ADN, el pilar fundamental de la vida es el material gentico de todos los

organismos vivos y contiene informacin que es crucial para la herencia. el

aislamiento de ADN es necesaria para el anlisis gentico incluyendo fines
cientficos, mdicos o forenses. La presencia de lpidos, protenas, polisacridos
y algunas otras impurezas en la preparacin de ADN puede interferir con los
mtodos de anlisis de ADN mediante la reduccin de la calidad del ADN, lo
que conduce a su corta vida de almacenamiento. ADN se puede aislar de
cualquier organismo vivo o muerto. fuentes utilizadas comnmente para el
aislamiento de ADN son la sangre entera, el pelo, el esperma, los huesos, uas,
tejidos, saliva, clulas epiteliales, la orina, las bacterias, los tejidos animales, y
plantas.
El aislamiento de ADN por lo general comienza con la lisis de clulas o tejidos
que es esencial para la destruccin de estructuras de protenas y tambin
permite la liberacin de cidos nucleicos a partir del ncleo. El hidrxido de
sodio se utiliza sobre todo para extraer el ADN de una clula. Ayuda a romper
la pared celular aflojando la estructura dura de una pared celular o membrana.
Ms importante an, NaOH interrumpe el enlace de hidrgeno entre las bases
de nitrgeno y convertir el ADN de doble cadena (dsDNA) (incluyendo el ADN
genmico (gDNA) y el plsmido) a ADN monocatenario (ssDNA). Este proceso
se llama desnaturalizacin y es la parte central de este procedimiento de
extraccin de ADN. La presencia de hidrxido de sodio hace que la solucin
muy bsico o alcalino. Tris-Cl mantiene el pH de la solucin. Bsicamente se
reacciona con los lipopolisacridos presentes en la membrana externa .
Taq polimerasa tasas de produccin de barras de ADN choiceHigh demandan
alto xito
en la amplificacin de la regin de cdigo de barras. Un elemento
particularmente crtico para la amplificacin PCR es la enzima polimerasa.
Durante las pruebas de protocolos de cdigo de barras de ADN a travs de una
amplia gama de grupos taxonmicos, desde los insectos hasta los mamferos,
estaba claro que una mayor costo de la polimerasa de Invitrogen
(Platinum Taq ADN polimerasa) entreg los dos mayores amplicones intensidad
y el xito de amplificacin en los casos en que no estndar de Taq. Los
resultados indicaron que Platinum
Taq ofrece el ms alto rendimiento, y ahora es el estndar de PCR
enzima utilizada por el CCDB. PlatinumTaq tambin ofrece una serie de
ventajas con respecto a norma
polimerasas Taq. Es una enzima robusta que necesita menos en comparacin
con la optimizacin estndar

Taq. Como Platinum Taq requiere un "arranque en caliente" para la activacin,

hay menos degradacin de la enzima y un menor nmero de amplicones de
PCR no especficos. Platinum Taq tambin es estable a temperatura ambiente,
lo que permite la preparacin avanzada y el almacenamiento de placas de PCR
para su uso futuro.
La adicin de trehalosa facilita PCR y hace posible congelacin de los maestrosmezclas alcuotas. Actualmente CCDB utiliza la estrategia de proceso por lotes
para la fabricacin de placas de PCR. Mezclas se dividen en partes alcuotas
directamente en placas de 96 pocillos, utilizando Biomek FX robot, las placas
se cubrieron con una pelcula de PCR y se almacenaron a -20 C durante un
mximo de 3 meses. Cada lote se etiqueta, registrado en el sistema y
probado para asegurar el funcionamiento. La combinacin de un Platinum Taq
termostable con trehalosa asegura un alto rendimiento incluso despus de
mltiples ciclos de congelacin-deshielo de. Los resultados con regularidad
polimerasas Taq pueden ser menos satisfactorio.
Las alcuotas en tubos pueden ser almacenadas a -20 C durante un mximo
de 3 meses (1-3 ciclos de congelacin-descongelacin no afectan al
rendimiento). El contenido de un Tuve debe mezclar pipeteando ser el uso de
proa.
Aliquots in tubes can be stored at -20C for up to 3 months
(1-3 freeze-thaw cycles dont affect performance). The con
tent of a tube should be mixed by pipetting before use.
Consumables & Equipment for PCR amplification

10%
trehalose: dissolve of 5 g D-(+)-trehalose dehydrate
(Sigma,
90210
), in 50 ml of total volume of molecular
grade ddH
2

O. Store at 20C.

10X
PCR Buffer for Platinum
Taq
(Invitrogen).
Store at 20C.

50 mM MgCl
2
(Invitrogen). Store at 20C.

10
mM dNTP mix

(New England Biolabs

). Store at
20C in 100 l aliquots.

100
M primer stock: dissolve desiccated primer (Invitro
gen) in __ number of nmol x 10 l ultrapure H
2
O. Store
at 20C.

10 M primer working solution: add 20 l of 100 M

primer stock to 180 l of molecular grade ddH
2
O.
Store at 20C.

Platinum
Taq
polymerase (Invitrogen). Store at 20C
in 50 l aliquots.

Microplate (Eppendorf

plates).

Cap strips (ABgene

) or Aluminum sealing film.

Thermocycler (Mastercycler

ep gradient, Eppendorf

plantilla de ADN 2 l por pocillo alcuota de 1/8 del volumen total de la mezcla
en 8-tubo de PCR banda (si se hace ms de una placa, se vierte la mezcla en
un recipiente desechable) y prescindir de volumen deseado (10,5 l de
reacciones 12,5 l) en placa de 96 pocillos y luego agregar 1-2 l de extracto de
ADN.
Si va a llenar varias placas de 96 pocillos incluyen el volumen extra para
permitir que los errores de pipeteo y volumen muerto en la pipeta nel
multichan digital (por ejemplo, para la fabricacin de placas 10 con 12,5 l
reacciones
cada una, incluyen aproximadamente 40 reacciones adicionales)
recomendaciones .General
El uso de puntas de filtro se recomienda para todos los reactivos de PCR para
evitar la contaminacin. Limpiar la mesa de trabajo con alcohol antes de la
creacin de reacciones.
Siempre use una punta estril al retirar la Taq polimerasa y los otros reactivos
de sus tubos.
Mantenga las plantillas de ADN (es decir, otros productos de la PCR) del
alcance de los reactivos de PCR, mientras que est configurando las mezclas
de reaccin. Aadir ADN despus de todos los reactivos han sido
vuelto al congelador.
Siempre incluya una muestra sin plantilla como negativo