciona el proceso de deshidratacin, aumentando las probabilidades de formacin de cristales
intracelulares durante la congelacin que posiblemente daen las clulas embrionarias.
El problema es que la recuperacin de embriones de 6,5 das es difcil con ndices de xito de recolecta
bajos. Desafortunadamente, los ndices de preez tras transferencia son de por medio de 55%. Lo ideal
sera de encontrar la maneja de congelar con xito los embriones colectados a 7 o 8 das, cuando los
ndices de xito de colecta son superiores.
Recientes trabajos de Hinrichs y Choi sobre las biopsias de embriones en el fin de realizar una muestra
para el diagnstico gentico preimplantacional (DGP) han demostrado que el colapso del blastocele
inducido por la muestra de trofoblasto no afecta los ndices de preez tras transferencia (Hinrichs y
Choi, 2012). De estos resultados, se intent vitrificar los embriones luego colapso del blastocele con
etilenglicol y sucrosa. Mostraron que mientras ms colapsado est el blastocele, mejores sern los
ndices de preez. El mtodo de aspiracin del lquido es importante. Es preferible aspirar el lquido
desde la periferia (el trofoblasto), que entrar hasta el centro del blastocele. Con esta tcnica, se han
logrado ndices de preez muy buenos (86%) tras la aspiracin del blastocele y posterior vitrificacin,
poniendo de manifiesto la importancia de una disminucin de volumen en el proceso de
crioconservacin (Choi et al, 2011).
Conclusin
Desde hace los ltimos 30 aos, solo la crioconservacin de los embriones de menos de 300m de
dimetro permita ndices de preez del 50% en promedio luego de la transferencia. Comparando la
vitrificacin con la congelacin lenta, las dos tcnicas son aplicables en el campo con ndices de preez
similares. Por su rapidez de ejecucin y el hecho que permite una inversin moderada
comparativamente al costo de la compra de un congelador programable necesario para la congelacin
lenta, la vitrificacin es la ms practicada en el campo con embriones colectados a los 6,5-7 das.
Aunque se necesita el uso de soluciones de crioprotectores a alta concentracin toxica para el embrin
y se requiere experiencia en el manejo de los embriones. En lo que se refiere a los embriones de ms de
300 m de dimetro, son constituidos de un blastocele lleno de lquido y tienen una capsula que los
rodea e impide la penetracin de los crioprotectores. Adems representan un grande volumen. Hasta
hace poco tiempo, estos embriones no sobrevivan a la congelacin. Reciamente, Hinrichs y Choi, al
desarrollar el DGP, encontraron la manera de congelar blastocistos expandidos sacndoles el lquido del
blastocele previamente a la vitrificacin. Desafortunadamente, la tcnica de colapso del blastocele
implica el uso de un micromanipulador, reservado a los laboratorios especializados. El desarrollo de la
congelacin del blastocisto a nivel comercial supondra un gran paso para la industria de la
reproduccin equina y los investigadores han dado un paso muy importante con los ltimos resultados.
Quiz falta poco para estandarizar y adaptar la tcnica al campo !
Bibliografa
Bruyas JF. Freezing of embryos. In: McKinnon AO, Squires EL, Vaala WE, Varner DD Equine Reproduction 2nd Ed
Wiley-Blackwell. 2011:2887-2920
Carnevale EM, Eldridge-Panuska WD, Caracciolo di Brienza V. How to collect and vitrify equine embryos for direct
transfer. In 50th Annual Convention AAEP, 2004, Denver, Colorado
Choi YH, Velez IC, Riera FL, Roldan JE, Hartman DL, Bliss SB, Blanchard TL, Hayden SS, Hinrichs K. Successful
cryopreservation of expanded equine blastocysts. Theriogenology 2011;76:143-152
Eldridge-Panuska WD, Caracciolo di Brienza V, Seidel Jr. GE, Squires EL, Carnevale EM Establishment of
pregnancies after serial dilution or direct transfer by vitrified equine embryos. Theriogenology 2005;63:13081318.
Hinrichs K, Choi YH. Equine embryo biopsy, genetic testing and cryopreservation. Journal of Equine Veterinary
Science 2012;32:390-396
Hochi S, Fujimoto T, Braun J, Oguri N. Pregnancies following transfer of equine embryos cryopreserved by
vitrification. Theriogenology 1994;42:4838.
Hochi S, Maruyama K, Oguri N. Direct transfer of equine blastocysts frozen-thawed in the presence of ethylene
glycol and sucrose. Theriogenology 1996;46:1217-1224
Kingma SE, Thibault ME, Betteridge KJ, Schlaf M, Gartley CJ, Chenier TS. Permeability of the equine embryonic
capsule to ethylene glycol and glycerol in vitro. Theriogenology 2011;76(8):1540-51
Legrand E, Bencharif I, Barrier-Battut I, Delajarraud H, Cornire P, Fini F, Tainturier D, Bruyas JF. Comparison of
pregnancy rates for days 7-8 equine embryos frozen in glycerol with or without previous enzymatic treatment of
their capsule. Theriogenology 2002;58:721-3
McKinnon AO, Squires EL. Morphologic assessment of the equine embryo. J Am Vet Med Assoc 1988;192(3):401-6
Pfaff R, Seidel GE, Squires EL, Jasko DJ. Permeability of equine blastocysts to ethylene glycol and glycerol.
Theriogenology 1993;39:284.
Scherzer J, Davis C, Hurley DJ. Laser-assisted vitrification of large equine embryos. Reprod Dom Anim
2011;46:1104-1106
Stout TA. Cryopreservation of equine embryos: current state-of-the-art. Reprod Dom Anim 2012;47(Suppl 3):8489
Yamamoto Y, Oguri N, Tsutsumi Y, Hachinohe YJ. Experiments in the freezing and storage of equine embryos. J
Reprod Fert Suppl. 1982;32:399-403.