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TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar al ttulo de
MICROBILOGO AGRCOLA Y VETERINARIO
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar al ttulo de
MICROBILOGO AGRCOLA Y VETERINARIO
NOTA DE ADVERTENCIA
APROBADO:
_________________________
Maria Ximena Rodrguez
DIRECTORA
________________________
Jos Salvador Montaa
JURADO 1
________________________
Pedro Jimnez
JURADO 2
APROBADO:
_________________________
ANGELA UMAA Mphil .
Decana Acadmica
________________________
JANETH ARIAS PALACIOS
Director de Carrera
AGRADECIMIENTOS
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIN4
2. MARCO TEORICO7
1.1 REGULADORES DE CRECIMIENTO VEGETAL.7
1.1.1 ETILENO.10
1.1.2 ACIDO ABSCSICO...11
1.1.3 CITOQUININAS.12
1.1.4 BRASINOESTEROIDES..12
1.1.5 ACIDO JASMNICO..........................................................13
2.2 AUXINAS13
2.2.1 CARACTERSTICAS GENERALES13
2.2.2 REGULACIN DE LAS FUNCIONES EN LA PLANTA14
2.2.3 BIOSNTESIS DE AUXINAS EN PLANTAS.............18
2.3 GIBERELINAS.19
2.3.1 CARACTERSTICAS GENERALES20
2.3.2 REGULACIN DE LAS FUNCIONES EN LA PLANTA22
2.3.3 BIOSNTESIS DE GIBERELINAS EN PLANTAS..22
2.4 RIZOBACTERIAS PROMOTORAS DEL CRECIMIENTO
VEGETAL.24
2.4.1 MECANISMOS DE ACCIN DE PGPRs.24
2.4.1.1 Mecanismos de accin directa ...25
2.4.1.2 Mecanismos de accin indirecta.. ...29
2.4.2 BIOSNTESIS DE REGULADORES DEL CRECIMIENTO
VEGETAL...30
2.4.2.1 Biosntesis de auxinas por bacterias...........................30
2.4.2.1.1 Ruta Indol 3 acetamida (IAM).. 30
2.4.2.1.2 Ruta Indol 3-Piruvato (IPvA)..31
MTODOS
DE
DETECCIN
COLORIMTRICA
DE
36
II
5.1.2
Azotobacter vinelandii y
Azospirillum brasilense..56
5.5.2
VEGETAL
PARTIR
DE
CULTIVOS
MICROBIANOS........................................................................58
5.6.1 DETECCION DE AUXINAS MICROBIANAS..58
5.6.1.1 Deteccin colorimtrica (Reactivo de Salkowsky)...58
III
DETECCIN
COLORIMTRICA
(REACTIVO
DE
SALKOWSKY)61
6.2 DETECCIN DE REGULADORES DEL CRECIMIENTO
VEGETAL POR CROMATOGRAFA DE CAPA FINA (TLC)71
6.2.1 ESTANDARIZACIN DE FASE MVIL PARA TLC.71
6.2.2 DETECCIN DE REGULADORES DE CRECIMIENTO EN
TLC...73
6.2.3
LIMITES
DE
DETECCION
DE
REGULADORES
DE
IV
BIOENSAYO
PARA
DETECCIN
DE
ACTIVIDAD
DE
7. CONCLUSIONES122
8. RECOMENDACIONES124
9. REFERENCIAS126
NDICE DE TABLAS
VI
Tabla 6.10
VII
NDICE DE FIGURAS
VIII
concentraciones de GA3.78
Figura 6.12 Reaccin del reactivo 2-4 dinitrofenilhidrazina con diferentes
concentraciones de AIA.78
Figura 6.13 Curva patrn de concentraciones AIA con reactivo Salkowsky
(R1m)81
Figura 6.14
diferentes medios82
Figura 6.15 Produccin AIA por A. vinelandii ATCC12518 en medio BT83
Figura 6.16 Curvas crecimiento(Abs540) y produccin de AIA (ug/ml) de
Azotobacter vinelandii en diferentes medios de cultivo85
Figura 6.17 Curvas de produccin de AIA por Azospirillum brasilense en
diferentes medios86
Figura 6.18 Curvas crecimiento (Abs540nm) y produccin de AIA (ug/ml) de
Azospirillum brasilense en diferentes medios.87
Figura 6.19 Produccin de AIA por las cepas del bioinoculante evaluado, y
curva de produccin de AIA por Azotobacter vinelandii ...90
Figura 6.20 Cromatgramas A. vinelandii. ..................................................94
Figura 6.21 Cromatgramas A. brasilense...................................................96
IX
LISTA DE ANEXOS
ANEXO 1
MEDIOS DE CULTIVO..132
ANEXO 2
GRFICAS DE PRODUCCIN AIA133
ANEXO 3
ESTADSTICA BIOENSAYO139
XI
Resumen
Se evaluaron diferentes tcnicas para la deteccin de reguladores de
crecimiento vegetal especficamente, Acido Indol Actico y Giberelinas,
dentro de las cuales se realiz una estandarizacin para el reactivo de
Salkowsky a base de acido sulfrico como tcnica cuantitativa para AIA y
cromatografia de capa fina como tcnica cualitativa, tanto para AIA como
para GA3, buscando los solventes de mejor resolucin y reactivos de mayor
espectro de deteccin. Igualmente se busc la estandarizacin de un
bioensayo que permitiera determinar los efectos especficos de diferentes
tratamientos con reguladores grado reactivo y presentaciones comerciales,
para as poder precisar el efecto de la inoculacin de semillas con caldos
microbianos y establecer la accin de los reguladores de crecimiento vegetal.
Se escogi el reactivo de Salkowsky R1m (H2SO4 7,9M FeCl3 40mM,
proporcin muestra reactivo 1:2), el cual mostr caractersticas muy similares
a las observadas con Salkowsky-HClO4 para la determinacin de AIA.
Para la tcnica de cromatografa de capa fina se logr la estandarizacin de
la fase mvil cloroformo: etilacetato : acido actico (50:30:20) con la cual se
obtuvo buena resolucin de AIA, IBA y GA3, ya que no se reportan solventes
que determinen los tres tipos de reguladores al mismo tiempo. El revelador
(H2SO4 60% - FeCl3 28mM) tambin permiti la deteccin de los tres
reguladores.
Igualmente a partir de cultivos microbianos montados para evaluar su
capacidad como promotores de crecimiento vegetal por produccin de
reguladores con las tcnicas previamente estandarizadas, se logr la
implementacin de un medio de cultivo sencillo y econmico (BT) que
Abstract
Different techniques for plant growth regulators detection, specifically indol
acetic acid and gibberellins, were evaluated. A standardization for AIA
quantitative colorimetric detection was performed, using a new Salkowsky
reagent formulation with sulfuric acid. As qualitative technique for AIA and
GA3 detection, TLC was evaluated, looking for solvent systems with better
resolution and spray reagens with a wider detection spectrum. A bioassay
was proved, to determine the specific effects of different plant growth
regulators (reactive and commercial grade), in order to set microbial broths
treatment effects and to establish the plant growth regulators effect.
Salkowsky R1m reactive (H2SO4 7,9M FeCl3 40mM, sample reactive
proportion 1:2) was chosen, it showed the most similar activity compared with
Salkowsky-HClO4 for AIA determination.
For TLC standardization, the solvent system chloroform : ethyl acetate :
acetic acid (50:30:20) proved a proper AIA, IBA y GA3 resolution, knowing
that there are not reports for solvent systems which enable the detection of
the three regulators at the same run. The spray reagent (H2SO4 60% - FeCl3
28mM) allowed the three regulator detection as well.
The microbial cultures evaluated for plant growth promoters detection,
permitted the implementation of a simple and economic culture media (BT),
which induce both growth promoters production and good microbial
development
Finally, a bioassay was performed. This assay let to determine the effect of
different plant growth regulators at three development stages in lettuce
seedlings. Following that, it was possible to associate plant growth regulator
production and effects on seedlings development to lettuce seeds treated
with microbial broths.
1. INTRODUCCIN
no
es
fcil
puesto
que
se
producen
en
bajas
2. MARCO TERICO
actividad
reguladores
dinmica
de
estos
sigue
de
una
regulacin
intrnseca y un movimiento
dentro de la planta (Figura
2.1), establecido en base a
estudios clsicos desde el
sitio
de
transporte
produccin
de
cada
de
estos
suelo
afectando
el
desarrollo de la planta.
regulador
tras
del
varios
crecimiento
aos
de
1988).
Hoy
en
da
es
vegetal
de
tipo
que
10
En
1963
caracterizado
mientras
fue
por
estudiaba
identificado
Frederick
el
Adicto,
compuesto
Abscsico.
11
2.1.3 CITOQUININAS
En 1913 Gottlieb Haberlandt descubri
un compuesto en el floema con la
capacidad
de
estimular
la
divisin
estos
reguladores
de
crecimiento
vegetal
recientemente
12
2006).
2.2 AUXINAS
Charles Darwin, en su libro el Poder de Movimiento en las Plantas, pone de
manifiesto la actividad de una sustancia con capacidad para inducir el
movimiento frente a una fuente de luz en coleoptilos de Phalaris canariensis
(alpiste), la cual posteriormente fue identificada como auxina (Arteca, 1996).
Desde ese entonces han sido ampliamente estudiadas y juegan un papel
central en la regulacin del crecimiento de las races, promueven la
elongacin del tallo e inhiben el crecimiento de brotes laterales manteniendo
la dominancia apical (Salisbury, 1994).
2.2.1 CARACTERSTICAS GENERALES
El nombre auxina se deriva del griego auxein, que significa aumento o
incremento, designando cualquier compuesto constituido por el grupo
auxnico, y a menudo se usa como sinnimo al cido indolactico (AIA).
Qumicamente son llamadas cido 3 -indol actico (Figura 2.5), y son
derivados del triptofano.
13
Derivados del indol como cido indol propinico (IPA), cido indol
butrico (IBA) (Figura 2.6) y el ido 3-indol actico (AIA) (Figura 2.5).
14
15
Acido 2,4,5-triclorofenoxiactico
2,4,5-Triclorofenoxiactico
Acido naftalinactico
16
17
Figura 2.8 Biosntesis de AIA en plantas. Tomado de Taiz & Zeiger, 2006
18
2.3 GIBERELINAS
Las giberelinas (GAs) son reguladores del creciemiento de las plantas
superiores que regulan numerosos aspectos del desarrollo vegetal.
Este grupo de hormonas fue descubierto al azar por fitopatlogos japoneses
que estudiaban en el arroz una enfermedad conocida como Bakane (planta
loca) causada por el hongo Gibberella fujikuroi en el ao de 1809, en donde
se observaba un crecimiento excesivo en los tallos y brotes. Posteriormente
en 1955, se aisl a partir del filtrado segregado por el hongo, el compuesto
19
hongos
como
Gibberella
fujikuroi,
Fusarium
moniliforme,
20
Figura 2.9 Estructura qumica de las giberelinas. Tomado de Life the Science of Biology, 2001.
21
22
Figura 2.10 Rutas de biosntesis de las giberelinas en plantas. Tomado de Martinez & Garca, 2004
23
24
25
26
27
Es conocido que
28
por
nemtodos
protozoos,
actividad
de
bacterifagos,
29
30
et al., 2002).
2.4.2.1.2 Ruta indol 3-Piruvato (IPvA)
La ruta de biosntesis de IAA en bacterias sigue la va del indol 3piruvato
(IPvA), siendo la ms conocida en bacterias, como Bradyrhizobium,
Azospirillum,
Rhizobium,
Azotobacter,
Enterobacter
cloacae,
31
32
AcetilCoA
Acido Mevalnico
Acido Mevalnico Pirofosfato
GIBERELINAS GA3
GA12 aldehdo
Isopentenil Pirofosfato
Dimetilalil Pirofosfato
Geranio Pirofosfato
Farnesil Pirofosfato
Ent- cido Kaurenoico
Geranilgeranil Pirofosfato
Copil Pirofosfato
Ent- Kaurenal
Ent- Kaurenol
Figura 2.12 Ruta de sntesis de giberelinas siguiendo del Acido Mevalnico. Tomado de Davies, 1988
33
en bajas
de
las
tcnicas
espectroscpicas
requeridas
para
su
reguladores
de
crecimiento
vegetal
pueden
ser
producidos
34
el
avance
de
la
tecnologa
se
han
desarrollado
tcnicas
35
reaccin
colorimtrica
base
del
reactivo
Folling-Wu
(cido
36
2.5.2
DETECCIN
FSICO-QUMICA
DE
REGULADORES
DE
CRECIMIENTO VEGETAL
37
preliminar
de
sus
constituyentes
como
deteccin
de
compuestos indeseables.
Los materiales y equipos que utiliza son similares a los utilizados en
cromatografa en papel, pero utiliza sorbentes (fase estacionaria) en donde
se agrupan adsorbentes, intercambiadores de iones y geles de filtracin,
entre ellos se encuentra el gel de slice o cido slico, siendo este el ms
utilizado, el hidrxido de aluminio comnmente llamado almina, Kieselgur o
Tierra de Diatomceas se utiliza en separaciones por reparto de
oligosacridos, celulosa fibrosa o celulosa microcristalina y poliamida entre
otros (Skoog & Leary, 1993).
2.5.2.2 Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)
Es utilizada por su alta eficiencia, resolucin y velocidad de separacin, es
utilizada para separar reguladores vegetales de crecimiento de otros
compuestos presentes en el extracto, al igual que por su capacidad para
separar compuestos o impurezas, en donde puede observarse la alta
resolucin de la tcnica. Puede ser utilizada en bioensayos, aunque hay que
tener en cuenta que aunque puede haber separacin no hay la purificacin
necesaria del compuesto para que pueda ser utilizado directamente en
espectroscopa (Davies, 1988).
2.5.2.3 Cromatografa de gases acoplada a espectroscopia de masas
(GCMS)
Este mtodo es considerado como el mejor para el anlisis de sustancias
asociadas al crecimiento vegetal, debido a su eficacia y a la simplicidad de la
tcnica.
38
39
40
3. JUSTIFICACIN
Las plantas para su desarrollo, no solo realizan procesos fotosintticos o
toman sustancias minerales del suelo, tambin llevan a cabo en su interior
una serie de procesos fisiolgicos que ayudan a dicho desarrollo. De la
misma forma, las plantas tambin se ven afectadas y de cierta manera
reguladas por algunos de los procesos que ocurren en el suelo, la mayora
de los cuales son llevados a cabo por microorganismos, entre los que se
encuentran fijadores de nitrgeno, solubilizadores de fsforo, productores de
hormonas y otros, los cuales son conocidos como PGPRs (rizobacterias
promotoras de crecimiento vegetal).
Para que las plantas puedan llegar a desarrollarse satisfactoriamente, es
necesaria la coordinacin de procesos fisiolgicos como la absorcin de
nutrientes, procesos fotosintticos y procesos externos del suelo y del
ambiente, de los cuales depende su correcto funcionamiento.
Dentro de los procesos fisiolgicos se encuentra incluida la sntesis de
distintas sustancias como reguladores de crecimiento (auxinas, giberelinas,
citocinas, etc.) los cuales son compuestos que actan como reguladores
endgenos del crecimiento y desarrollo en las plantas superiores.
Las auxinas son conocidas como el primer regulador de crecimiento vegetal
estudiado en plantas. Se les identifican como compuestos qumico de alto
potencial en la agricultura. Su accin no solo se limita al fototropismo, es
conocida por su participacin en elongacin celular, dominancia apical,
aparicin de races adventicias, diferenciacin vascular, formacin de frutos y
flores.
41
42
43
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL
Implementar y estandarizar mtodos sencillos de deteccin de auxinas y
giberelinas a partir de cultivos microbianos.
44
5. MATERIALES Y MTODOS
45
Tabla 5.1 Preparaciones del reactivo de Salkowsky a base de mezclas de cido perclrico y cloruro
frrico y cido sulfrico y cloruro frrico.
Concentracin
Reactivo
Perclrico
R1
R2
R3
Volumen de reaccin
AIA
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
Salkowsky
2mL
1 mL
1 mL
1 mL
Referencias
Bric et al, 1990
Glickmann & Dessaux, 1994
Glickmann & Dessaux, 1994
Glickmann & Dessaux, 1994
Tabla 5.2 Preparaciones del reactivo de Salkowsky a base de cido sulfrico con diferentes
modificaciones en cuanto a concentraciones de H2SO4 y FeCl3 y diferentes volmenes de reaccin.
Reactivo
R1m
R1m1
R1m2
R2m
Concentracin
FeCl3
H2SO4
40 mM
7,9 M
40 mM
10,8 M
40 mM
10,8 M
16 mM
10,8 M
Volumen de reaccin
AIA
Salkowsky
1 mL
2mL
1 mL
1 mL
1 mL
2mL
1 mL
2mL
46
5.1.1.2
47
Tabla 5.3. Descripcin de fases mviles utilizadas en la estandarizacin de TLC para deteccin de
reguladores de crecimiento vegetal.
Fase
Mvil
S1
90:5:10
S2
50:30:20
S3
S4
60:40:5
50:40:10
S5
30:55:10
S6
50:30:5
S7
50:30:10
S8
50:30:10
S9
Solvente
Proporciones Referencias
15:5:1
S10
CHCl3 : CH3COOH
95:5
S11
8:1:1
S12
10:1:1
S13
12:3:5
S14
ETER PETROLEO:CH3COOC2H5
60:40
S15
CH2Cl2:CH3COOC2H5 : CH3COOH
90:10:1
S16
ETER PETROLEO:CH3COOC2H5
30:70
Zeevart, 1965
Metzger &
Zeevart, 1980
Torres et al, 2000
Tien et al, 1979
Barazani &
Friedman, 1999
Modificado de
Torres et al, 2000
Modificado de
Torres et al, 2000
Ahmad & Ahmad,
2004
Ross & Bradbeer,
1968
Sweet & Lewis,
1971
Sweet & Lewis,
1971
Strzelczyk et al,
1983
Tien et al, 1979
Contreras et al,
2001
Contreras et al,
2001
Contreras et al,
2001
El revelador utilizado fue H2SO4 60% y FeCl3 28mM, con una composicin
similar al reactivo de Salkowsky, garantizando la deteccin de auxinas (AIA),
y citado en literatura como revelador para giberelinas (Merck, 1980).
La aplicacin del revelador para la estandarizacin se realiz por medio de
inmersin (Figura 5.1) y no por aspersin (Figura 5.2), por la facilidad de
manejo de las placas de tamao (3.5cm x 10cm) y para garantizar el
cubrimiento total del revelador sobre la placa.
48
MIX
GA3
AIA
IBA
49
50
5.2.1.2
preparada
previamente
con
HCl,
2-4
51
52
(cido
naftalen
actico)
(Colinagro
S.A),
reguladores
Las cmaras hmedas fueron montadas con 20 semillas por caja, colocando
5 por cada surco, y acordeones de 4 surcos, con 4 repeticiones por
tratamiento, para un total de 80 semillas por tratamiento (ISTA, 2006). La
inoculacin con el caldo del ultimo dia del cultivo microbiano, los patrones
comerciales de reguladores y los productos comerciales de las semillas fue
realizada previa imbibicin en la solucin de cada tratamiento, GA3
53
54
Indice
Definicin
GC
GRI
R50
R50
PV
MDG
VG
5.4 MICROORGANISMOS
Los microorganismos empleados en el estudio fueron Azospirillum brasilense
cepa ATCC 29145 (control de produccin de GAs) y Azotobacter vinelandii
cepa ATCC 12518 (control de produccin de AIA). El primero obtenido del
laboratorio Asociacin Suelo Planta Microorganismo, de la Pontificia
Universidad Javeriana (PUJ), cepa obtenida del proyecto La silvicultura
como alternativa viable para el aprovechamiento sostenible y la conservacin
de las plantas medicinales de la flora nativa de Colombia financiado por el
convenio Andrs Bello y la PUJ; mientras la cepa de Azotobacter vinelandii
se obtuvo del Laboratorio de Microbiologa Ambiental y Suelos de la PUJ.
Tambin se trabaj con 14 cepas las cuales no fueron identificadas, que
hacen parte de un bioinoculante utilizado como acelerador de compostaje, ,
desarrollado en el Laboratorio de Biotecnologa del Departamento de
Microbiologa de la PUJ, del trabajo: Aislamiento de bacterias termfilas y
55
56
5.5.2
PREPARACIN
DEL
INCULO
DE
LAS
CEPAS
DEL
57
ambiente,
finalmente
se
ley
absorbancia
con
un
58
la
fase
orgnica
se
concentr
(evaporacin)
por
59
60
6. RESULTADOS Y DISCUCION
6.1 ESTANDARIZACIN DE MTODOS DE DETECCIN DE AUXINAS
6.1.1 DETECCIN COLORIMTRICA (REACTIVO DE SALKOWSKY)
Al evaluar las reacciones de los diferentes tipos de reactivos de Salkowsky a
base de cido sulfrico, se observ un comportamiento diferente de los datos
entre los tres reactivos inicialmente evaluados R1, R2 y R3 (Glickmann &
Dessaux, 1995), encontrndose variaciones tanto en sus valores de
pendiente (Figura 6.1), como en el color que presentaron en el momento de
la reaccin (Figura 6.2).
Figura 6.1 Curvas de deteccin AIA con el reactivo de Salkowsky a base a de cido perclrico y cido
sulfrico: a Salkowsky HClO4 (HClO4 3,5 M FeCl3 10mM, 1:2), b Salwosky R1 (H2SO4 7,9 M
FeCl3 40 mM, 1:1), c Salkowsky R2 (H2SO4 10,8 M FeCl3 16 mM, 1:1), d Salkowsky R3 (H2SO4 6,9
M FeCl3 9,2 mM, 1:4); se observan los datos de pendiente y R2 para cada una de las reacciones.
61
b
Curva deteccin AIA - R2
Figura 6.2 Muestras de reaccin de diferentes concentraciones de AIA con los diferentes reactivos de
Salkowsky. a Salkowsky HClO4 (HClO4 3,5 M FeCl3 10mM, 1:2), b Salkowsky R1 (H2SO4 7,9 M
FeCl3 40 mM, 1:1), c Salkowsky R2 (H2SO4 10,8 M FeCl3 16 mM, 1:1), d Salkowsky R3 (H2SO4 6,9
M FeCl3 9,2 mM, 1:4); se observa la escala de color segn las diferentes concentraciones de AIA.
62
Tabla 6.1 Datos de pendiente, R2 y color obtenidos a partir de la reaccin de HClO4, R1, R2 y R3 con
AIA, los asteriscos pertenecen a la gama de color del reactivo a base de acido perclorico el cual cuenta
con 4 asteriscos, buscando una comparacin entre la gama de color con los reactivos evaluados.
Reactivo
HClO4
R1
R2
R3
Pendiente
0,034
0,018
0,014
0,007
R2
0,999
0,994
0,992
0,986
Color
****
****
**
*
63
e
Figura 6.3 Curvas de deteccin de AIA con el reactivo de Salkowsky a base a de cido perclrico y
cido sulfrico: a Salkowsky a base de HClO4 (HClO4 3,5 M FeCl3 10mM, 1:2), b Salwosky R1m
(H2SO4 7,9 M FeCl3 40 mM, 1:2), c Salkowsky R1m1 (H2SO4 10,8 M FeCl3 40 mM, 1:1), d
64
b
Curva deteccin AIA - R1m1
d
Curva deteccin AIA R2m
(H2SO4 10.8M - FeCl3 16mM, 1:2)
e
Salkowsky R1m2 (H2SO4 10,8 M FeCl3 40 mM, 1:2), e Salkowsky R2m (H2SO4 10,8 M FeCl3 16
mM, 1:2); se observan los datos de pendiente y R2 para cada una de las reacciones.
Figura 6.4 Muestras de reaccin de diferentes concentraciones de AIA con los diferentes reactivos de
Salkowsky. a Salkowsky a base de HClO4 (HClO4 3,5 M FeCl3 10mM, 1:2), b Salwosky R1m (H2SO4 7,9 M
FeCl3 40 mM, 1:2), c Salkowsky R1m1(H2SO4 10,8 M FeCl3 40 mM, 1:1), d Salkowsky R1m2 (H2SO4
10,8 M FeCl3 40 mM, 1:2), e Salkowsky R2m (H2SO4 10,8 M FeCl3 16 mM, 1:2); se observa la escala de
color segn las diferentes concentraciones de AIA.
65
Al obtener los datos de las reacciones del patrn de AIA con los reactivos R1m,
R1m1, R1m2 y R2m (Tabla 6.2) y los diferentes patrones de color (Figura 6.4)
observados en el momento de la reaccin, en comparacin con los datos iniciales
de la reaccin de AIA con Salkowsky preparado con HClO4 y de acuerdo a las
pendientes de las grficas y la escala de color que presento la reaccin se decidi
trabajar con el reactivo R1m, el cual presenta mayor sensibilidad y color de
reaccin con el reactivo a base de cido perclrico. El reactivo R1m1 presenta
mayor sensibilidad que el R1m, pero la reaccin muestra una tonalidad diferente a
la reaccin con Salkowsky-HClO4.
Tabla 6.2 Datos de pendiente y R2 obtenidos a partir de la reaccin de R1m, R1m1, R1m2 y R2m con AIA.
los asteriscos pertenecen a la gama de color del reactivo a base de acido perclorico el cual cuenta con 4
asteriscos, buscando una comparacin entre la gama de color con los reactivos evaluados.
Reactivo
HClO4
R1m
R1m1
R1m2
R2m
Pendiente
0,034
0,024
0,032
0,01
0,009
R2
0,999
0,973
0,964
0,963
0,994
Color
****
****
***
*
**
67
para cada reactivo, se corri una reaccin con solucin de AIA en dos
concentraciones (10ug/ml y 30ug/ml), y el espectro se determin en rango de luz
visible (400nm 700nm) (Figura 6.5 y 6.6). Los picos de mxima absorcin estn
entre 528nm y 534 nm. La longitud de absorbancia mxima de la reaccin con
Salkowsky-HClO4 fue de 528 nm, lo cual se ajusta a la literatura donde se
recomienda la lectura a 530 nm (Salkowsky, 1889); de la misma forma ocurre con
el reactivo R1m donde la diferencia no excede los 0.5 nm, con lo que se puede
determinar la lectura a 530 nm (Tabla 6.3) (Bric et al, 1991; Glickmann & Dessaux,
1995). En caso de que la longitud de onda de mxima absorcin tenga un cambio
mayor de 10nm, se podra modificar la lectura de la prueba a la longitud del onda
de pico de absorcin para aumentar la sensibilidad de la prueba. En el caso del
reactivo R1m no es necesario hacer esta modificacin.
Tabla 6.3 Valores de mxima absorcin en el espectro absorbancia de 400 700nm de las reacciones con
las diferentes formulaciones del reactivo de Salkowsky.
(nm)
10
30
REACTIVO ug/ml
ug/ml
Perclrico 528,50 528,50
529,50 529,50
R1
531,00 530,50
R2
532,00 532,00
R3
532,50 532,50
R1m
531,00 531,50
R1m1
532,50 533,50
R1m2
533,50 535,00
R2m
68
a.
b.
c.
d.
Figura 6.5 Espectro de absorcin de reacciones con diferentes formulaciones de reactivo de Salkowsky (AIA
30ug/m). a. HClO4, b. H2SO4 R1, c. H2SO4 R2 d. H2SO4 R3.
69
b.
a.
d.
c.
e.
Figura 6.6 Espectro de absorcin de reacciones con formulaciones de reactivo de Salkowsky modificadas
(AIA 30ug/m). a. HClO4, b. H2SO4 R1m, c. H2SO4 R1m1, d. H2SO4 R1m2, e. H2SO4 R1m2
70
71
Tabla 6.4 Movilidad cromatogrfica (Rf) de reguladores de crecimiento (GA3, AIA, IBA) en las fases
mviles evaluadas (los reguladores con prefijo m indican el carril del cromatograma en el que se sirvi
la mezcla de los tres reguladores, mix).
FRENTE DE CORRIDA (PROMEDIO 4,5 cm)
mGA3
mAIA
S1
0,00
S2
0,31
S3
S4
mIBA
GA3
AIA
IBA
mGA3
mAIA
mIBA
GA3
AIA
IBA
0,56
0,63
0,00
0,60
0,75
0,88
0,28
0,83
0,68
0,00
0,88
0,28
0,60
0,68
0,00
0,59
0,67
0,83
0,88
0,28
0,83
0,91
0,00
0,63
0,75
0,00
0,00
0,67
0,77
0,00
0,65
0,78
0,65
0,76
0,06
0,68
0,78
0,07
0,68
0,78
0,05
0,72
0,82
0,05
0,71
0,81
S5
0,00
0,85
0,90
0,36
0,86
0,90
0,39
0,89
0,93
0,39
0,89
0,93
S6
0,03
0,71
0,81
0,04
0,72
0,83
0,00
0,70
0,81
0,00
0,71
0,80
S7
0,07
0,78
0,87
0,07
0,78
0,87
0,00
0,76
0,84
0,00
0,76
0,84
S8
0,00
0,67
0,82
0,03
0,67
0,83
0,06
0,68
0,77
0,06
0,66
0,80
S9
0,00
0,53
0,64
0,00
0,53
0,60
0,00
0,54
0,64
0,00
0,54
0,54
S10
0,00
0,33
0,53
0,00
0,36
0,53
0,00
0,38
0,60
0,00
0,33
0,58
S11
0,04
0,37
0,50
0,04
0,42
0,59
0,09
0,50
0,61
0,09
0,44
0,59
S12
0,00
0,29
0,40
0,00
0,29
0,41
0,00
0,29
0,42
0,00
0,29
0,40
S13
0,76
0,00
0,93
0,73
0,90
0,91
0,78
0,86
0,92
0,78
0,90
0,92
S14
0,00
0,10
0,19
0,00
0,14
0,25
0,00
0,17
0,25
0,04
0,17
0,34
S15
0,00
0,31
0,44
0,00
0,31
0,50
0,00
0,35
0,48
0,00
0,35
0,40
S16
0,00
0,50
0,63
0,04
0,54
0,65
0,00
0,46
0,63
0,00
0,46
0,65
La fase mvil S13 fue el mejor sistema de solvente para la movilidad de GA3
evidenciado por el mayor Rf de GA3 de las 16 fases mviles (Tabla 6.5), con
una fluorescencia clara. Sin embargo las bandas de AIA e IBA no presentan
buena resolucin, presentndose como manchas; mientras que en el carril
del Mix se observa un enmascaramiento AIA por IBA, observndose solo una
mancha amarilla con un borde fucsia caracterstico del AIA (Figura 6.8 a). El
sistema de solvente S5 presenta el segundo Rf de GA3 ms alto de las 16
fases mviles evaluadas, lo que lo hace un excelente solvente para GA3
(Tabla 6.5); sin embargo, aunque AIA e IBA se observan con buena
resolucin, este sistema tambin resuelve otras bandas en el cromatgramas
(Figura 6.8 b).
La fase mvil S2, compuesta por cloroformo: acetato de etilo: cido actico
(50:30:20), present un Rf para GA3 de 0.28, el cual es menor comparado
72
con S5 y S13 (Tabla 6.5), y excelente resolucin entre las bandas de AIA e
IBA, en los dos frentes de corrida evaluados (Figura 6.8 c y d).
Los valores de Rf y la resolucin entre las bandas de AIA e IBA (Figura 6.9)
obtenidos a partir de los cromatgramas sugieren a la fase mvil S2, como el
solvente adecuado para la deteccin de los tres reguladores de crecimiento
vegetal (AIA, IBA y GA3).
Tabla 6.5 Mejores valores de movilidad cromatogrfica (Rf) Rf de las fases mviles para la deteccin
de AIA, IBA y GA3 (los reguladores con prefijo m indican el carril del cromatograma en el que se sirvi
la mezcla de los tres reguladores, mix).
FRENTE DE CORRIDA (PROMEDIO 4,5 cm)
mGA3
mAIA
mIBA
GA3
AIA
IBA
mGA3
mAIA
mIBA
GA3
AIA
IBA
S2
0,31
0,75
0,88
0,28
0,83
0,88
0,28
0,83
0,88
0,28
0,83
0,91
S5
0,00
0,85
0,90
0,36
0,86
0,90
0,39
0,89
0,93
0,39
0,89
0,93
S13
0,76
0,00
0,93
0,73
0,90
0,91
0,78
0,86
0,92
0,78
0,90
0,92
73
IBA
IBA
AI
GA3
AIA
GA3
AIA IBA
MIX
GA3
AIA IBA
IBA
IBA
AIA
AIA
GA3
GA3
c. Cromatograma S2
Frente de corrida 4 cm
6cm
MIX
GA3
AIA IBA
MIX
GA3
AIA IBA
d. Cromatograma S2
Frente de corrida
4 cm
6cm
FIGURA 6.7 a. Cromatograma fase mvil S13, luz visible y UV, frente de corrida 4cm, b.Cromatograma
fase mvil S5, luz visible y UV, frente de corrida 4cm, c. Cromatograma fase mvil S2, luz visible frente
de corrida 4cm y 6cm, d. Cromatograma fase mvil S2, luz UV, frente de corrida 4cm y 6cm.
74
del
revelador (Reyes et al., 1991), lo cual fue observado bajo luz ultravioleta,
observndose una fluorescencia azul intensa en los cromatogramas (Figura
6.7), tanto en la mezcla de reguladores como en el patrn de GA3.
6.2.3 LIMITES DE DETECCIN DE REGULADORES DE CRECIMIENTO
VEGETAL EN TLC (AIA, IBA, GA3)
Para establecer el lmite de deteccin de la tcnica se realiz una curva de
deteccin de reguladores AIA, IBA, GA3 con el patrn de cada regulador a
diferente concentracin (Figura 6.8) estableciendo el limiete de deteccipon a
partir de el rango de produccin de AIA, GA3 en microorganismos,
produccin de AIA (0.05ug/ml), y GA3 (0.05 ug/ml). (Torres et al, 2000, Tien
et al, 1979). Se establecio el limiete de deteccin de la tenica como de 0.5ug/
ml para AIA, IBA y GA3.
0.01ug
0.05ug
0.1ug
0.5ug
1ug
5ug
10ug
GA3
AIA
IBA
0.01ug
0.05ug
0.1ug
0.5ug
1ug
5ug
10ug
GA3
AIA
IBA
Figura 6.8 Lmite de deteccin de reguladores de crecimiento vegetal (AIA, IBA y GA3) en TLC. Panel
superior cromatograma luz visible y panel inferior cromatoigrama en UV.
75
6.3
ESTANDARIZACIN
DE
MTODOS
DE
DETECCIN
DE
GIBERELINAS
6.3.1 DETECCION COLORIMETRICA
76
GA3: AIA
100ug/ml
Figura 6.10. Reaccin de cido fosfomolbdico con una mezcla de AIA y GA3. (1:1).
deteccin
colorimetrca
de
giberelinas
con
el
reactivo
2,4
77
Figura 6.11 Reaccin del reactivo 2-4 dinitrofenilhidrazina con diferente concentraciones de GA3
Figura 6.12 Reaccin del reactivo 2-4 dinitrofenilhidrazina con diferentes concentraciones de AIA.
78
79
80
6.4
DETECCIN
DE
CIDO
INDOL
ACTICO
EN
CULTIVOS
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
y = 0,023x + 0,019
R = 0,994
0,3
0,2
0,1
0
0
10
15
20
25
30
35
40
45
Figura 6.13 Curva patrn de concentraciones AIA con reactivo Salkowsky (R1m)
81
80
80
70
60
50
40
30
20
10
0
70
60
50
40
30
20
10
0
Tiempo (Dias)
a.
Tiempo (Dias)
b.
Figura 6.14 Curvas de produccin de AIA por Azotobacter vinelandii a. Produccin de AIA en medio BT, b.
Produccin de AIA en medio TSB (Montaje 2).
82
A. vinelandii fue establecido como el control positivo para la produccin de AIA por
la buena produccin de AIA detectada en el segundo montaje y su tendencia de
produccin en aumento lineal. Al comparar su produccin en los medios de cultivo
TSB y BT se observ un comportamiento similar en cuanto a la produccin de AIA
(Figura 6.14). Esta cepa de A. vinelandii tambin fue utilizada como control
positivo de produccin de AIA en medio BT por Duque & Quintana (2008). La cepa
present un comportamiento lineal tendiente al aumento en la produccin de AIA
hasta el da 8 de cultivo (Figura 6.15). En cuanto a concentracin de AIA por da
de cultivo, los valores fueron similares a los obtenidos en el segundo y tercer
montaje.
Los
resultados
de
Duque
&
Quintana
(2008)
corroboran
el
120,00
100,00
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
-20,00 0
10
12
14
16
-40,00
Tiempo (das)
Figura 6.15 Produccin AIA por A. vinelandii ATCC12518 en medio BT (Duque & Quintana, 2008)
84
cuales regulan la toma de nutrientes en las clulas (Brock et al, 2001), la tripticasa
es una fuente de triptfano, que estimula la produccin de AIA lo que determinara
su comportamiento (Asghar et al., 2002; Karadeniz et al., 2006). As mismo, el
medio BT es un medio apropiado para la produccin de biomasa, aunque es un
medio sencillo de sales bsicas y glucosa (Anexo1). Entre sus componentes se
encuentra NH4NO3 y triptona (digerido pancretico de casena) que adems de ser
fuente de triptfano sirve de fuente de nitrgeno orgnico y Ca, promoviendo un
mejor crecimiento (Brock et al, 2001). La glucosa, fuente de carbono, es
8
6
4
2
0
0
AIA ug/ ml
4
5
Tiempo (Dias)
80
Concentracin AIA ug/ ml
10
80
70
60
50
40
30
20
10
0
60
50
40
30
20
10
1
0
0
0
3
4
Tiempo (Dias)
AIA ug/ml
b.
8
7
6
5
4
3
2
1
a.
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
70
0
0
2
AIA ug/ml
Tiempo (Dias)
Crecimiento en unidades de Abs
c.
Figura 6.16 Curvas crecimiento (Abs540) y produccin de AIA (ug/ml) de Azotobacter vinelandii. a. Cultivo en
medio TSB, b. Cultivo en medio BT, c. Cultivo en medio B.
85
Tabla 6.6 Cuadro de comparacin de da de mayor produccin de AIA por Azotobacter vinelandii en medios
TSB y BT (los valores indican la diferencia de produccin de AIA da a da)
TSB
BT
0,152
0,000
2,513
0,042
0,000
0,000
0,181
3,078
3,212
0,647
0,000
10,659
2,745
4,570
8,495
0,944
10,363
8,091
0,233
17,070
7,890
1,446
17,527
14,570
0,343
15,067
9,503
0,527
24,933
17,715
1,887
14,113
3,481
2,463
6,371
-4,449
2,218
11,882
-6,089
-0,012
11,210
-3,938
86
4
3
2
1
0
0
4
3
2
1
0
0
Tiempo (Dias)
a.
Tiempo (Dias)
b.
Figura 6.17 Curvas de produccin de AIA por Azospirillum brasilense a. Produccin de AIA en medio BT, b.
Produccin de AIA en medio TSB (Montaje 2)
87
50
40
30
20
10
0
0
2
AIA ug/ml
a.
60
70
3
4
Tiempo (Dias)
70
60
50
40
30
20
10
1
0
0
0
AIA ug/ ml
3
4
Tiempo (Dias)
b.
Figura 6.18 Curvas crecimiento (Abs540) y produccin de AIA (ug/ml) de Azospirillum brasilense.
a. Cultivo en medio TSB, b. Cultivo en medio BT.
88
Tabla 6.7 Cuadro de comparacin de da de mayor produccin de AIA por Azospirillum brasilense en
medios TSB y BT (los valores indican la diferencia de produccin de AIA da a da).
TSB
BT
0,000
0,000
0,000
0,000
0,211
2,339
0,153
0,000
0,600
0,108
0,342
0,000
0,441
1,142
0,792
2,298
0,429
-0,188
1,355
0,927
1,238
0,995
0,239
2,500
0,453
2,608
-1,060
0,699
89
69,00
59,00
49,00
39,00
29,00
19,00
9,00
-1,00
0
Tiempo (Dias)
Azotobacter vinelandii
Cepa 5
Cepa 10
Cepa 1
Cepa 6
Cepa 11
Cepa 2
Cepa 7
Cepa 12
Cepa 3
Cepa 8
Cepa 13
Cepa 4
Cepa 9
Cepa 14
Figura 6.19 Produccin de AIA por las 14 cepas del bioinoculante evaluado, y curva de produccin de
AIA por Azotobacter vinelandii control positivo.
La produccin de AIA por parte de las cepas (Tabla 6.8), no sobrepas los
47ug/ml. La produccin de AIA fue buena en el medio de cultivo BT al igual
que la produccin de biomasa, lo que no se observ en medio B, por la
carencia de triptona en el medio, con lo que se puede concluir las rutas de
biosntesis de AIA, tanto en las bacterias y los actinomicetos del
bioinoculante, es dependiente triptfano (Strzeclczyk et al, 1984).
Las cepas 1, 2, 3 y 9 fueron las cepas con mayor productividad de AIA,
mientras que las cepas 5, 6, 7, 10, 11, 12 y 14 fueron las de menor
produccin de AIA, al no superar los 4ug/ml de produccin de AIA (Figura
6.19 y Tabla 6.8).
90
Tabla 6.8 Valores de mxima produccin de AIA por las cepas bioinoculante
MXIMA
DIA MXIMA
PRODUCCIN
PRODUCCIN
CEPA
DE AIA (ug/ml)
DE AIA (ug/ml)
30
47
41
25
0,25
20
40
10
11
12
13
16
14
0,89
91
92
0
1
2
3
4
5
6
0,000
0,000
10,363
17,527
24,933
6,371
11,210
0,000
0,986
1,306
16,028
11,431
0,792
-2,194
0,000
15,486
32,222
-23,083
7,264
-27,833
-2,472
0,000
7,542
33,681
-18,028
10,278
-30,333
-1,861
0,000
0,431
1,861
9,861
13,028
-0,194
-1,778
0,000
1,058
0,391
1,594
0,855
0,768
-0,159
0,000
0,768
0,681
0,580
-0,072
0,101
0,377
0,000
0,000
0,000
0,007
0,135
0,036
0,071
0,000
1,694
2,222
7,681
2,986
2,556
3,153
0,000 0,000
5,181 2,722
34,917 0,792
-16,500 4,361
-14,097 0,750
-7,556 2,403
-0,194 -1,236
Da de Azotobacter
Cepa 1 Cepa 2 Cepa 3 Cepa 4 Cepa 5 Cepa 6 Cepa 7 Cepa 8 Cepa 9 Cepa 10 Cepa 11 Cepa 12 Cepa 13 Cepa 14
cultivo vinelandii
Tabla 6.9 Cuadro de comparacin de da de mayor produccin de AIA por las 14 cepas del bioinoculante evaluado y A. vinelandii
0
1
2
3
4
5
6
MIX
AZOTOBACTER VINELANDII
R1
R2
AIA IBA GA3 AIA IBA GA3
R3
AIA IBA GA3
0,00
0,75
0,75
0,77
0,75
0,75
0,77
0,77
0,00
0,92
0,92
0,92
0,92
0,92
0,92
0,92
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,86
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,25
0,00
0,74
0,75
0,75
0,75
0,75
0,75
0,75
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,82
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,26
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,95
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,37
93
6 MIX
6 MIX
6 MIX
6 MIX
6 MIX
6 MIX
94
Da de
cultivo
0
1
2
3
4
5
6
MIX
AZOSPIRILLUM BRASILENSE
R1
R2
AIA IBA GA3 AIA IBA GA3
R3
AIA IBA GA3
0,00 0,00
0,00
0,88 0,00
0,00
0,89 0,00
0,00
0,89 0,00
0,00
0,89 0,00
0,00
0,89 0,00
0,00
0,89 0,00
0,00
0,89 0,92
0,37
95
6 MIX
6 MIX
6 MIX
6 MIX
6 MIX
6 MIX
f
Figura 6.21 Cromatgramas A. brasilense. R1 a luz visible b fluorescencia, R2 c luz visible
d fluorescencia, R3 e luz visible fluorescencia
96
97
0
1
2
3
4
5
6
MIX
0
1
2
3
4
5
6
MIX
0
1
2
3
4
5
6
MIX
0
1
2
3
4
5
6
MIX
0
1
2
3
4
5
6
MIX
CEPA 1
AIA
IBA
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,92
0,95
CEPA 4
0,00
0,00
0,00
0,00
0,69
0,00
0,69
0,00
0,69
0,00
0,69
0,00
0,69
0,00
0,69
0,74
CEPA 7
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,83
0,35
CEPA 10
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,83
0,88
CEPA 13
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,85
0,38
GA3
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,37
0,00
0,00
0,00
0,00
0,31
0,31
0,31
0,31
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,88
0,00
0,37
0,37
0,37
0,00
0,00
0,00
0,37
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,38
CEPA 2
AIA
IBA
GA3
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,82
0,00
0,00
0,82
0,00
0,00
0,82
0,00
0,00
0,82
0,00
0,00
0,82
0,00
0,00
0,82
0,86
0,31
CEPA 5
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,32
0,00
0,00
0,32
0,00
0,00
0,32
0,00
0,00
0,32
0,77
0,00
0,32
0,77
0,00
0,32
0,77
0,83
0,32
CEPA 8
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,86
0,89
0,38
CEPA 11
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,43
0,00
0,00
0,43
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,85
0,89
0,43
CEPA 14
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,82
0,31
0,31
CEPA 3
AIA
IBA
GA3
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,92
0,94
0,38
CEPA 6
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,89
0,94
0,40
CEPA 9
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,92
0,00
0,00
0,92
0,00
0,00
0,92
0,00
0,00
0,92
0,95
0,40
CEPA 12
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,40
0,00
0,00
0,40
0,00
0,00
0,40
0,00
0,00
0,40
0,83
0,40
0,40
98
A. CEPA 1
CEPA 1
6 MIX
0
6 MIX
C. CEPA 3
6 MIX
6 MIX
6 MIX
CEPA 2
B. CEPA 2
CEPA 3
6 MIX
Figura 6.22 Cromatgramas luz visible y ultravioleta Cepas Bioinoculante A. Cepa 1, B. Cepa 2, C,
cepa 3.
99
D. CEPA 4
CEPA 4
6 MIX
E. CEPA 5
6 MIX
CEPA 5
6 MIX
MIX
MIX
CEPA 6
F. CEPA 6
6 MIX
Figura 6.22 Cromatgramas luz visible y ultravioleta Cepas Bioinoculante D Cepa 4, E Cepa 5,
F Cepa 6
100
G. CEPA 7
CEPA 7
6 MIX
6 MIX
4 5
6 MIX
6 MIX
CEPA 9
I. CEPA 9
CEPA 8
H. CEPA 8
MIX
6 MIX
101
CEPA 10
J. CEPA 10
6 MIX
K. CEPA 11
6 MIX
6 MIX
6 MIX
CEPA 11
6 MIX
L. CEPA 12
CEPA 12
6 MIX
102
M. CEPA 13
CEPA 13
6 MIX
N .CEPA 14
6 MIX
6 MIX
CEPA 14
6 MIX
.Figura 6.22 Cromatgramas luz visible y ultravioleta Cepas Bioinoculante G. Cepa 7, H. Cepa 8,
I. Cepa 9, J Cepa 10, K Cepa 11, L Cepa 12, M Cepa 13, N Cepa 14
103
104
105
1a
3a
3b
1b
3c
3d
106
vs.
H 1 : ( ij ) 0 , donde
107
Pr > F
Montaje 1 Montaje 2
Estadstico
Wilks' Lambda
0.9988
0.4183
Pillai's Trace
0.9982
0.8604
Hotelling-Lawley Trace
0.9999
Roy's Greatest Root
0.1657
0.128
Montaje 3
0.7462
0.7016
0.7539
0.2275
Montaje 1
Montaje 2
Montaje 3
Indice Estadio 1 Estadio 2 Estadio 3 Estadio 1 Estadio 2 Estadio 3 Estadio 1 Estadio 2 Estadio 3
NDS
NDS
NDS
0.4935
0.1378
0.1378
0.7103
0.7103
0.5385
GC
NDS
NDS
NDS
0.4935
0.4244
0.2057
0.9096
0.7103
0.5006
GRI
0.0131
0.0302
0.0038
<.0001
0.0044
<.0001
<.0001
<.0001
R50 0.0091
0.0131
0.0302
0.0038
<.0001
0.0044
<.0001
<.0001
<.0001
R50 0.0091
0.0007
0.0105
0.0336
0.4866
<.0001
<.0001
0.0040
<.0001
0.0031
PV
0.0864
0.0028
0.3419
0.0008
0.0246
0.0314
0.0035
0.0197
MDG 0.0183
0.0037
0.0729
0.0075
0.0530
0.0002
<.0001
0.0190
0.0010
0.0071
VG
108
109
110
111
Segn los datos del montaje de las cepas y comparando con los datos
obtenidos a partir del anlisis de los montajes 1 y 2, se podra decir que para
el estado 1, las cepas 6, 10 y 13 (Tabla6.18) fueron los mejores
tratamientos, ya que presentaron los valores ms altos para los datos
significativos de los ndices; se podra atribuir a estas cepas un efecto de
GA3. En el estado 2, los mejores tratamientos fueron la cepa 12 y 13,
posiblemente por la produccin de auxinas y/o GA3. Finalmente para el
estado 3, los mejores tratamientos agrupados en la mayora de los ndices
fueron las cepas 10, 7 y A. vinelandii, posiblemente por la produccin de
auxinas y/o GA3.
Los microorganismos como de promotores de crecimiento vegetal tienen la
capacidad de sintetizar diferentes reguladores de crecimiento vegetal como
auxinas,
giberelinas
citoquininas,
entre
otras.
Estos
metabolitos
112
113
GC
Trat
Cepa 13
A, vinelandii
Cepa 9
Cepa 2
Cepa 6
A, brasilense
Cepa 3
BT
Cepa 5
Cepa 8
Agua
Cepa 14
Cepa 7
Cepa 4
Cepa 1
Cepa 12
Cepa 10
Cepa 11
R50
R50
PV
Duncan
C
C
C
C
C
C
C B
C B
C B
C B
C B
C B
C B
C B
C B
C B
B
A
Trat
Cepa 6
Cepa 5
Cepa 12
Cepa 7
Cepa 10
Cepa 8
Cepa 9
Cepa 11
Cepa 13
Cepa 1
Cepa 14
Cepa 4
Cepa 2
Cepa 3
A, vinelandii
Agua
BT
A, brasilense
Media
48.000
48.000
48.000
48.000
48.000
48.000
51.000
51.000
51.000
51.000
54.000
57.000
57.000
57.000
57.000
57.000
60.000
72.000
R50
R50
PV
MDG
MDG
VG
VG
Duncan
C
C
C
C
C
C
C B
C B
C B
C B
C B
C B
C B
C B
C B
C B
B
A
Trat
Cepa 6
Cepa 10
Cepa 13
Cepa 12
Cepa 8
Cepa 5
Cepa 7
Cepa 14
Cepa 1
Cepa 11
Cepa 9
A, vinelandii
Cepa 4
Cepa 3
Agua
Cepa 2
A, brasilense
BT
PV
Media
0,3031 A
0,3021 A
0,296 B
0,2958 B
0,2917 B
0,2833 B
0,2802 B
0,275 B
0,2604 E
0,2576 E
0,2549 E
0,2498 E
0,2484 E
0,2465 E
0,2396 E
0,2369 E
0,2263 E
0,2173 E
A
A
A C
A C
D A C
D A C
B D A C
B D A C
B D A C
B D A C
B D A C
B D A C
B D C
D C
D
Duncan
Trat
Cepa 13
Cepa 10
A, vinelandii
Cepa 8
Cepa 12
Cepa 3
Cepa 9
Cepa 14
Cepa 1
Cepa 7
Cepa 5
A, brasilense
Cepa 6
Agua
Cepa 2
BT
Cepa 4
Cepa 11
MDG
Duncan
Media
0,26897 A
0,23785 B A
0,23479 B A
0,23016 B A C
0,22569 B A C
0,22437 B A C
0,22321 B A C
0,22109 B A C
0,21759 B A C
0,21693 B A C
0,21181 B A C
0,20738 B C
0,2042 B C
0,18866 B C
0,18519 B C
0,18287 B C
0,18056 B C
0,17593 C
Trat
Cepa 13
Cepa 10
Cepa 12
Cepa 8
Cepa 6
Cepa 7
Cepa 14
Cepa 5
Cepa 1
A, vinelandii
Cepa 9
Cepa 3
A, brasilense
Cepa 11
Agua
Cepa 4
Cepa 2
BT
Media
0,0802 A
0,0727 B
0,0681 B
0,0675 B
0,0621 B
0,0618 B
0,0611 B
0,0597 B
0,0596 B
0,0594 B
0,0572 B
0,056 B
0,0474 B
0,0452 D
0,045 D
0,0448 D
0,0439 D
0,0397 D
VG
A
A C
A C
D A C
D A C
D A C
D A C
D A C
D A C
D A C
D A C
D C
C
C
C
C
Duncan
Duncan
A
A
AB
AB
AB
B
R50
Tabla 6.15 Tablas de comparacin Duncan para estadio 1; a. Montaje 1, b. Montaje 2 c. Montaje 3
Media
48.000
48.000
48.000
48.000
48.000
48.000
51.000
51.000
51.000
51.000
54.000
57.000
57.000
57.000
57.000
57.000
60.000
72.000
R50
GRI
GRI
GRI
GC
Trat
Media Duncan Trat
100
A
Agua
Agua
A
Gibgro 100
Gibgro
100
A
AIA
AIA
100
A
GA3
GA3
99
AB Hormo
Hormo
B
98
IBA
IBA
GC
Trat
Media Duncan Trat
100 A
Agua
Agua
Gibgro 100 A
Gibgro
Hormo 100 A
Hormo
100 A
AIA
AIA
100 A
IBA
IBA
100 A
GA3
GA3
c.
b.
a.
114
GRI
GC
Trat
Cepa 13
A, vinelandii
Cepa 9
Cepa 2
Cepa 6
A, brasilense
Cepa 3
BT
Cepa 5
Cepa 8
Agua
Cepa 14
Cepa 7
Cepa 4
Cepa 1
Cepa 12
Cepa 10
Cepa 11
Trat
Cepa 12
Cepa 13
Cepa 9
Cepa 10
Cepa 7
Cepa 6
Cepa 1
A. vinelandii
Cepa 8
Cepa 11
Cepa 5
Cepa 4
Cepa 14
Cepa 3
Cepa 2
BT
Agua
A. brasilense
PV
R50
Media
69.000
69.000
69.000
72.000
72.000
75.000
78.000
81.000
84.000
84.000
87.000
90.000
90.000
96.000
99.000
105.000
108.000
123.000
G
G
G
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
B
B
B
B
A
Trat
Cepa 13
Cepa 10
Cepa 12
G
A. vinelandii
G
Cepa 6
G
Cepa 9
G E
Cepa 5
G E D
Cepa 7
G E D
Cepa 11
G E D
Cepa 1
G E D C Cepa 8
B E D C Cepa 14
B E D C Cepa 3
E D C
Cepa 4
D C
Cepa 2
A C
BT
A
Agua
A. brasilense
Duncan
PV
Media
0.21838
0.20432
0.20255
0.19659
0.18816
0.18571
0.18452
0.18403
0.17974
0.17903
0.17731
0.17674
0.16979
0.16944
0.16667
0.14962
0.14815
0.14517
A
B
B
B
B
B
B
B
B
B
F
F
F
F
F
F
F
F
A
A C
D A C
D A C
D
C
D
C
D
C
D E C
D E C
B D E C
B D E C
D E C
D E C
D E
E
E
Duncan
MDG
Trat
A. vinelandii
Cepa 10
Cepa 12
Cepa 13
Cepa 5
Cepa 9
Cepa 14
Cepa 1
Cepa 6
Cepa 8
Cepa 11
Cepa 7
Cepa 2
Cepa 3
Cepa 4
BT
A. brasilense
Agua
MDG
Media
0.19213
0.19077
0.18988
0.18619
0.18244
0.17593
0.17380
0.17176
0.17130
0.16921
0.16736
0.16713
0.16667
0.16458
0.16250
0.14962
0.14347
0.14015
A
A
A
A
A
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
D
D
VG
A
A C
A C
A C
D A C
D A C
D A C
D A C
D A C
D A C
D
C
C
Duncan
Trat
Cepa 13
Cepa 10
Cepa 12
A. vinelandii
Cepa 5
Cepa 9
Cepa 6
Cepa 1
Cepa 7
Cepa 14
Cepa 11
Cepa 8
Cepa 3
Cepa 2
Cepa 4
BT
A. brasilense
Agua
Media
0.041030
0.039711
0.039200
0.038149
0.034658
0.032771
0.032218
0.031063
0.030883
0.030843
0.030312
0.030187
0.027969
0.027778
0.027616
0.022397
0.020912
0.020763
VG
A
A
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
D
D
D
Media
Duncan
0,036661
A
0,034358
A
0,024444
B
0,023928
B
0,022617
B
0,018366
B
VG
Trat
Media
Duncan
Hormo 0,12207 A
Agua
0,09906 B A
GA3
0,08034 B A
Gibgro
0,06991 B A
AIA
0,05669 B
IBA
0,05227 B
Media
Duncan Trat
0,18401
A
GA3
0,18032
A
Hormo
0,15291
B
Agua
0,15253
B
AIA
0,14947
B
IBA
0,13287
B
Gibgro
MDG
Trat
Media
Duncan
Agua
0,31349 A
Hormo 0,30463 B A
GA3
0,27546 B A
Gibgro 0,23333 B A
IBA
0,22194 B A
AIA
0,2133 B
Tabla 6.16 Tablas de comparacin Duncan para estadio2; a. Montaje 1, b. Montaje 2 c. Montaje 3
Duncan
Media Duncan Trat
Media
1,667
A
Cepa 12
69.000 H
1,667
A
Cepa 13
69.000 H
1,667
A
Cepa 9
69.000 H
1,667
A
Cepa 10
72.000 H
G
1,667
A
Cepa 7
72.000 H
G
1,646
A
Cepa 6
75.000 F H
G
1,646
A
Cepa 1
78.000 F H E
G
1,646
A
A. vinelandii 81.000 F H E D
G
1,646
A
Cepa 8
84.000 F H E D
G
1,646
A
Cepa 11
84.000 F H E D
G
1,646
A
Cepa 5
87.000 F H E D C G
1,646
A
Cepa 14
90.000 F B E D C G
1,625
A
Cepa 4
93.000 F B E D C
1,625
A
Cepa 3
96.000 B E D C
1,625
A
Cepa 2
99.000 B
D C
1,625
A
BT
105.000 B
A C
1,625
A
Agua
108.000 B
A
1,583
A
A. brasilense 123.000 A
R50
GRI
GC
PV
Trat
Media
Duncan
Hormo
0,3912 A
Agua
0,31349 B
Gibgro
0,2996 C B
GA3
0,29167 C B
AIA
0,26466 C B
IBA
0,23225 C
R50
R50
R50
Trat
Media Duncan
Hormo 48.000 C
Gibgro 56.000 B C
Agua
60.000 B C
GA3
66.000 B A
AIA
72.000 B A
IBA
80.000 A
R50
Trat
Media Duncan
Hormo 48.000 C
Gibgro 56.000 B C
Agua
60.000 B C
GA3
66.000 B A
AIA
72.000 B A
IBA
80.000 A
Trat
Media Duncan Trat
Media Duncan Trat
Agua
100
A
Hormo 1,667
A
GA3
Gibgro
100
A
Gibgro 1,667
A
Hormo
IBA
100
A
Agua
1,667
A
AIA
GA3
100
A
AIA
1,667
A
IBA
Hormo
99
AB GA3
1,667
A
Agua
AIA
98
B
IBA
1,633
A
Gibgro
GRI
Trat
Media Duncan
Agua
2,333 A
Gibgro
2,333 A
Hormo
2,333 A
AIA
2,333 A
IBA
2,333 A
GA3
2,333 A
GC
Trat
Media Duncan
Agua
100 A
Gibgro
100 A
Hormo
100 A
AIA
100 A
IBA
100 A
GA3
100 A
A
A
A
A C
D A C
D A C
D A C
D A C
D A C
D A C
D
C
D
C
D
C
C
Duncan
c.
b.
a.
115
R50
GRI
R50
Duncan Trat
Media
A
Cepa 10
99 E
A
Cepa 7
102 E
A
Cepa 8
102 E
A
A. vinelandii
105 D
A
Cepa 13
108 D
A
Cepa 9
108 D
A
Cepa 6
108 D
A
Cepa 11
108 D
A
Cepa 12
111 D
A
Cepa 14
114 D
A
Cepa 5
120 D
A
Cepa 1
120 D
A
Cepa 4
123 B
A
BT
132 B
A
Cepa 2
141 B
A
A. brasilense
144 B
A
Cepa 3
147 B
B
Agua
153 A
R50
PV
PV
Media Duncan
0,2691 A
0,229 B A
0,2061 B
0,1977 B
0,1919 B
0,1694 B
PV
Trat
Media
A. vinelandii 0,151 A
Cepa 10
0,1427 B
Cepa 8
0,1373 B
Cepa 13
0,1333 B
Cepa 6
0,1319 B
E
Cepa 7
0,1292 B
E
Cepa 11
0,126 B
E
Cepa 12
0,1243 E
E
Cepa 9
0,1242 E
E
A. brasilense 0,121 E
E
Cepa 5
0,1193 E
E C
Cepa 14
0,1184 E
D E C Cepa 1
0,1183 E
D A C Agua
0,1153 E
A C Cepa 4
0,1115 E
A
Cepa 2
0,1087 E
Cepa 3
0,1004 E
BT
0,097 E
Duncan
MDG
Trat
Hormo
GA3
Gibgro
AIA
IBA
Agua
MDG
Media
0,14205 A
0,12922 B
0,12443 B
0,11971 B
0,11829 B
0,11705 B
0,11502 B
0,11448 B
0,11386 B
0,11375 B
0,11353 B
0,10938 B
0,10882 B
0,10627 B
0,1059 B
0,10313 D
0,09681 D
0,09624 D
VG
VG
Duncan
Trat
Media
A. vinelandii 0,021443 A
A
Cepa 10
0,018506 B A
A C Cepa 8
0,015851 B C
D A C A. brasilense 0,015627 B C
D A C Cepa 9
0,015533 B C D
D
C Cepa 11
0,015126 B C D
D
C Cepa 7
0,015005 B C D
D
C Cepa 13
0,014499 B C D
D
C Cepa 6
0,014429 B C D
D
C Cepa 12
0,01431 B C D
D
C Cepa 14
0,013928 B C D
D
C Cepa 5
0,013927 B C D
D
C Agua
0,013295 B C D
D
C Cepa 1
0,0122 C D
D
C Cepa 4
0,012096 C D
C
Cepa 2
0,011517 C D
Cepa 3
0,009873 C D
BT
0,0094 D
Duncan
Media
Duncan
0.100794
A
0.019810
B
0.019214
B
0.018366
B
0.017525
B
0.015913
B
VG
Trat
Media
Duncan
Hormo 0,061949 A
Gibgro 0,045786 B
0,039128 C B
Agua
0,035482 C B
AIA
0,031987 C B
GA3
0,028221 C
IBA
MDG
Trat
Media Duncan
Hormo 0,22783 A
Gibgro 0,20034 B
0,18946 C B
Agua
0,17949 C B
AIA
0,16667 C
GA3
0,16204 C
IBA
Trat
A. vinelandii
A
Cepa 10
A C
A. brasilense
A C
Cepa 9
A C
Cepa 11
A C
Cepa 14
D A C
Cepa 8
B D A C Agua
B D A C Cepa 5
B D
C Cepa 7
B D
C Cepa 12
B D
C Cepa 6
B D
C Cepa 13
B D
C Cepa 4
D
C Cepa 2
D
C Cepa 1
D
BT
Cepa 3
Duncan
R50
R50
Trat
Media
Cepa 10
99 E
Cepa 7
102 E
Cepa 8
102 E
E
Cepa 11
105 E
E
A. vinelandii
105 E
E
Cepa 13
108 D
E
Cepa 6
108 D
E
Cepa 9
108 D
E
Cepa 12
111 D
E
Cepa 4
114 D
E C
Cepa 14
114 D
E C
Cepa 1
117 D
D E C Cepa 5
120 B
D A C BT
132 B
A C Cepa 2
141 B
A C A. brasilense
144 B
A
Cepa 3
147 A
Agua
153 A
Duncan
Trat
GA3
Hormo
Gibgro
AIA
IBA
Agua
Trat
Hormo
Gibgro
GA3
AIA
IBA
Agua
Tabla 6.17 Tablas de comparacin Duncan para estadio3; a. Montaje 1, b. Montaje 2 c. Montaje 3
GC
GRI
Trat
Media Duncan Trat
Media
Cepa 13
100.000
A Cepa 13
1,667
A. vinelandii 100.000
A A. vinelandii 1,667
Cepa 9
100.000
A Cepa 9
1,667
Cepa 2
100.000
A Cepa 2
1,667
Cepa 6
100.000
A Cepa 6
1,667
A. brasilense 98.750
A A. brasilense 1,646
Cepa 3
98.750
A Cepa 3
1,646
BT
98.750
A BT
1,646
Cepa 5
98.750
A Cepa 8
1,646
Cepa 8
98.750
A Cepa 5
1,646
Agua
98.750
A Cepa 1
1,625
Cepa 12
97.500
A Cepa 10
1,625
Cepa 1
97.500
A Cepa 12
1,625
Cepa 10
97.500
A Cepa 7
1,604
Cepa 7
96.250
A Cepa 4
1,604
Cepa 4
96.250
A Cepa 14
1,604
Cepa 14
96.250
A Cepa 11
1,583
Cepa 11
95.000
A Agua
1,229
GC
Trat
Media Duncan Trat
100
A
Agua
Agua
A
Gibgro 100
Gibgro
100
A
AIA
AIA
100
A
GA3
Hormo
99
AB GA3
Hormo
98
B
IBA
IBA
R50
Trat
Media Duncan
80.000 B
Hormo
88.000 B A
Gibgro
96.000 B A
GA3
104.000 A
AIA
108.000 A
IBA
108.000 A
Agua
GRI
Trat
Media Duncan
2,333 A
Agua
Gibgro 2,333 A
Hormo 2,333 A
2,333 A
AIA
2,333 A
IBA
2,333 A
GA3
GC
Trat
Media Duncan
100 A
Agua
Gibgro 100 A
Hormo 100 A
100 A
AIA
100 A
IBA
100 A
GA3
c.
b.
a.
Tabla 6.18 Resultados de los mejores tratamientos para los montajes 1 y 2 de evaluacin de
reguladores, y montaje 3 de evaluacin de microorganismos.
Tratamiento (Montaje 3)
Cepas 6, 10 y 13
Cepas 12 y 13
Cepas 10, 7 y
Hormonagro, GA3 y control (H2O) Azotobacter vinelandii
116
117
118
119
120
121
7. CONCLUSIONES
brasilense
(ATCC
291459)
caracterizada
como
productora de AIA.
Para la deteccin de AIA, IBA y GA3 por TLC, en una misma corrida
cromatogrfica, se determin como fase mvil cloroformo : etilacetato :
acido actico (50:30:20) y como revelador H2SO4 60% - FeCl3 28mM.
122
123
8. RECOMENDACIONES
AIA,
por
extraccin
lquido-lquido
haciendo
elevado,
permiten
la
deteccin
de
metabolitos
en
concentraciones de ng/mL.
124
probaron
crecer
bien
en
condiciones
de
mesofilia,
125
9. REFERENCIAS
Ahmad F., Ahmad I., Hhan M. S., 2004. Indole Acetic Production of
Azotobacter
126
Cassan F., Bottini R., Schneider G., & Piccoli P. 2001. Azospirillum
brasilense and Azospirillum Lipoferum Hydrolyze Conjugates of GA20
and Metabolize The Resultant Aglycones To GA1 in Seedlings of Rice
Dwart Mutants. Plant Physiology. (125) 2053-2058.
Celis J., Sandoval M., Zagal E., Briones M. 2006. Efecto de la adicin
de biosolidos urbanos y de salmonicultura sobre la germinacin de
semillas de lechuga (Lactuca Sativa L.) en un suelo patagnico. J.Soil
Sc.Plant. Nutr.6 (3)(13-25)
Chiwocha S., Abrams S., Ambrose S., Cutler A., Loewen A., Kermo
A.. 2003. A Method for Profiling Classes of Plant Hormones and their
Metabolites Using Liquid Chromatography Electrospray Ionization
Tandem Mass Spectrometry: An Analisys of Hormone Regulation of
Thermodormancy of Lettuce (Lactuca Sativa L.) Seed. The Plant
Journal (35) 405-417.
127
Davies P.J. 1988. Plant Hormones and their Role in Plant Growth and
Development.
Segunda
Edicin.
Editorial
Kluwer
Academic
Dong Y., Gai Ke. A. 2005. The Application of Gibberellic Acid to the
Determination of Trace Amounts of Lead by Spectrofluorimetry.
Journal of The Chinese Chemical Society (52) 1131-1135.
Dobbelaere S., Vanderleyden J., Okon Y.. 2003. Plant Growth Promoting Effects of Diazotrophs in the Rhizosphere. Critical Reviews
in Plant Sciences (22) 107-149.
Ergun N., Topcuoglu F., Yildiz A.. 2002. Auxin (Indol 3- acetic acid),
Gibberellic acid (GA3), Abscisic Acid (ABA) and Citokynin (Zeatin)
Production by some species of Moses and Lichens. Turk Journal
Botany (26) 13 -18.
128
and
their
Biosynthesis
Under
Salinity
Calcium
Jiang Z., Liu X., Liang A..1997. Rapid Spectrofluorimetric Method for
Traces Of Gibberelin. (346) 249-252.
Jones D.L., Darrah P:R., Kochian L.V. 1994. Amino acid influx at the
soil-root interface of Zea mays L. and its implications in the
rhizosphere. Plant and Soil, 163 (1-12).
Kende H., Zeevaart J. 1997. The Five Classical plant hormones. The
plant cell. Vol 9, 1 197.
129
Loon
L.C.
2007.
Plant
responses
to
plant
growth-promoting
Vinelandh
In
Chemicallydefined
Media
Containing
Piotrowski
M,
Schonfelder
&Weiler
EW
(2001)
The
130
Purves W., Sadova D., Orians G., Heller C.. 2002. Vida La Ciencia De
La Vida. Sexta Edicin. Editorial Medica Panamericana. New York . pp
1133.
Reyes
Candau
J.,
Cerd-Olmedo
E.,
1991.
Gibberelins
and
131
Schnider U., Blumer C., Troxler J., Defago G., Haas D. 1994.
Overproduction of antibiotics 2,4 diacetylphloroglucinol and pyoluteorin
in
Pseudomonas
fluorescence
strain
CHAO.
Improving
Plant
Tanimoto Eiichi. 2005. Regulation of Root Growth by Plant HormonesRoles for Auxin and Gibberellin. Critical Reviews In Plant Sciences
(24) 249-265.
Torres m.,
Acid
and
Siderophores,
from
Colombian
Rice
132
133
ANEXO 1
MEDIO TSB (Caldo tripticasa soya)
COMPOSICION
Glucosa
Peptona de casena
Peptona de soya
NaCl
K2HPO4
g/L
2,5
17
3
5
2,5
MEDIO B
COMPOSICION
Glucosa
K2HPO4
NH4NO3
NaCl
MgSO47H2O
g/L
5
1
0,4
0,2
0,4
MEDIO BT (B MODIFICADO)
COMPOSICION
Glucosa
K2HPO4
NH4NO3
NaCl
MgSO47H2O
Triptona
g/L
5
1
0,4
0,2
0,4
20
134
ANEXO 2
8
7
6
5
4
3
2
1
0
10
5
0
0
-5
TIEMPO (Das)
TIEMPO (Das)
2. Montaje 3
Produccin AIA Azotobacter vinelandii en medio TSB
(Montaje 3)
40
Conce nt racin AIA (ug/ m l)
35
30
25
20
15
10
5
0
0
TIEMPO (Das)
0
0
Tiempo (Dias)
135
Azospirillum brasilense
3. Montaje 1
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) A. brasilense EN MEDIO
TSB
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
5
4
3
2
1
0
TIEMPO (Das)
10
TIEMPO (Das)
Cepas bioinoculante
PRODUCCION DE AIA EN MEDIO BT
4. CEPA 1
(ug/ ml)
CONCENTRACION DEAIA
TIEMPO (Das)
5. CEPA 2
PRODUCCION DE AIA ug/ ml CEPA 2
CONCENTRACION DE AIA
(ug/ ml)
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
0
TIEMPO (Das)
136
6. CEPA 3
CONCENTRACION DEAIA
(ug/ ml)
TIEMPO (Das)
7. CEPA 4
TIEMPO (Das)
8. CEPA 5
PRODUCCION AIA (ug/ ml) CEPA 5
CONCENTRACION DE AIA
(ug/ ml)
6
5
4
3
2
1
0
0
TIEMPO (Das)
137
9. CEPA 6
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 6
CONCENTRACION DE AIA
(ug/ ml)
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
TIEMPO (Das)
10. CEPA 7
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 7
CONCENTRACION DEAIA
(ug/ ml)
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
-0,05 0
TIEMPO (Das)
11. CEPA 8
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 8
CONCENTRACION DEAIA
(ug/ ml)
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
0
TIEMPO (Das)
138
12. CEPA 9
CONCENTRACION DEAIA
(ug/ ml)
TIEMPO (Das)
13. CEPA 10
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 10
CONCENTRACION DEAIA
(ug/ ml)
12,00
10,00
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00
0
TIEMPO (Das)
14. CEPA 11
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 11
CONCENTRACION DE AIA
(ug/ ml)
7
6
5
4
3
2
1
0
0
TIEMPO (Das)
139
15. CEPA 12
CONCENTRACION DE AIA
(ug/ ml)
TIEMPO (Das)
16. CEPA 13
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 13
CONCENTRACION DE AIA
(ug/ ml)
35,00
30,00
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
0
TIEMPO (Das)
17. CEPA 14
PRODUCCION DE AIA (ug/ ml) CEPA 14
CONCENTRACION EN AIA
(ug/ ml)
3,00
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
0
TIEMPO (Das)
140