Professional Documents
Culture Documents
STRESZCZENIE
itochondria tworz w komrce dynamiczn sie, ktra ulega cigym procesom fuzji i
fragmentacji. Fragmentacja mitochondriw jest elementem wielu istotnych procesw
komrkowych, do ktrych midzy innymi nale mitoza, apoptoza czy mitofagia. Gwnym
biakiem biorcym udzia w tym procesie jest Drp1 (ang. dynamin related protein 1). Biako
to posiada zdolno oligomeryzacji, dziki czemu tworzy na powierzchni bon mitochondrialnych spiralne struktury, ktre w wyniku hydrolizy GTP zaciskaj si i przerywaj integralno bon prowadzc do fragmentacji mitochondrium. Proces ten jest cile regulowany
poprzez rne mechanizmy, gwnie za porednictwem kontroli aktywnoci biaka Drp1.
Praca ta przedstawia obecny stan wiedzy na temat fragmentacji mitochondriw ze szczeglnym uwzgldnieniem roli i regulacji aktywnoci Drp1 w tym procesie.
WPROWADZENIE
Mitochondria stanowi zoon struktur komrkow, ktra tworzy skomplikowan sie wzajemnych pocze oraz jest zaangaowana w regulacj wielu procesw komrkowych takich jak synteza ATP, apoptoza lub buforowanie
poziomu jonw wapnia w komrce [1]. Ewolucyjnie mitochondria powstay w
drodze wchonicia komrek -proteobakterii przez prekursora dzisiejszej komrki eukariotycznej, w wyniku czego powstaa struktura komrkowa otoczona podwjn bon lipidow i dysponujca wasnym mitochondrialnym genomem (mtDNA) [1,2]. W zewntrznej bonie mitochondrialnej zakotwiczonych
jest wiele biaek poredniczcych w oddziaywaniach z biakami cytoplazmatycznymi, jak rwnie umieszczone s kompleksy i kanay biakowe odpowiadajce za transport czsteczek midzy cytoplazm i mitochondrium. Silne pofadowanie wewntrznej bony mitochondrialnej zapewnia du powierzchni
umoliwiajc wydajne rozmieszczenie znajdujcych si w niej kompleksw
acucha oddechowego. Najbardziej wewntrzn cz mitochondrium stanowi
macierz mitochondrialna, w ktrej znajduj si midzy innymi rybosomy oraz
mtDNA. Pomidzy wewntrzn i zewntrzn bon znajduje si przestrze midzybonowa, w ktrej wystpuj biaka regulujce dziaanie kompleksw acucha oddechowego oraz ruch i modyfikacje czsteczek transportowanych do
mitochondriw. Dziaanie acucha oddechowego powoduje wygenerowanie
rnicy potencjau elektrochemicznego pomidzy przestrzeni midzybonow
a macierz mitochondrialn. Rnica potencjaw zapewnia si napdow dla
syntezy ATP, umoliwia transport jonw wapnia do macierzy mitochondrialnej
oraz jest miar prawidowej funkcjonalnoci mitochondriw. Zaburzenia rnicy potencjaw s zatem sygnaem do naprawy lub wyeliminowania wadliwych
mitochondriw [1,3].
Bernadeta Michalska
Jerzy Duszyski
Jdrzej Szymaski
Pracownia Bioenergetyki i Bon Biologicznych,
Instytut Biologii Dowiadczalnej im. M. Nenckiego PAN, Warszawa
Pracownia Bioenergetyki i Bon
Biologicznych, Instytut Biologii
Dowiadczalnej im. M. Nenckiego PAN, ul.
Pasteura 3, 02-093 Warszawa;
tel.: (22) 589 23 45,
e-mail: j.szymanski@nencki.gov.pl
127
Rycina 1. Reorganizacja struktury sieci mitochondrialnej jest moliwa dziki procesom fuzji i fragmentacji. Proces fragmentacji jest niezbdny w wielu procesach
komrkowych, takich jak (A) utrzymanie funkcjonalnej sieci mitochondrialnej
poprzez eliminacj uszkodzonych fragmentw sieci w drodze mitofagii, (B) indukowanie apoptozy w wyniku uwolnienia cytochromu c (lub innych czynnikw
proapoptotycznych) z przestrzeni midzybonowej, (C) wydajny transport mniejszych mitochondriw wzdu cytoszkieletu do miejsc komrki wykazujcych
zwikszone zapotrzebowanie na ATP, (D) rwnomierny rozkad prawidowego
(zielone piercienie) i zmutowanego (czerwone piercienie) mtDNA pomidzy
rne obszary sieci powstae w wyniku fragmentacji oraz rwny podzia mitochondriw do komrek potomnych. Ostatni aspekt jest niezwykle wany, gdy
mitochondria nie powstaj w komrce de novo, lecz s generowane w drodze
wzrostu i podziau ju wczeniej istniejcych, odziedziczonych mitochondriw
(biogeneza mitochondriw).
Rycina 2. Porwnanie sekwencji izoform Drp1 (grny rysunek): przedstawiono sze izoform, rnicych si wystpowaniem wybranych eksonw (nr 3,16,17): izoforma
1 (736 aa, NP_036192), izoforma 2 (710 aa, NP_036193), izoforma 3 (699 aa, NP_005681), izoforma 4 (725 aa, NP_001265392), izoforma 5 (749 aa, NP_001265393), izoforma
6 (738 aa, NP_001265394). Poniej izoformy 5 zaznaczono kolorami fragmenty sekwencji biaka Drp1 odpowiadajce jego rnym domenom. Eksony zaznaczono kolorem
szarym w najniszym rzdzie. Na schemacie pominito najkrtsz izoform 7 (533 aa), ktra powstaje z wykorzystaniem alternatywnego kodonu start. Struktura Drp1
(dolny rysunek) - przedstawienie budowy domenowej dla monomeru (po lewej) oraz dimeru (po prawej) na podstawie struktury krystalograficznej biaka Drp1 (4BEJ,
PDB). Kolory odpowiadaj domenom zgodnie z opisem na grnym rysunku. Tylko fragment domeny zmiennej nie jest widoczny w strukturze krystalograficznej, gdy
zosta w duej czci usunity z biaka rekombinowanego w celu uzyskania krysztaw biaka.
128
www.postepybiochemii.pl
przy okreleniu domena zmienna i wyrniaj w tym rejonie fragment zwany insertem B i wanie to nazewnictwo
bdzie uywane w niniejszym artykule. Domeny GTPazowa, rodkowa oraz GED wystpuj u wszystkich biaek z
rodziny dynamin, natomiast domena zmienna jest charakterystyczna tylko dla Drp1 [16] i jest rejonem odgrywajcym
istotn rol w regulacji aktywnoci tego biaka, co zostanie
szerzej opisane. Rol domeny GTPazowej jest hydroliza
GTP, a domena GED wie si z domen GTPazow, przez
co stymuluje jej aktywno [12]. Domena rodkowa bierze
udzia w formowaniu si Drp1 w dimery, tetrametry oraz
struktury wyszego rzdu [12].
IZOFORMY
Produkty genu DNM1L podlegaj alternatywnemu splicingowi w trzech eksonach (eksony 3, 16, 17) spord 21
kodujcych biako Drp1 [17]. Ekson 3 koduje fragment domeny GTPazowej, a eksony 16 i 17 koduj rejon insertu B
(Ryc. 2). Wikszo poszczeglnych izoform Drp1 rni si
pomidzy sob liczb aminokwasw wystpujc w insercie B w domenie zmiennej, std te wzia si nazwa tej domeny. Alternatywny splicing Drp1 w trzech eksonach daje
moliwo istnienia 23 = 8 izoform tego biaka [17], z czego
wedug bazy sekwencji referencyjnych (www.ensembl.org,
ludzki gen: DNM1L) wyrnia si 7 izoform. Jedna spord tych 7 izoform (izoforma 2, Ryc. 2) oprcz zdolnoci
do interakcji z mitochondriami, jest w stanie oddziaywa
take z mikrotubulami. Alternatywny splicing Drp1 wpywa wic na lokalizacj tego biaka w komrce i zaley take
od rodzaju komrek. Badania przeprowadzone na myszach
wykazay, e na przykad wzr ekspresji izoform Drp1 w
mzgu jest cakowicie inny od wzoru ekspresji genw kodujcych izoformy tego biaka w nerkach [17]. Poszczeglne
izoformy Drp1 maj wic rne znaczenie funkcjonalne dla
komrek. Wielko izoform Drp1 wystpuje w zakresie od
699 do 749 reszt aminokwasowych, co daje mas okoo 80
kDa.
STRUKTURY OLIGOMERYCZNE DRP1
Drp1 wykazuje zdolno do oddziaywania z zewntrzn bon mitochondrialn. W komrce biako to przemieszcza si pomidzy cytosolem a sieci mitochondrialn
(Ryc. 3), lecz tylko niewielka cz populacji tego biaka
zwizana w danej chwili z mitochondriami jest zaangaowana w proces fragmentacji [18,24]. Po zrekrutowaniu do
miejsca fragmentacji biako Drp1 tworzy struktur spiraln, ktra oplata mitochondrium i wie GTP [16]. Jeden
z modeli pokazuje, e to miejsce podziau jest otoczone
przez okoo 48 tetramerw Drp1, a piercie tworzony
przez Drp1 na powierzchni mitochondrium jest podwjn
spiral [15]. Wizanie GTP do oligomeru Drp1 powoduje
jego stabilizacj oraz niewielkie zmniejszenie si jego rednicy wynikajce z uporzdkowania powstaej struktury
poprzez zmiany konformacyjne. Nastpnie ma miejsce hydroliza GTP, ktra umoliwia wytworzenie si energii mechanicznej potrzebnej do zaciskania si piercienia Drp1
poprzez dalsze zmiany konformacyjne tego biaka, co
prowadzi do przerwania fragmentu sieci mitochondrialnej w wyniku reorganizacji struktury bon mitochondrium
w tym miejscu [16]. Po fragmentacji oligomer Drp1 ulega
rozpadowi na mniejsze elementy, umoliwiajc ponowne
wykorzystanie biaka w tym procesie [25]. Zaobserwowano, e po zakoczeniu fragmentacji pewna cz Drp1
przez krtki czas pozostaje zwizana z obydwoma nowopowstaymi kocami mitochondrium (Ryc. 3) [21,26,27].
Na podstawie tych obserwacji wyrniono 3 typy struktur,
ktre Drp1 tworzy na powierzchni mitochondriw podczas ich fragmentacji: Drp1 zwizane do mitochondriw
w miejscach ich zmniejszonej rednicy; Drp1 zwizane do
mitochondriw po fragmentacji, ale unieruchomionych
i wci poczonych za porednictwem tego biaka, oraz
Drp1 zwizane z rozdzielonymi ju nowopowstaymi kocami tego organellum (Ryc. 4) [21,27]. To sugeruje, e do
129
Rycina 3. Mitochondria tworz w komrce zoon sie, ktra moe podlega dynamicznym przeksztaceniom. Po lewej stronie zdjcie komrek HeLa wybarwionych
barwnikiem mitotracker, mitochondria zaznaczono na biao. Obok, z prawej strony, przykad fragmentacji sieci mitochondrialnej, uchwycony w kilkusekundowych
odstpach czasu (0, 2, 4 sekundy). Biako Drp1 oznaczono kolorem zielonym, a mitochondria czerwonym. Skal (2 m) zaznaczono jako biay pasek w grnym prawym
rogu kadego zdjcia. Pomiary wykonano z uyciem stabilnej linii GFP-Drp1 (komrki HeLa Kyoto), w ktrej mitochondria oznakowano wykorzystujc biako mito-mNeptune. Po prawej stronie przedstawiono schemat ilustrujcy dwa rne modele fragmentacji mitochondriw rozwaane w literaturze: (model A) biako Drp1 jest
rekrutowane do miejsca podziau bezporednio przed zajciem tego procesu, gdzie tworzy piercie, przy pomocy ktrego dokonuje si nastpnie fragmentacja mitochondrium, (model B) biako Drp1 wie si na powierzchni mitochondrium, a nastpnie przemieszcza si po tej powierzchni i tworzy coraz wiksze kompleksy, ktre
w miejscach podziau mog doprowadzi do fragmentacji mitochondrium. Niemodyfikowane komrki HeLa Kyoto otrzymano z laboratorium Jana Ellenberga (EMBL
Heidelberg) za zgod prof. Shuh Narumiya z Uniwersytetu w Kyoto. Zdjcia wykonano przez autorw artykuu przy uyciu mikroskopw Leica SP8 oraz Zeiss Spinning
Disc w Pracowni Obrazowania Struktury i Funkcji Tkankowych w Instytucie Nenckiego. Przy otrzymywaniu stabilnej linii GFP-Drp1 korzystano z urzdze Pracowni
Cytometrii Instytutu Nenckiego.
fragmentacji mitochondrium dochodzi porodku otaczajcej to organellum podwjnej spirali tworzonej przez Drp1
[15,21,26]. Dodatkowo, Drp1 stabilizuje struktury mitochondrium w porednich etapach procesu fragmentacji,
w ktrych nastpuje unieruchomienie nowopowstaych
kocw za porednictwem tego biaka. Rol tej stabilizacji
moe by zmniejszenie energii produktu reakcji fragmentacji, po czym dopiero nastpuje separacja nowopowstaych kocw mitochondrium. W separacji i oddalaniu si
od siebie nowych kocw mitochondrium bierze udzia
cytoszkielet komrki [21]. Badania przeprowadzone na
drodach za pomoc mikroskopii elektronowej wykazay,
e rednica mitochondriw w miejscu fragmentacji wynosi
okoo 109 nm i jest to warto zbliona do urednionego
rozmiaru struktury tworzonej przez Dnm1 (odpowiednik
Drp1 u drody) w roztworze z dodatkiem niezdolnego
do hydrolizy analogu GTP [28]. Typowa rednica mitochondriw wynosi od 500 do 1000 nm, co sugeruje, e zanim Drp1 zostanie zrekrutowane do miejsc fragmentacji i
utworzy spiralny oligomer, musi zaj proces wstpnego
zmniejszenia rednicy mitochondriw do wczeniej wspomnianej wartoci wynoszcej okoo 100 nm [29]. W proces
Rycina 4. Etapy fragmentacji mitochondriw z udziaem Drp1. (1) Uformowanie si podwjnej spirali Drp1 na zewntrznej bonie mitochondrium o wstpnie zmniejszonej rednicy. (2) Zaciskanie
si spirali Drp1 pod wpywem hydrolizy GTP, co powoduje dalsze zmniejszanie si rednicy mitochondrium w tym miejscu. (3) Powstanie nowych kocw sieci mitochondrialnej, ktre s unieruchomione i stabilizowane za porednictwem Drp1. (4) Separacja nowopowstaych kocw sieci
mitochondrialnej. Cz Drp1 pozostaje zwizana z tym kocami przez pewien czas.
130
Wiele bada jest prowadzonych na temat wpywu domeny zmiennej i wystpujcego w niej insertu B na oddziaywanie Drp1 z mitochondriami. Obecno lub brak insertu B
jak rwnie caej domeny zmiennej w Drp1 ma wpyw na
rednic spiralnych oligomerw tworzonych przez to biako. Z bada przeprowadzonych in vitro wynika, e Drp1 z
delecj caego fragmentu domeny zmiennej na powierzchni
bon formuje si w spiralne polimery o rednicy powyej
250 nm [25]. Obecno domeny zmiennej, ale bez insertu
B, prowadzi do tworzenia spiral Drp1 o rednicy poniej
200 nm, natomiast obecno tego insertu w czsteczce Drp1
powoduje zmniejszenie si rednicy tworzonych spiral do
wartoci poniej 100 nm [23]. Wystpowanie insertu B w domenie zmiennej Drp1 jest gwnym wyznacznikiem stopnia
zakrzywienia powstajcej struktury spiralnej i moliwoci
dopasowania jej do ksztatu bony biologicznej podlegajcej przeksztaceniom [23,25]. Zaobserwowano, e obecno
insertu B hamuje aktywno GTPazow biaka Drp1 [23,26].
Sugeruje si, e ta obniona aktywno GTPazowa wpywa
na zahamowanie procesw fragmentacji mitochondriw
poprzez osabion zdolno odczania funkcjonalnych dimerw z rezerwuarw Drp1, co jest procesem zalenym
od hydrolizy GTP [22,23]. Delecja caego fragmentu domeny zmiennej powoduje nadmiern aktywno tego biaka,
ktre w tym wypadku wystpuje w roztworze wycznie w
postaci dimerw [32]. W warunkach sprzyjajcych oligomeryzacji (w roztworze), brak tej domeny promuje przedwczesne formowanie si Drp1 w wiksze struktury. Wykazano,
e te struktury wyszego rzdu tworz dobrze uporzdkowane filamenty [25]. Zaproponowano wic, e domena
zmienna wraz insertem B allosterycznie moduluje zdolno
tworzenia si oligomerw Drp1, co moe mie rol w hamowaniu nadmiernej oligomeryzacji Drp1 in vivo [23,26].
Badania przeprowadzone w komrkach potwierdzaj hipotez o samohamujcej roli penionej przez domen zmienn [26]. Usytuowanie domeny zmiennej w przestrzennej
strukturze Drp1 blokuje fragment tego biaka, ktry jest
odpowiedzialny za jego oligomeryzacj. Domena ta moe
wic zapobiega przedwczesnej, nieproduktywnej oligomeryzacji, gdy Drp1 znajduje si w cytosolu. Natomiast na
powierzchni mitochondrium oddziaywanie Drp1 z lipidami bony mitochondrialnej moe powodowa zmian konformacji tego biaka prowadzc do odsonicia fragmentu
promujcego oligomeryzacj, ktra umoliwia formowanie
si funkcjonalnych spiral prowadzcych do fragmentacji
tego organellum [25]. W zwizku z tym, e w badaniach
in vitro brak domeny zmiennej nie wpywa hamujco na
tworzenie funkcjonalnych oligomerw Drp1 na powierzchni dwuwarstw lipidowych, wywnioskowano, e mechanoenzymatyczny rdze tego biaka skadajcy si z domen
GTPazowej, rodkowej oraz GED jest wystarczajcym elementem potrzebnym do zacinicia bon pod wpywem
hydrolizy GTP. Domena zmienna peni natomiast funkcj
Postpy Biochemii 62 (2) 2016
regulatorow poprzez kontrol oligomeryzacji Drp1 zarwno w roztworze jak i na powierzchni bon. Bierze ona udzia
w procesie osigania przez oligomery Drp1 prawidowej
geometrii na powierzchni mitochondrium, ktra w dalszym
etapie umoliwia cakowite zacinicie bon prowadzce do
ich fragmentacji. Funkcj regulatorow domeny zmiennej
moe potwierdza take fakt, e w tej domenie wystpuje
najwicej miejsc potranslacyjnych modyfikacji Drp1 [15,25].
MODYFIKACJE POTRANSLACYJNE DRP1
Drp1 podlega rnego rodzaju modyfikacjom potranslacyjnym, ktre wpywajc na aktywno, lokalizacj oraz
dynamik tego biaka, odgrywaj wan rol w regulacji
procesu fragmentacji mitochondriw. Jak ju wspomniano,
wikszo miejsc potranslacyjnych modyfikacji Drp1 mieci
si w domenie zmiennej [15]. Znaczenie modyfikacji potranslacyjnych w regulacji aktywnoci Drp1 moe podkrela fakt, e zwyka nadekspresja tego biaka nie prowadzi
do zwikszenia poziomu fragmentacji mitochondriw [33].
Modyfikacje te obejmuj fosforylacj, sumoilacj, ubikwitylacj oraz S-nitrozylacj.
Spord wymienionych modyfikacji najwicej wiadomo
o fosforylacji Drp1. Drp1 podlega tej modyfikacji w wielu
miejscach, do ktrych nale: reszty seryn 616, 637 oraz 693
(numeracja waciwa dla izoformy 1 Drp1, o dugoci 736
reszt aminokwasowych), z ktrych pierwsze dwa miejsca
zostay najlepiej scharakteryzowane. Fosforylacja reszty
seryny 616 przez zalen od cykliny B1 kinaz 1 (Cdk1,
ang. cyclin dependent kinase 1) powoduje aktywacj Drp1
podczas mitozy, co indukuje fragmentacj mitochondriw
potrzebn do rwnomiernej dystrybucji tego organellum
do komrek potomnych [34]. W warunkach stresu oksydacyjnego aktywuje si inna kinaza kinaza biakowa C
(PKC, ang. protein kinase C ), ktra rwnie poredniczy
w fosforylacji, reszty seryny 616, co powoduje fragmentacj
oraz nieprawidowe funkcjonowanie mitochondriw, przez
co prowadzi do uszkodze mzgu [35]. Poza tym niedawno odkryto, e fosforylacja reszty seryny 616 Drp1 przez
kinaz Erk jest niezbdnym, wczesnym etapem procesu indukowanego reprogramowania komrek do komrek pluripotentnych [36]. Natomiast fosforylacja reszty seryny 637
przez zalen od cAMP kinaz biakow (PKA, ang. protein
kinase A) inaktywuje to biako, co ma zwizek midzy innymi ze zmniejszeniem podatnoci komrki na apoptoz
[37,38]. PKA fosforyluje zarwno frakcj Drp1 wystpujc
w cytosolu jak i t na zewntrznej bonie mitochondrialnej.
Fosforylacja cytosolowej frakcji Drp1 zapobiega przemieszczeniu si tego biaka do mitochondrium [39]. Natomiast
podczas fosforylacji mitochondrialnej frakcji Drp1, biako
PKA jest rekrutowane do zewntrznej bony mitochondrium przez wystpujce w tej bonie biako AKAP1 (ang.
A kinase anchoring protein 1), czego skutkiem jest agregacja
Drp1 w due, wolno poruszajce si kompleksy, niezdolne do fragmentacji mitochondrium [40]. Fosforylacja reszty
seryny 637 Drp1 zachodzi take za porednictwem biaka
CaMKI (ang. Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase I ) i
w przeciwiestwie do fosforylacji za porednictwem PKA
powoduje stymulacj fragmentacji mitochondriw [41]. W
fosforylacji reszty seryny 637 Drp1 porednicz take biaka
ROCK1 (ang. Rho-associated coiled coil-containing protein kina-
131
132
padku sumoilacji, zachodzi przy udziale kaskady enzymatycznej. W ubikwitynacji Drp1 poredniczy midzy innymi
ligaza E3 MARCH5, nazywana take MITOL [51,52]. Rola
ubikwitynacji Drp1 za porednictwem zakotwiczonego w
zewntrznej bonie mitochondrialnej MARCH5/MITOL nie
zostaa jednoznacznie okrelona, gdy opublikowane jak
dotd wyniki bada s ze sob niespjne [51-53]. MARCH5/
MITOL moe regulowa przebieg fragmentacji mitochondriw poprzez penienie bardziej oglnej roli, polegajcej na
ubikwitynacji zmutowanych, nieprawidowo sfadowanych
lub uszkodzonych biaek obecnych na mitochondriach, co
prowadzi do ich degradacji w proteasomie [33]. Ostatnio zaproponowano rol poredniczc dla MARCH5 w ubikwitynacji jednego z biaek adaptorowych dla Drp1, ktra poprzez hamowanie fragmentacji mitochondriw ma na celu
ochron komrki przed indukowan stresem apoptoz [54].
W ubikwitynacji Drp1 poredniczy take biako Parkin,
czego skutkiem jest kierowanie Drp1 na drog degradacji
proteasomalnej. Sugeruje si, e rol Parkin jest kontrola poziomu Drp1 w komrce, dziki czemu mitochondria mog
prawidowo funkcjonowa [55].
S-nitrozylacja biaka zachodzi w wyniku reakcji tlenku
azotu (NO) z grup -SH cysteiny. NO jest czsteczk sygnalizacyjn, ale jej nadmiar ma negatywny wpyw na komrki, a w szczeglnoci na komrki nerwowe, czciowo
poprzez powodowanie fragmentacji mitochondriw [56].
Zwikszona synteza NO zachodzi w neuronach osb z
chorob Alzheimera i jest odpowiedzi na nagromadzenie
-amyloidu. S-nitrozylacja reszty cysteiny 644 Drp1 zachodzi w domenie GED i prowadzi do powstania dimerycznej
formy SNO-Drp1, a take zwiksza aktywno GTPazow tego biaka i zdolno do tworzenia oligomerw. To
prowadzi to zwikszonej fragmentacji mitochondriw w
neuronach, czego skutkiem jest utrata pocze synaptycznych i uszkodzenia tych komrek [56]. Wyniki tych bada
s jednak kontrowersyjne, poniewa inna grupa badawcza
sugeruje, e S-nitrozylacja Drp1 nie wpywa w aden sposb na zwikszenie aktywnoci tego biaka [57].
ZNACZENIE FUNKCJONALNE DRP1
parametrw mitochondrialnych w porwnaniu z komrkami kontrolnymi, co sugeruje, e Drp1 nie jest niezbdnym
biakiem w przeywalnoci i utrzymaniu aktywnych mitochondriw tych komrek [58].
SKADNIKI ZEWNTRZNEJ BONY
MITOCHONDRIALNEJ ODDZIAUJCE Z DRP1
Mff, podobnie jak Drp1, wystpuje w postaci kilku izoform, ktrych poziom ekspresji zaley od typu komrki
[29,60]. Co najmniej 9 wariantw splicingowych tego biaka jest kodowanych przez gen MFF, lecz rnice w funkcjonalnoci tych izoform nie zostay poznane [29]. Mff
gromadzi si w odrbnych skupiskach na powierzchni mitochondrium i kolokalizuje z Drp1. C-koniec tego biaka
jest zakotwiczony w zewntrznej bonie mitochondrium, a
N-koniec bierze udzia w interakcji z Drp1 [29,60]. Biako
Mff posiada zdolno oligomeryzacji i w roztworze wystpuje w postaci tetramerw [32]. Oddziaywanie Drp1 z
mitochondriami jest zaburzone w komrkach z wyciszon
ekspresj genu kodujcego Mff, co prowadzi do elongacji
tego organellum [29,60,61], a nadekspresja genu kodujcego Mff powoduje zwikszon fragmentacj mitochondriw, co wskazuje na istotn rol tego biaka w przebiegu tego procesu [60,61]. Mff rekrutuje Drp1 niezalenie
od obecnoci Fis1, gdy interakcja ta nie jest zaburzona w
komrkach z wyciszon ekspresj genu kodujcego Fis1
[60]. Wykazano, e Mff w rny sposb reaguje z rnymi izoformami Drp1 i wpywa na ich zdolno do hydrolizy GTP. Nadekspresja genu kodujcego izoform 3 Drp1
(brak insertu B) w komrkach z wyciszon ekspresj genu
kodujcego endogenny Drp1, powodowaa fragmentacj
mitochondriw w wikszym stopniu w porwnaniu do
innych izoform tego biaka, nawet przy braku ekspresji
Mff [23]. Wskazuje to wic na mniejsze znaczenie Mff we
fragmentacji mitochondriw za porednictwem izoformy
3 Drp1. W przypadku izoform Drp1 zawierajcych insert B
dodatkowym efektem oddziaywania z Mff jest zwikszenie aktywnoci GTPazowej Drp1, co ma znaczenie przy indukowaniu zmiany konformacyjnej prowadzcej do zaciskania kompleksu fragmentujcego. Mff dziaa zatem jako
allosteryczny regulator aktywnoci Drp1, jednak stopie
tej regulacji zaley od izoformy Drp1 [23]. Uwaa si, e
Mff jest w stanie oddziaywa z dimerami Drp1, a wiksze
oligomery nie tworz funkcjonalnych oddziaywa z Mff,
co moe oznacza, e tak jak ju wczeniej wspomniano,
dimery Drp1 s tymi jednostkami strukturalnymi, ktre s
funkcjonalnie aktywne w tworzeniu kompleksu fragmentujcego mitochondrium [32]. Gwnym zadaniem Mff jest
zatem stanowienie rusztowania dla tworzenia oligomerw
Drp1 na powierzchni mitochondrium [32]. Inna grupa baPostpy Biochemii 62 (2) 2016
dawcza stwierdzia jednak, e Mff jest w stanie selektywnie rekrutowa Drp1 w postaci tetramerw lub wikszych
oligomerw [62]. W kilku pracach zaobserwowano, e
brak domeny zmiennej lub insertu B wpywa na wzmocnienie oddziaywania pomidzy Drp1 a Mff [26,32,62].
Z dotychczasowych bada jednoznacznie wynika, e Mff
jest jednym z gwnych biaek poredniczcych w procesie fragmentacji mitochondriw i regulujcych aktywno
rnych izoform Drp1, jednak dodatkowe badania s potrzebne w celu wyjanienia jakie formy oligomeryczne
Drp1 s preferowane w oddziaywaniu z Mff.
FIS1
133
Innym wanym czynnikiem prawidowego przebiegu fragmentacji mitochondrium jest skad lipidowy bon
mitochondrialnych, ktrego istotnym elementem jest kardiolipina. Kardiolipina jest fosfolipidem specyficznym
dla mitochondriw, ktry stanowi 12-17% wszystkich mitochondrialnych fosfolipidw, z czego w wikszoci wystpuje w wewntrznej bonie mitochondrialnej (14-23%),
a w zewntrznej bonie stanowi od 3 do 10% lipidw tam
wystpujcych [7]. W zewntrznej bonie mitochondrialnej
kardiolipina wystpuje gwnie w miejscach kontaktu z bon wewntrzn [22,67]. Kardiolipina poredniczy we fragmentacji mitochondriw poprzez stymulacj oligomeryzacji
Drp1 oraz aktywnoci GTPazowej tego biaka na powierzchni mitochondrium [22,68]. W celu zwizania si Drp1 do mitochondrium oraz stymulacji jego aktywnoci GTPazowej,
lokalne stenie kardiolipiny musi przekroczy pewien
prg oraz musi ona wystpowa w fazie pynnej umoliwiajcej atw reorganizacj bon mitochondrialnych, ktra
prowadzi do fragmentacji mitochondrium [68]. Wykazano,
e kardiolipina oddziauje z Drp1 poprzez fragment domeny zmiennej [21,22,67,68]. Zaproponowano, e rol domeny
zmiennej jest indukowanie formowania si platform bogatych w kardiolipin w bonie mitochondrialnej. Lokalne
zwikszenie stenia kardiolipiny w bonie mitochondrium
w obecnoci Drp1 doprowadza do przejcia fazowego tego
lipidu z uoenia lamelarnego dwuwarstwowego do nielamelarnego, odwrconego heksagonalnego (faza HII), co
w dalszym etapie poprzez reorganizacj struktury bon mitochondrialnych prawdopodobnie umoliwia zmniejszenie
si rednicy mitochondrium w danym miejscu i ostatecznie
prowadzi do fragmentacji. Domena zmienna Drp1 odgrywa
take rol w zalenym od hydrolizy GTP przejciu fazowym
kardiolipiny z fazy lamelarnej do fazy HII [68]. W rejonie tej
domeny zidentyfikowano 4 reszty lizyny, ktre s niezbd-
134
Siateczka rdplazmatyczna (ER, ang. endoplasmic reticulum) peni w komrce wiele funkcji, do ktrych mona zaliczy midzy innymi syntez i modyfikacje biaek,
syntez lipidw a take magazynowanie oraz uwalnianie
jonw wapnia [69]. ER tworzy liczne miejsca kontaktu z
pozostaymi organellami w komrce, w tym take z mitochondriami, oraz z bon komrkow. Miejsca kontaktu
pomidzy ER a mitochondriami bior udzia w sygnalizacji za porednictwem jonw wapnia oraz w syntezie
fosfolipidw [30,69]. Przykadem wsppracy pomidzy
ER a mitochondriami jest synteza kardiolipiny. Kwas
fosfatydowy, bdcy prekursorem kardiolipiny, jest
syntetyzowany w ER, a nastpnie jest transportowany
do mitochondriw, gdzie ulega przeksztaceniom [69].
Miejsca kontaktu ER z mitochondriami s take zaangaowane we fragmentacj tego organellum (Ryc. 5) [30].
Analiza miejsc fragmentacji mitochondriw, przeprowadzona w ywych komrkach za pomoc mikroskopii
fluorescencyjnej, wykazaa, e okoo 90% tych zdarze
wystpowao w miejscu kontaktu ER z mitochondriami. W miejscach, gdzie tubule ER otaczaj mitochondria,
rednica mitochondriw jest mniejsza ni poza miejscami kontaktu tych organelli, co moe wskazywa, e ER
bierze udzia we wstpnym zaciskaniu bony mitochondrium, co w kolejnym etapie moe uatwia formowanie
si oligomeru Drp1 w tym miejscu [30]. rednica spiral
tworzonych przez Drp1 [28] jest zbliona do rednicy mitochondrium w miejscu otoczonym przez ER, co wspiera
t hipotez. W miejscach kontaktu tych dwch organelli gromadzi si Mff, co pozwala na rekrutacj Drp1, a w
konsekwencji prowadzi do fragmentacji mitochondrium
[30]. W komrkach z wyciszon ekspresj genw kodujcych biaka Mff oraz Drp1 rwnie obserwuje si miejsca kontaktu ER z mitochondriami, w ktrych mitochondria maj zmniejszon rednic. Oznacza to, e siateczka
rdplazmatyczna niezalenie od Mff i Drp1 wyznacza
w komrce miejsca, w ktrych moe formowa si kompleks prowadzcy do fragmentacji mitochondrium. ER
prawdopodobnie aktywnie uczestniczy we fragmentacji
mitochondrium, poniewa pozostaje zwizane z tym organellum przez cay okres procesu fragmentacji [30]. Jak
dotd nie poznano mechanizmu, ktry determinuje lokalizacj miejsc kontaktu ER z mitochondriami, a ktre docelowo s miejscami fragmentacji mitochondriw.
www.postepybiochemii.pl
AKTYNA
Przedstawione tutaj informacje pokazuj, e fragmentacja sieci mitochondrialnej jest wieloetapowym procesem,
angaujcym wiele biaek oraz organelli, ktrych skoordynowane dziaanie prowadzi do powstania funkcjonalnego
kompleksu. Jednym z gwnych skadnikw tego kompleksu fragmentujcego jest biako Drp1, ktre podlega regulacji na wielu poziomach. Biako to wystpuje w postaci
kilku izoform, ktre mog tworzy rnice si rozmiarami
struktury oligomeryczne, co pozwala na dopasowanie poPostpy Biochemii 62 (2) 2016
135
136
35. Qi X, Disatnik M-H, Shen N, Sobel RA, Mochly-Rosen D (2011) Aberrant mitochondrial fission in neurons induced by protein kinase C
under oxidative stress conditions in vivo. Mol Biol Cell 22: 256-265
36. Prieto J, Len M, Ponsoda X, Sendra R, Bort R, Ferrer-Lorente R, Raya
A, Lpez-Garca C, Torres J (2016) Early ERK1/2 activation promotes
DRP1-dependent mitochondrial fission necessary for cell reprogramming. Nat Commun 7: 11124
37. Chang CR, Blackstone C (2007) Cyclic AMP-dependent protein kinase
phosphorylation of Drp1 regulates its GTPase activity and mitochondrial morphology. J Biol Chem 282: 21583-21587
38. Cribbs JT, Strack S (2007) Reversible phosphorylation of Drp1 by cyclic
AMP-dependent protein kinase and calcineurin regulates mitochondrial fission and cell death. EMBO Rep 8: 939-944
39. Cereghetti GM, Stangherlin a, Martins de Brito O, Chang CR, Blackstone C, Bernardi P, Scorrano L (2008) Dephosphorylation by calcineurin regulates translocation of Drp1 to mitochondria. Proc Natl Acad Sci
USA 105:15803-15808
40. Merrill RA, Dagda RK, Dickey AS, Cribbs JT, Green SH, Usachev YM,
Strack S (2011) Mechanism of neuroprotective mitochondrial remodeling by PKA/AKAP1. PLoS Biol. 4: e1000612
41. Han XJ, Lu YF, Li SA, Kaitsuka T, Sato Y, Tomizawa K, Nairn AC,
Takei K, Matsui H, Matsushita M (2008) CaM kinase I-induced phosphorylation of Drp1 regulates mitochondrial morphology. J Cell Biol
182: 573-585
42. Wang W, Wang Y, Long J, Wang J, Haudek SB, Overbeek P, Chang
BHJ, Schumacker PT, Danesh FR (2012) Mitochondrial fission triggered by hyperglycemia is mediated by ROCK1 activation in podocytes and endothelial cells. Cell Metab 15: 186-200
43. Wikstrom JD, Israeli T, Bachar-Wikstrom E, Swisa A, Ariav Y, Waiss
M, Kaganovich D, Dor Y, Cerasi E, Leibowitz G (2013) AMPK regulates ER morphology and function in stressed pancreatic -cells via
phosphorylation of DRP1. Mol Endocrinol 27: 1706-1723
44. Chou CH, Lin CC, Yang MC, Wei CC, Liao HD, Lin RC, Tu WY, Kao
TC, Hsu CM, Cheng JT, Chou AK, Lee CI, Loh JK, Howng SL, Hong
YR (2012) GSK3beta-mediated Drp1 phosphorylation induced elongated mitochondrial morphology against oxidative stress. PLoS One
7: e49112
45. Braschi E, Zunino R, McBride HM (2009) MAPL is a new mitochondrial SUMO E3 ligase that regulates mitochondrial fission. EMBO Rep
10: 748-754
46. Wasiak S, Zunino R, McBride HM (2007) Bax/Bak promote sumoylation of DRP1 and its stable association with mitochondria during apoptotic cell death. J Cell Biol 177: 439-450
47. Prudent J, Zunino R, Sugiura A, Mattie S, Shore GC, McBride HM
(2015) MAPL SUMOylation of Drp1 Stabilizes an ER/Mitochondrial
Platform Required for Cell Death. Mol Cell 59: 941-955
48. Anderson C a., Blackstone C (2013) SUMO wrestling with Drp1 at mitochondria. EMBO J 32: 1496-1498
49. Zunino R, Braschi E, Xu L, McBride HM (2009) Translocation of SenP5
from the nucleoli to the mitochondria modulates DRP1-dependent fission during mitosis. J Biol Chem 284: 17783-17795
50. Guo C, Hildick KL, Luo J, Dearden L, Wilkinson K, Henley JM (2013)
SENP3-mediated deSUMOylation of dynamin-related protein 1 promotes cell death following ischaemia. EMBO J 32: 1514-1528
51. Yonashiro R, Ishido S, Kyo S, Fukuda T, Goto E, Matsuki Y, Ohmura-Hoshino M, Sada K, Hotta H, Yamamura H, Inatome R, Yanagi S
(2006) A novel mitochondrial ubiquitin ligase plays a critical role in
mitochondrial dynamics. EMBO J 25: 3618-3626
52. Nakamura N, Kimura Y, Tokuda M, Honda S, Hirose S (2006)
MARCH-V is a novel mitofusin 2- and Drp1-binding protein able to
change mitochondrial morphology. EMBO Rep 7: 1019-1022
53. Karbowski M, Neutzner A, Youle RJ (2007) The mitochondrial E3
ubiquitin ligase MARCH5 is required for Drp1 dependent mitochondrial division. J Cell Biol 178: 71-84
54. Xu S, Cherok E, Das S, Li S, Roelofs BA, Ge SX, Polster BM, Boyman L,
Lederer WJ, Wang C, Karbowski M (2015) Mitochondrial E3 ubiquitin
ligase MARCH5 controls mitochondrial fission and cell sensitivity to
www.postepybiochemii.pl
62. Liu R, Chan DC (2015) The mitochondrial fission receptor Mff selectively recruits oligomerized Drp1. Mol Biol Cell 26: 4466-4477
63. Shen Q, Yamano K, Head BP, Kawajiri S, Cheung JTM, Wang C, Cho
J-H, Hattori N, Youle RJ, van der Bliek AM (2014) Mutations in Fis1
disrupt orderly disposal of defective mitochondria. Mol Biol Cell 25:
145-159
64. Palmer CS, Elgass KD, Parton RG, Osellame LD, Stojanovski D, Ryan
MT (2013) Adaptor proteins MiD49 and MiD51 can act independently
of Mff and Fis1 in Drp1 recruitment and are specific for mitochondrial
fission. J Biol Chem 288: 27584-27593
65. Palmer CS, Osellame LD, Laine D, Koutsopoulos OS, Frazier AE, Ryan
MT (2011) MiD49 and MiD51, new components of the mitochondrial
fission machinery. EMBO Rep 12: 565-573
66. Elgass KD, Smith E, LeGros M, Larabell C, Ryan MT (2015) Analysis of
ER-mitochondria contacts using correlative fluorescence microscopy
and soft X-ray tomography of mammalian cells. J Cell Sci 128: 27952804
67. Bustillo-Zabalbeitia I, Montessuit S, Raemy E, Basaez G, Terrones O,
Martinou JC (2014) Specific interaction with cardiolipin triggers functional activation of dynamin-related protein 1. PLoS One 7: e102738
68. Stepanyants N, Macdonald PJ, Francy CA, Mears JA, Qi X, Ramachandran R (2015) Cardiolipins propensity for phase transition and its reorganization by dynamin-related protein 1 form a basis for mitochondrial membrane fission. Mol Biol Cell 26: 3104-3116
69. Phillips MJ, Voeltz GK (2015) Structure and function of ER membrane
contact sites with other organelles. Nat Rev Mol Cell Biol 17: 69-82
70. Manor U, Bartholomew S, Golani G, Christenson E, Kozlov M, Higgs
H, Spudich J, Lippincott-Schwartz J (2015) A mitochondria-anchored
isoform of the actin-nucleating spire protein regulates mitochondrial
division. Elife 4: 08828
e-mail: j.szymanski@nencki.gov.pl
ABSTRACT
In the cell mitochondria constitute a dynamic network undergoing continuous reshaping by fusion and fission. Mitochondrial fission is
involved in several crucial cellular processes such as mitosis, apoptosis and mitophagy. Main mediator of mitochondrial fission is Dynamin
related protein1 (Drp1). This protein is able to assemble into higher order oligomers, what enables the formation of Drp1 spiral structures on
the surface of mitochondrial network. These spirals constrict thanks to the energy gained from GTP hydrolysis, what results in mitochondrial
fission. Mitochondrial fission process is precisely regulated by different mechanisms, especially by controlling Drp1 activity. This article
presents our current understanding of mitochondrial fission with a particular focus on the role of Drp1 in this process and mechanisms that
regulate activity of this protein.
Postpy Biochemii 62 (2) 2016
137