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ESTANDARIZACIN DE MTODOS DE DETECCIN PARA

PROMOTORES DE CRECIMIENTO VEGETAL (CIDO INDOL ACTICO Y


GIBERELINAS) EN CULTIVOS MICROBIANOS

LINA XIMENA CELIS BAUTISTA


IVN RICARDO GALLARDO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA


FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y VETERINARIA
BOGOTA
ENERO 2008

ESTANDARIZACIN DE MTODOS DE DETECCIN PARA


PROMOTORES DE CRECIMIENTO VEGETAL (CIDO INDOL ACTICO Y
GIBERELINAS) EN CULTIVOS MICROBIANOS

LINA XIMENA CELIS BAUTISTA


IVN RICARDO GALLARDO

TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar al ttulo de
MICROBILOGO AGRCOLA Y VETERINARIO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA


FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y VETERINARIA
BOGOTA
ENERO DE 2008

ESTANDARIZACIN DE MTODOS DE DETECCIN PARA


PROMOTORES DE CRECIMIENTO VEGETAL (CIDO INDOL ACTICO Y
GIBERELINAS) EN CULTIVOS MICROBIANOS

LINA XIMENA CELIS BAUTISTA


IVN RICARDO GALLARDO

TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar al ttulo de
MICROBILOGO AGRCOLA Y VETERINARIO

Director: Maria Ximena Rodrguez

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA


FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y VETERINARIA
BOGOTA
ENERO 2008

NOTA DE ADVERTENCIA

Artculo 23 de la Resolucin N. 13 de Julio de 1946


La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral catlica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el
anhelo de buscar la verdad y la justicia.

ESTANDARIZACIN DE MTODOS DE DETECCIN PARA


PROMOTORES DE CRECIMIENTO VEGETAL (CIDO INDOL ACTICO Y
GIBERELINAS) EN CULTIVOS MICROBIANOS

LINA XIMENA CELIS BAUTISTA


IVN RICARDO GALLARDO

APROBADO:

_________________________
Maria Ximena Rodrguez
DIRECTORA

________________________
Jos Salvador Montaa
JURADO 1

________________________
Pedro Jimnez
JURADO 2

ESTANDARIZACIN DE MTODOS DE DETECCIN PARA


PROMOTORES DE CRECIMIENTO VEGETAL (CIDO INDOL ACTICO Y
GIBERELINAS) EN CULTIVOS MICROBIANOS

LINA XIMENA CELIS BAUTISTA


IVN RICARDO GALLARDO

APROBADO:

_________________________
ANGELA UMAA Mphil .
Decana Acadmica

________________________
JANETH ARIAS PALACIOS
Director de Carrera

Do you hear the message in the music now


I hear it too
You know, you got your history in the making now
Slowing down won't get you through, no no
Time Wont Wait
Jamiroquai

AGRADECIMIENTOS

A nuestros padres y familia, por ofrecernos la oportunidad de desarrollar este


largo proceso, por brindarnos su constante apoyo y colaboracin.
A Mara Ximena Rodrguez, por todas las enseanzas brindadas por su
apoyo, paciencia, exigencia, confianza, esmero y en especial por todos los
conocimientos que nos otorgo.
A Mara Mercedes Martnez, por brindarnos este proyecto, por los
conocimientos que nos otorgo y por el apoyo igualmente recibido.
A la Federacin Internacional de Universidades Catlicas (FIUC) por el apoyo
financiero brindado.
A Claudia Ramrez y Gisela Castrillon, por su asesora.
A el personal de monitoria y material (Inesita, Vanessa, Paola) por los
favores y facilidades que nos brindaron.
A Maritza Lpez por su apoyo y favores brindados.
A tesistas del laboratorio 131 (Anglica, Pablito, Daniel, William, Caro Bello,
Ruth) que ya casi lo logramos todos.
Y a todos los que se queden por fuera de esta lista, pero que igualmente
saben que nos apoyaron y nos ayudaron y que les agradecemos.

Agradecimientos especiales Ivn:


A Giya, Mi chinito, Enri, Pipe, Flaka y el resto que siempre estuvieron ah al
menos para ver la madrugadera y trasnochadera que toco y que apoyaron de
alguna forma.

TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIN4
2. MARCO TEORICO7
1.1 REGULADORES DE CRECIMIENTO VEGETAL.7
1.1.1 ETILENO.10
1.1.2 ACIDO ABSCSICO...11
1.1.3 CITOQUININAS.12
1.1.4 BRASINOESTEROIDES..12
1.1.5 ACIDO JASMNICO..........................................................13
2.2 AUXINAS13
2.2.1 CARACTERSTICAS GENERALES13
2.2.2 REGULACIN DE LAS FUNCIONES EN LA PLANTA14
2.2.3 BIOSNTESIS DE AUXINAS EN PLANTAS.............18
2.3 GIBERELINAS.19
2.3.1 CARACTERSTICAS GENERALES20
2.3.2 REGULACIN DE LAS FUNCIONES EN LA PLANTA22
2.3.3 BIOSNTESIS DE GIBERELINAS EN PLANTAS..22
2.4 RIZOBACTERIAS PROMOTORAS DEL CRECIMIENTO
VEGETAL.24
2.4.1 MECANISMOS DE ACCIN DE PGPRs.24
2.4.1.1 Mecanismos de accin directa ...25
2.4.1.2 Mecanismos de accin indirecta.. ...29
2.4.2 BIOSNTESIS DE REGULADORES DEL CRECIMIENTO
VEGETAL...30
2.4.2.1 Biosntesis de auxinas por bacterias...........................30
2.4.2.1.1 Ruta Indol 3 acetamida (IAM).. 30
2.4.2.1.2 Ruta Indol 3-Piruvato (IPvA)..31

2.4.2.2 Biosntesis de giberelinas por bacterias.32


2.5 MTODOS DE DETECCIN DE REGULADORES DE
CRECIMIENTO VEGETAL34
2.5.1

MTODOS

DE

DETECCIN

COLORIMTRICA

DE

REGULADORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL36


2.5.1.1 Deteccin colorimtrica de auxinas36
2.5.1.1.1 Reactivo de Salkowsky

36

2.5.1.2 Deteccin colorimtrica de giberelinas..36


2.5.1.2.1 Reactivo de Folling-Wu (cido fosfomolbdico).36
2.5.1.2.2 Reactivo 2,4-cido dinitrofenilhidrazina..37
2.5.2 DETECCIN FSICO-QUMICA DE REGULADORES DE
CRECIMIENTO VEGETAL.37
2.5.2.1 Cromatografa de capa fina (TLC)..37
2.5.2.2 Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC).38
2.5.2.3 Cromatografa de gases acoplada a espectroscopa de
masas (GCMS)..38
2.5.2.4 Espectrofluorometra.39
3. JUSTIFICACIN.41
4. OBJETIVOS44
4.1 OBJETIVO GENERAL44
4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS..44
5. MATERIALES Y MTODOS45
5.1 ESTANDARIZACIN DE MTODOS DE DETECCIN DE
AUXINAS (CIDO INDOL ACTICO, AIA)...45
5.1.1 DETECCIN COLORIMTRICA..45
5.1.1.1 Reactivo de Salkowsky..45
5.1.1.2 Evaluacin del espectro de absorbancia (400-700nm)
para las reacciones con diferentes formulaciones del
reactivo de Salkowsky... 47

II

5.1.2

DETECCIN DE REGULADORES DEL CRECIMIENTO


VEGETAL POR CROMATOGRAFA DE CAPA FINA
(TLC)47

5.2 ESTANDARIZACIN DE MTODOS DE DETECCIN DE


GIBERELINAS50
5.2.1 DETECCIN COLORIMTRICA..50
5.2.1.1 Reactivo Folling-Wu cido Fosfomolibdico.50
5.2.1.2 Reactivo 2,4 dinitrofenilhidrazina.51
5.2.2 DETECCIN FLUOROMTRICA.52
5.3 BIOENSAYO PARA LA DETECCIN DE AUXINAS Y
GIBERELINAS53
5.3.1 NDICES DE GERMINACIN...54
5.4 MICROORGANISMOS.55
5.4.1 MEDIOS DE CULTIVO...56
5.4.2 RECUPERACION Y RECONSTITUCIN DE CEPAS.56
5.5 PRODUCCION DEL INOCULO PARA LA FERMENTACIN.56
5.5.1

PREPARACIN DEL INCULO

Azotobacter vinelandii y

Azospirillum brasilense..56
5.5.2

PREPARACIN DEL INCULO DE LAS CEPAS DEL


BIOINOCULANTE (14 Cepas)..57

5.5.3 FERMENTACIN DISCONTINUA...57


5.5.3.1 Fermentacin discontinua de cepas de referencia y
estandarizacin de medio de cultivo....................57
5.5.3.2 Fermentacin discontinua de las cepas del
bioinoculante..58
5.6

MTODOS DE DETECCIN DE REGULADORES DEL


CRECIMIENTO

VEGETAL

PARTIR

DE

CULTIVOS

MICROBIANOS........................................................................58
5.6.1 DETECCION DE AUXINAS MICROBIANAS..58
5.6.1.1 Deteccin colorimtrica (Reactivo de Salkowsky)...58

III

5.6.1.1.1 Curva patrn de cido indol actico (AIA). 58


5.6.1.1.2 Determinacin de produccin de cido indol actico
(AIA) en cultivos microbianos..59
5.6.1.2 Deteccin de auxinas y giberelinas por cromatografa
de capa fina (TLC)..59
6. RESULTADOS Y DISCUSIN.61
6.1 ESTANDARIZACIN DE MTODOS DE DETECCIN DE
AUXINAS.61
6.1.1

DETECCIN

COLORIMTRICA

(REACTIVO

DE

SALKOWSKY)61
6.2 DETECCIN DE REGULADORES DEL CRECIMIENTO
VEGETAL POR CROMATOGRAFA DE CAPA FINA (TLC)71
6.2.1 ESTANDARIZACIN DE FASE MVIL PARA TLC.71
6.2.2 DETECCIN DE REGULADORES DE CRECIMIENTO EN
TLC...73
6.2.3

LIMITES

DE

DETECCION

DE

REGULADORES

DE

CRECIMIENTO VEGETAL EN TLC (AIA, IBA, GA3)75


6.3 ESTANDARIZACIN DE MTODOS DE DETECCIN DE
GIBERELINAS76
6.3.1 DETECCIN COLORIMTRICA76
6.3.1.1 Reactivo Folling-Wu (cido fosfomolbdico).................76
6.3.1.2 Reactivo 2,4 dinitrofenilhidrazina..77
6.3.2 DETECCIN FLUOROMTRICA..79
6.4

DETECCION DE CIDO INDOL ACTICO EN CULTIVOS


MICROBIANOS POR REACCIN DE SALKOWSKY.81
6.4.1 CURVA PATRN DE CIDO INDOL ACTICO (AIA)..81
6.4.2 PRODUCCIN DE CIDO INDOL ACTICO (AIA)..82
6.4.2.1 Azotobacter vinelandii..82
6.4.2.2 Azospirillum brasilense87
6.4.2.3 Cepas bioinoculante...89

IV

6.5. DETECCIN DE REGULADORES DE CRECIMIENTO EN


CULTIVOS MICROBIANOS POR CROMATOGRAFA DE CAPA
FINA (TLC)..93
6.5.1 Azotobacter vinelandii.93
6.5.2 Azospirillum brasilense95
6.5.3 CEPAS BIOINOCULANTE..97
6.6

BIOENSAYO

PARA

DETECCIN

DE

ACTIVIDAD

DE

REGULADORES DE CRECIMIENTO VEGETAL..105


6.6.1 ANLISIS ESTADSTICO107
6. 7 ANLISIS DE RESULTADOS Y DISCUSIN GENERAL116

7. CONCLUSIONES122
8. RECOMENDACIONES124
9. REFERENCIAS126

NDICE DE TABLAS

Tabla 5.1 Preparaciones del reactivo de Salkowsky a base de mezclas de


cido perclrico y cloruro frrico y cido sulfrico y cloruro frrico..46
Tabla 5.2 Preparaciones del reactivo de Salkowsky a base de cido sulfrico
con diferentes modificaciones en cuanto a concentraciones de H2SO4 y FeCl3
y diferentes volmenes de reaccin..46
Tabla 5.3. Descripcin de fases mviles utilizadas en la estandarizacin de
TLC para deteccin de reguladores de crecimiento vegetal.48
Tabla 5.4 ndices de germinacin.55
Tabla 6.1 Datos de pendiente, R2 y color obtenidos a partir de la reaccin de
HClO4, R1, R2 y R3 con AIA..63
Tabla 6.2 Datos de pendiente y R2 obtenidos a partir de la reaccin de R1m,
R1m1, R1m2 y R2m con AIA...................66
Tabla 6.3 Valores de mxima absorcin en el espectro absorbancia de 400
700nm de las reacciones con las diferentes formulaciones del reactivo de
Salkowsky..68
Tabla 6.4 Movilidad cromatogrfica (Rf) de reguladores de crecimiento (GA3,
AIA, IBA) en las fases mviles evaluadas72
Tabla 6.5 Mejores valores de movilidad cromatogrfica (Rf) Rf de las fases
mviles para la deteccin de AIA, IBA y GA3..73
Tabla 6.6 Cuadro de comparacin de da de mayor produccin de AIA por
Azotobacter vinelandii en medios TSB y BT...86
Tabla 6.7 Cuadro de comparacin de da de mayor produccin de AIA por
Azospirillum brasilense en medios TSB y BT..89
Tabla 6.8 Valores de mxima produccin de AIA cepas bioinoculante 91
Tabla 6.9 Cuadro de comparacin de da de mayor produccin de AIA por
las cepas del bioinoculante evaluado y Azospirillum brasilense..92

VI

Tabla 6.10

Valores de movilidad cromatogrfica (Rf) de reguladores de

crecimiento en cultivos de Azotobacter vinelandii..93


Tabla 6.11

Valores de movilidad cromatogrfica (Rf) de reguladores de

crecimiento en cultivos de Azospirillum brasiliense94


Tabla 6.12

Valores de movilidad cromatogrfica (Rf) de reguladores de

crecimiento en cultivos de cepas del bioinoculante98


Tabla 6.13 Anlisis multivariado MANOVA para la variable rplica en la
interaccin tratamiento*rplica en pruebas de bioensayos.108
Tabla 6.14

Valores de P (ANOVA) para la deteccin de actividad de

reguladores de crecimiento en bioensayos108


Tabla 6.15 Tablas de comparacin Duncan para estadio 1..113
Tabla 6.16 Tablas de comparacin Duncan para estadio 2..114
Tabla 6.17 Tablas de comparacin Duncan para estadio 3..115
Tabla 6.18 Resultados de los mejores tratamientos para los montajes 1 y 2
de evaluacin de lo reguladores, y montaje 3 de evaluacin de
microorganismos116

VII

NDICE DE FIGURAS

Figura 2.1 Movimientos de los reguladores de crecimiento en la planta.8


Figura 2.2 Estructura qumica del Etileno..10
Figura 2.3 Estructura qumica del cido Abscsico..11
Figura 2.4 Estructura qumica de citoquinina12
Figura 2.5 Estructura qumica del cido 3-Indol Actico.14
Figura 2.6 Auxinas naturales15
Figura 2.7 Auxinas sintticas16
Figura 2.8 Biosntesis de AIA en plantas18
Figura 2.9 Estructura qumica de las giberelinas..21
Figura 2.10 Rutas de biosntesis de las giberelinas en plantas.23
Figura 2.11 Biosntesis de AIA en bacterias..32
Figura 2.12 Ruta de sntesis de giberelinas Acido Mevalonico..33
Figura 5.1 Revelado por inmersin49
Figura 5.2 Revelado por aspersin49
Figura 5.3 Cmaras de TLC y placas de silica gel..49
Figura 5.4 Cmara hmeda bioensayo..53
Figura 5.5 Estadios de desarrollo germinacin de semillas de lechuga.54
Figura 5.6 Cmara de TLC.60
Figura 6.1 Curvas de deteccin AIA con el reactivo de Salkowsky a base a
de cido perclrico y cido sulfrico61
Figura 6.2 Muestras de reaccin de diferentes concentraciones de AIA con
los diferentes reactivos de Salkowsky.62
Figura 6.3 Curvas de deteccin de AIA con el reactivo de Salkowsky a base
a de cido perclrico y cido sulfrico.64
Figura 6.4 Muestras de reaccin de diferentes concentraciones de AIA con
los diferentes reactivos de Salkowsky..65

VIII

Figura 6.5 Espectro de absorcin de reacciones con diferentes


formulaciones de reactivo de Salkowsky (AIA 30ug/m).69
Figura 6.6

Espectro de absorcin de reacciones con formulaciones de

reactivo de Salkowsky modificadas (AIA 30ug/m)..70


Figura 6.7 Cromatogramas luz visible y UV S13, S5, S2.............................74
Figura 6.8 Lmite de deteccin de reguladores de crecimiento vegetal (AIA,
IBA y GA3) en TLC...75
Figura 6.9 Reaccin con cido fosfomolbdico a diferentes concentraciones
de GA3.76
Figura 6.10 Reaccin de cido fosfomolbdico con una mezcla de AIA y GA3.
(1:1)77
Figura 6.11

Reaccin del reactivo 2-4 dinitrofenilhidrazina con diferente

concentraciones de GA3.78
Figura 6.12 Reaccin del reactivo 2-4 dinitrofenilhidrazina con diferentes
concentraciones de AIA.78
Figura 6.13 Curva patrn de concentraciones AIA con reactivo Salkowsky
(R1m)81
Figura 6.14

Curvas de produccin de AIA por Azotobacter vinelandii en

diferentes medios82
Figura 6.15 Produccin AIA por A. vinelandii ATCC12518 en medio BT83
Figura 6.16 Curvas crecimiento(Abs540) y produccin de AIA (ug/ml) de
Azotobacter vinelandii en diferentes medios de cultivo85
Figura 6.17 Curvas de produccin de AIA por Azospirillum brasilense en
diferentes medios86
Figura 6.18 Curvas crecimiento (Abs540nm) y produccin de AIA (ug/ml) de
Azospirillum brasilense en diferentes medios.87
Figura 6.19 Produccin de AIA por las cepas del bioinoculante evaluado, y
curva de produccin de AIA por Azotobacter vinelandii ...90
Figura 6.20 Cromatgramas A. vinelandii. ..................................................94
Figura 6.21 Cromatgramas A. brasilense...................................................96

IX

Figura 6.22 Cromatgramas luz visible y ultravioleta Cepas Bioinoculante99


Figura 6.23 Estados de desarrollo Lactuca sativa L.108

LISTA DE ANEXOS

ANEXO 1
MEDIOS DE CULTIVO..132
ANEXO 2
GRFICAS DE PRODUCCIN AIA133
ANEXO 3
ESTADSTICA BIOENSAYO139

XI

Resumen
Se evaluaron diferentes tcnicas para la deteccin de reguladores de
crecimiento vegetal especficamente, Acido Indol Actico y Giberelinas,
dentro de las cuales se realiz una estandarizacin para el reactivo de
Salkowsky a base de acido sulfrico como tcnica cuantitativa para AIA y
cromatografia de capa fina como tcnica cualitativa, tanto para AIA como
para GA3, buscando los solventes de mejor resolucin y reactivos de mayor
espectro de deteccin. Igualmente se busc la estandarizacin de un
bioensayo que permitiera determinar los efectos especficos de diferentes
tratamientos con reguladores grado reactivo y presentaciones comerciales,
para as poder precisar el efecto de la inoculacin de semillas con caldos
microbianos y establecer la accin de los reguladores de crecimiento vegetal.
Se escogi el reactivo de Salkowsky R1m (H2SO4 7,9M FeCl3 40mM,
proporcin muestra reactivo 1:2), el cual mostr caractersticas muy similares
a las observadas con Salkowsky-HClO4 para la determinacin de AIA.
Para la tcnica de cromatografa de capa fina se logr la estandarizacin de
la fase mvil cloroformo: etilacetato : acido actico (50:30:20) con la cual se
obtuvo buena resolucin de AIA, IBA y GA3, ya que no se reportan solventes
que determinen los tres tipos de reguladores al mismo tiempo. El revelador
(H2SO4 60% - FeCl3 28mM) tambin permiti la deteccin de los tres
reguladores.
Igualmente a partir de cultivos microbianos montados para evaluar su
capacidad como promotores de crecimiento vegetal por produccin de
reguladores con las tcnicas previamente estandarizadas, se logr la
implementacin de un medio de cultivo sencillo y econmico (BT) que

promoviera la produccin de los reguladores y as mismo el desarrollo


microbiano.
Finalmente se mont un bioensayo en el cual se logr determinar el efecto
de diferentes reguladores de crecimiento vegetal en tres estados de
desarrollo en plntulas de lechuga, y as al inocular las semillas con las
cepas evaluadas como promotoras, asociar la produccin de promotores a
su efecto en el desarrollo de las plntulas.

Abstract
Different techniques for plant growth regulators detection, specifically indol
acetic acid and gibberellins, were evaluated. A standardization for AIA
quantitative colorimetric detection was performed, using a new Salkowsky
reagent formulation with sulfuric acid. As qualitative technique for AIA and
GA3 detection, TLC was evaluated, looking for solvent systems with better
resolution and spray reagens with a wider detection spectrum. A bioassay
was proved, to determine the specific effects of different plant growth
regulators (reactive and commercial grade), in order to set microbial broths
treatment effects and to establish the plant growth regulators effect.
Salkowsky R1m reactive (H2SO4 7,9M FeCl3 40mM, sample reactive
proportion 1:2) was chosen, it showed the most similar activity compared with
Salkowsky-HClO4 for AIA determination.
For TLC standardization, the solvent system chloroform : ethyl acetate :
acetic acid (50:30:20) proved a proper AIA, IBA y GA3 resolution, knowing
that there are not reports for solvent systems which enable the detection of
the three regulators at the same run. The spray reagent (H2SO4 60% - FeCl3
28mM) allowed the three regulator detection as well.
The microbial cultures evaluated for plant growth promoters detection,
permitted the implementation of a simple and economic culture media (BT),
which induce both growth promoters production and good microbial
development
Finally, a bioassay was performed. This assay let to determine the effect of
different plant growth regulators at three development stages in lettuce
seedlings. Following that, it was possible to associate plant growth regulator
production and effects on seedlings development to lettuce seeds treated
with microbial broths.

1. INTRODUCCIN

Con la llegada de la segunda revolucin verde se han establecido nuevas


tecnologas, las cuales buscan la optimizacin de los sistemas agrcolas. De
esta forma se ha abierto campo a la investigacin y, a la produccin de
bioformulados comerciales. Estos se basan en microorganismos con
reconocida actividad como promotores de crecimiento vegetal. Actividad que
es fundamentada bsicamente en la produccin de reguladores de
crecimiento vegetal capaces de incrementar la velocidad de germinacin en
las semillas, fortalecimiento de los mecanismos naturales de defensa de la
planta y estimulacin del sistema radicular, entre otros que le proveen
ventajas beneficios a la planta.
Al grupo de reguladores de crecimiento vegetal pertenecen las auxinas, un
grupo ampliamente reconocido y estudiado, en donde la ms conocida es el
cido indol actico (AIA).

Aunque muchos compuestos qumicos de

estructura similar pueden reeemplazarlo para promover los fenmenos


tpicos del AIA, otro compuesto ampliamente utilizado es el cido indol
butrico (IBA), siendo estos los ms relevantes. Estos compuestos, pueden
ser sintetizados artificialmente, as como tambin otra auxina, el cido
naftalen actico (NAA), los cuales son comercializados y utilizados
ampliamente en varios campos.
La accin de las auxinas como reguladores del crecimiento vegetal est
asociada al desarrollo y regulacin de la planta, entre los cuales se
encuentra la elongacin celular, tropismos, divisin celular y enraizamiento,
entre otras.

Las giberelinas (GAs), funcionan como reguladores de crecimiento vegetal al


estar estrechamente asociadas a la promocin de la germinacin de las
semillas, crecimiento del tallo, inducir la brotacin de yemas y el desarrollo de
los frutos. Existen varios tipos de giberelinas, siendo las ms comunes: GA1,
GA3, GA4, GA7 y GA9.
En la naturaleza dichos reguladores de crecimiento vegetal no solo son
producidos por las plantas, sino que tambin otros organismos, presentes en
el suelo, los cuales son capaces de sintetizar estos metabolitos, y que estn
en contacto constante con las races de las plantas, lo que genera un mejor
desarrollo de estas y as una relacin entre la planta y el microorganismo,
estos microorganismos, ya sean hongos o bacterias, son conocidos como
promotores de crecimiento vegetal o PGPMs (Plant Growth Promoting
Microorganisms) que no solo son capaces de sintetizar reguladores de
crecimiento vegetal sino que tambin ayudan a las plantas en otros
procesos, evidenciando su produccin por medio de bioensayos, por su
especificidad y precisin.
Con el tiempo, se han establecido varios estudios de dichos reguladores de
crecimiento vegetal, aplicando tcnicas de anlisis qumicos, las cuales
pueden identificar, caracterizar y cuantificar estos compuestos. Las tcnicas
ms utilizadas son las cromatogrficas como cromatografa en capa fina,
cromatografa lquida de alta resolucin, al igual que cromatografa de gases
combinada con espectrofotometra de masas. Estas tcnicas se han aplicado
al estudio de estos y otros compuestos orgnicos para elucidar su
conformacin estructural, deteccin y cuantificacin de produccin por
determinados organismos, ya sean plantas, hongos o bacterias.
El esatudio de estos reguladores de crecimiento vegetal producidos por
microorganismos,

no

es

fcil

puesto

que

se

producen

en

bajas

concentraciones y pueden encontrarse mezclados con otros compuestos


debido a que se generan como metabolitos secundarios, lo que hace
necesaria la purificacin eficiente del compuesto.
Generalmente se utilizan procesos de cromatografa con sorbentes como gel
de slice, una vez purificado, su anlisis se hace teniendo en cuenta las
caractersticas qumicas del mismo, basado en la aparicin de fluorescencia
(por ejemplo GA3).
Debido a las distintas funciones de los reguladores de crecimiento vegetal y
en este caso especfico las auxinas y giberelinas, sobre las plantas, y as
mismo a la gran variedad de organismos capaces de sintetizar estos
metabolitos, es preciso un mtodo estndar para evaluar la produccin de
dichos compuestos por los microorganismos promotores del crecimiento
vegetal, sin importar que tipo de microorganismo sea y dar pie a la
generacin de nuevas investigaciones para evaluacin de calidad de
bioformulados y produccin de biofertilizantes, entre otros.
Este trabajo hace parte del proyecto Formacin de tcnicos para mejorar la
calidad de suelos en pases en va de desarrollo: empleo de compost
mejorado biotecnolgicamente en cultivos orgnicos, financiado por la
Fundacin Internacional de Universidades Catlicas (FIUC).

2. MARCO TERICO

2.1 REGULADORES DE CRECIMIENTO VEGETAL


Los reguladores del crecimiento vegetal o fitohormonas, son compuestos
orgnicos de bajo peso molecular que actan a muy bajas concentraciones
en sitios distantes de donde son producidos, interviniendo en muchos
procesos fisiolgicos como el desarrollo de tejidos, crecimiento del tallo y la
cada de hojas, entre otros (Purves et al., 2002; Salisbury, 1994). Estos
reguladores estn directamente involucrados en procesos metablicos o en
el proceso de desarrollo tal es el caso de la produccin de amilasa y la
induccin de la floracin entre otros, pero al actuar en bajas concentraciones
modifican dichos procesos, donde sus efectos varan segn su interaccin
con otros reguladores de crecimiento vegetal, de esta forma regulan o
influyen en un rango de procesos celulares y fisiolgicos entre los que se
cuentan la divisin celular, diferenciacin celular, desarrollo de frutos,
tropismos, dormancia de semillas, germinacin de semillas, senescencia,
abscisin de las hojas, entre otras.
Son usados ampliamente en la agricultura, horticultura y biotecnologa para
modificar y controlar el desarrollo y crecimiento de las plantas.
El trmino utilizado para nombrarlas como hormonas vegetales todava es
debatido por algunos autores, puesto que las plantas no poseen un sistema
circulatorio anlogo al de los animales. Por su naturaleza qumica, no son
protenas, y el hecho de que dichas hormonas estimulan o regulan el
crecimiento de la planta, es por lo que muchos botnicos y bilogos se
refieren a ellas como reguladores del crecimiento vegetal, trmino que ser
adoptado en este trabajo.

Existen siete clases de reguladores de crecimiento vegetal entre los cuales


se encuentran auxinas, giberelinas, citoquininas, brasinosteroides, cido
abscsico, etileno y cido jasmnico,, las cuales participan en la regulacin
del crecimiento y desarrollo de la planta (Kende & Zeevaart, 1997; Tanimoto,
2005).
La

actividad

reguladores
dinmica

de

estos

sigue
de

una

regulacin

intrnseca y un movimiento
dentro de la planta (Figura
2.1), establecido en base a
estudios clsicos desde el
sitio

de

transporte

produccin
de

cada

regulador (Tanimoto, 2005).


Algunos

de

estos

reguladores son adquiridos


del
Figura 2.1 Movimientos de los reguladores de crecimiento

suelo

afectando

el

desarrollo de la planta.

en la planta. Tomado de Tanimoto, 2005.

Dentro de los reguladores que promueven una respuesta fisiolgica, existen


cuatro grupos principales de compuestos que ocurren en forma natural, cada
uno de los cuales exhibe

propiedades de regulacin del crecimiento en

plantas. Se incluyen auxinas, giberelinas, citoquininas y etileno, mientras que


los que inhiben el crecimiento o lo retardan se encuentran el cido abscsico
con una estructura particular y actuando a muy bajas concentraciones dentro
de la planta (Kende & Zeevaart, 1997; Tanimoto, 2005).

Los reguladores de crecimiento vegetal, actan de uno u otro modo en


todos los procesos de desarrollo, estos fenmenos de regulacin pueden
clasificarse de acuerdo con Rojas& Ramrez, 1993 en:
1. De correlacin, como multiplicacin y alargamiento celular,
dominancia apical, actividad de las yemas, letargo y absicin de
rganos.
2. De sensibilidad o movimiento como los tropismos y nastias.
3. De reproduccin como floracin, polinizacin y desarrollo del fruto.
Tambin se ven implicados regulando el transporte de nutrientes, en sitios
donde los nutrientes se elaboran en mayor cantidad de la requerida como las
hojas a puntos donde se utilizan intensamente sin que elaboren la cantidad
suficiente, como las races flores y frutos en desarrollo (Rojas& Ramrez,
1993).
El concepto de hormonas vegetales o reguladores de crecimiento vegetal es
derivado de experimentos sobre tropismo realizados por Charles Darwin en
coleptilos en donde se evidenci la respuesta de un regulador endgeno,
llevandolo al descubrimiento de las auxinas en 1928, y el consecuente
descubrimiento del cido indol actico (Rojas & Ramrez, 1993).
El descubrimiento de este regulador gener como consecuencia varias lneas
de investigacin encaminadas al descubrimiento de otros reguladores.

La caracterizacin qumica de stos, fue establecida a partir de tejidos de


plantas superiores, y su descubrimiento fue a travs de ensayos a partir de
extracto de tejidos y la accin de cada regulador, auxinas a partir de orina,
giberelina de cultivos filtrados de Gibberella fujikoroi, entre otros. Hoy en da
se utilizan mtodos de extraccin y purificacin como HPLC, TLC y GC-MS,
entre otros (Davies, 1988).
2.1.1 ETILENO
En 1935, Crocker propuso al etileno
como
vegetal

regulador
tras

del
varios

crecimiento
aos

de

observacin como regulador y como


producto sintetizado por la planta
(Davies,
Figura 2.2 Estructura qumica del Etileno.
Tomado de www.plant-hormone info.

1988).

Hoy

en

da

es

reconocido como un regulador del


crecimiento

vegetal

gaseoso (Figura 2.2),

de

tipo

que

promueve la senecencia, se produce en todas las partes de la planta y est


involucrado en la maduracin de los frutos al promover la senescencia lo que
acelera la maduracin, interviene en el mantenimiento del gancho apical en
plntulas, en la diferenciacin de la raz y hojas, en la formacin de races
adventicias y estimula la maduracin de los frutos. Es sintetizado a partir del
aminocido metionina en todos los tejidos de la planta, aunque est ms
asociada a los frutos y su produccin depende del tipo de tejido, al igual que
de la especie vegetal y del estado de desarrollo de la planta (Purves et al.,
2002; Salisbury, 1994).

10

2.1.2 CIDO ABSCSICO

En

1963

caracterizado
mientras

fue
por

estudiaba

identificado
Frederick
el

Adicto,

compuesto

responsable de la abscisin de la los


frutos en el algodn. El cido abscsico
(Figura 2.3), promueve la acumulacin
Figura 2.3 Estructura qumica del cido

de las protenas de almacenamiento en

Abscsico.

las semillas (Davies, 1988).

Tomado de www.plant-hormone info.

Suele estar presente en altas concentraciones en los brotes latentes y en


algunas semillas latentes, y es el inhibidor ms comn de la germinacin de
las semillas. Tambin inhibe el alargamiento del tallo, regula el intercambio
de gas (CO2) y vapor de agua entre las hojas y la atmsfera mediante sus
efectos sobre los estomas, ya que estimula la oclusin de los estomas,
generalmente inhibe la funcin de otras enzimas como sucede con las
giberelinas. Es un compuesto de naturaleza sesquiterpenoide, producido en
la ruta del cido mevalnico en los cloroplastos en donde es sintetizado
parcialmente ya que es biosintetizado inicialmente en las hojas. Su
produccin es estimulada por el estrs y por las bajas temperaturas (Purves
et al., 2002; Salisbury, 1994).

11

2.1.3 CITOQUININAS
En 1913 Gottlieb Haberlandt descubri
un compuesto en el floema con la
capacidad

de

estimular

la

divisin

celular, trabajo que fue extendido en


1954 por Jablonski y Skoog. Fue solo
hasta 1955 cuando Millar, aisl el
compuesto y tom su nombre por
Figura 2.4 Estructura qumica de citoquinina

estimular la divisin celular y el proceso

Tomado de www.plant-hormone info.

de citoquinesis (Davies, 1988).

Las citoquininas (Figura 2.4), estimulan la formacin de brotes, promueven la


divisin celular, ayudan a la germinacin, inhiben el alargamiento del tallo,
estimulan el crecimiento de los brotes laterales y retardan el envejecimiento
de las hojas. Se encuentra en altas concentraciones en los meristemos y los
tejidos en crecimiento hasta donde es traslocado por el xilema desde las
races, desde donde probablemente es sintetizado por la ruta bioqumica de
la adenina (Purves et al., 2002; Salisbury, 1994).
2.1.3 BRASINOESTEROIDES
Siendo

estos

reguladores

de

crecimiento

vegetal

recientemente

determinados, los brasinoesteroides son conocidos como reguladores


nuevos con mltiples efectos. Estimulan el alargamiento celular, el
alargamiento del tubo polnico y la diferenciacin del tejido vascular, e inhiben
el alargamiento de la raz (Taiz & Zeiger, 2006).
Son polihidroxiesteroides de 27, 28 o 29 tomos de carbono. Estn
presentes en todos los tejidos vegetales. Biosintticamente provienen del
cicloartenol, obtenido desde el escualeno (triterpeno). Se catabolizan por, la
conjugacin con cidos grasos, glicosilacion y oxidaciones (Sobern et al.,

12

2006).

El tratamiento con nanogramos de brasinoesteroides por planta es

suficiente para promover el crecimiento, por lo que sern de importancia en


la agricultura, al aumentar los rendimientos de cultivos (Purves et al, 2002).
2.1.4 CIDO JASMONICO
El cido jasmnico y el jasmonato de metilo tienen un papel dentro de las
respuestas al estrs y de defensa. Tambin se ha comprobado que estos
compuestos pueden modular procesos como la viabilidad del polen, la
maduracin de frutos y el crecimiento de la raz (Purves et al, 2002).

2.2 AUXINAS
Charles Darwin, en su libro el Poder de Movimiento en las Plantas, pone de
manifiesto la actividad de una sustancia con capacidad para inducir el
movimiento frente a una fuente de luz en coleoptilos de Phalaris canariensis
(alpiste), la cual posteriormente fue identificada como auxina (Arteca, 1996).
Desde ese entonces han sido ampliamente estudiadas y juegan un papel
central en la regulacin del crecimiento de las races, promueven la
elongacin del tallo e inhiben el crecimiento de brotes laterales manteniendo
la dominancia apical (Salisbury, 1994).
2.2.1 CARACTERSTICAS GENERALES
El nombre auxina se deriva del griego auxein, que significa aumento o
incremento, designando cualquier compuesto constituido por el grupo
auxnico, y a menudo se usa como sinnimo al cido indolactico (AIA).
Qumicamente son llamadas cido 3 -indol actico (Figura 2.5), y son
derivados del triptofano.

13

Figura 2.5 Estructura qumica del cido 3-Indol Actico.


Tomado de www.plant-hormone info.

Su estructura qumica bsica, se compone de un grupo indol, por lo que es


fcil encontrar en las plantas otros compuestos con estructura similar (Figura
2.6). Hoy en da se encuentran compuesto de similar accin sintetizados
artificialmente (Figura 2.7).
Para que una sustancia exhiba accin auxnica debe tener un radical cido o
ser fcilmente convertible a l, un anillo aromtico y de uno a cuatro
carbonos entre el carboxilo y el anillo(Rojas & Ramirez, 1987).. Todas las
auxinas sintticas causan efectos parecidos pero cada producto individual
tiene una aplicacin particular dentro de la regulacin o accin auxnica (Taiz
& Zeiger, 2006)
Existen tres grupos auxnicos (Rojas & Ramirez, 1987):

Derivados del indol como cido indol propinico (IPA), cido indol
butrico (IBA) (Figura 2.6) y el ido 3-indol actico (AIA) (Figura 2.5).

Derivados del naftaleno, como cido naftalen actico (NAA) (Figura


2.6), cido naftoxiactico (Noxa o BNOA), cido naftilpropinico
(NPA).

Derivados fenoxi, usados como herbicidas selectivos y algunas veces


como reguladores del crecimiento vegetal.

14

4-clorindol-3-acido acetico (4-Cl-IAA)

Acido fenilacetico (PAA)

Acido indol actico-aspartico

Acido indol 3 -butrico

Figura 2.6 Auxinas naturales. Tomado de www.biologie.uni-hamburg.de

Se encuentran en las clulas en concentraciones de 10-6 -10-8 M, y su


distribucin dentro de los tejidos est sujeto a los principios del transporte
activo y polar. Si la concentracin del compuesto en el tejido aumenta, el
efecto que tienen sobre la planta ser la inhibicin de la elongacin de la
raz, la razn es un estmulo en la produccin de etileno, mientras que a
bajas concentraciones estimula la elongacin de los brotes y las races
(Salisbury, 1994).

15

Acido 2,4,5-triclorofenoxiactico

Acido 2,4 - diclorofenoxiactico

2,4,5-Triclorofenoxiactico

Acido naftalinactico

Figura 2.7 Auxinas sintticas. Tomado de www.biologie.uni-hamburg.de

2.2.2 REGULACIN DE LAS FUNCIONES EN LA PLANTA


Las funciones de las auxinas en los tejidos vegetales estn estrechamente
ligadas a la elongacin celular, fototropismo, geotropismo, dominancia apical,
iniciacin de la raz, produccin de etileno y desarrollo de los frutos.
La elongacin celular, est generada por la respuesta del tejido a las auxinas
las cuales son resumidas por Arteca, 1996 en:

Baja resistencia de la pared celular, al romperse los enlaces


covalentes entre la celulosa y los xiloglucanos de la pared celular.

16

Cambi en las relaciones hdricas de la clula, aunque el potencial


osmtico no cambia; el potencial de la clula se torna negativo.

Al disminuir el potencial hdrico, el agua dentro de la clula se mueve


hacia la pared celular ejerciendo presin y ocasionando la elongacin
celular.

Una vez elongada la clula, los enlaces covalentes entre la celulosa y


los polisacridos de la pared son establecidos nuevamente.

El fototropismo est influenciado por el transporte de las auxinas,


acumulndose a un lado del tallo, generando el movimiento en respuesta a
los estmulos de la luz (Arteca, 1996), el geotropismo responde de igual
forma a la acumulacin de las auxinas en las hojas y el tallo en respuesta a
la fuerza de gravedad (Arteca, 1996).
La dominancia apical est relacionada con el transporte de auxinas por
medio de un mecanismo dependiente de energa, alejndose en forma
basiptala desde el punto apical de la planta hacia su base. Este flujo de
auxina reprime el desarrollo de brotes axilares laterales a lo largo del tallo,
manteniendo de esta forma la dominancia apical (Arteca, 1996).
Las auxinas promueven el desarrollo radicular al estimular la iniciacin de
la raz en esquejes y su diferenciacin, lo cual es evidente con la aplicacin
exgena de auxinas, donde la elongacin de la raz se ve disminuida
cuando su concentracin es baja. Son reconocidas como estimulantes de
la produccin de etileno en varios tejidos, incrementa el tamao de los
frutos al estimular el crecimiento de las clulas, ya que actan sobre la
elongacin y la divisin celular jugando un papel fundamental en el
crecimiento de rganos y frutos (Salisbury et al, 1994).

17

2.2.3 BIOSNTESIS DE AUXINAS EN PLANTAS


Las auxinas son producidas en las plantas a partir del catabolismo del
triptfano lo cual se observ en ensayos en donde al colocar triptfano ste
era catabolizado por el tejido en AIA, aumentando su concentracin en el
mismo (Salisbury et al., 1994; Taiz & Zeiger, 2006).

Figura 2.8 Biosntesis de AIA en plantas. Tomado de Taiz & Zeiger, 2006

18

El triptfano est compuesto por un grupo indol y est universalmente


presente en los tejidos vegetales, ya sea en forma libre o incorporada. Hay
tres rutas principales de sntesis de auxinas dependientes del triptfano (Taiz
& Zeiger, 2006).
La ruta de tripatamina (TAM), est presente en numerosas especies de
plantas incluyendo Arabidopsis thaliana. La decarboxilacin del triptfano a
triptamina, produce una serie de reacciones enzimticas que originan indol 3acetaldehdo (IAAId), el cual es oxidado por la IAA deshidrogenasa
convirtindolo en cido 3-indol actico (Figura 2.8).

La ruta de sntesis del

indol 3-piruvato (IPA), est estrechamente relacionada con la ruta TAM, ya


que su precursor es el TAM el cual es convertido a indol 3piruvato por la
accin enzimtica de la Trp aminotransferasa, el cual es decarboxilado para
formar IAAId, que es convertido en cido 3indol actico. A partir del indol 3
acetonitrilo (IAN) se origina la ruta de IAN, en la cual el triptfano es
inicialmente convertido a inol 3 acetaldoina (IAOx) y posteriormente a IAN,
para finalmente ser convertido en Acido 3Indol Actico (Figura 2.8) (Taiz &
Zeiger, 2006).

2.3 GIBERELINAS
Las giberelinas (GAs) son reguladores del creciemiento de las plantas
superiores que regulan numerosos aspectos del desarrollo vegetal.
Este grupo de hormonas fue descubierto al azar por fitopatlogos japoneses
que estudiaban en el arroz una enfermedad conocida como Bakane (planta
loca) causada por el hongo Gibberella fujikuroi en el ao de 1809, en donde
se observaba un crecimiento excesivo en los tallos y brotes. Posteriormente
en 1955, se aisl a partir del filtrado segregado por el hongo, el compuesto

19

inductor del sobrecrecimiento del tallo que se denomin cido giberlico.


Pocos aos despus, se comprob que las plantas tambin poseen
compuestos con estructuras muy semejantes al cido giberlico (Agrios,
2004).
Hoy en da muchos de los microorganismos promotores del crecimiento
vegetal son reconocidos como productores de giberelinas. Tal es el caso de
bacterias de los gneros Azospirillum, Pseudomonas, Bacillus, Azotobacter,
algunos

hongos

como

Gibberella

fujikuroi,

Fusarium

moniliforme,

Phanerochaete chrysosporium, Aspergillus flavus, F. oxysporium, Penicillium


corylophilum, P. cyclopium y Rhizopus stolonifer, entre otros, tambin han
reportado algas como productoras de giberelinas (Ergun et al, 2002; Hasan,
2002; Janzen et al, 1992; Snchez- Marroqun, 1963; Srivastava & Ahmad,
2003; Unyayar & Unyayar., 1996).
Se han aislado y caracterizado 121 GAs, la mayora de ellas a partir de
especies vegetales superiores. Al estudiar dichos compuestos se determin
su estructura, revelando su capacidad como reguladores del crecimiento
vegetal, por lo que pueden afectar, regular o modular un amplio rango de
respuestas de crecimiento vegetal ya sea en la germinacin de semillas, la
estimulacin del crecimiento del tallo o races (Azcon & Bieto, 2000).
2.3.1 CARACTERSTICAS GENERALES
Desde el punto de vista qumico, las GAs (Figura 2.9) constituyen una familia
de diterpenos tetracclicos cidos cuyo esqueleto est constituido por un
anillo ent-giberelano de 20 o 19 tomos de carbono. Sin embargo, a nivel
fisiolgico, en este grupo solamente se pueden distinguir unos pocos
miembros con capacidad para influir en el crecimiento vegetal o giberelinas
activas (Arteca, 1996).

20

Figura 2.9 Estructura qumica de las giberelinas. Tomado de Life the Science of Biology, 2001.

En cuanto a su actividad biolgica, muy pocos compuestos pertenecientes a


la gran familia de giberelinas poseen la capacidad de regular el desarrollo
vegetal, el resto son precursores o productos inactivados laterales o finales,
tambin como reservas de las rutas que sintetizan las GAs activas.
La capacidad individual de cada giberelina para modificar el crecimiento se
determin en la dcada de los sesenta mediante ensayos biolgicos, en
stos se determin la respuesta de una determinada GA en un proceso
fisiolgico dado. Las respuestas que producen o modulan las giberelinas
afectan tanto la regulacin del crecimiento vegetativo como al desarrollo
reproductivo de la planta (Azcon & Bieto, 2000).
Las GAs son determinantes en el control de la elongacin del tallo, tambin
modifican sustancialmente los procesos reproductivos de los vegetales,
participando en el control de la induccin de la floracin la cual se ha
estudiado en Arabidopsis thaliana (Phillps, 1998), en la produccin,
crecimiento, y desarrollo de los frutos. As mismo sustituyen los
requerimientos de luz o fro que precisan muchas de las semillas para
germinar (Azcon & Bieto, 2000; Salisbury, 1994).

21

2.3.2 REGULACIN DE LAS FUNCIONES EN LA PLANTA


Las giberelinas promueven el crecimiento celular debido a que incrementan
la hidrlisis de almidn, fructanos y sacarosa con lo que se originan
molculas de fructosa y glucosa. Estas hexosas proporcionan energa va
respiracin contribuyendo a la formacin de la pared celular, y a la
alimentancin de los embriones, acelera la germinacin de las semillas,
tambin hacen momentneamente ms negativo el potencial hdrico de la
clula, lo que genera que el agua penetre con mayor rapidez provocando la
expansin celular y diluyendo los azcares (Davies, 1988).

2.2.2 BIOSNTESIS DE GIBERELINAS EN PLANTAS


Para la sntesis de giberelinas se siguen los pasos comunes de sntesis de
terpenoides.

Un terpenoide es una sustancia compuesta por bloques o

unidades de cinco tomos de carbono denominados isoprenos; segn el


nmero de isoprenos, las giberelinas se denominan como diterpenos (Azcon
& Bieto, 2000).
La biosntesis de giberelinas ha sido objeto de varias revisiones (Hedden,
1999; Hedden & Kamiya, 1997; Olzewski et al., 2002). Se divide en tres
etapas de acuerdo con su localizacin celular y las diferentes caractersticas
de las enzimas que participan en el proceso de sntesis, la primera etapa se
localiza en los plastidios y consiste en la conversin de geranilgeranil
difosfato (GGDP) a ent-kaureno, por accin de la enzima ent-kaureno
sintetasa (Figura 2.10), GGDP se sintetiza a travs de la ruta del cido
mevalnico (MVA) (Figura 2.10) en el citoplasma, la no dependiente de MVA
en el cloroplasto, la segunda etapa est localizada en el retculo
endoplasmtico y consiste en la sntesis de GA12 a partir de ent-kaureno;

22

est catalizada por dos monooxigenasas de membrana dependiente de


NADPH; la ent-kaureno oxidasa (KO) y cido ent-kaurenoico oxidasa (KAO),
cada uno de los cuales cataliza tres pasos metablicos consecutivos. Estas
rutas son comunes a todos los organismos incluyendo microorganismos
(Arteca, 1996; Martinez & Garca, 2004). La tercera etapa de la biosntesis de
GAs tiene lugar en el citoplasma y en ella intervienen dioxigenasas solubles
dependientes de 2-ceto-glutarato y Fe+2, esta es la etapa ms compleja en la
que se han descrito dos rutas metablicas importantes denominadas:

No hidroxilacin temprana en el carbono 13

Hidroxilacin temprana en el carbono 13

Figura 2.10 Rutas de biosntesis de las giberelinas en plantas. Tomado de Martinez & Garca, 2004

23

2.4 BACTERIAS PROMOTORAS DEL CRECIMIENTO VEGETAL


Las bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPRs, Plant Growth
Promoting Rhizobacteria), son capaces de colonizar los sistemas radicales
de las plantas y promover el crecimiento de stas. Tienen la capacidad de
alterar el crecimiento de los tejidos vegetales directa o indirectamente;
indirectamente las PGPR juegan un papel importante en la disminucin o
prevencin de otros fitopatgenos que puedan atacar las plantas; mientras
que directamente las PGPR promueven el crecimiento de la planta al
sintetizar compuestos (por ejemplo reguladores del crecimiento vegetal) que
le facilitan a la planta la toma de nutrientes del ambiente (Gray & Smith,
2004).
Las PGPRs sintetizan compuestos como auxinas y compuestos parecidos a
las giberelinas que aumentan la taSa de germinacin de las semillas y el
desarrollo de pelos radiculares que ayudan a la planta a crece al aumentar la
capacidad de absorber (Hasan, 2002). La sntesis microbiana de sustancias
reguladores de crecimiento como las auxinas y giberelinas es un factor
importante en la fertilidad del suelo por lo que es necesaria su evaluacin
para determinar la fertilidad del mismo.
2.4.1 MECANISMOS DE ACCIN DE PGPRs
Los mecanismos de accin de los PGPRs pueden clasificarse en directos y
indirectos, y cada uno de ellos puede actuar de manera independiente y
diferente (Solano, 2000).

24

2.4.1.1 Mecanismos de accin directa


A este grupo pertenecen aquellos metabolitos producidos por la bacteria
capaces de estimular el crecimiento vegetal (Kloepper, 1993). Totalmente
independientes de la poblacin microbiana edfica y del soporte edfico. Tal
es que caso de:

Fijacin de nitrgeno de forma asociativa,

Produccin de reguladores de crecimiento vegetal como auxinas,


giberelinas y citoquininas, entre otras.

Inhibicin de sntesis de etileno.

Aumento en la permeabilidad de la raz.

El tipo de mecanismo de accin que utilice cada especie de bacteria


promotora del crecimiento vegetal, es difcil de estimar ya que cada bacteria
en particular puede afectar el crecimiento de la planta de diferentes maneras
y con diferentes mecanismos de accin (Kloepper, 1994; Solano, 2000).
El mecanismo de accin directo de las PGPRs por excelencia es la
produccin de reguladores de crecimiento vegetal (Brown, 1974; Solano,
2000; Tien et al., 1979).
Aunque muchos de los microorganismos del suelo pueden producir
sustancias reguladores del crecimiento vegetal, el sistema radicular est
asociado a distintas comunidades microbianas capaces de sintetizar
reguladores de crecimiento vegetal.
Algunos microorganismos tienen la capacidad de producir estos reguladores,
ya sea hongos como Dipodascopsis ininucleata, productor de auxinas y
zeatina, Cercospora rosicola productor de cido abscsico, mientras que
Giberella fujikuroi produce giberelinas y citoquininas en su estado imperfecto
como Fusarium moniliforme (Unyayar & Unyayar, 1996). Entre las bacterias

25

con reconocida actividad como productoras de reguladores de crecimiento se


encuentran los gneros Azospirillum y Azotobacter los cuales al penetrar la
raz producen giberelinas, auxinas, citoquininas, cido abscsico y fijan
nitrgeno (Vargas et al, 2001), lo que las convierte en excelentes
biofertilizantes. Para el gnero Pseudomonas tambin se ha reportado la
capacidad de produccin de auxinas y giberelinas (Vargas et al., 2001).
Es as como bacterias promotoras de crecimiento vegetal, han mostrado
efectos benficos por la produccin de reguladores del crecimiento vegetal,
como las giberelinas y auxinas, tal es el caso de Azospirillum sp.,
Pseudomonas sp. y Azotobacter sp., entre otros gneros reconocidas como
bacterias promotoras del crecimiento vegetal (Cassan et al., 2001).
Desde 1934 cuando Kgl, Haagen-Smit y Erxleben, obtuvieron AIA purificado
de orina, identificada como auxina, empezaron los estudios alrededor de su
actividad y biosntesis (Baca & Elmerich, 2000), y con ellos la aparicin de
trabajos en los que se reportaba a bacterias y hongos (Baca & Elmerich,
2000; Cassan et al., 2001) como productores de auxinas, los cuales son
asociados a la rizsfera de las plantas, reconociendo que el 80% de las
PGPRs o bacterias asociadas a la rizsfera son capaces de producir Acido
Indol Actico (AIA) (Zakharova et al, 1999). Las investigaciones que se han
producido no solo involucran la biosntesis bacteriana de este regulador, o su
actividad fisiolgica en las plantas, si no que establecen la relacin que las
bacterias productoras de reguladores de crecimiento vegetal puede generar
con la planta y entender la dinmica de funcionamiento rizobacteria-planta
(Zakharova et al., 1999).
La produccin bacteriana de giberelinas es menos comn que la produccin
de auxinas (Solano, 2000). Las giberelinas al igual que el cido indol actico
son metabolitos secundarios los cuales tienen potencial comercial y son
importantes en el campo agrcola como en el desarrollo de la biotecnologa
vegetal (Birkermeyer et al., 2003; Hasan, 2002).

26

Se han identificado cerca de 130 clases de giberelinas, provenientes de


plantas, bacterias y hongos de las cuales las ms comunes y biolgicamente
activas son GA1, GA3 y GA4 (Cassan et al., 2001). En recientes artculos se
han reportado al rededor de 89 tipos de giberelinas producidas por
diazotrficos (microorganismos fijadores de nitrgeno). Gracias a distintos
experimentos se ha observado la produccin de giberelinas por Azotobacter
sp., Pseudomonas sp., Rhizobium leguminosarium bv phaseoli, Azospirillum
brasilense, Azospirillum lipoferum, Acetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum
seropedicae, Bacillus pumilus y Bacillus licheniformes (Dobbelaere et al.,
2003).
Las bacterias del gnero Azospirillum y Azotobacter son rizobacterias gram
negativas, fijadoras de nitrgeno de vida libre, y que se han encontrado en
relacin estrecha con las races de las plantas; adems son capaces de
promover el crecimiento de las plantas a travs del mejoramiento del
desarrollo de las races (Bahat-Samet et al., 2004). Se han detectado tres
tipos de sustancias promotoras de crecimiento producidas por bacterias del
gnero Azospirillum; auxinas, citoquininas y giberelinas. Se asume que los
reguladores de crecimiento vegetal producidos por bacterias causan cambios
detectados en la morfologa de las races luego de ser inoculadas con
Azospirillum sp, que pueden generar un aumento en la absorcin de
minerales (Bahat-Samet et al., 2004).
Es muy probable que esas auxinas y giberelinas producidas, no jueguen un
papel muy importante en la fisiologa del organismo productor y sean
generadas como metabolitos secundarios.

Sin embargo en varias

observaciones, entre estas de inoculaciones con Azotobacter chroococcum


en plantas de tomate, se ha sugerido que las GAs producidas por
microorganismos pueden inducir o promover el crecimiento de la planta
hospedera (Dobbelaere et al., 2003). Se ha observado tambin que GA3

27

tiene un efecto similar a inoculaciones con Azospirillum lipoferum al promover


el desarrollo de las races a las 48 horas de la inoculacin en plntulas de
maz especialmente incrementando la densidad de los pelos radicales en
reas fisiolgicamente activas para la absorcin de nutrientes y agua
(Dobbelaere et al., 2003; Garcia de Salomone & Dobereiner, 1996). En un
estudio comparativo, aplicaciones de GA3 e inoculaciones con Azospirillum
sp., fue comparado su efecto en altura y peso fresco sobre plantas de maz
sometidas a un tratamiento inhibidor de la sntesis de giberelinas. Se
observaron niveles parecidos en el incremento de la altura de las plantas
inoculadas con Azospirillum brasilense y Azospirillum lipoferum con relacin
a las que se les adicion la GA3, concluyendo que las GAs producidas por
Azospirillum sp. juegan un papel importante en el desarrollo de gramneas
(Dobbelaere et al., 2003).

Los miembros de este gnero ofrecen un

excelente modelo para establecer la produccin de auxinas y su biosntesis,


al igual que investigar las asociaciones plantabacteria. Investigaciones
enfocadas a la biosntesis de AIA en Azospirillum brasilense ponen de
manifiesto varias rutas de biosntesis dependientes de triptfano, y
utilizndolo como modelo en el estudio de biosntesis de AIA en bacterias
(Zakharova et al, 1999).

Por otro lado la aplicacin de PGPRs en plantas cultivadas, es uno de los


ms prometedores mtodos para aumentar la produccin agrcola (Strigul &
Kravchenko, 2005), aunque existen problemas para la introduccin de estos
microorganismos al suelo ya que en varios casos stos no sobreviven all, o
no realizan la funcin esperada al incorporarlos.

Es conocido que

organismos benficos, introducidos a la rizosfera, son afectados por distintos


factores tanto biticos como abiticos. Dentro de los factores abiticos se
encuentran la temperatura del suelo, el pH de este mismo, la disponibilidad
de oxgeno, la disponibilidad de nutrientes, el contenido de agua, el tipo de

28

suelo, la textura y estructura del suelo. Gracias a la gran abundancia de


microorganismos en la rizsfera inducidos por la liberacin de compuestos
orgnicos por las plantas, se incluyen una serie de factores biticos que
afectan la supervivencia de las PGPR en el suelo, dentro de stas se incluye
predacin

por

nemtodos

protozoos,

actividad

de

bacterifagos,

competencia microbiana por recursos e interacciones directas como


inhibicin de la actividad microbiana por produccin de antibiticos y
sinergismo o incremento de nutrientes disponibles (Strigul & Kravchenko
2005).
2.4.1.2 Mecanismos de accin indirecta
Los mecanismos indirectos son aquellos en donde la estimulacin del
crecimiento aunque de manera indirecta, y la bacteria libera sus metabolitos
al medio edfico afectando otros factores rizosfricos, los cuales se revierten
en una mejora o estimulacin del crecimiento de la planta por ejemplo
(Kloepper, 1993; Solano, 2000):

Produccin de sustancias capaces de movilizar nutrientes de tipo


aminocido, siderforos o cidos orgnicos que liberaran fsforo,
hierro y/o aluminio (Cattelan et al., 1999; Jones et al., 1994).

Influyen en la produccin de fitoalexinas, compuestos utilizados para


la defensa de la planta, respuesta inducida por lipopolisacridos
producidos por bacterias en el rizoplano (Agrios, 2005; Cattelan et al.,
1999, Loon, 2007).

Algunas bacterias pueden hidrolizar molculas producidas por


patgenos como Pseudomonas cepacia y P. solanacearum, son
capaces de hidrolizar el cido fusrico, liberar 1,3glucanasa
inhibiendo el desarrollo de la pared fngica de hongos fitopatgenos
como Phytium ultimun y Rhizoctonia solani (Cattelan et al., 1999;
Loon, 2007; Schnider et a.l, 1994; Solano, 2000).

29

2.4.2 BIOSNTESIS DE REGULADORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL


La habilidad que muestran los microorganismos para sintetizar reguladores
de crecimiento vegetal es muy conocida, las cuales se producen en
asociacin con las plantas, estableciendo relaciones de tipo benfico, o de
parasitismo en donde las bacterias u hongos sintetizan estos reguladores o
compuestos similares con estructuras qumicas de accin similar, para
estimular los tejidos hospederos. A la lista de microorganismos productores
de reguladores se suman bacterias, actinomycetes, algas y hongos los
cuales pueden producir diferentes tipos de regulador y en diferentes
concentraciones (Baca & Elmerich, 2000; Tsavkelova et al., 2005).
2.4.2.1 Biosntesis de auxinas en bacterias
Las auxinas son derivadas del triptfano (Trp), por mltiples rutas
metablicas, pero solo puede ser sintetizado funcionalmente por rutas
dependientes de Trp.

2.4.2.1.1 Ruta Indol 3 acetamida (IAM)


La ruta IAM es la ruta para sntesis de auxinas mejor estudiada en bacterias,
consta de dos etapas. En la primera etapa, el triptfano es convertido a IAM
por la enzima triptfano 2monooxigenasa (IaaM), mientras que en la
segunda etapa el IAM es convertido a AIA por una IAM hidrolasa (IaaH).
Esta ruta fue descrita inicialmente como una ruta de sntesis especfica para
bacterias, ya que no habia evidencia de su existencia en plantas, hasta el
uso de tcnicas de alta sensibilidad para la deteccin de IAM en tejidos de
Arabidopsis thaliana, en donde se encontr que tambin hace parte de las
rutas de sntesis utilizadas por las plantas (Piotrowski et al., 2001; Pollmann

30

et al., 2002).
2.4.2.1.2 Ruta indol 3-Piruvato (IPvA)
La ruta de biosntesis de IAA en bacterias sigue la va del indol 3piruvato
(IPvA), siendo la ms conocida en bacterias, como Bradyrhizobium,
Azospirillum,

Rhizobium,

Azotobacter,

Enterobacter

cloacae,

Cyanobacteria. El primer paso en esta va es la conversin del triptfano a


IPvA por la aminotransferasa (Pollmann et al., 2002; Taiz & Zeiger, 2006).
Posteriormente IPvA es decarboxilado a indol 3 acetaldehido (IAAId) por la
indol 3 piruvato decarboxilasa (IPDC). En el ltimo paso IAAId es oxidada y
convertida en cido 3indol actico. Esta ruta ha sido descrita y
caracterizada en Azospirillum brasilense, en donde se ha descrito el gen que
codifica para la enzima IPDC (Zakharova et al, 1999) (Figura 2.8 y 2.11).

31

Figura 2.11 Biosntesis de AIA en bacterias. Tomado de Piotrowski et al. 2001

2.4.2.2 Biosntesis de giberelinas en bacterias


La biosntesis de giberelinas en microorganismos es similar a la ruta
biosinttica que realizan las plantas superiores, aunque no juegan un papel
vital en la fisiologa de estos microorganismos, las giberelinas son producidas
como metabolitos secundarios.
La ruta biosinttica de las giberelinas en PGPRs an no ha sido reportada,
pero gracias a que las giberelinas son compuestos isoterpenoides, tanto los
producidos por las plantas como las producidas por las bacterias, se podra
asumir que la va de biosntesis en este tipo de bacterias, es la que se ha
reportado en animales, plantas, hongos, archeas y algunas enterobacterias
(Rohmer, 2003), es decir por la ruta del cido mevalnico (Figura 2.10 y 2.12)

32

donde el acetato y el mevalonato son considerados como precursores


importantes de la sntesis de los isoterpenoides (Rohmer, 2003).

AcetilCoA
Acido Mevalnico
Acido Mevalnico Pirofosfato
GIBERELINAS GA3

GA12 aldehdo

Isopentenil Pirofosfato

Dimetilalil Pirofosfato

Geranio Pirofosfato

7Acido Kaurenoico Hidroxilado

Farnesil Pirofosfato
Ent- cido Kaurenoico
Geranilgeranil Pirofosfato

Copil Pirofosfato
Ent- Kaurenal
Ent- Kaurenol
Figura 2.12 Ruta de sntesis de giberelinas siguiendo del Acido Mevalnico. Tomado de Davies, 1988

33

2.5 MTODOS DE DETECCIN DE REGULADORES DE CRECIMIENTO


VEGETAL

Las hormonas vegetales se encuentran en las plantas

en bajas

concentraciones si se comparan con otros metabolitos secundarios como


alcaloides y terpenos, entre otros, por lo que la identificacin qumica de las
mismas puede verse limitada por las tcnicas usadas para su extraccin y
purificacin, ya sea por la baja concentracin en que se presentan o por la
sensibilidad

de

las

tcnicas

espectroscpicas

requeridas

para

su

identificacin qumica. La cuantificacin de giberelinas producidas por


PGPRs se ha realizado bajo tcnicas cromatogrfcas como cromatografa
de capa fina (TLC), y cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC),
mientras que la identificacin de las mismas se ha logrado mediante la
espectrofotometra de masas (Birkemeyer et al., 2003; Chiwocha et al., 2003;
Don et al., 2005).

Desde 1980 (Taiz & Zeiger, 2002), con la aplicacin de la cromatografa


lquida de alta resolucin combinada con los bioensayos se han realizado
diversas investigaciones a cerca de la naturaleza y estructuras qumicas de
las giberelinas. Desde entonces, con la cromatografa puede lograrse la
separacin de estas sustancias para posteriormente ser pasada por un
espectrofotmetro, de donde se obtiene su configuracin estructural,
obteniendo casi una huella digital del mismo.
Los

reguladores

de

crecimiento

vegetal

pueden

ser

producidos

industrialmente usando procesos de fermentacin, y se han obtenido


diferentes mtodos, para su obtencin y purificacin de dichos medios, es as
como la cromatografa lquida de alta presin (HPLC), es un procedimiento

34

de rutina, el cual se emplea para la purificacin y separacin de giberelinas.


Mientras que para su deteccin se han desarrollado diferentes mtodos,
como la cromatografa de capa fina (TLC), cromatografa de gases (GC),
cromatografa de gases y espectrofotometra de masas (GCMS) (Castillos,
1997). De esta forma la produccin in vitro de giberelinas por Azospirillum
sp., y el efecto de las mismas han sido estudiados por espectrofotometra de
masas (MS), por medio de esta tcnica se ha logrado establecer al
microorganismo como productor de auxinas y giberelinas exgenos de la
clase, GA1 y GA3 (Cassan, 2001).
Con

el

avance

de

la

tecnologa

se

han

desarrollado

tcnicas

espectroscpicas ms sensibles para la determinacin qumica, que pueden


ser utilizadas en estudios de este tipo, al igual que el avance en las tcnicas
cromatografcas que permiten la identificacin, purificacin y cuantificacin
de las sustancias de inters (Davies, 1988).
Conocer el fundamento de dichas tcnicas es de suma importancia para
entender y conocer las limitaciones de las mismas y de esta forma lograr
establecer la ms sensible y la ms adecuada al estudio.
Los mtodos ms usados hoy en da para el estudio de reguladores de
crecimiento vegetal son HPLC y GC. Debido a la aparicin de columnas de
alta resolucin comnmente se utiliza GC, mientras que HPLC slo es
utilizada con detectores altamente selectivos o con muestras altamente
purificadas (Arteca, 1996).

35

2.5.1 MTODOS DE DETECCIN COLORIMTRICA DE REGULADORES


DEL CRECIMIENTO VEGETAL
Los mtodos ms usados para la deteccin de reguladores de crecimiento
vegetal, especialmente giberelinas incluye el uso de costosos equipos, lo que
genera un sesgo en la investigacin al estar ligada a altos costos. Es por
esto que se buscan tcnicas que involucren procedimientos ms sencillos y
al alcance de cualquier laboratorio, como es el caso de la deteccin
colorimtrica que involucra un reactivo especfico y un espectroscopio.
2.5.1.1 Deteccin colorimtrica de auxinas
2.5.1.1.1 Reactivo de Salkowsky
El reactivo de Salkowsky, ha sido ampliamente utilizado para establecer la
presencia de grupos indol, en solucin a partir de tejidos vegetales y
extractos de cultivos microbianos, entre otros. Es un mtodo netamente
colorimtrico basado en la oxidacin que produce el cido perclrico a las
molculas de indol, generando una coloracin que va de la gama de los
rosados a fucsia, evidenciando la presencia de molculas con grupo indol
presumibles como compuestos auxnicos (Glickmann & Desaux, 1995,
Salkowsky, 1889).
2.5.1.2 Deteccin colorimtrica de giberelinas
2.5.1.2.1 Reactivo de Folling-Wu (cido fosfomolbdico)
La

reaccin

colorimtrica

base

del

reactivo

Folling-Wu

(cido

fosfomolbdico), es un mtodo utilizado en la deteccin de giberelinas, como


un mtodo sencillo y prctico de deteccin, basado en la reaccin de
reduccin que presenta el cido molbdico frente a soluciones de cido
giberlico a diferentes pH. La reaccin de reduccin ocasiona un cambio de

36

color del reactivo a azul mostrando la reduccin ocasionada por la presencia


de giberelina en la solucin (Graham & Henderson, 1960).
2.5.1.2.2 Reactivo 2,4-cido dinitrofenilhidrazina
El acido giberlico sufre hidrlisis a 100C lo que produce compuestos
cetnicos y cido giberico, stos compuestos cetnicos son los detectados
por el reactivo 2,4dinitrofenilhidrazina, lo que permite la deteccin, y en
menor escala la cuantificacin, de GA3 a partir de la reaccin que se
obtiene entre el reactivo 2,4dinitrofenilhidrazina y los compuestos
cetnicos derivados de la hidrlisis del cido giberlico (Graham &
Thomas, 1960).

2.5.2

DETECCIN

FSICO-QUMICA

DE

REGULADORES

DE

CRECIMIENTO VEGETAL

2.5.2.1 Cromatografa de capa fina (TLC)


La cromatografa de capa fina se ha utilizado en la separacin y el anlisis de
muchos compuestos y es de acuerdo a stos que se utilizan solventes
especficos, siendo particularmente til cuando se trata de sustancias no
voltiles.
En esta tcnica las separaciones se producen con base en distintos
procesos, adsorcin, reparto, intercambio inico y diferencia en el tamao de
las molculas, lo que le confiere ventaja frente a otras tcnicas ya que es
ms rpida y sensible debido a que la muestra se difunde menos, por lo cual
pueden separarse cantidades menores y por que el revelado puede llevarse
a cabo con reactivos muy sensibles como cidos sulfricos y clorosulfnico
(Jork, 1991).

37

La tcnica permite por tanto separaciones eficientes de mezclas complejas,


identificacin

preliminar

de

sus

constituyentes

como

deteccin

de

compuestos indeseables.
Los materiales y equipos que utiliza son similares a los utilizados en
cromatografa en papel, pero utiliza sorbentes (fase estacionaria) en donde
se agrupan adsorbentes, intercambiadores de iones y geles de filtracin,
entre ellos se encuentra el gel de slice o cido slico, siendo este el ms
utilizado, el hidrxido de aluminio comnmente llamado almina, Kieselgur o
Tierra de Diatomceas se utiliza en separaciones por reparto de
oligosacridos, celulosa fibrosa o celulosa microcristalina y poliamida entre
otros (Skoog & Leary, 1993).
2.5.2.2 Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)
Es utilizada por su alta eficiencia, resolucin y velocidad de separacin, es
utilizada para separar reguladores vegetales de crecimiento de otros
compuestos presentes en el extracto, al igual que por su capacidad para
separar compuestos o impurezas, en donde puede observarse la alta
resolucin de la tcnica. Puede ser utilizada en bioensayos, aunque hay que
tener en cuenta que aunque puede haber separacin no hay la purificacin
necesaria del compuesto para que pueda ser utilizado directamente en
espectroscopa (Davies, 1988).
2.5.2.3 Cromatografa de gases acoplada a espectroscopia de masas
(GCMS)
Este mtodo es considerado como el mejor para el anlisis de sustancias
asociadas al crecimiento vegetal, debido a su eficacia y a la simplicidad de la
tcnica.

A diferencia de otras tcnicas, como HPLC, donde se usan

detectores los cuales son destruidos y no permiten recobrar los niveles de


radioactividad, mientras que este mtodo mide diluciones isotpicas que no

38

presentan inconvenientes de este tipo por lo que es comnmente usada en la


identificacin y cuantificacin en este tipo de sustancias (Arteca, 1996).
Este mtodo fue el primero en ser usado para el anlisis de reguladores de
crecimiento vegetal por McMillan y sus colaboradores quienes trabajaron en
la identificacin de giberelinas. Aunque se conocen varias giberelinas, y son
de estructura qumica similar, se diferencian por la sustitucin de tomos los
cuales pueden ser reflejados en el espectro de masas lo que permite una
identificacin exacta no solo del grupo (giberelinas) sino de la molcula en si,
con lo cual se determina si es biolgicamente activa o no, al igual que se
observan diferencias en los derivados que producen (Davies, 1988).
2.5.2.4 Espectrofluoromtria
Bajo ciertas condiciones, los tomos absorben fotones de una longitud de
onda determinada, emiten algunas porciones de energa como fotones de
longitud de onda ms larga (energa ms baja), produciendo fenmenos
conocidos como fluorescencia y fosforescencia (Ramrez et al, 1996).
Estos fenmenos se distinguen entre s por la velocidad que caracteriza los
actos de absorcin y de reemisin, los cuales suceden en forma simultnea
para el fenmeno de fluorescencia, el cual solo se produce despus de la
absorcin de radiacin ultravioleta (Ramrez et al, 1996).
Los mtodos analticos utilizan el fenmeno de absorcin, en donde la
muestra absorbe parte de los fotones de energa lumnica incidente y se
detectan los fotones no absorbidos. El equipo utilizado en esta tcnica
cuenta con una fuente de radiacin, una lmpara ultravioleta, que incidir
sobre la muestra (Skoog & Leary, 1993).
La fluorescencia ms intensa y la ms til es la que presenta los compuestos
que contienen grupos funcionales aromticos, lo que permite la identificacin
de compuestos de este tipo.

39

La eficacia cuantitativa de la tcnica disminuye con el aumento de la


temperatura, y el fenmeno de fluorescencia se ve afectado por tetrabromuro
de carbono y/o yoduro de etilo al igual que la concentracin de oxgeno que
ocasiona atenuacin (quenching) (Skoog & Leary, 1993).
La espectrofluorometra ha tomado un papel importante en el anlisis y
particularmente en la determinacin de contaminantes, compuestos a niveles
traza y giberelinas (Don et al., 2005, Jiang et al., 1997).

40

3. JUSTIFICACIN
Las plantas para su desarrollo, no solo realizan procesos fotosintticos o
toman sustancias minerales del suelo, tambin llevan a cabo en su interior
una serie de procesos fisiolgicos que ayudan a dicho desarrollo. De la
misma forma, las plantas tambin se ven afectadas y de cierta manera
reguladas por algunos de los procesos que ocurren en el suelo, la mayora
de los cuales son llevados a cabo por microorganismos, entre los que se
encuentran fijadores de nitrgeno, solubilizadores de fsforo, productores de
hormonas y otros, los cuales son conocidos como PGPRs (rizobacterias
promotoras de crecimiento vegetal).
Para que las plantas puedan llegar a desarrollarse satisfactoriamente, es
necesaria la coordinacin de procesos fisiolgicos como la absorcin de
nutrientes, procesos fotosintticos y procesos externos del suelo y del
ambiente, de los cuales depende su correcto funcionamiento.
Dentro de los procesos fisiolgicos se encuentra incluida la sntesis de
distintas sustancias como reguladores de crecimiento (auxinas, giberelinas,
citocinas, etc.) los cuales son compuestos que actan como reguladores
endgenos del crecimiento y desarrollo en las plantas superiores.
Las auxinas son conocidas como el primer regulador de crecimiento vegetal
estudiado en plantas. Se les identifican como compuestos qumico de alto
potencial en la agricultura. Su accin no solo se limita al fototropismo, es
conocida por su participacin en elongacin celular, dominancia apical,
aparicin de races adventicias, diferenciacin vascular, formacin de frutos y
flores.

41

Las giberelinas, cumplen varios procesos importantes dentro de las plantas


entre los que se encuentran: induccin de sntesis enzimtica, promocin de
la germinacin de semillas, rompimiento de estados de dormancia o latencia
de estructuras vegetativas o semillas, activacin de la elongacin de tallos y
races, desarrollo de frutos.
Las auxinas y giberelinas son, por tanto, reguladores de crecimiento vegetal,
nativas en las plantas, que afectan, regulan o modulan un amplio abanico de
respuestas de crecimiento y que en su ausencia generara un gran retraso o
hasta inhibicin del crecimiento vegetal.
En la naturaleza, la produccin de auxinas y giberelinas no solo se lleva a
cabo por las plantas en su desarrollo normal, si no tambin por
microorganismos, que generan un impulso en el crecimiento de las plantas y
as un mejor desarrollo de estas.
El uso de las bacterias promotoras de crecimiento vegetal, se han convertido
en una excelente propuesta para optimizar la produccin de cultivos y su
calidad. Pues segregan a la rizsfera diversas sustancias involucradas
directamente en la respuesta fisiolgica de la planta. En la literatura se
encuentran reportes de la produccin de diversos reguladores de crecimiento
vegetal como cido indol actico y giberelinas por estas bacterias, lo que las
convierte en una fuente reguladores de crecimiento y un aporte extra de las
mismas para las plantas optimizando el rendimiento y la produccin en un
cultivo dado.
Debido a la importancia del papel desarrollado por las auxinas y giberelinas
en las plantas es importante lograr estandarizar un mtodo sencillo de
deteccin, puesto que si bien es cierto que la deteccin puede lograrse con
mtodos analticos qumicos, es indispensable establecer una manera

42

eficiente y segura que permita obtener la mxima efectividad de cada mtodo


en la deteccin de auxinas y giberelinas producidas, lo que se lograr
estableciendo el tiempo exacto de produccin de los reguladores de
crecimiento vegetal por parte de los microorganismos, logrando de esta
forma una curva de producto que puede ser aplicable a varios tipos de
microorganismos. Gracias a esto, se podra llegar a evaluar la viabilidad y
efectividad de distintos productos, desarrollar investigaciones y generar un
avance biotecnolgico, todo esto con el fin de aprovechar los beneficios que
pueden llegar a generar el uso de auxinas y giberelinas para el desarrollo de
una mejor agricultura.

43

4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL
Implementar y estandarizar mtodos sencillos de deteccin de auxinas y
giberelinas a partir de cultivos microbianos.

4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS


Estandarizar un mtodo de deteccin de auxinas y giberelinas por
cromatografa de capa fina.
Estandarizar un mtodo de deteccin colorimtrica de auxinas y
giberelinas.
Detectar la produccin de auxinas y giberelinas en cepas de un
bioinoculante acelerador del proceso de compostaje.
Establecer parmetros para estudiar la accin de reguladores de
crecimiento vegetal AIA, IBA GA3 en bioensayos.

44

5. MATERIALES Y MTODOS

5.1 ESTANDARIZACIN DE MTODOS DE DETECCIN DE AUXINAS


(CIDO INDOL ACTICO, AIA)
5.1.1 DETECCIN COLORIMTRICA
5.1.1.1 Reactivo de Salkowsky
Para establecer la intensidad y sensibilidad de la reaccin del reactivo de
Salkowsky, reportado ms comnmente en literatura, se realiz una curva de
calibracin con el reactivo de Salkowsky preparado a base de cido
perclrico (HClO4 3.48 M y FeCl3 10 mM ).
Se prepar un patrn de diferentes concentraciones (0, 5, 10, 15, 20, 25 y 30
ug/ml) de cido indol actico (AIA) comercial (Sigma) y se someti a reaccin
en proporcin de 2 mL de reactivo de Salkowsky por 1 mL del patrn de AIA,
luego se incub durante 30 minutos a temperatura ambiente y se ley la
absorbancia con un espectrofotmetro (Genesis 20) a 530nm, las mediciones
se realizaron por triplicado. Obteniendose la curva de calibracin.
Una vez establecida la sensibilidad del reactivo, la intensidad de la reaccin y
la gama de colores caractersticos de la reaccin, se realizaron diferentes
pruebas con reactivo Salkowsky preparado a base de cido sulfrico (Bric et
al, 1990; Glickmann & Dessaux, 1994), probando distintas concentraciones
tanto de FeCl3 como de H2SO4 y diferentes volmenes de reaccin (Tabla
5.1), con las mismas concentraciones del patrn de AIA (0, 5, 10, 15, 20, 25
y 30 ug/ml), incubando cada reaccin por 30 minutos a temperatura
ambiente, para determinar la sensibilidad, la intensidad de reaccin y la

45

escala de colores ms cercana a los obtenidos con el reactivo a base de


cido perclrico..
Se trabaj el reactivo de Salkowsky (Glickmann & Dessaux, 1994) con cido
sulfrico porque no fue posible comprar cido perclrico, debido a
restricciones para su importacin.

Tabla 5.1 Preparaciones del reactivo de Salkowsky a base de mezclas de cido perclrico y cloruro
frrico y cido sulfrico y cloruro frrico.

Concentracin
Reactivo
Perclrico
R1
R2
R3

FeCl3 H2SO4 HClO4


10 mM
3,5 M
40 mM 7,9 M
16 mM 10,8 M
9,2 mM 6,9 M
-

Volumen de reaccin
AIA
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL

Salkowsky
2mL
1 mL
1 mL
1 mL

Referencias
Bric et al, 1990
Glickmann & Dessaux, 1994
Glickmann & Dessaux, 1994
Glickmann & Dessaux, 1994

Dentro de los reactivos preliminarmente evaluados se determin los de mejor


sensibilidad de reaccin y color, comparados con la reaccin sometida con
cido perclrico y a stos se les realizaron algunas modificaciones en cuanto
a proporcin de reaccin (AIA: Reactivo) y concentracin de sus compuestos
(Tabla 5.2) buscando obtener la reaccin ms cercana a la presentada con el
reactivo de Salkowsky a base de acido perclrico.

Tabla 5.2 Preparaciones del reactivo de Salkowsky a base de cido sulfrico con diferentes
modificaciones en cuanto a concentraciones de H2SO4 y FeCl3 y diferentes volmenes de reaccin.

Reactivo
R1m
R1m1
R1m2
R2m

Concentracin
FeCl3
H2SO4
40 mM
7,9 M
40 mM
10,8 M
40 mM
10,8 M
16 mM
10,8 M

Volumen de reaccin
AIA
Salkowsky
1 mL
2mL
1 mL
1 mL
1 mL
2mL
1 mL
2mL

46

5.1.1.2

Evaluacin del espectro de absorbancia (400-700nm) para las

reacciones con diferentes formulaciones del reactivo de Salkowsky.


Para establecer la longitud de onda a la cual se debe leer cada reactivo, se
realiz un espectro de absorbancia para establecer el valor mximo de
absorbancia de cada reaccin con las diferentes formulaciones del reactivo
de Salkowsky.
Los espectros de absorcin se realizaron en un espectrofotmetro Shimadzu,
en longitud de onda de 400 700 nm, evaluando cada reactivo con 10 y 30
ug/ml de AIA (Sigma), por duplicado.
5.1.2

DETECCIN DE REGULADORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL

POR CROMATOGRAFA DE CAPA FINA (TLC)


La deteccin de reguladores de crecimiento por TLC, fue llevada a cabo en
placas de silica gel con indicador de fluorescencia (Merck), probando 15
fases mviles (Tabla 5.3), buscando buena separacin entre las bandas de
corrida y la movilidad de todos los reguladores.
Para la estandarizacin se utilizaron patrones de reguladores (AIA, IBA, GA3)
comerciales (SigmaAldrich), preparando soluciones stock de diferente
concentracin para evaluar la sensibilidad y la capacidad de deteccin de la
tcnica. Tambin se realizaron ensayos para determinar, el revelador, la
distancia entre puntos de siembra y el volumen de siembra. la forma de
revelar con calor en horno a 100C durante 10 minutos.
Las soluciones stock de los reguladores vegetales (AIA, IBA, GA3) se
disolvieron en agua, con una concentracin final de 10 mg/ml, a partir de ella
se realizaron diluciones para alcanzar concentraciones de 10, 5, 1, 0.5, 0.1,
0.05 y 0.01ug/ml para la siembra en las placas de TLC, y de este modo
establecer la mnima concentracin detectada.

47

Tabla 5.3. Descripcin de fases mviles utilizadas en la estandarizacin de TLC para deteccin de
reguladores de crecimiento vegetal.

Fase
Mvil
S1

CHCl3 : CH3COOC2H5 :CH3COOH

90:5:10

S2

CHCl3 : CH3COOC2H5 : CH3COOH

50:30:20

S3
S4

CHCl3 : CH3COOC2H5 : CH3COOH


CHCl3 : CH3COOC2H5 : HCOOH

60:40:5
50:40:10

S5

CHCl3 : CH3COOC2H5 : HCOOH

30:55:10

S6

CHCl3 : CH3COOC2H5 : CH3COOH

50:30:5

S7

CHCl3 : CH3COOC2H5 : CH3COOH

50:30:10

S8

CHCl3 : CH3COOC2H5 : HCOOH

50:30:10

S9

CHCl3 : CH3COOC2H5 : CH3COOH

Solvente

Proporciones Referencias

15:5:1

S10

CHCl3 : CH3COOH

95:5

S11

(CH3)2CHOH : NH4OH 25% : H2O

8:1:1

S12

(CH3)2CHOH : NH4OH 25% : H2O

10:1:1

S13

(CH3)2CHCH2OH : CH3COOH : H2O

12:3:5

S14

ETER PETROLEO:CH3COOC2H5

60:40

S15

CH2Cl2:CH3COOC2H5 : CH3COOH

90:10:1

S16

ETER PETROLEO:CH3COOC2H5

30:70

Zeevart, 1965
Metzger &
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Torres et al, 2000
Tien et al, 1979
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Modificado de
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2004
Ross & Bradbeer,
1968
Sweet & Lewis,
1971
Sweet & Lewis,
1971
Strzelczyk et al,
1983
Tien et al, 1979
Contreras et al,
2001
Contreras et al,
2001
Contreras et al,
2001

El revelador utilizado fue H2SO4 60% y FeCl3 28mM, con una composicin
similar al reactivo de Salkowsky, garantizando la deteccin de auxinas (AIA),
y citado en literatura como revelador para giberelinas (Merck, 1980).
La aplicacin del revelador para la estandarizacin se realiz por medio de
inmersin (Figura 5.1) y no por aspersin (Figura 5.2), por la facilidad de
manejo de las placas de tamao (3.5cm x 10cm) y para garantizar el
cubrimiento total del revelador sobre la placa.

48

Figura 5.1. Revelado por inmersin

Figura 5.2. Revelado por aspersin

El cromatograma se realiz en placas de silica gel de 3.5 x 10cm, las cuales


fueron marcadas y limpiadas en el solvente correspondiente antes de ser
utilizadas, marcando cada punto de siembra a 0.5 cm del borde de la placa
(Figura 5.3).
El volumen de muestra para siembra fue
de 1ul, se coloc en cada placa una
mezcla (mix) de reguladores preparado
con proporciones iguales de AIA, IBA y
GA3, y con muestra de cada regulador
por separado.

Figura 5.3. Cmaras de TLC y placas de silica gel

MIX

GA3

AIA

IBA

49

5.2 ESTANDARIZACIN DE MTODOS DE DETECCIN DE


GIBERELINAS
5.2.1 DETECCIN COLORIMTRICA

5.2.1.1 Reactivo Folling-Wu cido fosfomolbdico


La determinacin de cido giberlico con el reactivo Folling-Wu - cido
fosfomolbdico, se realiz a partir de soluciones stock de giberelinas a
diferentes concentraciones, buscando establecer una curva de calibracin
para la deteccin de GA3 en base al reactivo.
Se prepararon 200 ml del reactivo Folling-Wu - cido fosfomolbdico, a partir
de cido molbdico al 85%, una solucin de tungstanato de sodio al 10%,
hidrxido de sodio al 10% y cido fosfrico. El reactivo fue preparado en dos
fases, en la primera fase se adicionaron 7 g/l de cido molbdico, 1g/l de
tungstanato de sodio, posteriormente se adicionaron 40 ml de hidrxido de
sodio al 10% y se adicionaron 40 ml de agua destilada. La solucin fue
llevada a ebullicin durante 40 minutos para remover los rastros de amonio
presentes en el cido molbdico. En la segunda fase se dej enfriar la
solucin y se aadieron 70 ml de agua destilada y 25 ml de cido fosfrico al
85%. Finalmente la solucin fue aforada con agua destilada a 200 ml
(Graham & Henderson, 1960).
Las soluciones concentradas de giberelina fueron preparadas a partir de
GA3 comercial (Sigma-Aldrich), se obtuvieron soluciones de 100g/l,
500g/l y 1000g/l.
Se realizaron ensayos para determinar la sensibilidad del reactivo con el
cido giberlico, y especificidad del reactivo con una mezcla de GA3 con

50

AIA (Sigma-Aldrich) (1:1), y solo AIA comercial a una concentracin de


100g/l.
Una vez preparadas las soluciones de reguladores de crecimiento se
realiz la evaluacin del reactivo, a una proporcin de 1 ml de muestra y 3
ml de reactivo de cido fosfomolbdico, el tiempo de reaccin fue de 60
minutos, a bao mara en ebullicin. El tiempo cero fue estimado luego de
dos minutos de sumergidos los tubos de ensayo bao de agua a
ebullicin, pasados los 60 minutos, los tubos fueron retirados del bao y
la temperatura fue bajada con ayuda de bao de hielo. Una vez a
temperatura ambiente, la intensidad del color fue observada y la densidad
ptica fue medida a 780 nm en un espectrofotmetro (Genesis) (Graham
& Henderson, 1960).

5.2.1.2

Reactivo 2,4 dinitrofenilhidrazina

La determinacin de cido giberlico se realiz a partir de patrones


conocidos de giberelina comercial (Sigma-Aldrich), preparando soluciones
de 1 mg/ml, 500 ug/ml y 100 ug/ml. Para comprobar la efectividad del
reactivo se prob frente a concentraciones de cido indol actico,
preparando soluciones de 1 mg/ml, 500 ug/ml y 100 ug/ml a partir de acido
indol actico comercial (Sigma).
El reactivo se prepar a partir de hidrxido de potasio al 10%, 2-4
dinitrofenilhidrazina

preparada

previamente

con

HCl,

2-4

dintrofenilhidrazina y alcohol (Graham & Thomas, 1960).


Una vez preparado el reactivo y las soluciones stock de GA3 y AIA, se
coloc 1ml de reactivo por 1ml de muestra, la cual se llev a ebullicin
durante 5 minutos. El tiempo cero fue tomado 40 segundos despus de la
inmersin del ltimo tratamiento. Al final de este periodo, se llevaron los

51

tubos a un bao de hielo durante 5 minutos, posteriormente se aadieron


2 gotas de KOH al 10% en alcohol etlico al 80%, se homogeniz y se dej
reaccionar durante 5 minutos. El desarrollo de color rojo vino mostr una
reaccin positiva, y se midi la intensidad del color a 430 nm en un
espectrofotmetro (Genesis 20) (Graham & Thomas, 1960).
5.2.2 DETECCIN FLUOROMTRICA
La deteccin fluoromtrica fue realizada a partir de una solucin stock de
GA3 (SigmaAldrich) 100ug/ml. Se tomaron 0.2ml de esta solucin y se
adicionaron 0.2ml de mezcla cido sulfrico:etanol (50:50) (Reyes et al.,
1991), posteriormente se llev a incubacin a 48C durante 30 minutos. La
lectura se realiz a 464 nm en emisin y 406nm en excitacin.
Siguiendo el procedimiento descrito por Jiang et al. (1997) se tom 1ml de
solucin stock de GA3 y se le adicion 9ml de cido perclrico 7M,
posteriormente se llev a bao de agua a ebullicin durante 6 minutos y se
realiz la lectura a 457nm en emisin y 416 nm en excitacin.
Para realizar una curva de deteccin se prepararon soluciones de GA3 a
partir de la solucin stock de diferente concentracin 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5,
0.8, 1, 2, 3, 5, 8, 10, 15 y 20ug/ml, para determinara la capacidad de
deteccion del reactivo y la eficacia en la cuantificacin.

52

5.3 BIOENSAYO PARA LA DETECCIN DE AUXINAS Y GIBERELINAS


Se evalu la capacidad de productos comerciales de reconocida accin
como reguladores de crecimiento como Gibgro (GA3) (Arysta LifeScience),
Hormonagro

(cido

naftalen

actico)

(Colinagro

S.A),

reguladores

comerciales grado reactivo GA3, AIA, IBA (Sigma-Aldrich) y agua como


control sobre plntulas de lechuga, Lactuca sativa L., para posteriormente
evaluar la produccin de las cepas de referencia y las cepas del
bioinoculante como productoras de auxinas y giberelinas. Fue realizado en
cajas sello pack de tapa alta transparente, en la cual se coloc un acorden
de papel absorbente (papel para secado de manos, Familia) para originar
una cmara hmeda apta para germinacin y el desarrollo de las plntulas.
Inicialmente se realizaron ensayos de estandarizacin del volumen de agua
para las cajas el cual fue determinado como 2ml por surco (Figura 5.4).

Figura 5.4. Cmara hmeda bioensayo

Las cmaras hmedas fueron montadas con 20 semillas por caja, colocando
5 por cada surco, y acordeones de 4 surcos, con 4 repeticiones por
tratamiento, para un total de 80 semillas por tratamiento (ISTA, 2006). La
inoculacin con el caldo del ultimo dia del cultivo microbiano, los patrones
comerciales de reguladores y los productos comerciales de las semillas fue
realizada previa imbibicin en la solucin de cada tratamiento, GA3

53

(100ug/mL), AIA (100ug/mL), IBA (100ug/mL), Gibgro GA3 10% (200ppm),


Hormonagro (ANA 17,2g/L, 500ppm) y agua, durante 10 minutos y
posteriormente colocadas en cmara hmeda. La evaluacin de las cepas de
referencia y de las cepas del bioinoculante fue realizada imbibiendo las
semillas durante 10 minutos en los caldos de cultivo (sobrenadante) de la
fermentacin discontinua de cada cepa.
La lectura del ensayo fue realizada cada 12 horas determiando el estadio de
desarrollo de la planta (Celis et al, 2006) comprendidos en emergencia de la
radcula (Estado1), emergencia del hipocolito (Estado 2), emergencia de los
cotiledones (Estado 3) y emergencia de las hojas primarias (Estado 4)
(Figura 5.5)

FIGURA 5.5. Estadios de desarrollo en germinacin de semillas de lechuga.


Tomado de Celis et al., 2006

5.3.1 NDICES DE GERMINACIN


Con los datos de los estadios de desarrollo de las plntulas obtenidos a partir
del montaje en las cmaras hmedas, se establecieron ndices o parmetros
de evaluacin de crecimiento (Tabla 5.4), los cuales se evaluaron para el

54

resto de estadios para establecer diferencias significativas entre cada


tratamiento, en el cambio de estadio a estadio y su posible efecto sobre las
plntulas.
Tabla 5.4 ndices de germinacin. Tomado de Czabator, 1964;Thomson & Elkassaby., 1993

Indice

Definicin

GC

Capacidad de germinacin mxima (% Semillas germinadas al


final de la prueba)

GRI

# de semillas germinadas en un periodo de tiempo


determinado (# Sem germinadas / Hrs lectura actual-Hrs lectura
anterior)

R50

Tiempo (#Hrs) en que germin el 50% de lo sembrado

R50

Tiempo(#Hrs) en que germin el 50% de lo germinado


Valor mximo cociente del da de semillas germinadas en el
total de das de siembra (#Sem germinada/ Hrs lectura)

PV
MDG
VG

# Semillas total germinadas/ Hrs total de montaje


Valor de germinacin MDG* PV

5.4 MICROORGANISMOS
Los microorganismos empleados en el estudio fueron Azospirillum brasilense
cepa ATCC 29145 (control de produccin de GAs) y Azotobacter vinelandii
cepa ATCC 12518 (control de produccin de AIA). El primero obtenido del
laboratorio Asociacin Suelo Planta Microorganismo, de la Pontificia
Universidad Javeriana (PUJ), cepa obtenida del proyecto La silvicultura
como alternativa viable para el aprovechamiento sostenible y la conservacin
de las plantas medicinales de la flora nativa de Colombia financiado por el
convenio Andrs Bello y la PUJ; mientras la cepa de Azotobacter vinelandii
se obtuvo del Laboratorio de Microbiologa Ambiental y Suelos de la PUJ.
Tambin se trabaj con 14 cepas las cuales no fueron identificadas, que
hacen parte de un bioinoculante utilizado como acelerador de compostaje, ,
desarrollado en el Laboratorio de Biotecnologa del Departamento de
Microbiologa de la PUJ, del trabajo: Aislamiento de bacterias termfilas y

55

hongos mesfilos a partir de la fraccin orgnica de residuos slidos urbanos


(Rodrguez & Ruiz, 2006).
5.4.1 MEDIOS DE CULTIVO
Se evalu la capacidad del caldo tripticasa soya (TSB), medio B (Strzelczyk
et al, 1984) y medio B suplementado con triptona (BT) (Anexo 1) para inducir
la produccin de auxinas y giberelinas, y como soporte para la produccin de
biomasa en la fermentacin discontinua realizada para cada una de las
cepas.
5.4.2 RECUPERACIN Y RECONSTITUCIN DE CEPAS
Las cepas fueron recuperadas a partir de viales de conservacin en glicerol,
haciendo repiques en Agar Tripticasa Soya (TSA) (Anexo1), por triplicado; las
cajas fueron incubadas a 28 C por 2 das para luego realizar una prueba de
pureza con coloracin de Gram, finalmente fueron repicadas en TSA por
duplicado e incubadas a 28C.

5.5 PRODUCCIN DEL INCULO PARA LA FERMENTACIN


5.5.1 PREPARACIN DEL INCULO Azotobacter vinelandii y Azospirillum
brasilense
A partir de cultivos axnicos de A. vinelandii y A brasilense en TSA se
prepar una suspensin de clulas en solucin salina al 0,85% estril,
leyendo absorbancia en un espectrofotmetro Genesis 20 a 540 nm,
buscando un absorbancia de 0,2 nm equivalente a una concentracin de 108
clulas/ml, una vez se alcanzada dicha concentracin se realiz una dilucin
1/10 obteniendo una concentracin de 107 cel/ml en el inculo.

56

5.5.2

PREPARACIN

DEL

INCULO

DE

LAS

CEPAS

DEL

BIOINOCULANTE (14 Cepas)


El inculo de las 11 cepas bacterianas fue obtenido a partir de cultivos
axnicos de cada cepa realizando suspensiones celulares de concentracin
108 cel/ml, siguiendo el procedimiento descrito en el numeral 5.5.1. El inculo
de las 3 cepas de actinomycetes (cepas 6, 10 y 8) se realiz a partir de
cultivos axnicos realizando una suspensin celular de concentracin
107clulas/ml a partir de conteo en cmara de Neubauer.
5.5.3 FERMENTACIN DISCONTINUA
5.5.3.1 Fermentacin discontinua de cepas de referencia y estandarizacin
de medio de cultivo
La fermentacin discontinua para las cepas de referencia A. vinelandii y A.
brasilense, se realiz a partir de inculos axnicos de concentracin 107
cel/ml, en Caldo Tripticasa Soya (TSB), Caldo B, Caldo BT (Anexo 1)
evaluando los tres medios de cultivo por triplicado.
La fermentacin fue realizada en erlenmeyer de 250 ml con un volumen
efectivo de trabajo de 90 ml, al cual se le adicion el inculo, correspondiente
al 10% del volumen efectivo de trabajo, obteniendo una concentracin final
de 106 cel/ml. Posteriormente, las fiolas fueron llevadas a agitacin continua
en un agitador orbital a 100 rpm, a temperatura ambiente durante 7 das.
Cada 24 horas, se tomaron 4 ml de caldo de cultivo, durante los 7 das de la
fermentacin. La muestra de cultivo fue centrifugada a 5000 rpm por 10
minutos, se tom el sobrenadante y almacen en tubos eppendorf, para
posterior congelacin hasta la evaluacin de los reguladores de crecimiento.

57

5.5.3.2 Fermentacin discontinua de las cepas del bioinoculante


La fermentacin discontinua para las cepas del bioinoculante se realiz
siguiendo el mismo procedimiento descrito en el numeral 5.5.3.1, pero
solamente se llev a cabo en Caldo B y Caldo BT.

5.6 MTODOS DE DETECCIN DE REGULADORES DEL CRECIMIENTO


VEGETAL A PARTIR DE CULTIVOS MICROBIANOS
5.6.1 DETECCIN DE AUXINAS MICROBIANAS

5.6.1.1 Deteccin colorimtrica (Reactivo de Salkowsky)


Se determino que el reactivo de Salkowsky a base de cido sulfrico, fue
ms sensible y efectivo, se realiz la determinacin de la produccin de
cido indol actico a partir de los muestreos obtenidos de la fermentacin
para todas las cepas (A. vinelandii, A. brasilense y las 14 cepas del
bioinoculante). La formulacin del reactivo de Salkowsky utilizada fue R1m
(H2SO4 7,9M y FeCl3 40mM)
5.6.1.1.1 Curva patrn de cido indol actico (AIA)
Para la determinacin de la concentracin (ug/ml) de cido indol actico
(AIA) producidos por cada cepa diariamente, se realiz una curva patrn con
el reactivo Salkowsky a base de cido sulfrico (R1m).
Se prepar un patrn de diferentes concentraciones (0, 2, 4, 8, 10, 15, 20 y
30 ug/ml) de AIA comercial (Sigma) y se someti a reaccin a una proporcin
de 2 mL de reactivo de Salkowsky R1m por 1 mL de las diferentes
concentraciones del patrn de AIA, luego se incub durante 30 minutos a
temperatura

ambiente,

finalmente

se

ley

absorbancia

con

un

58

espectrofotmetro (Genesis 20) a 530nm. Las mediciones se realizaron por


triplicado y se determin la curva de calibracin y la ecuacin de la recta.
5.6.1.1.2 Determinacin de produccin de cido indol actico (AIA) en
cultivos microbianos
Las muestra de caldo de cultivo (sobrenadante) que se encontraban
almacenadas en congelacin, se sometieron nuevamente a centrifugacin,
en una microcentrfuga Jouan a 10.000 rpm por 5 min. Se tom 1ml del
sobrenadante y se llev a reaccin con 2ml del reactivo de Salkowsky R1m,
dejndolo en incubacin a temperatura ambiente por 30 minutos, para luego
leer en el espectrofotmetro (Genesis 20) a 530 nm determinando el valor de
absorbancia. Una vez obtenidos estos valores, se sustituyeron en la
ecuacin de la recta obtenida a partir de la curva patrn de AIA,
determinando la concentracin de AIA (ug/ml) producidos en cada da de la
fermentacin.
5.6.1.2 Deteccin de auxinas y giberelinas por cromatografa de capa fina
(TLC)
La deteccin de auxinas y giberelinas fue realizada a partir de muestras
previamente tratadas (microcentrifugacin a 10.000rpm por 10min) haciendo
una extraccin lquido-lquido. Una alcuota de 1.5ml del sobrenadante se
mezcl con 1.5ml de acetato de etilo, homogenizando con vortex 20 veces,
posteriormente la mezcla fue centrifugada, por 10 min a 5000rpm (centrfuga
Sorvall), para facilitar la separacin de las dos fracciones. A partir de la
fraccin orgnica se tom 1ml y se transfiri a un tubo eppendorf tapa rosca.
Posteriormente

la

fase

orgnica

se

concentr

(evaporacin)

por

centrifugacin al vaco en un speedvac Jouan, en el Laboratorio de


Micologa y Fitopatologa de la Universidad de Los Andes (LAMFU).

59

Finalmente la fraccin orgnica concentrada se reconstituy en 50ul de


metanol, sonicando las muestras durante 45 minutos.
Los cromatgramas fueron realizados en placas de silica gel para deteccin
de fluorescencia (Merck) de 10 x 10 cm, las cuales fueron limpiadas
previamente en la fase mvil de cloroformo: acetato de etilo: acido actico
(50:30:20).
Se sembr en las placas 10ul de muestra,
sirviendo inicialmente 2ul y dejando secar, y
repitiendo la siembra 5 veces.
Las placas fueron marcadas con 7 puntos
para siembra, sembrando en el ltimo carril
1ul de la mezcla de reguladores (AIA, IBA,
Figura 5.6 Cmara de TLC

GA3), como control del cromatograma.

Listos los cromatgramas se colocaron en la fase mvil dejando un frente de


corrida de 6.5 cm, posteriormente fueron retirados de la cmara de TLC
(Figura 5.6), se dejaron secar para posteriormente ser asperjados con el
revelador uniformemente (H2SO4 60%, FeCl3 28mM). Luego de la aspersin,
las placas se secaron a temperatura ambiente en la cabina de extraccin y
posteriormente las placas se sometieron a calentamiento en horno a 100C
durante 2 minutos. La lectura se realiz para GA3 en UV de onda larga,
mientras que AIA e IBA, fueron observados en luz visible, registrando en
ambos casos la movilidad cromatogrfica (Rf).

60

6. RESULTADOS Y DISCUCION
6.1 ESTANDARIZACIN DE MTODOS DE DETECCIN DE AUXINAS
6.1.1 DETECCIN COLORIMTRICA (REACTIVO DE SALKOWSKY)
Al evaluar las reacciones de los diferentes tipos de reactivos de Salkowsky a
base de cido sulfrico, se observ un comportamiento diferente de los datos
entre los tres reactivos inicialmente evaluados R1, R2 y R3 (Glickmann &
Dessaux, 1995), encontrndose variaciones tanto en sus valores de
pendiente (Figura 6.1), como en el color que presentaron en el momento de
la reaccin (Figura 6.2).

Figura 6.1 Curvas de deteccin AIA con el reactivo de Salkowsky a base a de cido perclrico y cido
sulfrico: a Salkowsky HClO4 (HClO4 3,5 M FeCl3 10mM, 1:2), b Salwosky R1 (H2SO4 7,9 M
FeCl3 40 mM, 1:1), c Salkowsky R2 (H2SO4 10,8 M FeCl3 16 mM, 1:1), d Salkowsky R3 (H2SO4 6,9
M FeCl3 9,2 mM, 1:4); se observan los datos de pendiente y R2 para cada una de las reacciones.

61

Curva deteccin AIA - Salkowsky

Curva deteccin AIA - R1

(HClO4 3.5M - FeCl3 10mM, 1:2)

(H2SO4 7.9M - FeCl3 40mM, 1:1)

b
Curva deteccin AIA - R2

Curva deteccin AIA - R3

(H2SO4 10.8M - FeCl3 16mM, 1:1)

(H2SO4 6.9M - FeCl3 9.2mM, 1:4)

Figura 6.2 Muestras de reaccin de diferentes concentraciones de AIA con los diferentes reactivos de
Salkowsky. a Salkowsky HClO4 (HClO4 3,5 M FeCl3 10mM, 1:2), b Salkowsky R1 (H2SO4 7,9 M
FeCl3 40 mM, 1:1), c Salkowsky R2 (H2SO4 10,8 M FeCl3 16 mM, 1:1), d Salkowsky R3 (H2SO4 6,9
M FeCl3 9,2 mM, 1:4); se observa la escala de color segn las diferentes concentraciones de AIA.

Luego de obtener los datos preliminares de las diferentes mezclas de cido


sulfrico y cloruro frrico de los reactivos bsicos R1, R2 y R3, en base a las
pendientes de las grficas obtenidas (Glickmann & Dessaux, 1995) (Tabla

62

6.1) y el color de la reaccin, se realizaron unas modificaciones a los


reactivos R1 y R2 (Glickmann & Dessaux, 1995) debido a que estos
presentaron datos ms altos de pendiente y R2 que los datos obtenidos con
el reactivo R3, comparados con los datos obtenidos a partir de la curva de
calibracin realizada con Salkowsky a base de HClO4. El color de la reaccin
fue similar en los cuatro para las cuatro formulaciones del reactivo. Teniendo
en cuente estas observaciones, se decidi variar la proporcin de reaccin
entre AIA y el reactivo, as como las concentraciones de H2SO4 y FeCl3
(Tabla 5.2). Nuevamente se compar la sensibilidad de cada reactivo (Figura
6.3) y el color de reaccin, buscando una coloracin similar a la gama de
colores observada en reaccin con Salkowsky a base de HClO4 (Figura 6.4).

Tabla 6.1 Datos de pendiente, R2 y color obtenidos a partir de la reaccin de HClO4, R1, R2 y R3 con
AIA, los asteriscos pertenecen a la gama de color del reactivo a base de acido perclorico el cual cuenta
con 4 asteriscos, buscando una comparacin entre la gama de color con los reactivos evaluados.

Reactivo
HClO4
R1
R2
R3

Pendiente
0,034
0,018
0,014
0,007

R2
0,999
0,994
0,992
0,986

Color
****
****
**
*

63

e
Figura 6.3 Curvas de deteccin de AIA con el reactivo de Salkowsky a base a de cido perclrico y
cido sulfrico: a Salkowsky a base de HClO4 (HClO4 3,5 M FeCl3 10mM, 1:2), b Salwosky R1m
(H2SO4 7,9 M FeCl3 40 mM, 1:2), c Salkowsky R1m1 (H2SO4 10,8 M FeCl3 40 mM, 1:1), d

64

Curva deteccin AIA - Salkowsky

Curva deteccin AIA - R1m

(HClO4 3.5M - FeCl3 10mM, 1:1)

(H2SO4 7.9M - FeCl3 40mM, 1:2)

b
Curva deteccin AIA - R1m1

Curva deteccin AIA - R1m2

(H2SO4 10.8M - FeCl3 40mM, 1:1)

(H2SO4 10.8M - FeCl3 40mM, 1:2)

d
Curva deteccin AIA R2m
(H2SO4 10.8M - FeCl3 16mM, 1:2)

e
Salkowsky R1m2 (H2SO4 10,8 M FeCl3 40 mM, 1:2), e Salkowsky R2m (H2SO4 10,8 M FeCl3 16
mM, 1:2); se observan los datos de pendiente y R2 para cada una de las reacciones.
Figura 6.4 Muestras de reaccin de diferentes concentraciones de AIA con los diferentes reactivos de
Salkowsky. a Salkowsky a base de HClO4 (HClO4 3,5 M FeCl3 10mM, 1:2), b Salwosky R1m (H2SO4 7,9 M
FeCl3 40 mM, 1:2), c Salkowsky R1m1(H2SO4 10,8 M FeCl3 40 mM, 1:1), d Salkowsky R1m2 (H2SO4
10,8 M FeCl3 40 mM, 1:2), e Salkowsky R2m (H2SO4 10,8 M FeCl3 16 mM, 1:2); se observa la escala de
color segn las diferentes concentraciones de AIA.

65

Al obtener los datos de las reacciones del patrn de AIA con los reactivos R1m,
R1m1, R1m2 y R2m (Tabla 6.2) y los diferentes patrones de color (Figura 6.4)
observados en el momento de la reaccin, en comparacin con los datos iniciales
de la reaccin de AIA con Salkowsky preparado con HClO4 y de acuerdo a las
pendientes de las grficas y la escala de color que presento la reaccin se decidi
trabajar con el reactivo R1m, el cual presenta mayor sensibilidad y color de
reaccin con el reactivo a base de cido perclrico. El reactivo R1m1 presenta
mayor sensibilidad que el R1m, pero la reaccin muestra una tonalidad diferente a
la reaccin con Salkowsky-HClO4.

Tabla 6.2 Datos de pendiente y R2 obtenidos a partir de la reaccin de R1m, R1m1, R1m2 y R2m con AIA.
los asteriscos pertenecen a la gama de color del reactivo a base de acido perclorico el cual cuenta con 4
asteriscos, buscando una comparacin entre la gama de color con los reactivos evaluados.

Reactivo
HClO4
R1m
R1m1
R1m2
R2m

Pendiente
0,034
0,024
0,032
0,01
0,009

R2
0,999
0,973
0,964
0,963
0,994

Color
****
****
***
*
**

El color de reaccin con el reactivo de Salkowsky puede variar segn el


compuesto detectado, caracterizndose AIA por generar un color fucsia en
reaccin con dicho reactivo. La tonalidad de la coloracin de la reaccin es
directamente proporcional a la cantidad de AIA (Bric et al, 1991). De esta forma,
cuando se torna de un color fucsia a prpura intenso es un indicativo de la
presencia de altas cantidades de AIA en la muestra; mientras que si se torna de
un color fucsia a rosa plido se asume la presencia de una baja concentracin de
AIA. La aparicin de color fucsia en la reaccin, es debida a una reaccin oxidativa
causada por el cido, y una transaminacin que lleva a la sustitucin del grupo
amino por el Cl del FeCl3, presente en el reactivo de Salkowsky (Gordon & Webert,
66

1950) la reaccin de oxidacin producida por el cido es ms intensa segn el


poder oxidativo del cido utilizado, siendo el cido perclrico uno de los cidos con
mayor poder oxidativo (Bric et al,1991, Glickmann & Dessaux 1995). Lo que se
busc en este trabajo fue sustituir el cido perclrico por cido sulfrico,
igualmente un cido con un alto poder oxidativo (Merck, 2001).
La reaccin de Salkowsky es altamente especfica para grupos indol, pero no para
AIA como tal. Cuando se pone en reaccin una muestra y se torna de color
amarillo a amarillo caf se podra especular la deteccin de otros compuestos con
grupos indol como cido indol butrico, cido indol pirvico o cido indol propinico
(Bric et al, 1991). Por esto, se busca al estandarizar el uso de nuevas
formulaciones de Salkowsky que el color de reaccin sea similar al color de
reaccin de Salkowsky a base de cido perclrico, ya que por color se podra
presumir la deteccin especfica de AIA y no de otros compuestos con grupos
indol. Debido a esto, no se escogi el reactivo R1m1 ya que aunque present un
valor de pendiente cercano al valor obtenido en la reaccin con cido perclrico,
no present una tonalidad tan similar a la que se presenta con cido perclrico,
por lo que se podra estar detectando otro tipo de compuestos con grupos indol. El
reactivo R1m2, cuya modificacin fue el aumento de la concentracin del cido
sulfrico con lo que se esperara que la reaccin de oxidacin fuese mayor,
present un color caf el cual no est acorde a la gama de color que se presenta
con el reactivo de Salkowsky a base de cido perclrico, lo cual posiblemente fue
causado a que la oxidacin pudo haber generado una deteccin de precursores de
AIA (Bric et al, 1991).
El cambio de coloracin de reaccin con algunas de las formulaciones del reactivo
de Salkowsky puede tambin estar relacionado con un cambio en la longitud de
onda de mxima absorbancia. Para verificar si se dieron cambios en la longitud de
mxima absorbancia, se evalu el espectro de absorbancia de las reacciones de
todos los reactivos de Salkowsky-H2S04 comparando con el espectro de
absorbancia de Salkowsky-HClO4. Para determinar los espectros de absorbancia

67

para cada reactivo, se corri una reaccin con solucin de AIA en dos
concentraciones (10ug/ml y 30ug/ml), y el espectro se determin en rango de luz
visible (400nm 700nm) (Figura 6.5 y 6.6). Los picos de mxima absorcin estn
entre 528nm y 534 nm. La longitud de absorbancia mxima de la reaccin con
Salkowsky-HClO4 fue de 528 nm, lo cual se ajusta a la literatura donde se
recomienda la lectura a 530 nm (Salkowsky, 1889); de la misma forma ocurre con
el reactivo R1m donde la diferencia no excede los 0.5 nm, con lo que se puede
determinar la lectura a 530 nm (Tabla 6.3) (Bric et al, 1991; Glickmann & Dessaux,
1995). En caso de que la longitud de onda de mxima absorcin tenga un cambio
mayor de 10nm, se podra modificar la lectura de la prueba a la longitud del onda
de pico de absorcin para aumentar la sensibilidad de la prueba. En el caso del
reactivo R1m no es necesario hacer esta modificacin.
Tabla 6.3 Valores de mxima absorcin en el espectro absorbancia de 400 700nm de las reacciones con
las diferentes formulaciones del reactivo de Salkowsky.

(nm)
10
30
REACTIVO ug/ml
ug/ml
Perclrico 528,50 528,50
529,50 529,50
R1
531,00 530,50
R2
532,00 532,00
R3
532,50 532,50
R1m
531,00 531,50
R1m1
532,50 533,50
R1m2
533,50 535,00
R2m

68

ESPECTRO DE ABSORCION REACCIN


SALKOWSKY-HClO4 (AIA 30ug/ml)

a.

b.

ESPECTRO DE ABSORCION REACCIN


SALKOWSKY-H2SO4 R2 (AIA 30ug/ml)

c.

ESPECTRO DE ABSORCION REACCIN


SALKOWSKY-H2SO4 R1 (AIA 30ug/ml)

ESPECTRO DE ABSORCION REACCIN


SALKOWSKY-H2SO4 R3 (AIA 30ug/ml)

d.

Figura 6.5 Espectro de absorcin de reacciones con diferentes formulaciones de reactivo de Salkowsky (AIA
30ug/m). a. HClO4, b. H2SO4 R1, c. H2SO4 R2 d. H2SO4 R3.

69

ESPECTRO DE ABSORCION REACCIN


SALKOWSKY-HClO4 (AIA 30ug/ml)

ESPECTRO DE ABSORCION REACCIN


SALKOWSKY-H2SO4 R1m(AIA 30ug/ml)

b.

a.

ESPECTRO DE ABSORCION REACCIN


SALKOWSKY-H2SO4 R1m2 (AIA 30ug/ml)

ESPECTRO DE ABSORCION REACCIN


SALKOWSKY-H2SO4 R1m1 (AIA 30ug/ml)

d.

c.

ESPECTRO DE ABSORCION REACCIN


SALKOWSKY-H2SO4 R1m2 (AIA 30ug/ml)

e.
Figura 6.6 Espectro de absorcin de reacciones con formulaciones de reactivo de Salkowsky modificadas
(AIA 30ug/m). a. HClO4, b. H2SO4 R1m, c. H2SO4 R1m1, d. H2SO4 R1m2, e. H2SO4 R1m2

70

6.2 DETECCIN DE REGULADORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL


POR CROMATOGRAFA DE CAPA FINA (TLC)

6.2.1 ESTANDARIZACIN DE FASE MVIL PARA TLC


La estandarizacin de deteccin de reguladores de crecimiento por TLC, fue
establecida probando 15 fases mviles (Tabla 5.3), buscando principalmente
buena resolucin entre las bandas de corrida y la movilidad de todos los
reguladores. Para la estandarizacin se utilizaron patrones de reguladores
(AIA, IBA, GA3) comerciales (SigmaAldrich), preparando soluciones stock
de diferente concentracin para evaluar el lmite de deteccin de la tcnica.
La resolucin entre las bandas y el valor de Rf, movilidad cromatogrfica
(Tabla 6.4), fueron los criterios bsicos para la escogencia de la fase mvil a
utilizar en la evaluacin de produccin de AIA, IBA, GA3 en las cepas de
referencia y las cepas del bioinoculante.
Los Rf de GA3 obtenidos a partir de las fases mviles S1, S3, S4, S5, S8, S9,
S10, S12, S14, S15, S16 (Tabla 6.4) con un frente de corrida de 4.5 cm,
demuestran la falta de afinidad entre el solvente y la muestra. Aumentando el
frente de corrida de 4.5 cm a 6 cm se observ movilidad de la muestra en los
solventes S3, S4, S5 (Tabla 6.4), mientras que con las mismas fases mviles
se observ la movilidad de AIA e IBA, la cual se ve sesgada por la falta de
movilidad de GA3.
La determinacin de la fase mvil fue realizada a partir de S2, S5 y S13,
siendo estos los solventes que mostraron mejor resolucin entre las bandas
de AIA e IBA y movilidad de GA3 (Tabla 6.4).

71

Tabla 6.4 Movilidad cromatogrfica (Rf) de reguladores de crecimiento (GA3, AIA, IBA) en las fases
mviles evaluadas (los reguladores con prefijo m indican el carril del cromatograma en el que se sirvi
la mezcla de los tres reguladores, mix).
FRENTE DE CORRIDA (PROMEDIO 4,5 cm)

mGA3

mAIA

S1

0,00

S2

0,31

S3
S4

FRENTE DE CORRIDA (PROMEDIO 6 cm)

mIBA

GA3

AIA

IBA

mGA3

mAIA

mIBA

GA3

AIA

IBA

0,56

0,63

0,00

0,60

0,75

0,88

0,28

0,83

0,68

0,00

0,88

0,28

0,60

0,68

0,00

0,59

0,67

0,83

0,88

0,28

0,83

0,91

0,00

0,63

0,75

0,00

0,00

0,67

0,77

0,00

0,65

0,78

0,65

0,76

0,06

0,68

0,78

0,07

0,68

0,78

0,05

0,72

0,82

0,05

0,71

0,81

S5

0,00

0,85

0,90

0,36

0,86

0,90

0,39

0,89

0,93

0,39

0,89

0,93

S6

0,03

0,71

0,81

0,04

0,72

0,83

0,00

0,70

0,81

0,00

0,71

0,80

S7

0,07

0,78

0,87

0,07

0,78

0,87

0,00

0,76

0,84

0,00

0,76

0,84

S8

0,00

0,67

0,82

0,03

0,67

0,83

0,06

0,68

0,77

0,06

0,66

0,80

S9

0,00

0,53

0,64

0,00

0,53

0,60

0,00

0,54

0,64

0,00

0,54

0,54

S10

0,00

0,33

0,53

0,00

0,36

0,53

0,00

0,38

0,60

0,00

0,33

0,58

S11

0,04

0,37

0,50

0,04

0,42

0,59

0,09

0,50

0,61

0,09

0,44

0,59

S12

0,00

0,29

0,40

0,00

0,29

0,41

0,00

0,29

0,42

0,00

0,29

0,40

S13

0,76

0,00

0,93

0,73

0,90

0,91

0,78

0,86

0,92

0,78

0,90

0,92

S14

0,00

0,10

0,19

0,00

0,14

0,25

0,00

0,17

0,25

0,04

0,17

0,34

S15

0,00

0,31

0,44

0,00

0,31

0,50

0,00

0,35

0,48

0,00

0,35

0,40

S16

0,00

0,50

0,63

0,04

0,54

0,65

0,00

0,46

0,63

0,00

0,46

0,65

La fase mvil S13 fue el mejor sistema de solvente para la movilidad de GA3
evidenciado por el mayor Rf de GA3 de las 16 fases mviles (Tabla 6.5), con
una fluorescencia clara. Sin embargo las bandas de AIA e IBA no presentan
buena resolucin, presentndose como manchas; mientras que en el carril
del Mix se observa un enmascaramiento AIA por IBA, observndose solo una
mancha amarilla con un borde fucsia caracterstico del AIA (Figura 6.8 a). El
sistema de solvente S5 presenta el segundo Rf de GA3 ms alto de las 16
fases mviles evaluadas, lo que lo hace un excelente solvente para GA3
(Tabla 6.5); sin embargo, aunque AIA e IBA se observan con buena
resolucin, este sistema tambin resuelve otras bandas en el cromatgramas
(Figura 6.8 b).
La fase mvil S2, compuesta por cloroformo: acetato de etilo: cido actico
(50:30:20), present un Rf para GA3 de 0.28, el cual es menor comparado

72

con S5 y S13 (Tabla 6.5), y excelente resolucin entre las bandas de AIA e
IBA, en los dos frentes de corrida evaluados (Figura 6.8 c y d).
Los valores de Rf y la resolucin entre las bandas de AIA e IBA (Figura 6.9)
obtenidos a partir de los cromatgramas sugieren a la fase mvil S2, como el
solvente adecuado para la deteccin de los tres reguladores de crecimiento
vegetal (AIA, IBA y GA3).
Tabla 6.5 Mejores valores de movilidad cromatogrfica (Rf) Rf de las fases mviles para la deteccin
de AIA, IBA y GA3 (los reguladores con prefijo m indican el carril del cromatograma en el que se sirvi
la mezcla de los tres reguladores, mix).
FRENTE DE CORRIDA (PROMEDIO 4,5 cm)

mGA3

mAIA

FRENTE DE CORRIDA (PROMEDIO 6 cm)

mIBA

GA3

AIA

IBA

mGA3

mAIA

mIBA

GA3

AIA

IBA

S2

0,31

0,75

0,88

0,28

0,83

0,88

0,28

0,83

0,88

0,28

0,83

0,91

S5

0,00

0,85

0,90

0,36

0,86

0,90

0,39

0,89

0,93

0,39

0,89

0,93

S13

0,76

0,00

0,93

0,73

0,90

0,91

0,78

0,86

0,92

0,78

0,90

0,92

Al realizar una revisin bibliogrfica no se encontraron referencias donde se


cite el uso de un mismo solvente para la deteccin de los tres reguladores de
crecimiento (AIA, IBA y GA3), por lo que los resultados obtenidos entonces
no se pueden comparar con resultados de estudios preliminares.
6.2.2 DETECCIN DE REGULADORES DE CRECIMIENTO EN TLC
La deteccin de auxinas se llev a cabo con el patrn de AIA e IBA, los
cuales reaccionaron con el revelador, de composicin similar a la del reactivo
Salkowsky, garantizando la deteccin de grupos indol. La reaccin evidenci
el color fucsia caracterstico de AIA con el reactivo Salkowsky (Bric et al.,
1990), mientras que para IBA se observ un color naranja oscuro en los
cromatgramas, tanto en los carriles donde se sirvieron individualmente los
patrones como en la mezcla de los tres (Figura 6.7).

73

IBA

IBA

AI

GA3

AIA

GA3

MIX GA3 AIA IBA MIX GA3

AIA IBA

MIX

MIX GA3 AIA IBA

a. Cromatograma S13 (Frente de


corrida 4 cm)

GA3

AIA IBA

b. Cromatograma S5 (Frente de corrida


4 cm)

IBA

IBA

AIA

AIA
GA3

GA3

MIX GA3 AIA

IBA MIX GA3 AIA IBA

c. Cromatograma S2
Frente de corrida 4 cm

6cm

MIX

GA3

AIA IBA

MIX

GA3

AIA IBA

d. Cromatograma S2
Frente de corrida

4 cm

6cm

FIGURA 6.7 a. Cromatograma fase mvil S13, luz visible y UV, frente de corrida 4cm, b.Cromatograma
fase mvil S5, luz visible y UV, frente de corrida 4cm, c. Cromatograma fase mvil S2, luz visible frente
de corrida 4cm y 6cm, d. Cromatograma fase mvil S2, luz UV, frente de corrida 4cm y 6cm.

74

Las giberelinas fueron detectadas por la fluorescencia que resulta de la


reaccin de oxidacin entre el cido giberlico y el cido sulfrico

del

revelador (Reyes et al., 1991), lo cual fue observado bajo luz ultravioleta,
observndose una fluorescencia azul intensa en los cromatogramas (Figura
6.7), tanto en la mezcla de reguladores como en el patrn de GA3.
6.2.3 LIMITES DE DETECCIN DE REGULADORES DE CRECIMIENTO
VEGETAL EN TLC (AIA, IBA, GA3)
Para establecer el lmite de deteccin de la tcnica se realiz una curva de
deteccin de reguladores AIA, IBA, GA3 con el patrn de cada regulador a
diferente concentracin (Figura 6.8) estableciendo el limiete de deteccipon a
partir de el rango de produccin de AIA, GA3 en microorganismos,
produccin de AIA (0.05ug/ml), y GA3 (0.05 ug/ml). (Torres et al, 2000, Tien
et al, 1979). Se establecio el limiete de deteccin de la tenica como de 0.5ug/
ml para AIA, IBA y GA3.

0.01ug

0.05ug

0.1ug

0.5ug

1ug

5ug

10ug

GA3
AIA
IBA
0.01ug

0.05ug

0.1ug

0.5ug

1ug

5ug

10ug

GA3
AIA
IBA
Figura 6.8 Lmite de deteccin de reguladores de crecimiento vegetal (AIA, IBA y GA3) en TLC. Panel
superior cromatograma luz visible y panel inferior cromatoigrama en UV.

75

6.3

ESTANDARIZACIN

DE

MTODOS

DE

DETECCIN

DE

GIBERELINAS
6.3.1 DETECCION COLORIMETRICA

6.3.1.1 Reactivo Folling-Wu (cido fosfomolbdico)


La reaccin de deteccin de giberelinas con el reactivo Folling-Wu (cido
fosfomolbdico) present un color azul en las soluciones de diferentes
concentraciones de GA3 (Figura 6.9). Las soluciones de AIA tratadas con el
mismo reactivo, tambin presentaron la misma coloracin azul (Figura 6.10).
Estos resultados demuestran la inespecificidad del reactivo.

Figura 6.9. Reaccin con cido fosfomolbdico a diferentes concentraciones de GA3.

La deteccin colorimetrca de giberelinas con el reactivo Follin Wu est


restringida a soluciones puras de giberelinas, ya que dicho reactivo puede
reaccionar con aminocidos y azucares (Graham & Henderson 1960), como
en el caso de AIA donde el grupo indol reacciona reduciendo el cido
fosfomolbdico generando el color azul caracterstico de la reaccin positiva.

76

GA3: AIA
100ug/ml

Figura 6.10. Reaccin de cido fosfomolbdico con una mezcla de AIA y GA3. (1:1).

6.3.1.2 Reactivo 2,4 dinitrofenilhidrazina


La

deteccin

colorimetrca

de

giberelinas

con

el

reactivo

2,4

dinitrofenilhidrazina present color rojo en los patrones de GA3,


correspondiente a la reaccin positiva del reactivo (Figura 6.11), por la
deteccin de los compuestos cetnicos producidos por la hidrlisis de las
giberelinas (Graham & Thomas, 1960). Sin embargo la reaccin de los
patrones de AIA gener el mismo color rojo, lo que evidenci la falta de
especificidad del reactivo (Figura 6.12). Probablemente debido a un
producto de la hidrlisis de AIA, lo que hace que la reaccin solo se pueda
aplicar para la cuantificacin de patrones de giberelinas o muestras puras.

77

Figura 6.11 Reaccin del reactivo 2-4 dinitrofenilhidrazina con diferente concentraciones de GA3

Figura 6.12 Reaccin del reactivo 2-4 dinitrofenilhidrazina con diferentes concentraciones de AIA.

78

6.3.2 DETECCIN FLUOROMTRICA


La deteccin fluoromtrica de GA3 es realizada en longitudes de onda del
espectro visible, en donde la fluorescencia esta reportada en emisin 457 y
excitacin 416nm (Jiang et al., 1997), mientras que Reyes y colaboradores
(1991), la reportan en emisin 464 nm y excitacin 406 nm. La deteccin se
basa en la oxidacin del cido giberlico por reaccin con cido sulfrico o
cido perclrico en alcohol. El producto de la oxidacin del cido giberlico
emite fluorescencia (Jiang et al, 1997).
La estandarizacin de la prueba no pudo ser llevada a cabo por problemas
con los fluormetros disponibles. El espectroflurmetro del Departamento de
Qumica de la PUJ no tiene monocromador en la fuente de excitacin, por lo
cual las lecturas de las reacciones con diferentes concentraciones de patrn
de GA3 no diferan. Tampoco se lograba una lectura estable, el indicador de
unidades de lectura oscilaba constantemente.
Tambin se trabaj con el fluormetro del Instituto de Errores Innatos del
Metabolismo. El fluormetro contaba con filtros de longitudes de onda muy
cercanas a las requeridas, pero no se detect seal en la reacciones, incluso
en las reacciones con los patrones de mayor concentracin. Siendo este
flourmetro, un equipo que trabaja con filtros y un poco antiguo, la
sensibilidad no es tan alta como la de un espectrofluormetro. El equipo
funciona muy bien con compuestos como umbeliferonas o cumarinas que
presentan autofluorescencia. Al parecer la fluorescencia emitida por la
oxidacin del cido giberlico no es lo suficientemente fuerte para ser
detectada por este equipo.
Se tuvo acceso a otro fluormetro de filtros, de mayor sensibilidad, que
trabaja en formato de lector de placa de Elisa (Universidad Nacional), pero

79

desafortunadamente este equipo no contaba con un juego de filtros de


longitudes de onda cercanas a las requeridas.
Teniendo en cuenta que los fluormetros de filtros no se podan utilizar por
diferencias en las longitudes de onda de deteccin, se busc un detector de
fluorescencia utilizado para HPLC. Estos detectores se pueden separar del
cromatgrafo y acoplar a una pantalla para lectura. El detector permite
ajustar cualquier longitud de onda en excitacin y emisin, y adems tiene
alta sensibilidad. El inconveniente en el uso de estos lectores se da porque
que solo tienen celdas de flujo. La reaccin para deteccin de giberelinas
tiene un porcentaje de cido sulfrico o perclrico alto (alrededor del 50%), lo
que causara dao irreparable al sistema de flujo acoplado la celda del
detector.

80

6.4

DETECCIN

DE

CIDO

INDOL

ACTICO

EN

CULTIVOS

MICROBIANOS POR REACCIN DE SALKOWSKY

6.4.1 CURVA PATRN DE CIDO INDOL ACTICO (AIA)


Para la deteccin y cuantificacin de cido indol actico (AIA) producido por
cada una de las cepas evaluadas, se realiz una curva patrn con el reactivo
de Salkowsky R1m, a diferentes concentraciones de patrn de AIA comercial
(Sigma - Aldrich) (2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 30 y 40 ug/ml) (Figura 6.14), para
determinar la ecuacin de la recta y el valor de R2, confirmando que los
valores de pendiente y R2 coincidieran con los obtenidos inicialmente con el
reactivo R1m, estandarizado previamente para la deteccin ptima de AIA.

CURVA DECALIBRACION SALKOWSKY(AIA)


1
0,9

Unidadees de Abs 530nm

0,8
0,7
0,6
0,5
0,4

y = 0,023x + 0,019
R = 0,994

0,3
0,2
0,1
0
0

10

15

20

25

30

35

40

45

Concentracin AIA ug/ ml

Figura 6.13 Curva patrn de concentraciones AIA con reactivo Salkowsky (R1m)

Una vez confirmada la coincidencia de los datos se utiliz dicha ecuacin


para cuantificar AIA producido por cada cepa, a partir de los datos obtenidos
por absorbancia de las muestras en reaccin con Salkowsky.

81

6.4.2 PRODUCCIN DE ACIDO INDOL ACTICO (AIA)


6.4.2.1 Azotobacter vinelandii
Se realizaron tres montajes de cultivo de Azotobacter vinelandii ATCC12518,
para determinar la produccin de AIA, debido a que los datos obtenidos a
partir de estos tuvieron alta variabilidad. En el primer montaje se observ un
comportamiento lineal ascendente, pero con una produccin de AIA baja
(Anexo 2). Para el segundo montaje los datos mostraron un comportamiento
lineal ascendente para la produccin de AIA, pero con concentraciones de
AIA mucho mayores en comparacin al primer montaje, adicionalmente esta
presento mejor definicin de color y un mejor comportamiento entre rplicas
(Figura 6.14), obteniendo concentraciones de AIA aproximadamente de
60ug/ml en el medio BT y 72 ug/ml en medio TSB, en el sexto da de cultivo,
lo cual concuerda con lo reportado por Torres y colaboradores (2000), en
donde la produccin de AIA por A. vinelandii alcanzaba concentraciones de
32.22 ppm 34.25 ppm. El tercer montaje present una curva de produccin
de AIA con un pico de produccin en el da 4, buen comportamiento entre
rplicas y buena definicin de color (Anexo 2).

Produccin de AIA Azotobacter vinelandii en medio TSB

Produccin de AIA Azotobacter vinelandii en medio BT


Concentracin AIA ug/ ml

Concentracin AIA ug/ ml

80

80
70
60
50
40
30
20
10
0

70
60
50
40
30
20
10
0

Tiempo (Dias)

a.

Tiempo (Dias)

b.

Figura 6.14 Curvas de produccin de AIA por Azotobacter vinelandii a. Produccin de AIA en medio BT, b.
Produccin de AIA en medio TSB (Montaje 2).

82

A. vinelandii fue establecido como el control positivo para la produccin de AIA por
la buena produccin de AIA detectada en el segundo montaje y su tendencia de
produccin en aumento lineal. Al comparar su produccin en los medios de cultivo
TSB y BT se observ un comportamiento similar en cuanto a la produccin de AIA
(Figura 6.14). Esta cepa de A. vinelandii tambin fue utilizada como control
positivo de produccin de AIA en medio BT por Duque & Quintana (2008). La cepa
present un comportamiento lineal tendiente al aumento en la produccin de AIA
hasta el da 8 de cultivo (Figura 6.15). En cuanto a concentracin de AIA por da
de cultivo, los valores fueron similares a los obtenidos en el segundo y tercer
montaje.

Los

resultados

de

Duque

&

Quintana

(2008)

corroboran

el

comportamiento de la cepa en procesos de produccin de AIA.


Los resultados de este estudio tambin concuerdan con los resultados reportados
por Zakharova y colaboradores (1999), quienes observarn una tendencia lineal
ascendente para las curvas de produccin de AIA en A. vinelandii y A. brasilense
habitantes de rizsfera.
Produccin AIA Azotobacter vinelandii en medio BT
(Duque; Quintana, 2008)

Concentracin de AIA ug/ ml

120,00
100,00
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
-20,00 0

10

12

14

16

-40,00
Tiempo (das)

Figura 6.15 Produccin AIA por A. vinelandii ATCC12518 en medio BT (Duque & Quintana, 2008)

Aunque se observaron diferencias entre los tres montajes, el comportamiento de la


cepa en los medios de cultivo evaluados TSB y BT fue muy parecido, ya que en
los dos medios de cultivo se observ una produccin de AIA parecida llegando a
concentraciones de 60ug/ml en medio BT y 70 ug/ml de TSB para el montaje 2; lo
83

que asegura al medio BT como un medio apropiado para la produccin de


biomasa y para la produccin de AIA (Figura 6.15 y 6.17). El medio B no present
dicho comportamiento, ya que no se observ produccin de AIA, este resultado se
puede explicar por que tanto el medio TSB como el medio BT (Anexo 1) estimulan
la produccin de AIA por proporcionar una fuente de triptfano (Trp), el cual es
considerado como el principal precursor en la va de sntesis de AIA. En cultivos
con presencia triptfano se incrementa la produccin de AIA por diferentes vas
metablicas (Bric et al., 1991; Zakharova et al., 1999), mientras que el medio B al
no tener una fuente de triptfano no promueve la produccin de AIA por dichas
vas. Esta observacin sugiere que en esta cepa de A. vinelandii solo actan las
rutas dependiente de triptfano para la biosntesis de AIA. En el medio B tampoco
se evidenci buena produccin de biomasa, probablemente por ser un medio
mineral

carente de fuentes de nitrgeno orgnico, aunque este medio se

recomienda para el crecimiento de microoganismos nativos de suelo (Strzelczyk et


al., 1984).
El crecimiento de A. vinelandii en los medios de cultivo present la misma
tendencia que la produccin de AIA, ya que segn valores de turbidez del cultivo
(Abs540) se observ que tanto para TSB como para BT los valores fueron muy
similares, y al presentarse buen crecimiento de la cepa en el medio se promueve
la produccin de AIA, al llegar a la fase estacionaria en la cintica de crecimiento
(Torres et al, 2000) (Figura 6.16 a y b). Por el contrario, en el medio B se
observaron valores de turbidez muy bajos, lo que indica poco crecimiento en el
medio, lo cual concuerda con la falta de produccin de AIA (Figura 6.16 c).
El comportamiento, en produccin de biomasa, de la cepa en los medios de cultivo
evaluados se debe a que tanto TSB como BT son medios de cultivos ricos en
nutrientes, TSB es un medio compuesto por peptona como fuente de nitrgeno y
carbono y dextrosa como fuente de carbono, los cuales son nutrientes esenciales
para el desarrollo y reproduccin bacteriana (Brock et al, 2001), tambin cuenta
con reguladores de osmolaridad, como cloruro de sodio y fosfato dipotsico, los

84

cuales regulan la toma de nutrientes en las clulas (Brock et al, 2001), la tripticasa
es una fuente de triptfano, que estimula la produccin de AIA lo que determinara
su comportamiento (Asghar et al., 2002; Karadeniz et al., 2006). As mismo, el
medio BT es un medio apropiado para la produccin de biomasa, aunque es un
medio sencillo de sales bsicas y glucosa (Anexo1). Entre sus componentes se
encuentra NH4NO3 y triptona (digerido pancretico de casena) que adems de ser
fuente de triptfano sirve de fuente de nitrgeno orgnico y Ca, promoviendo un
mejor crecimiento (Brock et al, 2001). La glucosa, fuente de carbono, es

8
6
4
2
0
0

AIA ug/ ml

4
5
Tiempo (Dias)

Azotobacter vinelandii en medio BT


Crecimiento (Abs) VsProduccin AIA ug/ ml

80
Concentracin AIA ug/ ml

10

80
70
60
50
40
30
20
10
0

Crecimiento en unidades de Abs

Concentracin AIA ug/ ml

Azotobacter vinelandii en medio TSB


Crecimiento (Abs) VsProduccin de AIA ug/ ml

60

50

40

30

20

10

1
0

0
0

Crecimiento en unidades de Abs

3
4
Tiempo (Dias)

AIA ug/ml

b.
8

Azotobacter vinelandii en medio B


Crecimiento (Abs) vsProducin AIA ug/ ml

7
6
5
4
3
2
1

Crecimietno en unidades de Abs

Concentracin AIA ug/ ml

Crecimiento en unidades de Abs

a.
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0

70

Crecimiento en unidades de Abs

metabolizada rpidamente por A. vinelandii (Moreno & Garcia, 1995).

0
0

2
AIA ug/ml

Tiempo (Dias)
Crecimiento en unidades de Abs

c.
Figura 6.16 Curvas crecimiento (Abs540) y produccin de AIA (ug/ml) de Azotobacter vinelandii. a. Cultivo en
medio TSB, b. Cultivo en medio BT, c. Cultivo en medio B.

El da de muestreo ptimo para la determinacin de AIA en cultivos en agitacin,


fue establecido por una diferencia entre los datos obtenidos da a da en la

85

produccin de AIA (Tabla 6.6), ya que no se observ un pico de produccin


constante entre los montajes. Al calcular la diferencia en produccin de AIA entre
los das de cultivo, se logr establecer el da de mayor produccin de AIA para
tomar este como el da de muestreo ptimo para determinar cuanto puede llegar a
producir una cepa da a da en este tipo de cultivos.

Tabla 6.6 Cuadro de comparacin de da de mayor produccin de AIA por Azotobacter vinelandii en medios
TSB y BT (los valores indican la diferencia de produccin de AIA da a da)

TSB

BT

Dia Montaje 1 Montaje 2 Montaje 3 Montaje 1 Montaje 2 Montaje 3


0

0,152

0,000

2,513

0,042

0,000

0,000

0,181

3,078

3,212

0,647

0,000

10,659

2,745

4,570

8,495

0,944

10,363

8,091

0,233

17,070

7,890

1,446

17,527

14,570

0,343

15,067

9,503

0,527

24,933

17,715

1,887

14,113

3,481

2,463

6,371

-4,449

2,218

11,882

-6,089

-0,012

11,210

-3,938

Teniendo en cuenta los resultados presentados en la tabla 6.6, el da de mayor


produccin de AIA para A. vinelandii, realizando un promedio entre los valores
obtenidos, sera el da cuatro; prestando mayor atencin a los resultados de los
mentajes 2 y 3 en medio BT. Adems, aunque no es el comportamiento tpico de
la cepa, en el montaje 3 se present un pico de produccin de AIA en el da cuatro
(Anexo2), lo que indicara tambin que es un da importante en la produccin de
AIA.
Como se reporta en literatura, la fase estacionaria en la cintica de crecimiento
microbiano es aquella en donde se inician algunos procesos biosinteticos de
metabolismo secundario, entre los cuales se cuenta la produccin de AIA
(Karadeniz et al, 2006), ajustndose al da de produccin mxima, el cual se
ubicara en la fase estacionaria de la cintica de crecimiento de la bacteria (Figura
6.17).

86

6.4.2.2 Azospirillum brasilense


Para A. brasilense se realizaron dos montajes de cultivo, en medio TSB, BT y B,
para determinar la produccin de AIA. El primer montaje present una produccin
lineal en aumento con baja produccin de AIA en comparacin a lo obtenido con
A. vinelandii, con buena definicin de color y comportamiento entre rplicas
(Anexo 2). El segundo montaje present la misma tendencia que el primero, con
una produccin de AIA no mayor a 10 ug/ml, buen comportamiento entre rplicas y
definicin de color (Figura 6.17).
Al obtener entonces los datos de produccin de AIA por A. brasilense se observ
el mismo comportamiento que en los datos de A. vinelandii, con un
comportamiento lineal con produccin en aumento caracterstica de A. brasilense
(Zakharova et al., 1999), el cual al igual que la mayora de los miembros del
gnero Azospirillum son productores de AIA dependientes de triptfano como
precursor de AIA. El triptfano se puede metabolizar por dos vas principales, va
Indol-3- acetamida (IAM) y va Indol-3-piruvato (IPyA) (Zakharova et al., 1999; Taiz
& Zeiger, 2006).
Produccin de AIA por Azospirillum brasilense en medio BT

Produccin de AIA por Azopirillum brasilense en medio TSB

Concentracin AIA ug/ml

Concantracin AIA ug/ml

4
3
2
1
0
0

4
3
2
1
0
0

Tiempo (Dias)

a.

Tiempo (Dias)

b.

Figura 6.17 Curvas de produccin de AIA por Azospirillum brasilense a. Produccin de AIA en medio BT, b.
Produccin de AIA en medio TSB (Montaje 2)

87

El crecimiento de A. brasilense en los medios de cultivo mostr la misma


tendencia de A. vinelandii con un crecimiento similar en el medio TSB
donde la produccin de AIA no fue muy alta (7ug/ml), pero el crecimiento y
desarrollo de la cepa determinado por la turbidez del cultivo (Figura 6.18),
gracias a que este medio (TSB) es una buena fuente de nutrientes para
este tipo de microorganismos favoreciendo as su desarrollo y crecimiento
con fuentes de C, N y dems elementos esenciales para su crecimiento
(Brock et al, 2001). Por otro lado, el crecimiento en medio BT no se
comparara con el crecimiento en TSB, ya que los datos de turbidez
obtenidos fueron muy, esto se vi reflejado en la produccin de AIA, la cual
fue de 5 ug/ml. Para el medio B no se observ ni produccin de AIA ni
crecimiento de la cepa, debido a que esta puede que sea una cepa un
poco ms exigente en cuanto a requerimientos para produccin de
biomasa.
7
6

50

40

30

20

10

0
0

2
AIA ug/ml

a.

Azospirillum brasilense en medio BT


Crecimiento (Abs) vsProduccin de AIA ug/ ml
Concentracin AIA ug/ ml

Azospirillum brasilense en medio TSB


Crecimiento (Abs) vsProduccin AIA ug/ ml

60

Crecimiento en unidades de Abs

Concentracin AIA ug/ ml

70

3
4
Tiempo (Dias)

70

60

50

40

30

20

10

1
0

0
0

AIA ug/ ml

Crecimiento en unidades de Abs

3
4
Tiempo (Dias)

Crecimiento en unidades de Abs

b.

Figura 6.18 Curvas crecimiento (Abs540) y produccin de AIA (ug/ml) de Azospirillum brasilense.
a. Cultivo en medio TSB, b. Cultivo en medio BT.

Para establecer el da de muestreo ptimo para determinar la produccin de


AIA por A. brasilense, se realiz un anlisis por diferencia de valores entre
los das de produccin de AIA (Tabla 6.7) ya que tampoco se observ un pico
de produccin constante entre los montajes realizados.

88

Tabla 6.7 Cuadro de comparacin de da de mayor produccin de AIA por Azospirillum brasilense en
medios TSB y BT (los valores indican la diferencia de produccin de AIA da a da).

TSB

BT

Dia Montaje 1 Montaje 2 Montaje 1 Montaje 2


0

0,000

0,000

0,000

0,000

0,211

2,339

0,153

0,000

0,600

0,108

0,342

0,000

0,441

1,142

0,792

2,298

0,429

-0,188

1,355

0,927

1,238

0,995

0,239

2,500

0,453

2,608

-1,060

0,699

Segn los resultados observados en la tabla 6.7, el da ptimo de muestreo


determinado por la diferencia de valores de produccin da a da, fue el da 5
ya que al hacer un promedio entre lo valores obtenidos se determina este
da, el cual tambin se ajusta a los valores obtenidos por el crecimiento como
fase estacionaria en su cintica de crecimiento, en la que se ha reportado
produccin de AIA (Janzen et al., 1992; Karadeniz et al., 2006) (Figura 6.19).

6.4.2.3 Cepas bioinoculante


La determinacin de la produccin de AIA realizada con el reactivo de
Salkowsky R1m para las cepas del bioinoculante (Figura 6.20), se analiz por
diferencia entre los valores produccin para determinar el da de mayor
produccin de AIA por cada una de las cepas, y se compararon con los
valores obtenidos con la cepa de A. vinelandii determinada como control
positivo para la produccin de AIA (Tabla 6.8).

89

Produccin AIA (CepasBioinoculante)+


Control positivo (Azotobacter vinelandii)
79,00

Concentracin AIA ug/ ml

69,00
59,00
49,00
39,00
29,00
19,00
9,00
-1,00
0

Tiempo (Dias)
Azotobacter vinelandii
Cepa 5
Cepa 10

Cepa 1
Cepa 6
Cepa 11

Cepa 2
Cepa 7
Cepa 12

Cepa 3
Cepa 8
Cepa 13

Cepa 4
Cepa 9
Cepa 14

Figura 6.19 Produccin de AIA por las 14 cepas del bioinoculante evaluado, y curva de produccin de
AIA por Azotobacter vinelandii control positivo.

La produccin de AIA por parte de las cepas (Tabla 6.8), no sobrepas los
47ug/ml. La produccin de AIA fue buena en el medio de cultivo BT al igual
que la produccin de biomasa, lo que no se observ en medio B, por la
carencia de triptona en el medio, con lo que se puede concluir las rutas de
biosntesis de AIA, tanto en las bacterias y los actinomicetos del
bioinoculante, es dependiente triptfano (Strzeclczyk et al, 1984).
Las cepas 1, 2, 3 y 9 fueron las cepas con mayor productividad de AIA,
mientras que las cepas 5, 6, 7, 10, 11, 12 y 14 fueron las de menor
produccin de AIA, al no superar los 4ug/ml de produccin de AIA (Figura
6.19 y Tabla 6.8).

90

Tabla 6.8 Valores de mxima produccin de AIA por las cepas bioinoculante

MXIMA

DIA MXIMA

PRODUCCIN

PRODUCCIN

CEPA

DE AIA (ug/ml)

DE AIA (ug/ml)

30

47

41

25

0,25

20

40

10

11

12

13

16

14

0,89

A partir de los datos de la Tabla 6.9, al hacer un promedio de la diferencia de


produccin de AIA da a da, se podra decir que el da de mejor produccin o
de mayor produccin para las cepas tiende a ser el da 3, observndose un
aumento en lo valores de AIA detectados e inclusive picos de produccin
cercanos a este da, lo que lo seala como un da ptimo para la produccin
de AIA, da que probablemente se encuentra en la fase estacionaria en la
cintica de crecimiento de los microorganismo corroborando la produccin de
AIA como un metabolito secundario tanto de bacterias como actinomicetos
(Karadeniz et al., 2006; Strzeclczyk et al., 1984).

91

92

0
1
2
3
4
5
6

0,000
0,000
10,363
17,527
24,933
6,371
11,210

0,000
0,986
1,306
16,028
11,431
0,792
-2,194

0,000
15,486
32,222
-23,083
7,264
-27,833
-2,472

0,000
7,542
33,681
-18,028
10,278
-30,333
-1,861

0,000
0,431
1,861
9,861
13,028
-0,194
-1,778

0,000
1,058
0,391
1,594
0,855
0,768
-0,159

0,000
0,768
0,681
0,580
-0,072
0,101
0,377

0,000
0,000
0,000
0,007
0,135
0,036
0,071

0,000
1,694
2,222
7,681
2,986
2,556
3,153

0,000 0,000
5,181 2,722
34,917 0,792
-16,500 4,361
-14,097 0,750
-7,556 2,403
-0,194 -1,236

0,000 0,000 0,000 0,000


2,029 0,542 2,667 0,778
0,565 1,292 5,917 0,528
0,116 1,250 16,569 0,389
1,087 -1,181 4,736 0,889
0,420 -0,278 -25,417 -0,792
1,246 -0,472 -2,153 -0,597

Da de Azotobacter
Cepa 1 Cepa 2 Cepa 3 Cepa 4 Cepa 5 Cepa 6 Cepa 7 Cepa 8 Cepa 9 Cepa 10 Cepa 11 Cepa 12 Cepa 13 Cepa 14
cultivo vinelandii

Tabla 6.9 Cuadro de comparacin de da de mayor produccin de AIA por las 14 cepas del bioinoculante evaluado y A. vinelandii

6.5. DETECCIN DE REGULADORES DE CRECIMIENTO EN CULTIVOS


MICROBIANOS POR CROMATOGRAFA DE CAPA FINA (TLC)
6.5.1 Azotobacter vinelandii
Los cromatgramas obtenidos a partir de las muestras de A. vinelandii,
muestran la produccin de AIA por la cepa desde el da 1 hasta el da 6 con
un Rf de 0.75 el cual concuerda con el control (mix) con un Rf de 0.75 (Tabla
6.10). El aumento en concentracin de AIA en el tiempo se evidenci por el
aumento de la intensidad del color de la banda (fucsia), en funcin del da de
cultivo (Torres et al., 2004) (Figura 6.21 a). Se observ un color fucsia
caracterstico de AIA debido a reaccin con el revelador, compuesto por
H2SO4 y FeCl3, por oxidacin del grupo indol seguida de transaminacin con
Cl (Salkowsky, 1889; Torres et al., 2004).
No se observa produccin de IBA, y tampoco de giberelinas por parte de A.
vinelandii (figura 6.20 a, b), pues no se detect la banda de color naranja
caracterstica de IBA, como se observa en el carril del mix (Rf 0.75). De igual
manera detecta fluorescencia tpica de GA3 en los carriles de las muestras de
cada da de cultivo, mientras que en control (mix de reguladores) se observ
una banda fluorescente azul intenso con un Rf de 0.37 (Tien et al., 1979).
Tabla 6.10 Valores de movilidad cromatogrfica (Rf) de reguladores de crecimiento en cultivos de
Azotobacter vinelandii
Da de
cultivo

0
1
2
3
4
5
6
MIX

AZOTOBACTER VINELANDII
R1
R2
AIA IBA GA3 AIA IBA GA3

R3
AIA IBA GA3

0,00
0,75
0,75
0,77
0,75
0,75
0,77
0,77

0,00
0,92
0,92
0,92
0,92
0,92
0,92
0,92

0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,86

0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,25

0,00
0,74
0,75
0,75
0,75
0,75
0,75
0,75

0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,82

0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,26

0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,95

0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,37

93

6 MIX

6 MIX

6 MIX

6 MIX

6 MIX

6 MIX

Figura 6.20 Cromatgramas A. vinelandii. R1 a luz visible b fluorescencia, R2 c luz visible


d fluorescencia, R3 e luz visible f fluorescencia

6.5.2 Azospirillum brasilense

94

Los cromatgramas de A. brasilense mostraron la produccin de AIA por


parte de la cepa desde el da 1 hasta el da 6, lo cual se vi reflejado con la
presencia de una banda fucsia con un valor de Rf 0.82, igual al Rf del control
(Tabla 6.11) (Torres et al., 2004). Se observ aumento en la intensidad del
color de la banda (rosado tenue a fucsia intenso), lo que refleja el aumento
de concentracin de AIA en el curso de tiempo de la fermentacin. No se
observ la presencia de IBA (banda amarillo naranja), ni de GA3 (banda de
fluorescencia azul en luz UV de longitud de onda laga). Esta cepa mostr un
comportamiento similar a A. vinelandii. Se observ la similitud entre rplicas y
la presencia de IBA y GA3 en el control (mix de reguladores) con un Rf de
0.89 para IBA y 0.37 para GA3 (Figura 6.21).
Tabla 6.11 Valores de movilidad cromatogrfica (Rf) de reguladores de crecimiento en cultivos de
Azospirillum brasiliense

Da de
cultivo

0
1
2
3
4
5
6
MIX

AZOSPIRILLUM BRASILENSE
R1
R2
AIA IBA GA3 AIA IBA GA3

R3
AIA IBA GA3

0,00 0,00 0,00

0,00 0,00 0,00

0,00 0,00

0,00

0,82 0,00 0,00

0,89 0,00 0,00

0,88 0,00

0,00

0,82 0,00 0,00

0,89 0,00 0,00

0,89 0,00

0,00

0,82 0,00 0,00

0,89 0,00 0,00

0,89 0,00

0,00

0,82 0,00 0,00

0,89 0,00 0,00

0,89 0,00

0,00

0,82 0,00 0,00

0,89 0,00 0,00

0,89 0,00

0,00

0,82 0,00 0,00

0,89 0,00 0,00

0,89 0,00

0,00

0,82 0,89 0,28

0,89 0,95 0,37

0,89 0,92

0,37

95

6 MIX

6 MIX

6 MIX

6 MIX

6 MIX

6 MIX

f
Figura 6.21 Cromatgramas A. brasilense. R1 a luz visible b fluorescencia, R2 c luz visible
d fluorescencia, R3 e luz visible fluorescencia

96

6.5.3 CEPAS DEL BIOINOCULANTE


Los cromatgramas de las cepas del bioinoculante se realizaron a partir de
un pool (mezcla de rplicas) de los das evaluados. Se detect produccin de
de AIA en cuatro cepas. La cepa 2 present banda de AIA del da 2 al 6 con
un Rf de 0.82, el mismo que el control (mix de reguladores). Al igual que en
las cepas control, el color de la banda fue intensificndose a lo largo del
tiempo de incubacin. La cepa 4 tambin present banda con un Rf igual al
del control (0.69) y aumento de la intensidad del color de la banda respecto al
tiempo. La cepa 5 present banda caracterstica con un Rf de 0.77, igual al
control, pero solo desde el da 5 al da 6. La cepa 9 present banda desde el
da 4 al da 6, con un Rf de 0.92, tal como el control. Los resultados de
movilidad cromatogrfica y fotografas de los cromatogramas de las 14 cepas
del bioinoculante se pueden observar en la Tabla 6.12 y la Figura 6.22,
respectivamente.
La fluorescencia caracterstica de las giberelinas (Tien et al, 1979) se
observ en cinco cepas. La cepa 4 present banda con un Rf de 0.31, desde
el da 4 al da 6. La cepa 5 present banda con un Rf de 0.32, desde el da 1
al da 6. La cepa 10 present banda con un Rf de 0.37, con produccin entre
los das 1 a 3. La cepa 11 present banda con Rf de 0.43, los das 2 y 3. La
cepa 12 present banda con un Rf 0.40, desde el da 3 al da 6.
Ninguna de las cepas evaluadas mostr produccin de IBA (Tabla 6.12 y
Figura 6.22), presentndose entonces para todas las fases estacionarias
nicamente la banda de color naranja en el carril de siembra del mix.

97

Tabla 6.12 Valores de movilidad cromatogrfica (Rf) de reguladores de crecimiento en cultivos de


cepas del bioinoculante
Da de
cultivo

0
1
2
3
4
5
6
MIX
0
1
2
3
4
5
6
MIX
0
1
2
3
4
5
6
MIX
0
1
2
3
4
5
6
MIX
0
1
2
3
4
5
6
MIX

CEPA 1
AIA
IBA
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,92
0,95
CEPA 4
0,00
0,00
0,00
0,00
0,69
0,00
0,69
0,00
0,69
0,00
0,69
0,00
0,69
0,00
0,69
0,74
CEPA 7
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,83
0,35
CEPA 10
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,83
0,88
CEPA 13
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,85
0,38

GA3
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,37
0,00
0,00
0,00
0,00
0,31
0,31
0,31
0,31
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,88
0,00
0,37
0,37
0,37
0,00
0,00
0,00
0,37
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,38

CEPA 2
AIA
IBA
GA3
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,82
0,00
0,00
0,82
0,00
0,00
0,82
0,00
0,00
0,82
0,00
0,00
0,82
0,00
0,00
0,82
0,86
0,31
CEPA 5
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,32
0,00
0,00
0,32
0,00
0,00
0,32
0,00
0,00
0,32
0,77
0,00
0,32
0,77
0,00
0,32
0,77
0,83
0,32
CEPA 8
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,86
0,89
0,38
CEPA 11
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,43
0,00
0,00
0,43
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,85
0,89
0,43
CEPA 14
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,82
0,31
0,31

CEPA 3
AIA
IBA
GA3
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,92
0,94
0,38
CEPA 6
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,89
0,94
0,40
CEPA 9
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,92
0,00
0,00
0,92
0,00
0,00
0,92
0,00
0,00
0,92
0,95
0,40
CEPA 12
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,40
0,00
0,00
0,40
0,00
0,00
0,40
0,00
0,00
0,40
0,83
0,40
0,40

98

A. CEPA 1

CEPA 1

6 MIX
0

6 MIX

C. CEPA 3

6 MIX

6 MIX

6 MIX

CEPA 2

B. CEPA 2

CEPA 3

6 MIX

Figura 6.22 Cromatgramas luz visible y ultravioleta Cepas Bioinoculante A. Cepa 1, B. Cepa 2, C,
cepa 3.

99

D. CEPA 4

CEPA 4

6 MIX

E. CEPA 5

6 MIX

CEPA 5

6 MIX

MIX

MIX

CEPA 6

F. CEPA 6

6 MIX

Figura 6.22 Cromatgramas luz visible y ultravioleta Cepas Bioinoculante D Cepa 4, E Cepa 5,
F Cepa 6

100

G. CEPA 7

CEPA 7

6 MIX

6 MIX

4 5

6 MIX

6 MIX

CEPA 9

I. CEPA 9

CEPA 8

H. CEPA 8

MIX

6 MIX

101

CEPA 10

J. CEPA 10

6 MIX

K. CEPA 11

6 MIX

6 MIX

6 MIX

CEPA 11

6 MIX

L. CEPA 12

CEPA 12

6 MIX

102

M. CEPA 13

CEPA 13

6 MIX

N .CEPA 14

6 MIX

6 MIX

CEPA 14

6 MIX

.Figura 6.22 Cromatgramas luz visible y ultravioleta Cepas Bioinoculante G. Cepa 7, H. Cepa 8,
I. Cepa 9, J Cepa 10, K Cepa 11, L Cepa 12, M Cepa 13, N Cepa 14

La va de sntesis de giberelinas en microorganismos es similar a la ruta de


sntesis que realizan las plantas superiores, aunque no juegan un papel vital
en la fisiologa como tal de los microorganismos. Esta ruta para las PGPRs
no ha sido reportada pero se describe la ruta de biosntesis de isoterpenoides
(es decir la ruta del cido mevalnico) como la ruta utilizada para la sntesis
de giberelinas; en donde el acetato y el mevalonato son considerados como
los precursores de la ruta (Rohmer, 2003). Posiblemente no todas las cepas
produjeron giberelinas debido a que no todas cuentan con la capacidad de

103

sintetizar dicho metabolito por la carencia de la maquinaria enzimtica


necesaria para el desarrollo de esta va de sntesis o inhibicin en la
expresin de estas rutas metablicas. Igualmente es posible que tampoco se
encontraran disponibles en el medio los precursores referenciados para la
ruta de sntesis.
Tambin se observ que no todos las cepas evaluadas produjeron AIA,
igualmente se podra decir que la causa es la falta del pool enzimtico
necesario para su sntesis (Karadeniz, et al, 2006; Bric, et al 1991); hay que
tener en cuenta los resultados deteccin de AIA por la reaccin de
Salkowsky. El no observar produccin de AIA en los cromatogramas puede
ser a un problema de deteccin, la cantidad de AIA en la muestra no alcanza
el lmite de deteccin de la tcnica, 0.05ug de acuerdo a los resultados de
este trabajo.
Siguiendo con la comparacin de los resultados de deteccin de AIA por
reaccin de Salkowsky y TLC, tampoco se observa una concordancia clara
entre las concentraciones de AIA y la aparicin de las bandas tpicas de AIA
en los cromatgramas de las cepas del bioinoculante. Esto se podra
presentar porque se pierde AIA en la extraccin lquido-lquido con acetato
de etilo, por ejemplo el proceso de agitacin (vortex) en la extraccin no es
homogneo entre todas las muestras, lo que no permite que las dos fases
(acuosa y orgnica) tengan el mismo contacto. Para probar esta posible
causa, alcuotas de diferentes concentraciones de patrones de los
reguladores de crecimiento se mezclaron con medio BT y se sometieron a
proceso de extraccin con acetato de etilo y posterior concentracin. Los
resultados de los de los cromatgramas no pudieron ser utilizados para
probar el posible problema en la extraccin porque se present un
sobrelapamiento entre las bandas de AIA e IBA. Las corridas se repitieron
varias veces pero, el resultado de movilidad de las bandas siempre fue el

104

mismo. Adicionalmente la banda correspondiente a GA3 no se detect,


incluso en las concentraciones ms altas de las mezclas de patrones
sometidas a extraccin. En el control de corrida, la banda de GA3 siempre se
detect, lo que indica que no hubo problemas con el revelador.

6.6 BIOENSAYO PARA DETECCIN DE ACTIVIDAD DE REGULADORES


DE CRECIMIENTO VEGETAL
Se realizaron tres montajes de germinacin de semillas de lechuga crespa
Lollo Rossa en cmara hmeda, el primero en octubre, el segundo en
noviembre y el tercero en diciembre. En el primer y segundo montaje se
evalu el efecto de dos productos comerciales Gibgro (Arysta LifeScience) y
Hormonagro (Colinagro), el primero a base de cido giberlico y el segundo a
base de auxinas (ANA); tambin se evaluaron patrones de AIA, IBA y GA3
(Sigma-Aldrich) y un control con agua destilada. El tercer montaje se realiz
con las 16 cepas evaluadas (A. vinelandii, A. brasilense y las 14 cepas del
bioinoculante), un control con el medio de cultivo (BT) y un control con agua
destilda. En el primer montaje cada tratamiento tuvo 3 rplicas, cada una con
20 semillas, para un total de 60 semillas por tratamiento, el segundo montaje
tuvo 5 rplicas, cada una con 20 semillas, para un total de 100 semillas por
tratamiento, y en el tercer montaje se tuvo 4 rplicas, cada una con 20
semillas, para un total de 80 semillas por tratamiento, que es el nmero
mnimo de semillas exigido por la ISTA (2006) para este tipo de
evaluaciones.
Una vez montadas las cmaras hmedas, y establecidos los estados de
desarrollo de las plntulas (Figura 6.24), se procedi a determinar los ndices
de germinacin para el estado 1 (Czabator, 1962; Thomson & Elkassaby.,
1993). Adicionalmente se determinaron los ndices de germinacin para el
resto de los estados (Anexo 3), gracias a que los ndices utilizados no son

105

especficos para germinacin. Esto son ndices que segn la teora se


pueden manejar para el resto de estados pues lo que marcan es el cambio
de un estado a otro, mas no caractersticas como tal de ese cambio, es decir
en este caso marca por nmero la cantidad de plntulas que pasan del
estado uno al dos, del dos al tres y as; igualmente tambin se tiene en
cuenta el tiempo de cambio de estado. Se decidi determinar los ndices
para todos los estados porque las semillas con las que se trabaj son
semillas certificadas, lo que indica que su germinacin es casi del 100%.
Este porcentaje de germinacin dificulta el poder encontrar diferencias
significativas entre los tratamientos, ya que el total de las semillas germinara
y no se evidenciara fcilmente el efecto de los tratamientos.

1a

3a

3b

1b

3c

3d

Figura 6.24 Estados de desarrollo Lactuca sativa L.

106

6.6.1 ANLISIS ESTADSTICO


Una vez determinados los ndices para cada estado y para cada tratamiento,
se tomaron los datos obtenidos de los tres montajes y se analizaron
buscando determinar el mejor tratamiento para todos los ndices y as
establecer cual regulador de crecimiento tenia el efecto ms marcado en
cada estado en general o en determinados ndices. En los montajes 1 y 2,
ninguna de las plntulas, en los seis tratamientos, present desarrollo hasta
el estado 4, en los 14 das de lectura. En el montaje 3, en algunos
tratamientos, se observaron plntulas con desarrollo hasta estado 4, pero
estos datos no se analizaron porque no se contaba con valores asociar su
comportamiento a un regulador de crecimiento especfico.
Dado que se midieron diferentes indicadores, se corri inicialmente un
anlisis multivariado (MANOVA) buscando identificar si el efecto de los
tratamientos y las rplicas afectan simultneamente a todos lo indicadores.
De acuerdo a estos estadsticos, se observ que el efecto del tratamiento si
es importante en la interaccin tratamiento po replica es decir que se prob
una hiptesis del siguiente estilo: H 0 : ( ij ) = 0

vs.

H 1 : ( ij ) 0 , donde

Ho propone que el efecto tratamiento no es significativo en el modelo de


estudio. Los resultados de los estadsticos Lambda de Wilks, Traza de Pillai,
Traza de Hotelling y la raz de Roy mostraron valores P menores a 0.05 para
todos los montajes, lo que indica que si hay una diferencia significativa entre
los tratamientos, llevando as a rechazar la hiptesis nula.
Luego se prob si el efecto la rplica en la interaccin tratamiento*rplica
deba ser incluida en el modelo final que describe el comportamiento de las
variables. De acuerdo a los p-valores (Tabla 6.13), vemos que estos son
mayores a 0.05 entonces no se rechazara la hiptesis nula donde se
propone que el efecto de la rplica en la interaccin tratamiento*replica no es

107

significativo o igual a 0, es decir que no se encuentra variabilidad entre las


rplicas para cada tratamiento en ninguno de los tres montajes realizados.
Tabla 6.13 Anlisis multivariado MANOVA para la variable rplica en la interaccin tratamiento*rplica
en pruebas de bioensayos.

Pr > F
Montaje 1 Montaje 2
Estadstico
Wilks' Lambda
0.9988
0.4183
Pillai's Trace
0.9982
0.8604
Hotelling-Lawley Trace
0.9999
Roy's Greatest Root
0.1657
0.128

Montaje 3
0.7462
0.7016
0.7539
0.2275

El paso siguiente fue identificar el efecto de cada tratamiento en cada uno de


los ndices, para cada montaje. Para esto se realiz un anlisis de varianza
ANOVA (Tabla 6.14) buscando diferencias significativas para los valores
obtenidos para cada ndice, en cada estado y en cada montaje.
Tabla 6.14 Valores de P (ANOVA) para la deteccin de actividad de reguladores de crecimiento en
bioensayos (se incluyen las variables montaje, estado de germinacin e ndices germinacin, en verde
valores de p>0,05)
Pr > F

Montaje 1
Montaje 2
Montaje 3
Indice Estadio 1 Estadio 2 Estadio 3 Estadio 1 Estadio 2 Estadio 3 Estadio 1 Estadio 2 Estadio 3
NDS
NDS
NDS
0.4935
0.1378
0.1378
0.7103
0.7103
0.5385
GC
NDS
NDS
NDS
0.4935
0.4244
0.2057
0.9096
0.7103
0.5006
GRI
0.0131
0.0302
0.0038
<.0001
0.0044
<.0001
<.0001
<.0001
R50 0.0091
0.0131
0.0302
0.0038
<.0001
0.0044
<.0001
<.0001
<.0001
R50 0.0091
0.0007
0.0105
0.0336
0.4866
<.0001
<.0001
0.0040
<.0001
0.0031
PV
0.0864
0.0028
0.3419
0.0008
0.0246
0.0314
0.0035
0.0197
MDG 0.0183
0.0037
0.0729
0.0075
0.0530
0.0002
<.0001
0.0190
0.0010
0.0071
VG

Segn los valores de ANOVA (Tabla 6.14) no se encontraron diferencias


significativas para los ndices GC y GRI para ninguno de los estados en
ninguno de los montajes, ya que estos ndices lo que determinan son
bsicamente el porcentaje de germinacin total y en un periodo de tiempo. Al
ser semillas certificadas se garantiza un porcentaje casi del 100% de

108

germinacin, por esto no es posible encontrar diferencias significativas entre


tratamientos para estos ndices.
Al observar diferencias significativas entre la mayora de ndices para cada
estado, se continu con la determinacin del efecto de los tratamientos en
cada ndice, para as poder establecer el tratamiento de mayor significancia
en cada estado. Para esta determinacin, se corri un anlisis de
agrupamiento de medias (Duncan y LSD de Fisher). Los dos anlisis
arrojaron los mismos resultados, por lo cual se decidi reportar nicamente
los resultados del anlisis de Duncan.
El primer montaje fue un ensayo preliminar, en el que se evaluaron
reguladores de crecimiento grado reactivo (AIA, IBA, GA3) y comerciales
(Gibgro y Hormonagro), para asociar su actividad biolgica con la
determinacin de los ndices en los diferentes estados. Para este montaje
los tratamientos que mejores resultados presentaron para el estado 1 fueron
Hormonagro, Gibgro y GA3 para los ndices relacionados con velocidad de de
germinacin (R50 y R50) (Tabla 6.15a). Hormonagro, tambin present los
mejores resultados en VG (valor de la germinacin) y PV (cantidad de
semillas a germinar por da), lo cual se correlaciona con los resultados de
R50 y R50, pues al germinar mayor nmero de semillas por da se
disminuye el tiempo en que germinan el total de las semillas, siendo esto
favorable pues se disminuye el tiempo de germinacin. Para el estado 2, el
tratamiento con los mayores ndices fue Hormonagro, excepto para MDG,
seguido en algunos ndices por Gibgro (Tabla 6.16 a). Para el estado 3, se
observo la misma tendencia, es decir Hormonagro present los mayores
valores en todos los ndices, seguido de Gibgro (Tabla 6.17 a)
Luego de determinar los resultados para el primer montaje, se hizo un
segundo montaje con los mismos tratamientos pero con 5 rplicas para un

109

total de 100 semillas, pues el nmero total de semillas por tratamiento de la


primera prueba no es representativo para estos ensayos(ISTA, 2006). En
este segundo montaje, en el estado 1, Hormonagro y GA3 presentaron los
mayores valores para los ndices R50, R50 y VG, AIA tambin present
valores en el rango de Hormanogro y GA3 para los ndices de velocidad de
germinacin (R50 y R50) (Tabla 6.15 b). El estado 2, se ve mayormente
influenciado por GA3 y Hormonagro para todos los ndices (Tabla 6.16 b). El
estado 3 present efecto de GA3 para para los ndices de velocidad de
germinacin (R50 y R50), y los ndices de cantidad de semillas a germinar
por da (PV) y valor de la germinacin (VG) estn influenciados por el control
(Tabla 6.17 b).
Al comparar los datos del montaje 1 y 2 se pudo evidenciar que los
tratamientos que tienen un efecto predominante sobre los ndices en los
diferentes estados son GA3 y Hormonagro. Las giberelinas son un regulador
de crecimiento vegetal el cual tiene la capacidad de estimular la divisin
celular y elongacin, igualmente tienen la capacidad de romper los estados
de dormancia de las semillas, debido a que se cree que tienen un efecto
sobre el calcio, ya que al adicionar GA3 al medio aumenta la concentracin
de calcio en el citosol lo que promueve la produccin de enzimas hidrolticas
como la -amilasa, la cual hidroliza el almidn presente en el endospermo
activando as la toma de nutrientes por parte de el embrin (Taiz & Zeiger,
2006). Se podra decir que este efecto de ruptura de dormancia se ve en el
montaje 2, escogido como tratamiento control ya que cumple con los
requerimientos mnimos exigidos por la ISTA(2006). Igualmente se podra
decir que la actividad de elongacin y divisin celular en el estado 2 est
influenciad por GA3, pues este tratamiento present los mayores valores en
todos los ndices, pero tambin hay una influencia significativa de
Hormonagro. Las auxinas son reguladores de crecimiento vegetal que
influyen principalmente en procesos de elongacin de races y tallos,

110

igualmente promueven la iniciacin de la raz generando el desarrollo y


elongacin de la radcula, y a nivel celular promueven la divisin y
diferenciacin celular por lo que influyen en el desarrollo de tejidos y
fototropismo de las plantas (Arteca 1996, Taiz & Zeiger, 2006). As entonces,
se podra decir que el efecto de las auxinas (Hormonagro) se ve reflejado en
los resultados observados en el estado 2 tanto del montaje 1 como del
montaje 2, donde este tratamiento se ve como uno de los mejores agrupado
con el tratamiento GA3, quien tambin se reporta como un promotor de la
divisin celular. En estado 2 las plntulas estn pasando de emergencia de
la radcula a emergencia de hipocotilo por lo que se presenta una gran
actividad de diferenciacin celular y divisin celular, procesos en los que se
podra ver un efecto directo tanto de las auxinas como de GA3 (Taiz & Zeiger,
2006). Para el estado 3, es difcil determinar cual tratamiento present la
mayor influencia, pues en el montaje 1 predomin el efecto de Hormonagro, y
en el montaje 2 GA3 tuvo mayor influencia en los ndices de velocidad.
En el tercer montaje, donde se evalu el efecto de las cepas, se vio un efecto
ms marcado para el estado 1 de las cepas 6 y 10 en tres de los ndices
representativos (R50, R50 y PV), aunque el anlisis estadstico agrup las
cepas 6, 5, 12, 7, 10 y 8 para los ndices R50 y R50, mientras que para los
ndices MDG y VG se observ como mejor tratamiento la cepa 13 (Tabla
6.15c). Para el estado 2, se observ para los ndices R50 y R50como
mejores tratamientos las cepas 9, 13 y 12, para PV la cepa 13 seguida de la
cepa 10, para MDG las cepas 5, 10, 12, 13, y A. vinelandii, para VG las
cepas 10 y 13 seguidas por la cepa 12 (Tabla 6.16 c). Para el estado 3, en
R50 las cepas 7, 8 y 10, en R50, igualmente las cepas 7, 8 y 10 ms la cepa
11 y el A. vinelandii, en PV A. vinelandii, al igual que para MDG y VG,
seguido en los tres casos por la cepa 10 (Tabla 6.17 c).

111

Segn los datos del montaje de las cepas y comparando con los datos
obtenidos a partir del anlisis de los montajes 1 y 2, se podra decir que para
el estado 1, las cepas 6, 10 y 13 (Tabla6.18) fueron los mejores
tratamientos, ya que presentaron los valores ms altos para los datos
significativos de los ndices; se podra atribuir a estas cepas un efecto de
GA3. En el estado 2, los mejores tratamientos fueron la cepa 12 y 13,
posiblemente por la produccin de auxinas y/o GA3. Finalmente para el
estado 3, los mejores tratamientos agrupados en la mayora de los ndices
fueron las cepas 10, 7 y A. vinelandii, posiblemente por la produccin de
auxinas y/o GA3.
Los microorganismos como de promotores de crecimiento vegetal tienen la
capacidad de sintetizar diferentes reguladores de crecimiento vegetal como
auxinas,

giberelinas

citoquininas,

entre

otras.

Estos

metabolitos

secundarios liberados al medio contribuyen de forma directa a que las


plantas desarrollen ms sus tejidos radiculares y liberen exudados ricos en
carbohidratos que benefician el crecimiento y adaptacin del microorganismo
en la rizosfera (Dobbelaere et al., 2003), as entonces el efecto de los
microorganismos evaluados en el bioensayo se puede ver reflejado en el
desarrollo de las plntulas, gracias a que inocular las semillas con los caldos
microbianos promovi un mejor desarrollo en comparacin a tratamientos
control (agua y medio de cultivo), donde el tiempo para pasar de un estado a
otro fue ms lento.

112

113

GC

Trat
Cepa 13
A, vinelandii
Cepa 9
Cepa 2
Cepa 6
A, brasilense
Cepa 3
BT
Cepa 5
Cepa 8
Agua
Cepa 14
Cepa 7
Cepa 4
Cepa 1
Cepa 12
Cepa 10
Cepa 11

R50

R50

PV

Duncan
C
C
C
C
C
C
C B
C B
C B
C B
C B
C B
C B
C B
C B
C B
B
A
Trat
Cepa 6
Cepa 5
Cepa 12
Cepa 7
Cepa 10
Cepa 8
Cepa 9
Cepa 11
Cepa 13
Cepa 1
Cepa 14
Cepa 4
Cepa 2
Cepa 3
A, vinelandii
Agua
BT
A, brasilense

Media
48.000
48.000
48.000
48.000
48.000
48.000
51.000
51.000
51.000
51.000
54.000
57.000
57.000
57.000
57.000
57.000
60.000
72.000

R50

Media Duncan Trat


43.200
B
GA3
45.600
B
AIA
60.000 AB Hormo
67.200
A
IBA
72.000
A
Agua
79.200
A
Gibgro

R50

PV

MDG

MDG

Trat Media Duncan


0,7027 A
IBA
0,41 B
Hormo
0,3889 B
GA3
Gibgro 0,3704 B
0,3333 B
Agua
0,2263 B
AIA

VG

VG

Duncan
C
C
C
C
C
C
C B
C B
C B
C B
C B
C B
C B
C B
C B
C B
B
A

Trat
Cepa 6
Cepa 10
Cepa 13
Cepa 12
Cepa 8
Cepa 5
Cepa 7
Cepa 14
Cepa 1
Cepa 11
Cepa 9
A, vinelandii
Cepa 4
Cepa 3
Agua
Cepa 2
A, brasilense
BT

PV
Media
0,3031 A
0,3021 A
0,296 B
0,2958 B
0,2917 B
0,2833 B
0,2802 B
0,275 B
0,2604 E
0,2576 E
0,2549 E
0,2498 E
0,2484 E
0,2465 E
0,2396 E
0,2369 E
0,2263 E
0,2173 E

A
A
A C
A C
D A C
D A C
B D A C
B D A C
B D A C
B D A C
B D A C
B D A C
B D C
D C
D

Duncan

Trat
Cepa 13
Cepa 10
A, vinelandii
Cepa 8
Cepa 12
Cepa 3
Cepa 9
Cepa 14
Cepa 1
Cepa 7
Cepa 5
A, brasilense
Cepa 6
Agua
Cepa 2
BT
Cepa 4
Cepa 11

MDG
Duncan
Media
0,26897 A
0,23785 B A
0,23479 B A
0,23016 B A C
0,22569 B A C
0,22437 B A C
0,22321 B A C
0,22109 B A C
0,21759 B A C
0,21693 B A C
0,21181 B A C
0,20738 B C
0,2042 B C
0,18866 B C
0,18519 B C
0,18287 B C
0,18056 B C
0,17593 C

Trat
Cepa 13
Cepa 10
Cepa 12
Cepa 8
Cepa 6
Cepa 7
Cepa 14
Cepa 5
Cepa 1
A, vinelandii
Cepa 9
Cepa 3
A, brasilense
Cepa 11
Agua
Cepa 4
Cepa 2
BT

Media
0,0802 A
0,0727 B
0,0681 B
0,0675 B
0,0621 B
0,0618 B
0,0611 B
0,0597 B
0,0596 B
0,0594 B
0,0572 B
0,056 B
0,0474 B
0,0452 D
0,045 D
0,0448 D
0,0439 D
0,0397 D

VG

A
A C
A C
D A C
D A C
D A C
D A C
D A C
D A C
D A C
D A C
D C
C
C
C
C

Duncan

Duncan
A
A
AB
AB
AB
B

Trat Media Duncan


Hormo 0,2301 A
0,2244 B A
IBA
Gibgro 0,1694 B A C
0,1536 B
C
GA3
Agua 0,1318 D C
0,0753 D
AIA

Media Duncan Trat


Media Duncan Trat
Media Duncan Trat
Media
43.200
B
A
0,275
A
Hormo 0,2794
Agua
Hormo 0,0769
45.600
B
0,2508
A
A
0,0697
GA3
Gibgro 0,22371
GA3
60.000 AB Agua 0,2256
A
A
0,0511
Hormo 0,22222
IBA
67.200
A
0,2249
A
0,21098
A
0,0507
IBA
AIA
AIA
72.000
A
0,2064
A
0,19444
A
AIA
IBA
Agua 0,0482
79.200
A
A
0,18148
A
Gibgro 0,1972
GA3
Gibgro 0,0358

R50

Media Duncan Trat Media Duncan Trat Media Duncan


36.000 B
Gibgro 36.000 B
Hormo 0,5509 A
36.000 B
Hormo 36.000 B
Gibgro 0,4556 B
52.000 B A GA3 52.000 B A Agua 0,3954 B C
60.000 A
60.000 A
0,3949 B C
IBA
GA3
60.000 A
60.000 A
0,3393
C
AIA
IBA
60.000 A
0,3324
C
Agua 60.000 A
AIA

Tabla 6.15 Tablas de comparacin Duncan para estadio 1; a. Montaje 1, b. Montaje 2 c. Montaje 3

Media
48.000
48.000
48.000
48.000
48.000
48.000
51.000
51.000
51.000
51.000
54.000
57.000
57.000
57.000
57.000
57.000
60.000
72.000

R50

Media Duncan Trat


1,667
A
GA3
1,667
A
AIA
1,667
A
Hormo
1,633
A
IBA
1,650
AB Agua
1,667
B
Gibgro

GRI

Media Duncan Trat


2,333 A
Gibgro
2,333 A
Hormo
2,333 A
GA3
2,333 A
IBA
2,333 A
AIA
2,333 A
Agua

GRI

Media Duncan Trat


1,667
A Cepa 6
1,667
A Cepa 5
1,667
A Cepa 12
1,667
A Cepa 7
1,667
A Cepa 10
1,646
A Cepa 8
1,646
A Cepa 9
1,646
A Cepa 11
1,646
A Cepa 13
1,646
A Cepa 1
1,646
A Cepa 14
1,646
A Cepa 4
1,625
A Cepa 2
1,625
A Cepa 3
1,625
A A, vinelandii
1,625
A Agua
1,625
A BT
1,583
A A, brasilense

GRI

Media Duncan Trat


100.000 A Cepa 13
100.000 A A, vinelandii
100.000 A Cepa 9
100.000 A Cepa 2
100.000 A Cepa 6
98.750
A A, brasilense
98.750
A Cepa 3
98.750
A BT
98.750
A Cepa 5
98.750
A Cepa 14
98.750
A Agua
98.750
A Cepa 8
97.500
A Cepa 1
97.500
A Cepa 4
97.500
A Cepa 10
97.500
A Cepa 7
97.500
A Cepa 12
95.000
A Cepa 11

GC

Trat
Media Duncan Trat
100
A
Agua
Agua
A
Gibgro 100
Gibgro
100
A
AIA
AIA
100
A
GA3
GA3
99
AB Hormo
Hormo
B
98
IBA
IBA

GC

Trat
Media Duncan Trat
100 A
Agua
Agua
Gibgro 100 A
Gibgro
Hormo 100 A
Hormo
100 A
AIA
AIA
100 A
IBA
IBA
100 A
GA3
GA3

c.

b.

a.

114

GRI

GC

Trat
Cepa 13
A, vinelandii
Cepa 9
Cepa 2
Cepa 6
A, brasilense
Cepa 3
BT
Cepa 5
Cepa 8
Agua
Cepa 14
Cepa 7
Cepa 4
Cepa 1
Cepa 12
Cepa 10
Cepa 11

Trat
Cepa 12
Cepa 13
Cepa 9
Cepa 10
Cepa 7
Cepa 6
Cepa 1
A. vinelandii
Cepa 8
Cepa 11
Cepa 5
Cepa 4
Cepa 14
Cepa 3
Cepa 2
BT
Agua
A. brasilense

PV

R50

Media
69.000
69.000
69.000
72.000
72.000
75.000
78.000
81.000
84.000
84.000
87.000
90.000
90.000
96.000
99.000
105.000
108.000
123.000
G
G
G
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
B
B
B
B
A

Trat
Cepa 13
Cepa 10
Cepa 12
G
A. vinelandii
G
Cepa 6
G
Cepa 9
G E
Cepa 5
G E D
Cepa 7
G E D
Cepa 11
G E D
Cepa 1
G E D C Cepa 8
B E D C Cepa 14
B E D C Cepa 3
E D C
Cepa 4
D C
Cepa 2
A C
BT
A
Agua
A. brasilense

Duncan

PV

Media
0.21838
0.20432
0.20255
0.19659
0.18816
0.18571
0.18452
0.18403
0.17974
0.17903
0.17731
0.17674
0.16979
0.16944
0.16667
0.14962
0.14815
0.14517

A
B
B
B
B
B
B
B
B
B
F
F
F
F
F
F
F
F

A
A C
D A C
D A C
D
C
D
C
D
C
D E C
D E C
B D E C
B D E C
D E C
D E C
D E
E
E

Duncan

MDG

Trat
A. vinelandii
Cepa 10
Cepa 12
Cepa 13
Cepa 5
Cepa 9
Cepa 14
Cepa 1
Cepa 6
Cepa 8
Cepa 11
Cepa 7
Cepa 2
Cepa 3
Cepa 4
BT
A. brasilense
Agua

MDG

Media
0.19213
0.19077
0.18988
0.18619
0.18244
0.17593
0.17380
0.17176
0.17130
0.16921
0.16736
0.16713
0.16667
0.16458
0.16250
0.14962
0.14347
0.14015

A
A
A
A
A
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
D
D

VG

A
A C
A C
A C
D A C
D A C
D A C
D A C
D A C
D A C
D
C
C

Duncan

Trat
Cepa 13
Cepa 10
Cepa 12
A. vinelandii
Cepa 5
Cepa 9
Cepa 6
Cepa 1
Cepa 7
Cepa 14
Cepa 11
Cepa 8
Cepa 3
Cepa 2
Cepa 4
BT
A. brasilense
Agua

Media
0.041030
0.039711
0.039200
0.038149
0.034658
0.032771
0.032218
0.031063
0.030883
0.030843
0.030312
0.030187
0.027969
0.027778
0.027616
0.022397
0.020912
0.020763

VG

A
A
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
D
D
D

Media
Duncan
0,036661
A
0,034358
A
0,024444
B
0,023928
B
0,022617
B
0,018366
B

VG

Trat
Media
Duncan
Hormo 0,12207 A
Agua
0,09906 B A
GA3
0,08034 B A
Gibgro
0,06991 B A
AIA
0,05669 B
IBA
0,05227 B

Media
Duncan Trat
0,18401
A
GA3
0,18032
A
Hormo
0,15291
B
Agua
0,15253
B
AIA
0,14947
B
IBA
0,13287
B
Gibgro

MDG

Trat
Media
Duncan
Agua
0,31349 A
Hormo 0,30463 B A
GA3
0,27546 B A
Gibgro 0,23333 B A
IBA
0,22194 B A
AIA
0,2133 B

Tabla 6.16 Tablas de comparacin Duncan para estadio2; a. Montaje 1, b. Montaje 2 c. Montaje 3

Duncan
Media Duncan Trat
Media
1,667
A
Cepa 12
69.000 H
1,667
A
Cepa 13
69.000 H
1,667
A
Cepa 9
69.000 H
1,667
A
Cepa 10
72.000 H
G
1,667
A
Cepa 7
72.000 H
G
1,646
A
Cepa 6
75.000 F H
G
1,646
A
Cepa 1
78.000 F H E
G
1,646
A
A. vinelandii 81.000 F H E D
G
1,646
A
Cepa 8
84.000 F H E D
G
1,646
A
Cepa 11
84.000 F H E D
G
1,646
A
Cepa 5
87.000 F H E D C G
1,646
A
Cepa 14
90.000 F B E D C G
1,625
A
Cepa 4
93.000 F B E D C
1,625
A
Cepa 3
96.000 B E D C
1,625
A
Cepa 2
99.000 B
D C
1,625
A
BT
105.000 B
A C
1,625
A
Agua
108.000 B
A
1,583
A
A. brasilense 123.000 A

Media Duncan Trat


100.000
A
Cepa 13
100.000
A
A. vinelandii
100.000
A
Cepa 9
100.000
A
Cepa 2
100.000
A
Cepa 6
98.750
A
A. brasilense
98.750
A
Cepa 3
98.750
A
BT
98.750
A
Cepa 5
98.750
A
Cepa 14
98.750
A
Agua
98.750
A
Cepa 8
97.500
A
Cepa 1
97.500
A
Cepa 4
97.500
A
Cepa 10
97.500
A
Cepa 7
97.500
A
Cepa 12
95.000
A
Cepa 11

R50

GRI

GC

PV

Trat
Media
Duncan
Hormo
0,3912 A
Agua
0,31349 B
Gibgro
0,2996 C B
GA3
0,29167 C B
AIA
0,26466 C B
IBA
0,23225 C

Media Duncan Trat


Media
Duncan Trat
76.800
C
GA3
0,19775
A
GA3
81.600
C
Hormo 0,18985
A
Hormo
100.800
B
Agua
0,15926
B
AIA
100.800
B
AIA
0,155
B
Agua
105.600
B
IBA
0,15035
B
IBA
124.800
A
Gibgro 0,13749
B
Gibgro

R50

Media Duncan Trat


76.800
C
GA3
81.600
C
Hormo
100.800
B
AIA
100.800
B
IBA
105.600
B
Agua
124.800
A
Gibgro

R50

R50

Trat
Media Duncan
Hormo 48.000 C
Gibgro 56.000 B C
Agua
60.000 B C
GA3
66.000 B A
AIA
72.000 B A
IBA
80.000 A

R50

Trat
Media Duncan
Hormo 48.000 C
Gibgro 56.000 B C
Agua
60.000 B C
GA3
66.000 B A
AIA
72.000 B A
IBA
80.000 A

Trat
Media Duncan Trat
Media Duncan Trat
Agua
100
A
Hormo 1,667
A
GA3
Gibgro
100
A
Gibgro 1,667
A
Hormo
IBA
100
A
Agua
1,667
A
AIA
GA3
100
A
AIA
1,667
A
IBA
Hormo
99
AB GA3
1,667
A
Agua
AIA
98
B
IBA
1,633
A
Gibgro

GRI

Trat
Media Duncan
Agua
2,333 A
Gibgro
2,333 A
Hormo
2,333 A
AIA
2,333 A
IBA
2,333 A
GA3
2,333 A

GC

Trat
Media Duncan
Agua
100 A
Gibgro
100 A
Hormo
100 A
AIA
100 A
IBA
100 A
GA3
100 A

A
A
A
A C
D A C
D A C
D A C
D A C
D A C
D A C
D
C
D
C
D
C
C

Duncan

c.

b.

a.

115

R50

GRI

R50
Duncan Trat
Media
A
Cepa 10
99 E
A
Cepa 7
102 E
A
Cepa 8
102 E
A
A. vinelandii
105 D
A
Cepa 13
108 D
A
Cepa 9
108 D
A
Cepa 6
108 D
A
Cepa 11
108 D
A
Cepa 12
111 D
A
Cepa 14
114 D
A
Cepa 5
120 D
A
Cepa 1
120 D
A
Cepa 4
123 B
A
BT
132 B
A
Cepa 2
141 B
A
A. brasilense
144 B
A
Cepa 3
147 B
B
Agua
153 A

R50

PV

PV

Media Duncan
0,2691 A
0,229 B A
0,2061 B
0,1977 B
0,1919 B
0,1694 B

PV
Trat
Media
A. vinelandii 0,151 A
Cepa 10
0,1427 B
Cepa 8
0,1373 B
Cepa 13
0,1333 B
Cepa 6
0,1319 B
E
Cepa 7
0,1292 B
E
Cepa 11
0,126 B
E
Cepa 12
0,1243 E
E
Cepa 9
0,1242 E
E
A. brasilense 0,121 E
E
Cepa 5
0,1193 E
E C
Cepa 14
0,1184 E
D E C Cepa 1
0,1183 E
D A C Agua
0,1153 E
A C Cepa 4
0,1115 E
A
Cepa 2
0,1087 E
Cepa 3
0,1004 E
BT
0,097 E
Duncan

MDG

Trat
Hormo
GA3
Gibgro
AIA
IBA
Agua

MDG
Media
0,14205 A
0,12922 B
0,12443 B
0,11971 B
0,11829 B
0,11705 B
0,11502 B
0,11448 B
0,11386 B
0,11375 B
0,11353 B
0,10938 B
0,10882 B
0,10627 B
0,1059 B
0,10313 D
0,09681 D
0,09624 D

VG

VG
Duncan
Trat
Media
A. vinelandii 0,021443 A
A
Cepa 10
0,018506 B A
A C Cepa 8
0,015851 B C
D A C A. brasilense 0,015627 B C
D A C Cepa 9
0,015533 B C D
D
C Cepa 11
0,015126 B C D
D
C Cepa 7
0,015005 B C D
D
C Cepa 13
0,014499 B C D
D
C Cepa 6
0,014429 B C D
D
C Cepa 12
0,01431 B C D
D
C Cepa 14
0,013928 B C D
D
C Cepa 5
0,013927 B C D
D
C Agua
0,013295 B C D
D
C Cepa 1
0,0122 C D
D
C Cepa 4
0,012096 C D
C
Cepa 2
0,011517 C D
Cepa 3
0,009873 C D
BT
0,0094 D
Duncan

Media
Duncan
0.100794
A
0.019810
B
0.019214
B
0.018366
B
0.017525
B
0.015913
B

VG

Trat
Media
Duncan
Hormo 0,061949 A
Gibgro 0,045786 B
0,039128 C B
Agua
0,035482 C B
AIA
0,031987 C B
GA3
0,028221 C
IBA

Media Duncan Trat


0.137762 A
Agua
0.135309
A
GA3
0.132867
A
Hormo
0.131036
A
Gibgro
0.12596
AB AIA
0.115873
B IBA

MDG

Trat
Media Duncan
Hormo 0,22783 A
Gibgro 0,20034 B
0,18946 C B
Agua
0,17949 C B
AIA
0,16667 C
GA3
0,16204 C
IBA

Trat
A. vinelandii
A
Cepa 10
A C
A. brasilense
A C
Cepa 9
A C
Cepa 11
A C
Cepa 14
D A C
Cepa 8
B D A C Agua
B D A C Cepa 5
B D
C Cepa 7
B D
C Cepa 12
B D
C Cepa 6
B D
C Cepa 13
B D
C Cepa 4
D
C Cepa 2
D
C Cepa 1
D
BT
Cepa 3

Duncan

Media Duncan Trat


Media Duncan
116.400
C Agua 0.86667 A
122.400 CB GA3
0.14583 B
124.800 CB Hormo 0.13939 B
B
127.200 CB Gibgro 0.13749
0.13297
B
132.000 AB AIA
139.200
A IBA
0.12595 B

R50

Media Duncan Trat


80.000 B
Hormo
88.000 B A Gibgro
96.000 B A Agua
104.000 A
AIA
108.000 A
GA3
108.000 A
IBA

R50
Trat
Media
Cepa 10
99 E
Cepa 7
102 E
Cepa 8
102 E
E
Cepa 11
105 E
E
A. vinelandii
105 E
E
Cepa 13
108 D
E
Cepa 6
108 D
E
Cepa 9
108 D
E
Cepa 12
111 D
E
Cepa 4
114 D
E C
Cepa 14
114 D
E C
Cepa 1
117 D
D E C Cepa 5
120 B
D A C BT
132 B
A C Cepa 2
141 B
A C A. brasilense
144 B
A
Cepa 3
147 A
Agua
153 A
Duncan

Trat
GA3
Hormo
Gibgro
AIA
IBA
Agua

Trat
Hormo
Gibgro
GA3
AIA
IBA
Agua

Tabla 6.17 Tablas de comparacin Duncan para estadio3; a. Montaje 1, b. Montaje 2 c. Montaje 3

GC
GRI
Trat
Media Duncan Trat
Media
Cepa 13
100.000
A Cepa 13
1,667
A. vinelandii 100.000
A A. vinelandii 1,667
Cepa 9
100.000
A Cepa 9
1,667
Cepa 2
100.000
A Cepa 2
1,667
Cepa 6
100.000
A Cepa 6
1,667
A. brasilense 98.750
A A. brasilense 1,646
Cepa 3
98.750
A Cepa 3
1,646
BT
98.750
A BT
1,646
Cepa 5
98.750
A Cepa 8
1,646
Cepa 8
98.750
A Cepa 5
1,646
Agua
98.750
A Cepa 1
1,625
Cepa 12
97.500
A Cepa 10
1,625
Cepa 1
97.500
A Cepa 12
1,625
Cepa 10
97.500
A Cepa 7
1,604
Cepa 7
96.250
A Cepa 4
1,604
Cepa 4
96.250
A Cepa 14
1,604
Cepa 14
96.250
A Cepa 11
1,583
Cepa 11
95.000
A Agua
1,229

Media Duncan Trat


Media Duncan
1,667
A
116.400 C
GA3
1,667
A
Hormo 122.400 CB
1,667
A
Gibgro 124.800 CB
1,65
A
127.200 CB
AIA
1,65
A
132.000 AB
IBA
1,63
A
139.200 A
Agua

GC

Trat
Media Duncan Trat
100
A
Agua
Agua
A
Gibgro 100
Gibgro
100
A
AIA
AIA
100
A
GA3
Hormo
99
AB GA3
Hormo
98
B
IBA
IBA

R50

Trat
Media Duncan
80.000 B
Hormo
88.000 B A
Gibgro
96.000 B A
GA3
104.000 A
AIA
108.000 A
IBA
108.000 A
Agua

GRI

Trat
Media Duncan
2,333 A
Agua
Gibgro 2,333 A
Hormo 2,333 A
2,333 A
AIA
2,333 A
IBA
2,333 A
GA3

GC

Trat
Media Duncan
100 A
Agua
Gibgro 100 A
Hormo 100 A
100 A
AIA
100 A
IBA
100 A
GA3

c.

b.

a.

Tabla 6.18 Resultados de los mejores tratamientos para los montajes 1 y 2 de evaluacin de
reguladores, y montaje 3 de evaluacin de microorganismos.

Estado Regulador (Montajes 1 y 2)


1
Hormonagro y GA3
2
Hormonagro y GA3
3

Tratamiento (Montaje 3)
Cepas 6, 10 y 13
Cepas 12 y 13
Cepas 10, 7 y
Hormonagro, GA3 y control (H2O) Azotobacter vinelandii

6. 7 ANLISIS DE RESULTADOS Y DISCUSIN GENERAL


Se evaluaron diferentes tcnicas para la deteccin de reguladores de
crecimiento vegetal, especficamente cido indol actico y giberelinas. Se
hizo una estandarizacin para deteccin colorimtrica de AIA con el reactivo
de Salkowsky preparado con cido sulfrico como tcnica cuantitativa, y
cromatografa de capa fina como tcnica cualitativa, tanto para AIA como
para GA3. Tambin se busc la estandarizacin de un bioensayo que nos
permitiera determinar los efectos especficos de diferentes reguladores de
crecimiento (grado reactivo y comerciales), para poder precisar el efecto de
la inoculacin de semillas con caldos microbianos y as establecer la
actividad biolgica de los diferentes microorganismos evaluados.
La tcnica de Salkowsky fue evaluada con distintas mezclas de cido
sulfrico y cloruro frrico (Glickman & Dessaux, 1995), debido a que la
formula original del reactivo es a base de cido perclrico, pero por
inconvenientes de importacin y restriccin de venta, se busc un cido que
pudiera brindar los mismos resultados o muy similares a los obtenidos con
Salkowsky preparado con cido perclrico. Se busc el reactivo (H2SO4FeCl3) y proporciones de reaccin que mostraran la sensibilidad, precisin y
similitud de color a la reaccin con Salkowsky-HClO4. Teniendo en cuenta
estas condiciones se escogi el reactivo R1m, descartando otros reactivos

116

que aunque en algunos casos mostraron sensibilidad mayor presentaban


gama de color diferente a la de la reaccin por oxidacin del grupo indol por
Salkowsky-HClO4. (Bric et al., 1991; Gordon & Weber, 1950)
Una vez estandarizada la tcnica colorimtrica de Salkowsky con el reactivo
R1m, se montaron cultivos con cepas referenciadas como productoras de
AIA. Se utilizaron dos cepas, A. vinelandii y A. brasilense, en las cuales se
observo la produccin de AIA con un comportamiento lineal en aumento en
funcin del tiempo, corroborando estudios realizados esta y otras cepas de A.
vinelandii (Duque & Quintana, 2008; Zakharova et al, 1999) y otras cepas de
A. brasilense (Zakharova et al., 1999). Se estableci como control positivo
para la produccin de AIA a la cepa de A. vinelandii por buena produccin de
AIA (80ug/ml) comparado con A. brasilense que produjo menos de 10 ug/ml.
La cepa de referencia A. vinelandii (ATCC12518) no est caracterizada como
una cepa productora de AIA en el catalogo de cepas de referencias de la
ATCC, mientras que A. brasilense (ATCC29145) si est caracterizada como
cepa productora de AIA, esto no concuerda con los resultados obtenidos en
el estudio.
Tambin se busc un medio de cultivo sencillo y econmico que promoviera
la sntesis de los reguladores de crecimiento y que al mismo tiempo
permitiera una buena produccin de biomasa. Se probaron tres medios de
cultivo, TSB como medio enriquecido y se compar con el medio B (et al,
1984), que es un medio mineral para microorganismos del suelo, y el mismo
medio B con suplemento de triptona, como fuente de triptfano para
induccin de produccin de AIA. El triptfano acta como precursor principal
en la va de sntesis del cido indol actico, debido a que es el origen del
grupo indol presente en el AIA (Taiz & Zeiger, 2006; Vasanthakumar &
Mcmanus, 2004; Zakharova et al., 1999). En la mayora de estudios se utiliza
L-triptfano para inducir la sntesis de AIA, pero al buscar estandarizar

117

tcnicas sencillas y al mismo tiempo econmicas, se decidi trabajar con


triptona, un suplemento econmico y ampliamente utilizado en laboratorios
de microbiologa convencionales. La triptona no solo es fuente de triptfano
sino tambin es fuente de carbono y nitrgeno orgnico fcilmente asimilable
por todos los microorganismos. Se determin, al observar el comportamiento
en crecimiento de las cepas y la produccin de AIA, que el medio B
suplementado con triptona (BT) es un medio ptimo tanto para el desarrollo
microbiano como para la promocin de produccin de AIA. Se descart el
medio B sin suplemento, ya que en este no se observ un buen desarrollo
microbiano y adems no se detecto la presencia de AIA, pero permiti
comprobar que los microorganismos evaluados poseen rutas metablicas
dependientes de triptfano para la biosntesis de AIA.
La tcnica de cromatografa de capa fina fue evaluada probando 16 sistemas
de solventes, buscando uno que lograra la separacin y deteccin de
reguladores de crecimiento vegetal como AIA, IBA y GA3, y as lograr una
determinacin de los tres reguladores en una misma corrida, pues no se
encontraron reportes de sistemas de solventes que permitieran la resolucin
de auxinas y giberelinas. La fase mvil cloroformo : etilacetato : cido actico
(50:30:20) permiti movilidad y separacin de los tres reguladores, y el
reactivo de tincin tambin permiti la deteccin de los tres reguladores en
los cromatogramas. El reactivo es una modificacin del reactivo de
Salkowsky con H2SO4 que permite deteccin de auxinas de grupo indol en
luz visible y deteccin de giberelinas en luz UV de onda larga (366nm).
Aunque este mtodo de deteccin es cualitativo, tiene la ventaja de poder
diferenciar entre auxinas derivadas del indol, cido indol actico y cido indol
butrico.
Una vez estandarizada la tcnica de deteccin de reguladores por TLC, fue
utilizada para evaluar la produccin de reguladores AIA, IBA, GA3 para las

118

muestras obtenidas a partir de los cultivos microbianos, observndose una


produccin de AIA y GA3 por las cepas 4 y 5 mientras que la produccin de
AIA fue determinada en las cepas 2 y 9, y la produccin de GA3 fue
observada en las cepas 10, 11 y 12. Las cepas de referencia mostraron
produccin de AIA pero no de GA3. La cepa de A. vinelandii no est
caracterizada como productora de GA3, pero la de A. brasilense si lo est
(Daz L.A., 2006, comunicacin personal).
Los resultados del bioensayo mostraron que dentro de los 7 ndices de
desarrollo evaluados no se present diferencia significativa para los ndices
GCs y GRI, se determin una tendencia general por estado mostrando para
los montajes 1 y 2, que el estado 1 est influenciado por GA3 y auxinas
(Hormonagro), el estado 2 tambin est influenciado por GA3 y Hormonagro,
al igual que el estado 3, aunque en este estado es ms difcil establecer la
relacin por que los montajes 1 y 2 tienen comportamientos diferentes, en el
montaje 1 predomina el efecto de Hormonagro y en el montaje 2 GA3. En el
montaje 3, en el estado 1 se observaron los ndices ms altos para las cepas
6 y 10, para el estado 2 las cepas 12 y 13, y para el estado 3 las cepas 7 ,
8, 10 y A. vinelandii.
La deteccin de reguladores a partir de TLC representa la tcnica ms
amplia, en el sentido de poder determinar tres reguladores de crecimiento en
un solo montaje, y tambin permite resolucin entre auxinas de origen
indlico, pero no es una tcnica altamente sensible. El lmite de deteccin de
esta tcnica para los tres reguladores (AIA, IBA y GA3) fue establecido a
0.05ug, pero al comparar los resultados de deteccin de AIA con TLC y los
del reactivo de Salkowsky no se presenta asociacin para todas las muestras
evaluadas. La prueba se Salkowsky mostr resultados positivos para todas
los micrrorganismos, aunque algunos en bajas concentraciones, mientras
que en TLC solo se detect AIA en las cepas de referencia y las cepas 2, 4, 5

119

y 9, siendo las cepas 2, 4 y 9 unas de las cepas con mayores


concentraciones de AIA en cultivo (determinado por Salkowsky-R1m). Lo
contradictorio de esta observacin es que la cepa 5 presenta bajas
concentraciones de AIA en cultivo. En el caso de las cepas que presentan
resultados positivos con Salkowsky y no muestran deteccin en TLC, no se
puede hablar de inespecificidad del reactivo de Salkowsky, pues este detecta
anillos indol en general (Salkowsky, 1889). En el caso que de Salkowsky
estuviera detectando otros compuestos indlicos, se observaran bandas de
color rosado-fucsia con Rf diferentes a del AIA, y este no fue el caso para
dichas cepas; incluso no se observaron bandas con la coloracin y Rf propios
de IBA. La razn de por qu se detecta AIA por Salkoswsky y no TLC est
ms encaminada a un problema en el momento de la extraccin lquidolquido con acetato de etilo, como ya se mencion en el numeral 6.5.
La cepa de referencia A.vinelandi ATCC12518, present resultados acordes
en todas las tcnicas estandarizadas en este trabajo, ya que se observ en
TLC, la produccin de AIA con una escala de color acorde a la produccin en
el tiempo entre los das 1 y 6, la determinacin de auxinas por Salkowsky fue
positiva obtenindose una de produccin mxima de no menos de 80 ug/ml
los cuales, se confirm por TLC corresponden a AIA, y finalmente en el
bioensayo se present como uno de los mejores tratamientos en el estado 3,
que previa estandarizacin fue catalogado como un estado altamente
influenciado por auxinas, lo cual confirma los resultados obtenidos con esta
cepa.
De acuerdo los resultados, la cepa 10 que se muestra como productora de
GA3 en TLC, exhibe la misma produccin de GA3 en el bioensayo ya que se
vi como uno de los mejores tratamientos para el estado 1 el cual, segn los
montajes de bioensayo 1 y 2 fue el ms influenciado por GA3, al igual que
para el estado 3, influenciado por GA3 y auxinas, en donde se confirmara la

120

accin de GA3 como nico regulador producto del metabolismo de la cepa 1,


teniendo en cuenta que el valor mximo de produccin de AIA segn prueba
de Salkowsky fue de 4ug/mL.
Las cepas 11 y 12 tambin mostraron alta produccin de GA3 en TLC, lo cual
concuerda con los datos obtenidos en el bioensayo donde se observa como
uno de los mejores tratamientos en el estado 2, el cual est influenciado por
GA3 y auxinas, mientras que la cepa 11 se mostr como el mejor tratamiento
para el estado 3.
La comparacin entre los resultados del bioensayo y la produccin de AIA en
reaccin colorimtrica (mayores ndices en estado 2 y mximo de 16ug/ml
de AIA), propone a la cepa 13 como productora de auxinas, aunque no se
haya detectado produccin en TLC. Lo mismo pasa con la cepa 8, que tiene
altos ndices en el estado 3.
Se confirm que la sntesis de reguladores de crecimiento tiene un efecto
directo en la promocin del desarrollo de las plntulas de lechuga, pero
tambin los intermediarios de las rutas de biosntesis de estos reguladores
puede tener un efecto indirecto de promocin de desarrollo sobre las
plntulas porque pueden inducir a la activacin de la rutas de biosntesis de
hormonas reguladoras de crecimiento en las plntulas (Bric et al., 1991;Taiz
& Zeiger, 2006).

121

7. CONCLUSIONES

El reactivo Salkowsky a base de acido sulfrico R1m, se estableci


como el reactivo de comportamiento similar al de cido perclrico,
siendo el ms indicado para ser utilizado en la tcnica de deteccin
colorimetrica.

Se estableci el medio BT como apto para la produccin de biomasa


microbiana y AIA, al compararlo con TSB.

La triptona utilizada en el medio BT es una buena fuente de triptfano,


y de otros nutrientes favoreciendo la produccin de biomasa
microbiana y AIA.

Se determin a la cepa de Azotobacter vinelandii (ATCC12518) como


control positivo para produccin de AIA, comparada con al cepa de
Azospirillum.

brasilense

(ATCC

291459)

caracterizada

como

productora de AIA.

Se estableci como da ptimo de muestreo para cepas productoras


de AIA el da 4 en fermentacin discontinua en medio BT.

Las pruebas colorimtricas evaluadas para deteccin y cuantificacin


GA3 no son especficas para giberelinas, solo se pueden utilizar para
cuantificar soluciones puras de giberelinas.

Para la deteccin de AIA, IBA y GA3 por TLC, en una misma corrida
cromatogrfica, se determin como fase mvil cloroformo : etilacetato :
acido actico (50:30:20) y como revelador H2SO4 60% - FeCl3 28mM.

En la estandarizacin del bioensayo de germinacin de semillas de


lechuga, se determinarn auxinas (Hormonagro) y GA3 como los
reguladores de mayor influencia en los estados de desarrollo 1 y 2.

Las cepas evaluadas son dependientes del triptfano para la


produccion de AIA.

122

Se evalu la produccin de AIA y GA3 por parte de las cepas de


bioinoculante acelerador de compostaje, donde las cepas 4 y 5 fueron
las nicas productoras de los dos metabolitos, las cepas 2 y 9 se
definieron como productoras de AIA, y las cepas 10, 11 y 12 como
productoras de GA3, de acuerdo a la prueba de TLC.

La prueba de Salkowsky determin a las cepas 2, 3 y 9 como las de


produccin ms alta de AIA.

El bioensayo en semillas de lechuga asoci a las cepas 6, 10, 12 y 13


como productoras de auxinas y AIA.

123

8. RECOMENDACIONES

La prueba de TLC puede establecerse como cuantitativa, con ayuda


de programas de densitometra de libre acceso en Internet. Debe
establecerse una curva de calibracin por intensidad de color en
funcin de concentracin de patrones. Esta recomendacin se hace
porque en los cromatogramas de las cepas de referencia se observ
claramente el aumento de intensidad de color en funcin de tiempo,
acorde a los resultados de cuantificacin de AIA en el curso de tiempo
del cultivo. Para la cuantificacin de auxinas con grupo indol, esta
estandarizacin no implica altos costos porque solo re requiere de un
scanner o una cmara digital convencional. La cuantificacin de
giberelinas si implicara mayores costos pues es indispensable contar
con una lmpara de UV onda larga de buena intensidad y de una
cmara digital de sistema ptico altamente sensible. Lo ideal es contar
con un densitmetro, pero este no es un equipo que fcilmente se
encuentre en un laboratorio de microbiologa y adicionalmente es un
equipo de un costo elevado.

Probar la eficacia de la extraccin de reguladores de crecimiento,


especficamente

AIA,

por

extraccin

lquido-lquido

haciendo

cuantificacin por reaccin con Salkowsky.

Evaluar la posibilidad de elevar el lmite de deteccin de reguladores


de crecimiento por TLC, usando placas HPTLC, que aunque tienen un
costo

elevado,

permiten

la

deteccin

de

metabolitos

en

concentraciones de ng/mL.

Confirmar las concentraciones lmite de deteccin de TLC por


cuantificacin en HPLC.

124

Hacer varias repeticiones, en tiempos diferentes, de los montajes de


los bioensayos, incluyendo otras formulaciones comerciales de
reguladores de crecimiento y ANA grado reactivo, para as confirmar la
asociacin de los tratamientos a los ndices calculados para los
diferentes estados de desarrollo.

Montar los bioensayos con semillas de especie con germinacion y


desarrollo ms lento, pero que sean fcilmente asequibles a un
laboratorio de microbiologa, para poder encontrar ms fcilmente
diferencias significativas entre los ndices y los estados de desarrollo.
En este trabajo tambin se hicieron ensayos con semillas de frjol,
montando curvas para determinar tiempo ptimo de imbibicin, pero la
rpida contaminacin de las semillas por hongos y bacterias no
permiti hacer la evaluacin de todos los estados de desarrollo. Es
posible minimizar la contaminacin con el uso productos como
Mancozeb.

Continuar caracterizando las cepas del bioinoculante como PGPB,


evaluando por ejemplo fijacin de nitrgeno, solubilizacin de fosfatos,
produccin de siderforos y capacidad antagnica, entre otras. El
inters en esta caracterizacin es muy particular, pues las 14 cepas de
este inoculante estn definidas como cepas termfilas, pero en este
estidio

probaron

crecer

bien

en

condiciones

de

mesofilia,

adicionalmente producen reguladores de crecimiento vegetal, y en el


bioensayo se confirm que pueden promover el desarrollo de plntulas
de lechuga. Todo esto implica que su actividad no solo aplica a nivel
de aceleracin del proceso de compostaje, si no tambin a nivel de
promocin de crecimiento vegetal. No se encuentran reportes de
bioinoculantes que tengan estas dos actividades.

125

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133

ANEXO 1
MEDIO TSB (Caldo tripticasa soya)
COMPOSICION
Glucosa
Peptona de casena
Peptona de soya
NaCl
K2HPO4

g/L
2,5
17
3
5
2,5

MEDIO B
COMPOSICION
Glucosa
K2HPO4
NH4NO3
NaCl
MgSO47H2O

g/L
5
1
0,4
0,2
0,4

MEDIO BT (B MODIFICADO)
COMPOSICION
Glucosa
K2HPO4
NH4NO3
NaCl
MgSO47H2O
Triptona

g/L
5
1
0,4
0,2
0,4
20

134

ANEXO 2

GRAFICAS PRODUCCION DE AIA


Azotobacter vinelandii
1. Montaje 1
PRODUCCION DE AIA ug/ ml A. vinelandii EN MEDIO
TSB

8
7
6
5
4
3
2
1
0

10

CO N CEN TRA CIO A IA


(u g/ m l)

CO N CEN TRACIO N AIA (u g/ m l)

PRODUCCION DE AIA ug/ ml A. vinelandii en medio BT

5
0
0

-5
TIEMPO (Das)

TIEMPO (Das)

2. Montaje 3
Produccin AIA Azotobacter vinelandii en medio TSB
(Montaje 3)

40
Conce nt racin AIA (ug/ m l)

CONCENTRACION AIA (ug/ ml)

PRODUCCION DE AIA A. Vinelandii EN MEDIO BT


(Montaje 3)
60
50
40
30
20
10

35
30
25
20
15
10
5

0
0

TIEMPO (Das)

0
0

Tiempo (Dias)

135

Azospirillum brasilense
3. Montaje 1
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) A. brasilense EN MEDIO
TSB

4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0

CON CEN TRACIO DE AIA


(ug/ m l)

CO N CEN TRACIO N AIA


(ug/ m l)

PRODUCCION DE AIA ug/ ml A. brasilense

5
4
3
2
1
0

TIEMPO (Das)

10

TIEMPO (Das)

Cepas bioinoculante
PRODUCCION DE AIA EN MEDIO BT

4. CEPA 1

(ug/ ml)

CONCENTRACION DEAIA

PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 1


45,00
40,00
35,00
30,00
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
0

TIEMPO (Das)

5. CEPA 2
PRODUCCION DE AIA ug/ ml CEPA 2

CONCENTRACION DE AIA
(ug/ ml)

60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
0

TIEMPO (Das)

136

6. CEPA 3

CONCENTRACION DEAIA
(ug/ ml)

PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 3


45,00
40,00
35,00
30,00
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
0

TIEMPO (Das)

7. CEPA 4

CONCENTRACIO DEAIA ug/ ml

PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 4


30,00
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
0

TIEMPO (Das)

8. CEPA 5
PRODUCCION AIA (ug/ ml) CEPA 5

CONCENTRACION DE AIA
(ug/ ml)

6
5
4
3
2
1
0
0

TIEMPO (Das)

137

9. CEPA 6
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 6

CONCENTRACION DE AIA
(ug/ ml)

3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0

TIEMPO (Das)

10. CEPA 7
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 7

CONCENTRACION DEAIA
(ug/ ml)

0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
-0,05 0

TIEMPO (Das)

11. CEPA 8
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 8
CONCENTRACION DEAIA
(ug/ ml)

25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
0

TIEMPO (Das)

138

12. CEPA 9

CONCENTRACION DEAIA
(ug/ ml)

PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 9


45,00
40,00
35,00
30,00
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
0

TIEMPO (Das)

13. CEPA 10
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 10

CONCENTRACION DEAIA
(ug/ ml)

12,00
10,00
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00
0

TIEMPO (Das)

14. CEPA 11
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 11

CONCENTRACION DE AIA
(ug/ ml)

7
6
5
4
3
2
1
0
0

TIEMPO (Das)

139

15. CEPA 12

CONCENTRACION DE AIA
(ug/ ml)

PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 12


4,50
4,00
3,50
3,00
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
0

TIEMPO (Das)

16. CEPA 13
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 13

CONCENTRACION DE AIA
(ug/ ml)

35,00
30,00
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
0

TIEMPO (Das)

17. CEPA 14
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 14
CONCENTRACION EN AIA
(ug/ ml)

3,00
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
0

TIEMPO (Das)

140

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