LABORATORIO MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

PRIMERA PRCTICA
PREPARACION, FIJACION Y COLORACION BACTERIAS
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DEFINICIN
Para observar las bacterias teidas es necesario, en primer lugar, hacer un
frotis de las bacterias y fijarlo.
Para hacer un frotis, cuando se parte de un cultivo de bacterias en medio
lquido, se toma una o varias cargas directamente con el asa y se extienden
sobre el portaobjetos. Si se parte de un cultivo en medio slido, debe
depositarse previamente una gota de agua sobre el portaobjetos. A
continuacin, se toma con el asa una pequea parte de la colonia y se dispersa
en la gota de agua, realizndose la extensin como en el caso anterior.
La fijacin tiene por objeto provocar modificaciones en la composicin fsicoqumica de la bacteria (coagulacin de las protenas, etc.) de forma que sta
conserve definitivamente una estructura similar a la que tena en vivo, sin
deformarse como consecuencia de los tratamientos a que se ver sometida
durante la tincin. Por otra parte la fijacin impide el arrastre de los
microorganismos al quedar estos adheridos al portaobjetos y hace que la pared
celular sea ms permeable a los colorantes.
Para la fijacin pueden utilizarse agentes qumicos (formol, metanol) o el calor.
Empleando el calor, una vez seco, se pasa dos o tres veces sobre la llama, con
la preparacin hacia arriba, para no quemarla. Hay que procurar que el calor
nunca sea excesivo, pues se alteraran las estructuras de la bacteria: en ningn
momento el portaobjetos, colocado sobre el dorso de la mano, debe quemar.
MATERIALES
Portaobjetos.
Mechero Bunsen.
Asa de siembra.
Tubos con cultivos de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas.
Cubetas de tincin o similar.
Colorantes para las tinciones: Cristal violeta, Lugol, Alcohol-Acetona (1:1) y
Fucsina.

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PREPARACION, FIJACION Y COLORACION BACTERIAS
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MTODO
Realizacin del frotis y la fijacin de los diferentes cultivos de
BACTERIAS.
Tinciones:
a) La TINCIN SIMPLE es la tincin en que se utiliza un solo colorante.
Como colorantes utilizaremos el azul de metileno o la fucsina, ambos de
naturaleza bsica.
La tcnica es la siguiente:
1. Hacer el frotis, secarlo y fijarlo.
2. Cubrir con colorante la preparacin y dejarlo actuar durante un minuto.
3. Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de
colorante.
4. Secar al aire y observar al microscopio con el objetivo de inmersin
(100x) empleando el aceite de inmersin sobre la preparacin una vez
este seca.
Esta tcnica permite observar la morfologa y tamao de las bacterias, as
como los tipos de agrupaciones que forman.
b) La TINCIN DE GRAM es la tincin diferencial ms utilizada pues
permite separar las bacterias en dos grandes grupos, las Gram-positivas y
las Gram-negativas. La tincin de Gram requiere cuatro soluciones y el
mtodo de tincin es el siguiente:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Se prepara el frotis, se seca y se fija.

Se cubre con cristal violeta durante un minuto.
Lavar suavemente con agua para eliminar el exceso de colorante.
Se cubre con lugol un minuto. El lugol acta como mordiente
aumentando la afinidad del colorante por la bacteria.
Lavar con agua el exceso de lugol.
Se gotea alcohol-acetona durante 30 segundos y se lava enseguida con
agua abundante.
Se cubre la preparacin con un colorante de contraste, como la fucsina,
durante 15 a 30 segundos.
Se lava con agua y se seca al aire, observndose a continuacin con el
objetivo de 100 x,
empleando el aceite de inmersin sobre la
preparacin una vez este seca.

c)

La TINCION DE ENDOSPORAS permite diferenciar algunos

microorganismos por la presencia de estructuras especficas, la tcnica
es la siguiente:
1. Colocar un trozo de papel filtro sobre el frotis preparado
2. Agregar verde malaquita sobre el papel de manera que cubra toda la
preparacin
3. Colocar el portaobjetos sobre un vaso con agua en ebullicin
4. Dejar cinco minutos evitando que se seque el colorante y eliminar con
agua destilada
5. Cubrir con safranina durante 30 segundos
6. Lavar nuevamente y dejar secar al aire
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Observaciones al microscopio
1. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio
2. Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la
preparacin con el objetivo de 10x, posteriormente pasar al de 40x.
Para observar con el objetivo de 100x colocar previamente una
pequea gota de aceite de inmersin sobre la preparacin
3. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con
el papel adecuado para eliminar el exceso de aceite.

RESULTADOS
Reportar las observaciones de forma, agrupacin, color y tamao relativo
completando el cuadro. Realizar los dibujos de la morfologa de cada uno de
los microorganismos y colorearlos.
10x
TINCION SIMPLE
Descripcin
cultivo:
Forma:
Agrupamiento:

40x

100x

TINCION DE GRAM
Descripcin
cultivo:
Forma:
Agrupamiento:
Reaccin
de
Gram:
TINCION
DE
ENDOSPORAS
Descripcin
cultivo:
Forma:
Agrupamiento: