UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE BIOLOGA
LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

EVALUACIN DE TRES MTODOS IN VITRO PARA LA OBTENCIN

DE BROTES DE AZTEKIUM RITTERII (BOED.).

TESIS

TRABAJO DE EXPERIENCIA RECEPCIONAL

QUE PRESENTA:

Adrin Flix Alvarez

Director de Tesis
Dra. Blanca Lilia Nader Garca

Xalapa, Veracruz, Marzo de 2011

Agradecimientos

Agradezco a la Facultad de Biologa de la Universidad Veracruzana por brindarme todos

los medios para realizar el presente trabajo.

Al Dr. Javier Caballero Nieto, Jefe del Jardn Botnico del Instituto de Biologa de la
UNAM, la atencin de donar al laboratorio de cultivo de tejidos vegetales un individuo y
semillas de Aztekium ritterii para la realizacin de la presente tesis.

Al bilogo Hctor David Jimeno Sevilla por la donacin de un individuo de Aztekium

ritterii.

A la Doctora Blanca Lilia Nader Garca por su ayuda en la realizacin de este trabajo,
como directora de tesis, as como por los consejos brindados.

A los integrantes de mi comit tutorial de la experiencia recepcional Bil. Guillermina

Aguado Lpez y M. en C. Toms Fernando Carmona Valdovinos por el apoyo, tiempo y
consejos que me brindaron para completar este trabajo.

Al bilogo Martn Lpez por resolver todas mis dudas en el laboratorio.

A Evelyn, Ftima, Betty y todos mis compaeros del Laboratorio de Cultivo de Tejidos
Vegetales por hacer tan agradable la estancia en el laboratorio.

Resumen
Aztekium ritterii es una especie endmica del municipio de Rayones en Nuevo Len, Mxico que
se encuentra amenazada segn la NORMA Oficial Mexicana NOM-059-SEMARNAT-2010 y
est registrada dentro del apndice I del CITES debido a la sobre explotacin del recurso para su
venta ilegal en el mercado nacional e internacional. Esta especie no puede reproducirse al ritmo
de la demanda comercial debido a su ciclo de vida largo y de lento crecimiento, por lo tanto, es
necesario idear tcnicas como el cultivo de tejidos vegetales para frenar la prdida de
poblaciones. En este trabajo se compararon los siguientes tres mtodos para la produccin de
brotes de Aztekium ritterii. La germinacin in vitro donde se evalu la influencia del cido
giberlico; la embriognesis somtica indirecta a travs de barridos hormonales de
Bencilaminopurina (BAP), y la elaboracin de microinjertos de A. ritterii utilizando 3 especies
como pie de injerto (Mammillaria haageana, Coryphantha greenwoodii y Ferocactus recurvus).
El mayor porcentaje de germinacin (60%) se dio al lavar las semillas con EXTRAN y
sembrarlas en medio MS sin reguladores; la concentracin de BAP que mejor resultado present
fue de 1.5 mgL-1, mientras que la especie que mejor respondi como pie de injerto para A. ritterii
fue Coryphantha greenwoodii, donde se observ una gran presencia de brotes laterales.
Comparando los resultados para los tres mtodos utilizados observamos que el mejor para la
obtencin de brotes fue el Microinjerto sobre Coryphantha greenwodii con un 440% de
produccin de brotes no hidratados.

ndice
1 Introduccin ............................................................................................. 1
1.2

Descripcin de la especie .............................................................................................................. 3

Antecedentes .......................................................................................... 5
2.1

Germinacin .................................................................................................................................. 5

2.2

Formacin de brotes ...................................................................................................................... 6

2.3

Microinjertos ................................................................................................................................. 8

Objetivo ................................................................................................. 9
4.1

Metas ............................................................................................................................................. 9

Hiptesis ................................................................................................ 9

Materiales y mtodo ............................................................................. 10

5.1
5.1.1

Desinfestacin ......................................................................................................................... 10

5.1.2

Medio de cultivo e inoculacin ............................................................................................... 11

5.1.3

Medicin de plntulas ............................................................................................................. 11

5.2

Induccin de brotes ..................................................................................................................... 11

5.2.1

Medio de cultivo e inoculacin ............................................................................................... 12

5.2.2

Subcultivo................................................................................................................................ 12

5.3
5.3.1

Germinacin ................................................................................................................................ 10

Microinjertos ............................................................................................................................... 12
Medio de cultivo e inoculacin ............................................................................................... 13

Resultados............................................................................................ 13
6.1
6.1.1

Germinacin ................................................................................................................................ 13
Crecimiento de plntulas ......................................................................................................... 14

6.2

Formacin de brotes .................................................................................................................... 16

6.3

Microinjertos ............................................................................................................................... 20

6.4

Comparacin de resultados ......................................................................................................... 22

Discusin.............................................................................................. 23

8 Conclusines ........................................................................................... 25
9

Literatura citada .................................................................................. 26

vi

1 Introduccin
La familia Cactaceae es exclusiva de Amrica (exceptuando dos especies epfitas provenientes de
frica) (Jenkins, 1993), y el 74% de las 550 especies registradas en Mxico son endmicas
(Hernndez, 2006). Sin embargo, las regiones ridas, semiridas y en particular la zona nortecentro del pas posee las concentraciones ms altas de cactceas amenazadas del mundo
(Hernndez y Brcenas 1995, 1996).
Los cactus tienen tasas de crecimiento lentas, ciclos de vida largos y poco reclutamiento (Nobel,
1988), por otro lado, son apreciados como plantas ornamentales por la belleza de sus flores o por
su rareza y se cotizan a buenos precios en el mercado nacional e internacional. Los viveros
especializados en la venta de cactceas son insuficientes para satisfacer las demandas comerciales
por lo que esta situacin ha propiciado la colecta ilegal y el trfico de especies (Santos, 2005).
La extraccin ilegal es el mayor problema que amenaza a la familia, esto causa el deterioro de
numerosas poblaciones (Glass 1998), por lo que 285 especies se han incluido en la NOM-059SEMARNAT-2001 (Semarnat 2002).
En 2004 la Procuradura Federal de Proteccin al Ambiente (PROFEPA) hizo un aseguramiento
de 240 cactceas en el Aeropuerto Internacional de la Ciudad de Mxico y se identificaron
especmenes de Aztekium ritterii, Obregonia denegrii y Ariocarpus spp., que son endmicas de
Mxico y que a pesar de estar protegidas por las leyes mexicanas y la Convencin sobre
Comercio Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres (CITES), haban
sido extrados ilcitamente de su hbitat natural (PROFEPA, 2004).
Aztekium ritterii produce mezcalina, sin embargo, la produce en cantidades muy pequeas como
para provocar algn efecto psicotrpico (Btiz y Rojas-Arechiga, 2002), su verdadero valor
comercial est dado por su calidad ornamental.
Siguiendo estndares de la Unin Internacional para la Conservacin de la Naturaleza, se ha
llegado a la conclusin de que A. ritterii se encuentra amenazada de extincin (Vovides, Luna y

Medina, 1997), adems se encuentra dentro de la categora de amenazada en el listado de la

NOM-059-2001, Anexo Normativo II, Lista de especies en riesgo (SEMARNAT, 2010).
Esta especie se encuentra dentro del Apndice I del CITES, el cual contempla las especies en
peligro de extincin que estn sometidas a comercio internacional, el cual est prcticamente
prohibido salvo en casos excepcionales, tales como intercambio cientfico o ejemplares
propagados artificialmente en viveros registrados ante la Secretara de la CITES. La especio en
cuestin se ha mantenido en esta lista por razones ecolgicas y de sobreexplotacin, incluyendo
saqueos ilegales (Bentez y Dvila, 2002).
La propagacin tradicional de cactceas por semilla es insuficiente para cubrir la demanda debido
a su limitada produccin, disponibilidad y vialidad, sobre todo cuando la propagacin vegetativa
tampoco es suficiente. Las cactceas se pueden propagar tanto por enraizamiento de esquejes,
hijuelos o injertos; sin embargo algunas especies poseen un crecimiento muy lento, poca o nula
produccin de hijuelos, o un tamao reducido de semillas muchas veces poco viables (Soltero
Quintana, 1996).
Debido a lo anterior es preciso contemplar otras tcnicas de propagacin. Una alternativa a estos
obstculos es la reproduccin in vitro, sobre todo para especies en peligro de extincin o
amenazadas, como es el caso del Aztekium ritterii. Dentro de este aspecto se puede hablar de
embriognesis somtica, microinjertos o germinacin in vitro de semillas.
Actualmente, con la biotecnologa se pueden resolver una gran diversidad de problemas, como
puede ser el caso de la reproduccin de plantas.
El cultivo de tejidos vegetales presenta varias aplicaciones como la conservacin de
germoplasma y propagacin de las especies, adems de la produccin de metabolitos secundarios
y el mejoramiento gentico, entre otros (Murashige, 1974).
La embriognesis somtica es una forma de propagacin asexual que puede ser reproducida
artificialmente por la manipulacin de clulas y tejidos in vitro. Algunos de los factores ms
importantes para la regeneracin exitosa de plantas son los medios de cultivo y las condiciones de
incubacin. La embriognesis somtica in vitro es un requisito para la propagacin a gran escala
y puede ser iniciada de dos formas: directamente, con explantes de tejido que resultarn en
2

plantas genticamente idnticas, e indirectamente, a partir de tejido indiferenciado (callo); la

propagacin por embriognesis indirecta conlleva el riesgo de producir plantas que pueden ser
genticamente diferentes unas de otras y de la planta parental. Se cree que la aparicin de la
variabilidad gentica dentro del cultivo de tejidos puede provenir de cambios celulares inducidos
durante el cultivo. (George, 1993).
El cultivo in vitro per se puede ser muy estresante para las clulas vegetales e involucra procesos
mutagnicos durante el establecimiento del explante, la induccin de callo, la formacin de
embriones y la regeneracin de plantas. Por esta va es posible obtener variacin, de origen
nuclear y/o citoplasmtica, que podra ser utilizada para el mejoramiento vegetal. Este proceso,
denominado variacin somaclonal, involucra cambios en las plantas regeneradas que son
transmitidos a la progenie (Cardone, Olmos, Echenique, 2004).
Por esta razn, las tcnicas de induccin de variacin somaclonal constituyen una potente
herramienta para lograr un rpido incremento en la variabilidad gentica de las especies
cultivadas (Okole et al. 2000).
Cuando se quiere reproducir cactus de difcil manejo, debido a requerimientos ambientales muy
especficos, se puede recurrir a la utilizacin de injertos, lo cual ha sido limitado debido al poco
xito que se atribuye a dificultades en el uso de tcnicas poco fiables y a problemas como la
contaminacin de hongos o bacterias, el estrs y la deshidratacin de los tejidos en la zona de
unin del injerto (Maldonado & Zapien, 1977).
Una alternativa potencial para evitar algunos de estos problemas es el uso de microinjertos de
plntulas, que se realiza en condiciones aspticas y de humedad relativa alta (Burger, 1984;
Hartmann et al., 1997).
1.2 Descripcin de la especie

En 1928 Frederich Boedeker describi Echinocactus ritterii, a partir de una planta facilitada por
Frederich Ritter en Mxico, al ao siguiente Boedeker describi el gnero Aztekium, basando este
nombre en la apariencia de la planta y compararla con las pirmides de la cultura azteca
(Velazco, 2006).
3

El gnero Aztekium cuenta con 2 especies, A. ritterii y A. hintonii, las cuales se distribuyen
nicamente en Nuevo Len. Aztekium ritterii es una planta de lento crecimiento con un rea de
distribucin muy pequea, endmica del Valle de Rayones, Nuevo Len; se encuentra en
acantilados de piedra caliza y en superficies de yeso muy empinadas. La zona total en que
posiblemente se d se estima en 50 kilmetros cuadrados, pero los hbitats adecuados en esa zona
estn limitados a caones y acantilados (Anderson, Arias y Taylor, 1994).
A. ritterii es un cactus globular, normalmente no mayor a 5 cm y por lo general tiene de 9 a 11
costillas que a su vez presentan numerosos surcos horizontales, entre estas costillas verdaderas se
encuentran pequeas costillas secundarias que llegan a la mitad del cuerpo de la planta. El color
de los ejemplares jvenes es un verde amarillento, tornndose en un verde grisceo al envejecer.
El centro del cactus contiene una gran cantidad de pubescencias blancas. Una vez que la planta ha
terminado su crecimiento es comn encontrar pequeos brotes a su alrededor.
Esta especie presenta de 1 a 3 espinas pequeas y frgiles por areola, formando una lnea
continua hacia el centro sobre las costillas verdaderas. Muchas veces estn ausentes en las areolas
jvenes. Sus flores son pequeas, de menos de 10 mm de ancho. Crecen en pice, de un color
entre blanco y rosado. Usualmente los ptalos externos presentan una raya ms obscura. Florece
libremente en cultivo a lo largo de los meses de verano. Sus frutos son pequeos y rosados que se
abren cuando maduran.
Al abrirse los frutos, se desprenden las semillas, las cuales son diseminadas por sinzoocoria
(Rojas-Archiga y Vzquez-Yanes, 2000).
Debido a las adversidades del medio, la depredacin animal y la falta de un microclima que
proteja el desarrollo de las plntulas, slo una pequea porcin de la gran cantidad de semillas
que puede llegar a producir el fruto llegan a germinar y a desarrollarse para producir nuevas
plantas. Las semillas estn cubiertas por una testa, el tegumento interno deja una pequea
abertura que es el micrpilo, el externo es ms corto, no llega al micrpilo y sus clulas contienen
abundantes taninos responsables de la dureza de la testa y de su color ms o menos obscuro. El
funculo al desprenderse, deja en las semillas residuos ms o menos grandes que constituyen una
estructura esponjosa llamada estrofolo (caracterstica de Aztekium ritterii, as como de
Mammillaria tetrancistra y Cochemiea poselgeri.). El embrin es el primordio de la planta, es
4

grande y ocupa toda la cavidad de la semilla; consta del eje primordial (tallito), la radcula y los
cotiledones. Durante la germinacin, la radcula del embrin saldr a travs del micrpilo, lo que
refiere una germinacin epigea. La plntula es el embrin desarrollado como consecuencia de la
germinacin, con cotiledones pequeos, siendo toda la plntula globosa u ovoide (Bravo-Hollis,
1978).

Figura 1. Semilla con testa tuberculada, puede notarse, en la parte inferior de la semilla, el estrofolo muy
desarrollado (Bravo-Hollis, 1978).

2 Antecedentes
2.1 Germinacin

La aplicacin de giberelinas para la germinacin de semillas se ha aplicado en diversas

investigaciones en el campo del cultivo de tejidos vegetales, como es el caso de Begonia
evansiana (Nagao, et al., 1959).
De 230 especies de cactus que se han germinado en estudios, el 64% requirieron de GA3 para su
germinacin (Deno, 1996).
Generalmente, las temperaturas extremas no favorecen la germinacin de cactceas, por ejemplo,
debajo de los 12 C y sobre los 28C (Fearn, 1981; Rojas-Archiga and Vzquez-Yanes, 2000).
Millberg et al. (2000) menciona que las especies de cactus con semillas grandes son
generalmente menos dependientes de la luz para su germinacin.
5

La germinacin de semillas de Carnegiea gigantea tanto en luz como en obscuridad se

increment al embeber las semillas en 500 a 1000 p.p.m. de cido giberlico (Alcorn y Kurtz
1959).
La germinacin de semillas de Ferocactus latispinus var. Spiralis y Echinocactus platyacanthus
f. grandis no se vio beneficiada por la alternacin de temperaturas en contraste al tratamiento con
temperatura constante (Baskin and Baskin, 1977; Potter et al., 1984; Rojas-Archiga et al., 1998;
Rojas-Archiga and Vzquez-Yanes, 2000).
Para la germinacin de semillas de Obregonia denegrii Fri., se embebieron las semillas en una
solucin con 1.4 M de cido giberlico (GA3), despus fueron desinfestadas y luego sembradas
en medio solido MS (Murashige y Skoog, 1962). En contraste con el control (22%) las semillas
tratadas con GA3 tuvieron una tasa de germinacin de 85% a los 7 das (Cardarelli et al., 2010).

2.2 Formacin de brotes

El balance entre auxinas y citocininas es particular para la induccin de brotes para cada especie
de Mammilaria (Johnson y Emino, 1979).
(Leshem et al. 1988; Paques & Boxus 1987, Citados por Debergh, 1992) han descrito que altas
concentraciones de BAP (10 mg L-1) producen hiperhidratacin en cultivos in vitro.
Prez- Molphe-Balch et al. (1998) demostraron que la utilizacin de BA (1 mg L-1) sola o en
combinacin con cido ANA (0.01 mg L-1) fueron muy efectivos en la formacin directa de
brotes en 21 especies de cactceas mexicanas.
Clayton et al. (1990), Rodrguez y Rubluo (1994) y Malda et al. (1999 b) sealaron que, en
distintas especies de cactceas, concentraciones altas de BA y bajas de ANA inducen la
brotacin.
Se ha logrado la induccin de embriognesis somtica en Turbinicarpus pseudomacrochele
utilizando durante 4 semanas medio MS suplementado con 2,4-D (3mg L-1), ANA (2mg L-1), Kin
(2mg L-1), L-glutamina (500mg L-1), y casena hidrolizada (250mg L-1). La germinacin de los
6

embriones somticos fue a las 16 semanas de repicar en medio MS con 5g/L de Phytagel y sin
reguladores (Torres-Muoz, 1996).
Mammillaria elongata produce brotes en medio MS adicionado con 1.07 M ANA y 11.09 o
22.19 M BA. Sin embargo, al tratar de inducirlos a partir de brotes en forma de cresta, se
obtuvieron brotes hiperhidratados (Papafotiou et al., 2001).
Para Opuntia ellisiana se lograron brotes a partir de areolas en medio MS con 10 M de BAP y
10 M de IBA con fotoperiodo de 16 horas (35 das). El mayor porcentaje de enraizamiento se
dio con medio MS con 25 M IBA, despus de 19 das (Jurez, 2002).
Moebius-Goldammer, et a.l (2003), indujo brotes de Ariocarpus kotschoubeyanus a partir de
embriognesis indirecta utilizando medio MS suplementado con 13.3M de benciladenina (BA)
y 5.4M de ANA.
En plntulas enteras de Cephalocereus senilis se encontr que en la concentracin de 0.3 mg L-1
de ANA y 3.0 mg L-1 de BA se indujeron el mayor nmero de brotes en la parte basal, seguido de
la parte media y por ltimo la apical (Choreo-Tapia et al., 2002).
Para inducir la formacin de brotes de Ferocactus glaucescens, Santos (2005), utiliz medio MS
con el doble de la concentracin de cloruro de calcio descrita originalmente por Murashige y
Skoog (1962), adicionado con 1 mg L-1 de BA y 0,02 mg L-1 de ANA. Adems obtuvo mayor
nmero de brotes compactos al repicar en medio MS con 2 mg L-1 de BAP con 1% de carbn
activado.
Se obtuvo callo en Mammillaria albicoma Bod. Al aplicar al medio MS 0.1mg L-1 de ANA y
5.0 mg L-1 de BA (Wyka et al., 2006).
Para Notocactus magnificus se reporta la formacin de callo en medio MS con tiamina HCl, iinositol, sacarosa 2% (w/v), BAP y 2,4-D. En el mismo medio, pero en obscuridad, se formaron
brotes a los 2-4 meses. (Ara de M., 2006).
Ruvalcaba (2010), obtuvo los mejores resultados en la proliferacin de brotes a partir de plantas
germinadas en laboratorio, tanto de las porciones apicales como laterales, de Coryphantha retusa

al suministrar su medio MS con 2.0 mg L-1 de 6-bencilaminopurina (BAP), solidificado con 3 mg

L-1 de Phytagel. El enraizamiento se llev a cabo en el mismo medio basal sin reguladores.
La influencia de BA solo y en combinacin con ANA favoreci la expresin morfogentica
segn reportaron para Aztekium ritterii en los trabajos de Starling (1984), Martnez-Vzquez y
Rubluo (1989) y Clayton et al. (1990).
Rodrguez-Garay y Rubluo (1992), tambin reportaron que el proceso de morfognesis en
Aztekium ritterii es tan compleja que se requiere la estructura completa de la planta para producir
brotes. Algunas respuestas morfognicas se dieron al exponer los explantes al medio MS con
vitaminas L2, 3% de sacarosa y suplementada con 1.0mg L-1 de BA ms 0.01 mg L-1 de ANA.
Para la formacin de raz se utiliz medio MS con 2.0mg L-1 de IBA, sin embargo se obtuvieron
resultados muy pobres, solamente 2 brotes de 60 enraizaron.
Segn Rodriguez y Rubluo (1992) se obtienen ms brotes de la parte media del tallo de Aztekium
ritterii, sin embargo son ms pequeos y de menor dimetro que los obtenidos de la parte basal.
Para el cultivo de clulas en suspensin de Aztekium ritterii, Santacruz (1998), ha utilizado medio
MS suplementado con vitamina L2 y adicionado con 3mg L-1 de cido 2,4-diclorofenoxiactico
(2,4-D), 2mg L-1 de cido naftalenactico (ANA), 2mg L-1 Kinetina (Kin). Los embriones
somticos comenzaron a desarrollarse al agotarse los reguladores del medio.
Navarro et al., 2009 obtuvieron brotes hidratados al usar cantidades iguales de BAP y ANA.

2.3 Microinjertos

En teora todos los cactus se pueden injertar en cualquier otro miembro de la familia Cactaceae,
pero las especies que se emplean ms a menudo como portainjertos en cactceas son Hylocereus
undatus, Echinopsis pachanoi, E. brigdesii, E. macrogonus, E. peruvianus, E. multiplex,
Trichocereus pachanoi, T.spachianus, T. macrogonus, T. fulvianus y T. pasacana. (Anderson,
1997; Toogood, 2002).

Estrada-Luna, et al. (2002) microinjertaron 5 especies de Opuntia, obteniendo mejores resultados

al realizar cortes horizontales en lugar de cortes en forma de cua.

3 Objetivo
Comparar 3 mtodos para la obtencin in vitro de brotes de Aztekium ritterii
4.1 Metas

Reconocer si el efecto del cido giberlico influye en la obtencin de un alto

porcentaje de germinacin.

Obtener brotes de A. ritterii mediante barridos hormonales y disminucin de

humedad en el medio.

Observar el desarrollo de brotes de A. ritterii al microinjertarlos.

4 Hiptesis
-

Las semillas de Aztekium ritterii germinarn bajo el efecto de luz blanca constante y en
presencia de cido giberlico.

Se obtendrn brotes de Aztekium ritterii sembrados en medio MS adicionado con

reguladores.

Se desarrollarn brotes de Aztekium ritterii al microinjertarlos.

5 Material y mtodo
5.1 Germinacin

El trabajo se llev a cabo en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales ubicado dentro de la

Facultad de Biologa, campus Xalapa, de la Universidad Veracruzana, a partir de semillas de
Aztekium ritterii donadas por el Jardn Botnico del Instituto de Ecologa de la UNAM,
procedentes de un decomiso de plantas originarios de Rayones, Nuevo Len.

5.1.1

Desinfestacin

El total de semillas (90 semillas), se dividi en tres grupos, cada uno con un tratamiento distinto:
A) Se lavaron 30 semillas con agua corriente y agua destilada, para remover cualquier mucilago
restante. Luego se sumergieron en una solucin antibacterial (Agrimicyn).
B) Se lavaron 30 semillas con agua corriente y agua destilada. Se sumergieron en una solucin
detergente (Extran) al 2% durante 30 minutos.
C) Se lavaron 30 semillas con agua corriente y agua destilada. Se colocaron en Extran al 2%
durante media hora y se enjuagaron bien, para posteriormente transferirlas a una solucin de
cido ctrico (2mg L-1) y cido ascrbico (2mg L-1).
Despus de los respectivos enjuagues, dentro de la campana se procedi a desinfectar las 90
semillas sumergindolas en una solucin de Cloro al 50% por 10 minutos y se volvieron a
enjuagar.

10

5.1.2

Medio de cultivo e inoculacin

Para cada uno de los tratamientos (A, B y C) procedieron las siguientes indicaciones:

- Se sembraron 10 semillas en medio de control, el cual consisti en medio MS sin reguladores.

- Se sembraron 10 semillas en medio MS adicionado con 1mg L-1 de Ga3, y
- Se sembraron 10 semillas en una solucin de 1mgL de GA3, posterior a esto se coloc 1 semilla
por cada frasco con medio MS sin reguladores.
La mitad de los frascos control, como de los tratados con GA3, se colocaron en luz blanca
constante y la otra mitad en obscuridad para apreciar la influencia de la luz en la germinacin de
esta especie, en una cmara de incubacin a 25C.

5.1.3

Medicin de plntulas

Se procedi a medir las plntulas durante los 90 das posteriores a la germinacin.

5.2 Induccin de brotes

Se trabaj a partir de explantes de areolas de Aztekium ritterii de una planta proveniente de la

coleccin privada del Bilogo David Jimeno Sevilla.
Se utilizaron las tcnicas de desinfestacin y formacin de callo expuestas por Navarro et al.,
2009.

11

5.2.1

Medio de cultivo e inoculacin

Se utiliz medio MS adicionado con ANA 0.5mg L-1, AS 2.0mg L-1, Polyvinylpyrrolidona
(PVP) 2.0g/L y cinco concentraciones distintas de BAP (1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0 mg L-1). Se
cortaron fragmentos de tejido calloso y se colocaron 2 de stos por cada frasco, se sembraron 2
lotes de 7 repeticiones con cada concentracin. Posteriormente el tejido calloso restante y los
brotes reventados por el exceso de humedad se repicaron en otros 2 lotes, uno con 7 repeticiones
y otro con seis, por cada concentracin de BAP. Por otro lado, se sembraron 15 frascos en medio
MS sin reguladores como control.

5.2.2

Subcultivo

Los brotes hidratados obtenidos se repicaron en 50 frascos con medio MS adicionado con PVP
2.0g/L, AS 2.0mg L-1 y 4.5g L-1 de Phytagel, la mitad de los frascos totales contenan tambin
vermiculita para disminuir el nivel de humedad del medio.
Los frascos se mantuvieron en una cmara de incubacin con luz blanca constante a una
temperatura de 25C.
Los explantes se repicaron una vez por mes y pasados 3 meses de la primera siembra en medio
de induccin de brotes se procedi a contabilizar la presencia de stos.

5.3 Microinjertos

Se utilizaron brotes obtenidos con el barrido hormonal para induccin de brotes.

12

5.3.1

Medio de cultivo e inoculacin

En medio MS sin reguladores, diez brotes de Aztekium ritterii se microinjertaron sobre plntulas
de Coryphantha greenwoodii, otros diez sobre plntulas de Mammillaria haageana y otros diez
sobre plntulas de Ferocactus recurvus, realizando cortes horizontales para observar si de esta
manera disminuye su absorcin de agua.
Los frascos se mantuvieron en una cmara de incubacin con luz blanca constante a una
temperatura de 25C.
Cada mes se repicaron los microinjertos y se procedi a tomar fotografas para observar su
respuesta.

6 Resultados
6.1 Germinacin

Se realizaron 3 tratamientos, con 30 semillas cada una; los tres resultaron efectivos en cuanto a la
desinfestacin de las semillas, nicamente en el primer tratamiento se contamin un frasco.
Tabla 1. Porcentaje de germinacin = (Nmero de semillas germinadas/ semillas sembradas) X 100. El mejor
resultado se obtuvo con el grupo tratado con Extran en medio MS sin reguladores para la germinacin de
semillas de Aztekium ritterii.

Medio MS
Sin
reguladores
1mgL-1 GA3
Embebidas en
1mgL-1 GA3

Agrimycin

Extran

cido Ctrico +
cido Ascrbico

30%

60%

20%

30%

50%

10%

10%

40%

30%

13

En la tabla anterior (Tabla 1) se aprecia que las mejores condiciones para la germinacin de
semillas de A. ritterii se consiguieron con la utilizacin de Extran en el tratamiento previo a la
germinacin y la inoculacin en medio MS sin reguladores.
Debido a la baja germinacin de semillas en obscuridad, tanto en presencia de GA3 como sin
ste, despus de transcurrir dos meses de la siembra, se trasladaron a luz, lo que produjo una
rpida respuesta en el caso de algunas semillas germinadas, lo que nos sugiere la necesidad de luz
sobre la germinacin.
Es importante notar que la mayora de las plntulas obtienen de forma natural una raz a los pocos
das de germinar.

Figura 2. Plntula con raz

6.1.1

Figura 3. Plntula hiperhidratada

Crecimiento de plntulas

Se registr el crecimiento de las plntulas germinadas con mediciones diarias durante 3 meses a
partir de su germinacin.
En las siguientes grficas (Grficas 1, 2 y 3) se muestra el crecimiento registrado durante 90 das
de las plntulas de cada tratamiento, adems se observa el tiempo de germinacin de la semilla
desde su siembra.
Se puede observar que en los casos de las semilla con tratamiento previo a la siembra de
Agrimycin (Grfica 1) y de Extran (Grfica 2) las semillas embebidas en una solucin 1mgL-1 de
cido giberlico tuvieron una germinacin ms temprana y tuvieron un crecimiento un poco
14

mayor al de las semillas en medio MS sin reguladores. En contraste, las semillas sembradas en
medio MS adicionadas con 1mgL-1 de GA3 sufrieron un crecimiento acelerado llegando a medir
entre 5 y 6 mm con un aspecto hiperhidratado, seguramente debido a que la presencia del cido
giberlico inhibi el desarrollo de races.

7
6
5
4
3
2
1
0

Da 1
Da 6
Da 11
Da 16
Da 21
Da 26
Da 31
Da 36
Da 41
Da 46
Da 51
Da 56
Da 61
Da 66
Da 71
Da 76
Da 81
Da 86
Da 91
Da 96
Da 101
Da 106
Da 111
Da 116
Da 121
Da 126
Da 131
Da 136

Altura de plntulas (mm)

Agrimycin

S/reguladores

MS+GA3

Embebida GA3

Grfica 1 Crecimiento de Plntulas de Aztekium ritterii del tratamiento con Agrimycin, las semillas.

6
5
4
3
2
1
0
Da 1
Da 6
Da 11
Da 16
Da 21
Da 26
Da 31
Da 36
Da 41
Da 46
Da 51
Da 56
Da 61
Da 66
Da 71
Da 76
Da 81
Da 86
Da 91
Da 96
Da 101
Da 106
Da 111
Da 116
Da 121

Tamao de plntulas (mm)

Extran

S/reguladores

MS+GA3

Embebida GA3

Grfica 2. Crecimiento de plntulas de Aztekium ritterii del tratamiento con Extran

15

En el caso del tratamiento con cido ctrico y cido ascrbico (Grfica 3) se registr el menor
tiempo de germinacin para las semillas embebidas en cido giberlico, incluso menor que los de
los otros tratamientos y el mayor crecimiento a lo largo de los 90 das llegando a los 4 mm con
raz.

4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
Da 1
Da 7
Da 13
Da 19
Da 25
Da 31
Da 37
Da 43
Da 49
Da 55
Da 61
Da 67
Da 73
Da 79
Da 85
Da 91
Da 97
Da 103
Da 109
Da 115
Da 121
Da 127
Da 133
Da 139
Da 145
Da 151
Da 157
Da 163
Da 169
Da 175

Tamao de plntulas (mm)

cido ctrico y cido ascrbico

S/reguladores

MS+GA3

Embebida GA3

Grfica 3. Crecimiento de plntulas de Aztekium ritterii del tratamiento con cido ctrico y cido ascrbico

Las semillas embebidas en cido giberlico inoculadas en medio MS basal, aunque presentaron
un bajo porcentaje de germinacin destacan por haber germinado en una menor cantidad de das
que las sembradas en los otros medios de cultivo.

6.2 Formacin de brotes

Se realizaron 5 ensayos con distintas concentraciones de BAP y concentraciones constantes de

ANA (0.5mgL-1), AS (2mgL-1) y PVP (2gL-1). Fueron 27 repeticiones en total por cada ensayo
entre las cuales se obtuvo una mayor cantidad de brotes con la concentracin de 1.5mg L-1 de
BAP.

16

Figura 4. Formacin de brotes

Figura 5. Formacin de brotes

Tabla 2. Diferentes ensayos para induccin de brotes de Aztekium ritterii, 27 frascos por concentracin de
BAP, 15 frascos sin reguladores como control. Se obtuvo una mayor cantidad de brotes con la concentracin
de 1.5mg L-1 de BAP.

Total de Brotes

Promedio de brotes

Formados

por frasco

1.0 mg L-1

71

2.62

1.5 mg L-1

88

3.25

2.0 mg L-1

60

2.22

2.5 mg L-1

43

1.59

3.0 mg L-1

31

1.14

Control

---

12

0.8

Ensayo

BAP

17

18
16
14

Nmero de brotes

12
10
8
6
4
2
0
-2
1 mg/L BAP

1.5 mg/L BAP

2 mg/L BAP

2.5 mg/L BAP

3 mg/L BAP

Sin reguladores

Reguladores de crecimiento

Grfica 4. Diagrama de cajas y alambres sobre la distribucin en el nmero de brotes por concentracin de
BAP. Se aprecia que la concentracin de 1.5 mgL-1 form un nmero mayor de brotes.

En la Grfica 4 se observa la distribucin en el nmero de brotes por concentracin de regulador

de crecimiento. Con los tratamientos 1mg/L BAP y 1.5mg/L BAP se obtiene el mayor nmero de
brotes, sin embargo tambin se presenta mayor variabilidad en comparacin con los dems
tratamientos.

Los tratamientos 2 mg/L BAP, 2.5 mg/L BAP y 3 mg/L BAP presentan

comportamiento muy similar, el nmero de brotes flucta entre 0 y 6 brotes. En cualquier caso, se
observa una mayor produccin de brotes que en el medio sin reguladores.
Posterior a la formacin de brotes, se repicaron 50 frascos, con 4 brotes cada uno, a medio MS
sin reguladores, la mitad con vermiculita y la mitad sin esta. En los frascos sin vermiculita se
observ una gran hidratacin y prdida de color. Los brotes en el medio con vermiculita
crecieron conservando su forma y recuperaron un color obscuro, adems de presentar formacin
de primordios de raz.

18

Figura 6. Brotes en vermiculita. Da 1 (Hiperhidratados).

Figura 7. Brotes en vermiculita. Da 30 (Recuperaron su color obscuro y se compactaron).

Figura 8. Brotes sin vermiculita. Da 1 (Hiperhidratados)

19

Figura 9. Brotes sin vermiculita. Da 30 (Continuaron hiperhidratandose)

Cuando se repicaron lotes de 5 repeticiones en medio MS basal con 5gL-1 de Phytagel, medio MS
basal con 4.5gL-1 de Phytagel y la mitad de concentracin de calcio y medio MS basal con 4.5gL1

de Phytagel adicionado con paja de caf, no se observaron los resultados deseados.

En el primer caso, el exceso del agente gelificante en el medio dificult la recepcin de agua a los
brotes evitando la hiperhidratacin, de tal manera que algunos comenzaron a deshidratarse
adems de permanecer poco estables sobre este medio.
En algunos casos se ha dejado agotar el medio de cultivo en los frascos y se han reportado
mejoras estructurales en brotes muy afectados por la hiperhidratacin y en algunos casos se
comienza a formar un primordio de raz.

6.3 Microinjertos

Se realizaron tres grupos de microinjertos, uno colocando brotes de A. ritterii sobre portainjertos
de Coryphanta greenwoodii, otro sobre portainjertos de Mammillaria haageana y otro sobre
Ferocactus recurvus.
Los pies de injerto de C. greenwoodii tuvieron un impacto ms favorable sobre los brotes de
Aztekium ritterii injertados. Es importante resaltar que a diferencia de las cabezas montadas sobre
20

M. haageana o Ferocactus recurvus estos injertos tienen un aspecto ms vigoroso y conservaron

su forma original. En algunos casos la estructura original se vio afectada por la formacin de
brotes laterales, que surgieron sin la aplicacin de ningn tipo de regulador de crecimiento y no
presentaron sntomas de hiperhidratacin llegando a formar 44 brotes entre los 10 microinjertos.

Figura 10 (da 1), 11 (da 30), 12 (da 60) y 13 (da 90) Microinjerto sobre M. haageana.

Ilustracin 14 (da 1), 15 (da 30), 16 (da 60) y 17 (da 90) Microinjerto sobre C. greenwoodii.

Figura 18. Microinjerto sobre Ferocactus recurvus. No se presentaron cambios relevantes.

21

Es importante observar que la parte apical del pie de injerto se ha unido con xito a la parte basal
de los brotes diseccionados de A. ritterii y se ha logrado un desarrollo continuo, lo que garantiza
ms material para microinjertos futuros.

Figura 19 y 20. Microinjerto utilizando A. ritterii como pie de injerto

6.4 Comparacin de resultados

Debido a que el objetivo de este trabajo es comparar la eficiencia de las tres tcnicas expuestas
con respecto a la obtencin de brotes de Aztekium ritterii se lleg a la conclusin de que el
Microinjerto sobre Coryphantha greenwoodii es la ms ptima (ver Tabla 3).
Tabla 3. Comparacin brotes obtenidos entre los mtodos de germinacin, embriognesis somtica y
microinjertos. El mtodo ms eficiente fue el de Microinjerto sobre C greenwoodii con un 440% de formacin
de brotes.

Explantes
Brotes
obtenidos
Porcentaje

Semillas (Extran 2%,

medio MS basal)

Callo en medio MS +
1.5mgL-1 BAP

10

54

Microinjerto
sobre C.
greenwoodii
10

88

44

60%

162.96%

440%

22

7 Discusin
Aztekium ritterii es una especie en peligro de extincin muy solicitada por el mercado
internacional debido a su atractivo como planta ornamental y se ha visto amenazada por la
colecta ilegal.
Para que pueda combatirse la colecta ilegal y apoyar a la recuperacin de las poblaciones
originales de A. ritterii, en este trabajo se han estudiado 3 mtodos para la obtencin de nuevas
plantas que en medida de lo posible ayudarn a satisfacer las demandas del mercado.
Las semillas fueron almacenadas en una cmara de incubacin con una temperatura que rodeaba
los 25C, condicin que entra dentro del rango manejado por Fearn (1981) y Rojas-Archiga et
al. (2000) que oscila entre los 12 C y sobre los 28C.
Los resultados arrojados por el experimento de germinacin no nos sugieren un beneficio
relevante del cido giberlico sobre las semillas en cuanto a su porcentaje de germinacin ni en
luz ni en obscuridad. Esto contrasta con lo reportado por Deno (1996) para Aztekium ritterii,
Alcorn y Kurtz (1959) para Carnegiea gigantea, Cardarelli et al (2010) para Obregonia denegrii
Fric. y Nagao et al. (1959) para Begonia evansiana.
Aztekium ritterii tiene semillas muy pequeas y manifest una preferencia por la germinacin en
condiciones de luz, esto se podra complementar con lo mencionado por Millberg et al. (2000)
quien estipula que las especies de cactus con semillas grandes son generalmente menos
dependientes de la luz para su germinacin.
El factor de escarificacin aparentemente influy ms sobre el porcentaje de germinacin,
mientras que el embeber las semillas en cido giberlico aceler la germinacin. El Extran fue la
mejor opcin encontrada en los experimento presentados, posiblemente debido a su fuerte accin
que acta como escarificante, aun as no resulta tan agresiva como la proporcionada por los
cidos ctrico y ascrbico, el cual se piensa pudo haber sido muy agresivo para las semillas ms
dbiles, afectando en el porcentaje de germinacin. Se sugiere que se realicen trabajos con una
concentracin menor de cido ctrico y cido ascrbico para comprobar su efectividad, con una
cantidad mayor de semillas y tambin distintas concentraciones de cido giberlico para
embebrlas.
23

En la experiencia del barrido hormonal se observ que las concentraciones ms bajas de BAP
desencadenaban una respuesta ms eficaz en la formacin de brotes, mientras que al aumentar la
concentracin del regulador se encontraban menos brotes.
Para la obtencin de brotes se utiliz una concentracin mayor de BAP que de ANA, lo cual
coincide con lo sugerido por Prez- Molphe-Balch et al. (1998) para 21 especies de cactceas as
como Clayton et al. (1990), Rodrguez y Rubluo (1994) y Malda et al. (1999 b) para distintas
especies de cactceas, Papafotiou et al. (2001) para Mammillaria elongata, Moebius-Goldammer,
et al. (2003) para Ariocarpus kotschoubeyanus, Choreo-Tapia et al. (2002) para Cephalocereus
senilis

y Santos (2005) para Ferocactus glaucescens. Mientras que proporciones similares

crearon callo para Mammillaria albicoma Bod. segn Wyka et al. (2006).
Para Aztekium ritterii, se reporta que la influencia de BAP en combinacin con ANA favoreci
la expresin morfogentica segn los trabajos de Starling (1984), Martnez-Vzquez y Rubluo
(1989) y Clayton et al. (1990). Lo cual coincide con lo reportado en este trabajo.
La Figura 7 nos muestra que la concentracin con un mayor nmero de brotes formados es de 1.5
mgL-1 de BAP ms 0.5 mgL-1 de ANA lo cual difiere de la reportada por Navarro et al. (2009),
quien utiliz una concentracin de 1 mgL-1 de BAP con 1 mgL-1 de ANA. Sin embargo, en el
presente trabajo se obtuvieron brotes menos hidratados y menos alargados, manteniendo una
forma ms acorde a la natural.
Aunque los brotes obtenidos se hiperhidrataron en menor medida fue necesario repicarlos a un
medio con vermiculita, la cual result eficaz en la tarea de contrarrestar el exceso de humedad en
el medio, donde se pudieron apreciar individuos con un color verde obscuro y muy compactos.
Es importante resaltar que al acabarse el medio de cultivo los brotes comenzaron a formar
pequeos primordios de raz.
En el experimento de microinjertos se utilizaron como pie de injerto tres distintas especies,
siendo Coryphantha greenwoodii la ms adecuada para el desarrollo de los injertos. Un resultado
destacado es la proliferacin de brotes laterales de A. ritterii sin la utilizacin de reguladores de
crecimiento. La importancia de estos microinjertos radica en la relativa facilidad para enraizar los
pies de injertos.
24

Los resultados obtenidos en este trabajo muestran un nmero superior de brotacin en los
microinjertos (440%) que en los obtenidos de callo con ayuda de 1.5 mgL-1 de BAP (162.96%) y
por germinacin (60%). Esto coincide con lo establecido por Rodrguez-Garay y Rubluo (1992),
quienes mencionan que el proceso de morfognesis en Aztekium ritterii es tan compleja que se
requiere la estructura completa de la planta para producir brotes.
En trabajos anteriores con A. ritterii se ha logrado la produccin de brotes in vitro, sin embargo,
la totalidad de los individuos obtenidos invariablemente se ha desarrollado en un estado de
hiperhidratacin. Las tcnicas desarrolladas en el presente trabajo lograron la obtencin de brotes
no hidratados de A. ritterii, lo que significa un importante avance en el estudio de la
micropropagacin de esta especie.

8 Conclusin
El cultivo de tejidos vegetales es una herramienta til para la proliferacin de plantas. En un
principio se enfoc su uso para especies ornamentales y alimenticias, sin embargo, actualmente
se a extendido su uso para tratar especies en peligro de extincin y es importante explorar todas
las opciones posibles para determinar la mejor tcnica que pueda utilizarse para cada situacin.
En este caso, para la especie Aztekium ritterii se haba trabajado en la formacin de brotes por
barrido hormonal a partir de areolas y a partir de callo, sin embargo, en este trabajo se realizaron
nuevos experimentos para evaluar la obtencin de brotes in vitro, como fue la germinacin y los
microinjertos.
Al hacer la comparacin de distintas tcnicas debe destacarse una caracterstica en comn, en esta
ocasin la obtencin de brotes, sin embargo por separado cada tcnica tiene sus ventajas y sus
desventajas.
En el caso del uso de semillas hay claras desventajas, como son el bajo porcentaje de
germinacin y el hecho de que por explante no se consigue ms de una plntula. Por el contrario

25

ste es el explante ideal para conseguir plantas completas y la variabilidad gentica deseada para
un proyecto de reforestacin.
La formacin de brotes con ayuda de reguladores de crecimiento es una gran herramienta para la
micropropagacin, ya que con los reguladores indicados y las concentraciones ideales se puede
obtener un alto ndice de brotacin. Esto nos puede servir para abastecer de manera ms eficiente
los viveros para que se vendan plantas no extradas de su medio y combatir el saqueo ilegal.
El objetivo principal de los injertos en esta experiencia fue evitar que los brotes de Aztekium
ritterii se hiperhidrataran y ayudarlas a establecerse en el suelo, por lo tanto nos sorprendi
encontrar tal ndice de brotacin, sin reguladores de crecimiento, sobre los individuos injertados
sobre Coryphantha greenwoodii.
Es muy importante investigar en trabajos futuros las condiciones necesarias para enraizar brotes
de A. ritterii y entender todo su ciclo. Cuando todo ese conocimiento se alcance ser viable su
micropropagacin y sera posible la formacin de una UMA especializada en esta y otras
especies amenazadas de su regin de origen para regular el trfico ilegal y la colecta clandestina.

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