CRIOPRESERVACIN DE EMBRIONES Y LARVAS DE ABALN ROJO, HALIOTIS

RUFESCENS
P. Ortiz1 y E. Dupr1
1Facultad de Ciencias del Mar, Universidad Catlica del Norte, Coquimbo, Chile. paola_ortiz@ucn.cl
En Chile, el cultivo de abaln rojo (Haliotis rufescens) es una industria creciente cuyo
rpido desarrollo (Flores-Aguilar et al., 2007) ha permitido que el pas se site dentro de los
principales productores de abaln a nivel mundial (FAO, 2015). Sin embargo, an quedan
importantes desafos por resolver, tales como el mejoramiento de las lneas genticas y el
abastecimiento continuo de semillas de calidad (Enrquez y Villagrn, 2008). Al respecto, se
han sealado diversas alternativas para mejorar la productividad en este tipo de cultivo
utilizando la biotecnologa aplicada a la reproduccin y desarrollo temprano de las especies
en cultivo. Una de estas tcnicas, cuyo desarrollo y aplicacin proporcionara un potencial
beneficio para la acuicultura, es la criopreservacin (FAO, 2010).
En organismos marinos la criopreservacin puede ser aplicada tanto en el mbito de la
biologa del desarrollo como en la biotecnologa marina y en la creacin de criobancos
(Odintsova y Boroda, 2012), desempeando un rol fundamental en reas avanzadas de la
produccin animal, a travs de la utilizacin de material criopreservado (gametos, embriones
o larvas) en programas de reproduccin asistida (Tiersch, 2008). En acuicultura, la utilizacin
de material criopreservado, como gametos, embriones y larvas presenta relevantes ventajas,
tales como: a) continuidad del proceso productivo cuando no existen reproductores maduros
o se registran mortalidades larvales masivas, b) mejorar la calidad del producto privilegiando
la preservacin de espermatozoides, embriones o larvas provenientes de individuos con
caractersticas de inters, tales como rendimiento en carne o resistencia a enfermedades
(Caffey y Tiersch, 2011) y c) asegurar la permanencia de genes provenientes de cepas
obtenidas mediante programas de mejoramiento gentico (Mudrak y Looney, 2011). Para el
abaln rojo H. rufescens, los estudios de criopreservacin son escasos y se han llevado a
cabo principalmente en gametos (Salinas, 2005; Ramrez et al., 2015). Para estados del
desarrollo ms avanzados como embriones y larvas, no existen estudios al respecto.
El objetivo de este trabajo fue establecer los parmetros bsicos del proceso de
criopreservacin en embriones y larvas de abaln rojo H. rufescens. Para ello, se evalu: a) la
toxicidad de tres crioprotectores: Propilenglicol (PG), Etilenglicol (EG), Dimetilsulfxido
(DMSO) en concentraciones de 5, 10, 15 y 20% (v/v) con tiempos de equilibrio de 10 y 20
minutos sobre la viabilidad de embriones (mrulas), larvas trocfora y vliger y b) los efectos
de seis tasas de congelacin: 0,5, 1, 2, 4, 6 y 8 C/min, sobre la viabilidad post
descongelacin de larvas trocfora y vliger.
Ovocitos fecundados de abaln rojo (Haliotis rufescens) fueron obtenidos desde los centros de cultivo ubicados
en la ciudad de Coquimbo y trasladados al laboratorio de criopreservacin Criogam de la Universidad Catlica del
Norte, Coquimbo. En el laboratorio, fueron incubados en recipientes con 2 L de agua de mar filtrada y esterilizada
(AMFE) a 1, 17 1C y una densidad inicial de cultivo de 50 ovocitos fecundados/mL, posterior a la eclosin de
larvas trocfora, la densidad fue disminuida a 20 larvas/mL. Los cultivos fueron mantenidos durante 4 das con
recambios de agua diarios de un 100%. Para la ejecucin de los experimentos, mrulas, trocforas y vliger fueron
recolectadas a las 5, 24 y 48 horas. post fecundacin (hpf), respectivamente.
Para los ensayos de toxicidad, las soluciones crioprotectoras fueron preparadas con AMFE a temperatura
ambiente (17 1C). En cada tratamiento se utiliz una concentracin de 100 mrulas/mL y de 1.000 larvas/mL. Los
crioprotectores fueron agregados al doble de la concentracin final requerida, adicionndolos 1:1 a las soluciones
con mrulas y larvas en dos pasos equimolares hasta completar tiempos de equilibrio de 10 y 20 minutos.
Posteriormente, el crioprotector fue diluido adicionando AMFE en dos pasos equimolares manteniendo tiempos de
equilibrio de 10 y 20 minutos. Inmediatamente despus, las muestras fueron lavadas con AMFE y trasladadas a
contenedores para su cultivo. Las mrulas fueron cultivadas en placas Petri de 50 x 15 mm con 10 mL de AMFE a
una concentracin de ~50 individuos/mL, mientras que las larvas (trocfora y vliger) fueron incubadas en tubos de
vidrio con 50 mL de AMFE utilizando una concentracin de ~20 individuos/mL. Los cultivos fueron mantenidos
durante 24 horas, a una temperatura promedio de 17 1C. La misma metodologa de cultivo fue empleada para el
control, compuesto por mrulas y larvas sin exposicin a los crioprotectores. Tanto los tratamientos de toxicidad de

crioprotectores, como el tratamiento control, fueron realizados en triplicado. La viabilidad de embriones y larvas se
analiz determinando la sobrevivencia embrionaria y larval, 24 horas post tratamiento. Para ello, en los ensayos con
mrulas se determin el porcentaje de eclosin de larvas trocfora (Roux et al., 2008), en tanto, para los ensayos con
larvas trocfora y vliger se determin el porcentaje de larvas vliger y larvas mviles (Horvat et al., 2012, Suquet et
al., 2012), respectivamente. Los distintos estados de desarrollo fueron identificados de acuerdo a observacin de la
morfologa externa, segn las descripciones del desarrollo embrionario y larval realizadas en diversas especies del
gnero Haliotidae (Seki, 1997; Pea, 1984; Curtois et al., 2007; Wong et al, 2010). Las larvas fueron fijadas en
formalina 1% (v/v) y observadas al microscopio. Los porcentajes de sobrevivencia fueron corregidos de acuerdo al
control antes de realizar los anlisis de datos. La correccin fue realizada de acuerdo a la media del porcentaje de
mortalidad calculado para el control (Emmet, 1949).
Los experimentos de congelacin se llevaron a cabo adicionando 1 mL de solucin de AMFE con larvas
concentradas (2000 larvas/mL), a tubos de vidrio de 10 x 5 mL. Luego, 1 mL de crioprotector, PG, EG o DMSO
(10% (v/v)), a temperatura ambiente, fue adicionado a cada tubo, en dos pasos equimolares, cada 5 minutos. Las
larvas con crioprotector, fueron aspiradas al interior de pajuelas plsticas cassou (IMV Tecnologas, Francia) de 0,5
mL y mantenidas a temperatura ambiente hasta completar un tiempo de equilibrio de 10 minutos. Inmediatamente,
las pajuelas fueron trasladadas, para su congelacin, al interior de una criocmara con sistema de congelacin
programado Freeze Control Cryogenesis V5 (Cryologic Pty. Ltd., Mulgrave, Victoria, Australia).
El procedimiento de congelacin se realiz en dos pasos. Inicialmente, las pajuelas, a temperatura ambiente (17
1C), fueron enfriadas a una tasa de 7C min-1 hasta alcanzar una temperatura de 0C, la cual se mantuvo durante 5
minutos. Luego, esta temperatura fue disminuida a -12C utilizando una tasa de congelacin de 1C min -1. Despus
de 5 minutos, la temperatura de las pajuelas se disminuy desde -12C a -35C con una tasa de congelacin de
0,5C/min (Protocolo I), 1C min-1 (Protocolo II), 2C/min (Protocolo III), 4C/min (Protocolo IV), 6C/min
(Protocolo V) y 8C/min (Protocolo VI). Las pajuelas fueron mantenidas a -35C durante 5 minutos y luego fueron
sumergidas en Nitrgeno lquido a -196C, mantenindolas almacenadas durante un mximo de 48 horas, hasta la
realizacin de los anlisis de viabilidad. Cada tratamiento se realiz en quintuplicado. Para los anlisis de viabilidad,
las pajuelas fueron descongeladas en un bao de agua termorregulado a 28 1C hasta observar la desaparicin del
hielo (~15 seg) en el interior de las pajuelas. Para cada pajuela la dilucin del crioprotector se realiz adicionando
una solucin de albmina de suero bovino (BSA) 0,1% (p/v) 1:1, a temperatura ambiente, en dos pasos equimolares,
cada 5 min. Para ello, inmediatamente despus de la descongelacin, el contenido de las pajuelas (300 L) fue
vaciado en tubos ependorf con 150 L de BSA al 0,1% (p/v) manteniendo esta solucin por 5 min, luego se repiti el
procedimiento hasta completar un tiempo de equilibrio de 10 min. Posteriormente, los tubos fueron aforados con
AMFE hasta completar 2 mL. Despus de ~30 min las larvas fueron recolectadas y lavadas con AMFE.
Inmediatamente, fueron trasladadas a placas Petri de 50 x 15 mm, con 10 mL de AMFE para iniciar los anlisis de
viabilidad. La viabilidad de larvas trocfora y vliger se analiz determinando la sobrevivencia larval, luego de 3 y
24 h posterior a la descongelacin. La sobrevivencia de larvas trocfora a las 3 horas post descongelacin, fue
cuantificada de acuerdo al nmero de individuos que present movimiento ciliar, en tanto, luego de 24 horas, la
sobrevivencia fue cuantificada de acuerdo al nmero larvas vliger desarrolladas. Por otra parte, la sobrevivencia de
larvas vliger criopreservadas, se cuantific segn observaciones realizadas en experimentos previos. Para ambos
tiempos post descongelacin (3 y 24 h), se cuantific el nmero de individuos que present alguna de las siguientes
caractersticas: a) movimiento de los cilios del velo, b) contraccin del pie, c) movimiento del oprculo, d)
movimiento de los cilios del pie, e) desplazamiento.
Los anlisis estadsticos fueron realizados utilizando el software estadstico SPSS versin 17.0. Se estableci un
nivel de significancia p < 0,05 para todas las pruebas estadsticas. Previo a los anlisis, los porcentajes de
sobrevivencia de embriones y larvas (trocfora y vliger) fueron transformados a raz cuadrada del arco seno (Zar,
1999), verificando la distribucin normal de los datos y la homocedasticidad de varianzas, mediante los Test
Kolmogrov Smirnov y Levenes, respectivamente (Zar, 1999). Un anlisis de varianza de una va (ANOVA) (Zar,
1999) fue realizado para investigar el efecto de los distintos crioprotectores, con diferentes concentraciones y
tiempos de equilibrio, sobre la viabilidad de embriones y larvas (trocfora y vliger). Cuando se encontr diferencias
significativas utilizando ANOVA, se realiz la prueba a posteriori de Tukey HSD para la comparacin mltiple de
medias (Zar, 1999). El efecto de las diferentes tasas de congelacin y los distintos crioprotectores sobre la
sobrevivencia de larvas trocfora y vliger, se investig mediante un anlisis de varianza (ANOVA) de dos vas con
medidas repetidas (Zar, 1999), previa verificacin de la normalidad de los datos mediante el Test Kolmogrov
Smirnov (Zar, 1999) y de esfericidad a travs del Test de Mauchly (Zar, 1999). Se seleccion la opcin de medidas
repetidas, debido a que las cinco rplicas utilizadas en cada tratamiento no fueron independientes, ya que se utiliz
larvas provenientes de un mismo pool de gametos. Cuando se encontr diferencias significativas utilizando ANOVA,
se realiz la prueba a posteriori de Bonferroni para la comparacin de medias por pares (Zar, 1999).

Entre los distintos estados del desarrollo, se encontr diferencias significativas (p < 0,05) en el porcentaje de
sobrevivencia post tratamiento para cada concentracin investigada (Fig. 1 a, Fig. 2 a, Fig. 3 a), siendo la larva
vliger el estado del desarrollo que present la mayor tolerancia a los efectos txicos de los crioprotectores, en
comparacin a embriones y larvas trocfora, utilizando un tiempo de equilibrio de 10 minutos. En larvas vliger no
se encontr diferencias significativas en los porcentajes de sobrevivencia, respecto al control, utilizando
concentraciones de hasta 10% (v/v) en todos los crioprotectores estudiados (Fig. 1 a, Fig. 2 a, Fig. 3 a). Para todos
los estados del desarrollo, utilizando 20 minutos como tiempo de equilibrio, disminuy la tolerancia a la exposicin
de los crioprotectores, encontrando diferencias significativas (p < 0,05) en los porcentajes de sobrevivencia, segn el
control, a partir de concentraciones de 5% (v/v) (Fig. 1 b, Fig. 2 b, Fig. 3 b). De acuerdo a estos resultados, para los
experimentos de criopreservacin, fueron seleccionados los estados del desarrollo trocfora y vliger, los
crioprotectores PG, EG y DMSO 10% (v/v) y un tiempo de equilibrio de 10 minutos.
En todos los ensayos de criopreservacin, no se observ sobrevivencia posterior a la descongelacin cuando
fueron congeladas larvas en estado trocfora. En larvas vliger, en tanto, se obtuvo sobrevivencia larval cuando se
utiliz tasas de congelacin desde 4C/min (Fig. 2). A partir de esta tasa, hasta los 8C/min, la sobrevivencia
disminuy significativamente (p < 0,05) con todos los crioprotectores empleados (Fig. 2). Se observ diferencias
significativas (p < 0,05) entre los distintos crioprotectores utilizados para cada tasa de congelacin (Fig. 2), siendo el
DMSO el crioprotector con el cual se obtuvo los mayores porcentajes de sobrevivencia, correspondientes a 66,8
6,9 (DE) y 86,4 3,6 (DE) a las 3 y 24 horas post descongelacin, respectivamente (Fig. 2 a, b), utilizando una tasa
de congelacin de 4C/min.
Los resultados de este estudio permitieron determinar los parmetros bsicos para la criopreservacin de estados
del desarrollo temprano de abaln rojo. La larva vliger fue el estado del desarrollo que present la mayor tolerancia
al proceso de criopreservacin, utilizando el crioprotector DMSO 10% con 10 minutos de tiempo de equilibrio y una
tasa de congelacin de 4C/min.

Figura 1: Porcentaje de sobrevivencia de embriones (mrulas), trocforas y vliger de abaln rojo Haliotis
rufescens, expuestos al crioprotector PG en concentraciones de 5, 10, 15 y 20% (v/v) con tiempos de equilibrio de (a)
10 minutos y (b) 20 minutos. Todos los datos estn corregidos de acuerdo al control y expresados como media DE.

Figura 2: Porcentaje de sobrevivencia de embriones (mrulas), trocforas y vliger de abaln rojo Haliotis
rufescens, expuestos al crioprotector EG en concentraciones de 5, 10, 15 y 20% (v/v) con tiempos de equilibrio de
(a) 10 minutos y (b) 20 minutos. Todos los datos estn corregidos de acuerdo al control y expresados como media
DE.
Figura 3: Porcentaje de sobrevivencia de embriones (mrulas), trocforas y vliger de abaln rojo Haliotis
rufescens, expuestos al crioprotector EG en concentraciones de 5, 10, 15 y 20% (v/v) con tiempos de equilibrio de
(a) 10 minutos y (b) 20 minutos. Todos los datos estn corregidos de acuerdo al control y expresados como media
DE.
Figura 4: Porcentaje de sobrevivencia de larvas vliger de abaln rojo Haliotis rufescens, criopreservadas con tasas
de congelacin de 0,5, 1, 2, 4, 6 y 8 (C/min) utilizando los crioprotectores PG, EG y DMSO 10% (v/v) con un
tiempo de equilibrio de 10 minutos. Los datos estn expresados como media DE.
Literatura citada

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