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PROGRAMA DE:
BIOLOGIA MOLECULAR E
INVESTIGACIN
Mdulo 15
Biologa Molecular aplicada al
diagnstico microbiolgico
CEGICAP
Av. Salaverry N 690
Jess Mara - Lima - Per
Telf. 332-1633
www.cegicap.edu.pe
cegicap@gmail.com
NDICE
1. ASPECTOS MICROBIOLGICOS
2. BIOLOGA MOLECULAR EN MEDICINA
3. MANEJO DE MUESTRAS PARA LA DETECCIN DE CIDOS NUCLEICOS FNGICOS
1. ASPECTOS MICROBIOLGICOS
El mayor riesgo microbiano del agua es el relacionado con el consumo de agua
contaminada con excrementos humanos o animales, aunque puede haber otras
fuentes y vas de exposicin significativas.
Este captulo trata sobre los microorganismos que, segn pruebas obtenidas en
estudios epidemiolgicos o en estudios prospectivos en situaciones no
epidmicas, ocasionan enfermedades por ingestin, inhalacin de gotculas o
contacto con agua de consumo, as como sobre el control de dichos
microorganismos.
1.1. Peligros microbianos relacionados con el agua de consumo
Los riesgos para la salud relacionados con el agua de consumo ms comunes y
extendidos son las enfermedades infecciosas ocasionadas por agentes patgenos
como bacterias, virus y parsitos (por ejemplo, protozoos y helmintos). La carga
para la salud pblica es funcin de la gravedad de la enfermedad o
enfermedades relacionadas con los agentes patgenos, de su infectividad y de la
poblacin expuesta.
Un fallo general del sistema de sistema de proteccin de la seguridad del
abastecimiento de agua puede ocasionar una contaminacin a gran escala del
agua y, potencialmente, epidemias detectables. Otras averas y la contaminacin
leve, posiblemente en ocasiones repetidas, pueden ocasionar brotes espordicos
significativos de enfermedades, pero no es probable que las autoridades de
vigilancia de la salud pblica los asocien con la fuente de abastecimiento de
agua de consumo.
La evaluacin y cuantificacin de los riesgos puede ayudar a comprenderlos y
gestionarlos, sobre todo los relacionados con casos de enfermedad espordicos.
1.1.1. Infecciones transmitidas por el agua
Existen diversos tipos de agentes patgenos que pueden transmitirse por el
agua de consumo contaminada. El cuadro 7.1 y la figura 7.1 proporcionan
informacin general sobre agentes patgenos importantes en la gestin de
sistemas de abastecimiento de agua de consumo. La gama de agentes patgenos
cambia en funcin de factores variables como el aumento de las poblaciones de
personas y animales, el incremento del uso de aguas residuales, los cambios de
los hbitos de la poblacin o de las intervenciones mdicas, las migraciones y
viajes de la poblacin, y presiones selectivas que favorecen la aparicin de
agentes patgenos nuevos o mutantes, o de recombinaciones de los agentes
patgenos existentes. Tambin existe una considerable variabilidad en la
inmunidad de las personas, ya sea adquirida por contacto con un agente
Nota: La transmisin por el agua de los agentes patgenos incluidos en el cuadro ha sido confirmada mediante estudios
epidemiolgicos e historias clnicas. La comprobacin de la patogenicidad se basa, en parte, en la reproduccin de la
enfermedad en hospedadores adecuados. El valor de la informacin de estudios experimentales en los que se expone a
voluntarios a concentraciones conocidas de agentes patgenos es relativo; como la mayora de los estudios se realizan
con voluntarios adultos sanos, la informacin obtenida slo es aplicable a una parte de la poblacin expuesta y la
extrapolacin a grupos ms vulnera bles debe estudiarse ms a fondo.
a
Periodo de deteccin del estado infeccioso en agua a 20 C: persistencia corta: hasta 1 semana; moderada: de 1
semana a 1 mes; larga: ms de 1 mes.
b
Estando el estado infeccioso en suspensin libre en agua tratada con dosis y tiempos de contacto convencionales. La
resistenc ia es moderada si es posible que el agente no sea destruido completamente.
c
Determinada en experimentos con voluntarios o basndose en informacin epidemiolgica.
d
Incluye los tipos enteropatgenos, enterotoxgenos y enteroinvasivos.
e
La va de infeccin principal es por contacto con la piel, pero puede infectar a enfermos de cncer o personas
inmunodeficientes por va oral.
f
En agua templada.
Figura 7.1
Evaluacin de la exposicin
La evaluacin de la exposicin consiste en el clculo del nmero de
microbios patgenos a los que se expone una persona, principalmente por
ingestin. La evaluacin de la exposicin es una actividad de prediccin
basada frecuentemente en juicios subjetivos. Conlleva, inevitablemente,
incertidumbre y debe tener en cuenta la variabilidad de factores como las
concentraciones de microorganismos (que varan en el tiempo), los
volmenes ingeridos, etctera.
La exposicin puede considerarse en trminos de una dosis nica de
agentes patgenos ingerida por un consumidor en un momento
determinado, o bien en trminos de la cantidad total ingerida en varias
exposiciones (por ejemplo, a lo largo de un ao). Se determina en funcin
de la concentracin de microbios en el agua de consumo y del volumen de
agua consumida.
Rara vez es posible o pertinente medir directamente y de forma sistemtica
la concentracin de agentes patgenos presentes en el agua de consumo.
Lo habitual es medir las concentraciones en las aguas de origen, o suponer
su valor, y aplicar reducciones estimadas de las concentraciones por
ejemplo, debidas al tratamiento del agua para calcular la concentracin
en el agua consumida. Si se mide la concentracin de agentes patgenos, es
mejor, por lo general, hacerlo donde es mxima (generalmente en las aguas
de origen). La reduccin de la concentracin de agentes patgenos lograda
mediante la aplicacin de sucesivas medidas de control se determina
generalmente por medio de indicadores, como E. Coli, en el caso de las
bacterias
entricas
patgenas
(vase
tambin
el
documento
complementario Water Treatment and Pathogen Control; apartado 1.3).
El otro componente de la evaluacin de la exposicin, que e s
independiente del agente patgeno objeto de evaluacin, es el volumen de
agua no hervida consumida por la poblacin, teniendo en cuenta las
variaciones de los hbitos de consumo entre personas diferentes y, sobre
todo, entre grupos de riesgo diferentes. En la evaluacin de los riesgos
derivados de peligros microbianos, es importante basarse en el volumen de
Figura 7.2
Metas de eficacia correspondientes a bacterias, virus y protozoos patgenos
seleccionados, con respecto a la calidad del agua bruta (para alcanzar un valor de 10 -6
AVAD por persona y ao)
.
1.2.4 Presentacin del resultado de la determinacin de metas relativas a la eficacia
El cuadro 7.4 presenta algunos datos del cuadro 7.3 en un formato ms
significativo para los responsables de la gestin de riesgos. Se incluye la
concentracin media de agentes patgenos en el agua de consumo, a efectos de
informacin. No es una metrfa relativa a la calidad del agua ni tiene por
finalidad fomentar la medicin de la concentracin de agentes patgenos en
-4
El cuadro 7.4 nicamente tiene en cuenta los cambios en la calidad del agua
derivados del tratamiento y no las medidas de proteccin de la fuente, que
contribuyen con frecuencia en gran medida a la inocuidad general, ya que afectan
a la concentracin de agentes patgenos, a su variabilidad, o a ambas cosas.
Adems, las estimaciones de riesgos presentadas en el cuadro 7.3 presuponen que
la calidad del agua no se degrada en la red de distribucin. Estos supuestos
pueden no ser realistas en todas las circunstancias, y es aconsejable tomar estos
factores en consideracin siempre que sea posible.
El cuadro 7.4 presenta nicamente estimaciones puntuales y no tiene en cuenta la
variabilidad y la incertidumbre. Los modelos completos de evaluacin de riesgos
incorporaran dichos factores representando las variables independientes como
distribuciones estadsticas en lugar de como estimaciones puntuales. No obstante,
la elaboracin de modelos de este tipo no est actualmente al alcance de muchos
pases y escasean los datos necesarios para definir las distribuciones mencionadas.
Para obtener este tipo de datos puede ser necesario invertir tiempo y recursos
considerables, pero ayudan mucho a conocer la calidad real del agua de origen y la
eficacia de su tratamiento.
El grado de tratamiento necesario depende tambin de los valores adoptados como
variables independientes del modelo de evaluacin de riesgos (por ejemplo,
consumo de agua de consumo o proporcin de la poblacin que es vulnerable). La
figura 7.3 muestra el efecto de la variacin en el consumo de agua de consumo no
hervida en las metas de eficacia correspondientes a Cryptosporidium parvum. Por
ejemplo, para una concentracin de 1 ooquiste por litro de agua bruta, las metas de
eficacia correspondientes a valores de consumo de 0,25 a 2 litros al da son de 2,6 a
3,5 unidades en la escala logartmica decimal. Segn algunos datos
epidemiolgicos, en los pases desarrollados una proporcin significativa de la
poblacin de edad superior a cinco aos puede no ser inmune a enfermedades
causadas por rotavirus. La figura 7.4 muestra el efecto de la variacin de la
proporcin de la poblacin que es vulnerable. Por ejemplo, para una concentracin
de 10 partculas vricas por litro de agua bruta, la meta de eficacia aumenta de 5,5 a
6,7 cuando la proporcin de personas vulnerables aumenta del 6 al 100%.
Los agentes patgenos tienen varias propiedades que los distinguen de otros
contaminantes del agua de consumo:
1.5
1.6
- pruebas de que los parmetros de calidad del agua de origen vuelven a ser
normales;
- arreglo de las averas que afectan a los procesos de tratamiento o a los
sistemas de distribucin;
- correccin de los fallos de los procesos de desinfeccin y restauracin de los
valores normales de concentracin residual de desinfectante;
- en los casos en que la recomendacin se debi a la deteccin de contaminacin
microbiana del agua de consumo, pruebas de la eliminacin o inactivacin de
la contaminacin;
- pruebas de que se han realizado purgas o desplazamientos de agua de las
caeras suficientes para retirar el agua potencialmente contaminada y las
biopelculas; o
- datos epidemiolgicos indicativos de que la epidemia ha finalizado.
Cuando se anulan las recomendaciones de hervir el agua o evitar su consumo,
debe notificarse la anulacin, por canales similares, a los mismos grupos de
poblacin a quienes se inform de la recomendacin. Adems, debe
informarse a los administradores, gestores u ocupantes de grandes edificios y
de edificios que cuentan con depsitos de almacenamiento de agua de la
necesidad de asegurarse de haber purgado concienzudamente los depsitos y
el conjunto de los sistemas de distribucin internos antes de recuperar los
usos normales del agua.
Las recomendaciones de evitar el consumo de agua, que tienen muchas
caractersticas comunes con las recomendaciones de hervir el agua pero son
menos frecuentes, se aplican cuando el agua contiene contaminantes
peligrosos, principalmente contaminantes qumicos, que no puede eliminarse
hirvindola.
1.6.2 Medidas tras un incidente
Es importante investigar adecuadamente cualquier incidente y promover
medidas correctoras que eviten que vuelva a producirse. El PSA deber
actualizarse para incorporar la experiencia adquirida. Los resultados de la
investigacin pueden tambin ser tiles para disear medidas aplicables a en
otros sistemas de abastecimiento de agua, para impedir que se produzca un
incidente similar en otro lugar. En caso pertinente, las investigaciones
epidemiolgicas de la autoridad de salud tambin contribuirn al diseo de
medidas futuras.
Medicina genmica
Las diferencias morfolgicas, fisiolgicas, bioqumicas y moleculares entre
individuos de la misma especie (diferencias fenotpicas), son producto de las
variaciones en la secuencia del DNA (variaciones genotpicas). Los cambios en
la secuencia del DNA que se presentan con una incidencia superior al 1%
reciben el nombre de polimorfismos, si la incidencia es menor son llamadas
mutaciones. En el genoma se identifican diferentes tipos de polimorfismos;
VNTRs (de Variable Number Tandem Repeats) y SNPs (de single nucleotide
polymorphism). Los SNPs (variaciones heredadas en una sola base) explican
alrededor del 90% de la diversidad fenotpica en el humano [5,6].
El estudio de los polimorfismos y su asociacin con las enfermedades
humanas es el rea de investigacin de la llamada medicina genmica, la cual
se define como el uso de anlisis genotpicos rutinarios para mejorar los
cuidados de la salud del individuo [7]. De la relacin entre los polimorfismos
y las enfermedades humanas que se derivan de las investigaciones en
medicina genmica surge el trmino de susceptibilidad gentica, es decir,
un polimorfismo o conjunto de estos que confieren propensin gentica al
desarrollo de ciertas enfermedades o bien a complicaciones de estas. La
capacidad de predecir con cierta exactitud los riegos de padecer enfermedades
donde los genes jueguen un papel fundamental hace posible la aplicacin de
medidas preventivas que limiten o incluso eviten los padecimientos y sus
complicaciones. La variabilidad gentica no slo es capaz de identificar la
susceptibilidad a los padecimientos, puede predecir adems la evolucin de
estos y su respuesta a las terapias farmacolgicas; claro ejemplo de ello son los
polimorfismos encontrados en pacientes con DM que se asocian a nefropata
diabtica severa [8].
Farmacogenica
La evaluacin de las reacciones txicas y adversas de los frmacos es un
requisito indispensable para su uso teraputico. Idiosincrasia es el trmino
acuado por la farmacologa para definir las reacciones individuales (tanto
teraputicas como toxicas) que puede experimentar un individuo tras la
administracin de una terapia farmacolgica; en definitiva, la respuesta
individual a las drogas es determinada por el genotipo [9,10].
De los estudios de variabilidad gentica se deriv la farmacogenmica,
disciplina que evala la influencia de los polimorfismos genticos en la
respuesta a los frmacos. Las evaluaciones farmacogenmicas de los nuevos
activos e incluso de los ya existentes permitirn incrementar la eficiencia y
bioseguridad de los tratamientos farmacolgicos para generar un tratamiento
justo a la medida del genotipo, en otras palabras, frmacos hechos a la medida
[10].
Medicina molecular y patogenia
Es clara la implicacin de la biologa molecular en el estudio, diagnstico y
tratamiento de padecimientos genticos hereditarios ocasionados por
mutaciones; sin embargo, todas las enfermedades humanas poseen un
componente gentico bien hereditario o como resultado de la respuesta del
organismo a los estmulos del medio, como las toxinas o los virus.
La exploracin de las funciones de cada gen humano y de sus implicaciones
Figura 3. Diagnstico Molecular. Las tcnicas generadas por la Biologa Molecular ofrecen ventajas
sobre las tcnicas convencionales en el diagnstico de enfermedades hereditarias y adquiridas.
Terapia gnica
La terapia gnica se define como la transferencia o introduccin de material
gentico para modificar el repertorio gentico de clulas, destinada a curar
enfermedades de origen tanto hereditario como adquirido. Las enfermedades
posibles de tratar con esta estrategia teraputica incluyen desde las
monognicas hereditarias hasta las polignicas e infecciosas; dada esta
diversidad, cada enfermedad requiere un abordaje particular. Las opciones en
la manipulacin gentica son variadas e incluyen la adicin o supresin de
genes. La adicin de genes (insertar un gen funcional que exprese la protena
teraputica en el tejido indicado), incluye la correccin de genes defectuosos,
insertar genes para inducir funciones nuevas o incrementar la expresin de un
gen de inters. Por otro lado, la supresin gnica se realiza a travs de RNA de
interferencia, oligonucletidos anti-sentido o bien ribozimas para disminuir o
anular la expresin de genes.
Segn el procedimiento que se aplique a las clulas para introducir el gen, la
terapia gnica se divide en terapia gnica ex vivo e in vivo (Figura 4). En la
terapia ex vivo las clulas a transfectar son cultivadas para posteriormente
introducirles el material gentico; una vez que estas clulas expresan el gen
teraputico son introducidas nuevamente al paciente. Por otro lado; la terapia
in vivo consiste en la introduccin directa del gen teraputico al torrente
sanguneo o en la administracin directa en el rgano o tejido diana. Cuando
la terapia gnica se aplica en clulas germinales se origina un cambio
permanente de todo el organismo y en generaciones posteriores. Por el
contrario, la aplicacin en clulas somticas implica que solo tejidos u rganos
Por otro lado, los vectores virales presentan una mayor eficiencia de
transduccin comparados con los sistemas no virales, por lo que son los
vectores de eleccin en los modelos in vivo y en protocolos clnicos de terapia
gnica. Hasta el momento se usan retrovirus, adenovirus, adenoasociados,
herpesvirus y baculovirus. Para su uso como vectores, los virus son
modificados genticamente para que sean deficientes en replicacin; en
algunas ocasiones adems, su cpside es modificada con la finalidad de dirigir
o re-direccionar su clula blanco. Cada uno de estos vectores posee ventajas y
limitaciones respecto a los otros dependiendo del transgen, el tipo celular y la
va de administracin. En general, un vector ideal debe producirse de manera
fcil y eficiente, no ser txico o inducir reacciones inmunolgicas, ser capaz de
infectar a clulas tanto en reposo como en replicacin y transducir tipos
celulares de manera especfica.
Con base en la naturaleza de su genoma los vectores virales pueden ser
divididos en vectores de RNA y DNA; dada su capacidad de integrar o no su
genoma viral dentro del DNA cromosmico de la clula husped pueden ser
clasificados como vectores integrativos o nointegrativos. Los vectores
integrativos se basan en retrovirus; los no integrativos incluyen a los vectores
adenovirales (Ad), virus adeno-asociados (AAV) y los virus de herpes simple
tipo 1 (HSV-1).
Medicina de RNA
La medicina de RNA utiliza diversas estrategias basadas en el uso de
molculas de RNA con fines teraputicos. De estas estrategias, la primera en
ser desarrollada fue la terapia antisentido; es decir, aquella basada en el
empleo de oligonucletidos antisentido expresamente diseados para
bloquear la accin de determinados genes. Esta idea inicio promisoriamente
hacia 1992 en la Universidad de Harvard, donde se propuso inicialmente que
la terapia antisentido podra resultar eficaz para tratar enfermedades
vinculadas con una actividad gentica anormal y donde se inici la
elaboracin comercial de oligonucletidos antisentido.
Esta terapia se basa en la sntesis de un oligonucleotido antisentido a un
mRNA para el que se desea bloquear su traduccin, evitando as la
produccin de una protena nociva. En un abordaje alterno, el oligonucletido
puede ir dirigido a unirse a un DNA de doble cadena que contiene una
mutacin causante de una patologa; de esta manera, la triple cadena formada
no ser transcrita, impidiendo la expresin del gen defectuoso.
Las desventajas presentadas por esta estrategia estriban en la gran cantidad de
oligonucletidos que se requieren administrar para sistemas in vivo y en la
facilidad de degradacin de estos RNA de cadena sencilla (a veces aun antes
de alcanzar su objetivo); adems, dada la conformacin espacial tanto del
DNA como del RNA, aun con un diseo terico correcto no es posible
asegurar la hibridacin del oligonucletido. Esta estrategia ha probado ser til
para bloquear la expresin del oncogn kRAS, los efectos fibrticos del TGF-
y para inhibir la expresin vrica del VHC.
El sistema de inhibicin conocido como RNA de interferencia (RNAi) se
descubri al observarse que algunas molculas de RNA de longitud pequea
podan anular la expresin de genes en clulas de plantas y animales al
hibridar con las cadenas de RNA mensajero, con lo que la sntesis proteica se
vea inhibida [17,18]. Este proceso de inhibicin con RNA de doble cadena se
da en las clulas naturalmente, por ejemplo, las plantas lo utilizan como
defensa contra infecciones virales; otros procesos dentro de la clula utilizan
mecanismos similares.
El siguiente aporte en esta historia, despus del descubrimiento de los RNA
pequeos, ocurri a mediados del 2002 cuando se identific una enzima con
actividad de ribonucleasa llamada Dicer. Esta enzima es la encargada de
producir en la clula las molculas de RNA pequeo a partir de molculas de
RNA grandes. Los segmentos cortados pueden ser, segn el gen que los
produjo, microRNAs y RNAs interferentes cortos (siRNAs).
Los siRNAs se originan por el procesamiento de un RNA largo de doble
cadena (dsRNA) por la enzima Dicer que genera fragmentos de 20-25
nucleotidos de longitud. Este siRNA se incorpora a un complejo denominado
Complejo Silenciador Inducido por RNA (RISC) que contiene proteasas. Al
constituirse el RISC, las hebras complementarias (sentido y antisentido) del
siRNA son desapareadas. El siRNA desapareado antisentido se asocia,
mediante hibridacin, con el RNA blanco y gua al complejo RISC hacia su
secuencia blanco (mRNA sentido) al cual es complementario. La actividad de
endorribonucleasa corta el RNA blanco en la porcin media de la regin
pareada y algunas exonucleasas completan la degradacin. Esta estrategia se
ha utilizado como herramienta para silenciamiento de genes especficos en
clulas de mamfero. Otras estrategias que se han implementado para inducir
la expresin de estas molculas son la inyeccin de dsRNA (sintetizado
qumicamente o transcrito in vitro), el bombardeo de partculas recubiertas del
RNAi o la transfeccin con vectores que portan secuencias para la expresin
endgena del RNAi (transitoria o estable).
Las posibilidades y aplicaciones del RNA pequeo han cambiado la manera
de entender la produccin de protenas, la cual ya no se puede explicar sin la
participacin de estos RNA que pueden inactivar genes completos. Como
estrategia teraputica, su poderosa accin de inhibicin y la posibilidad de
propagarse de una clula a otra podr generar nuevas terapias genticas
altamente eficaces. Por su tamao pequeo, su participacin en la expresin o
inexpresin de protenas y sus funciones todava desconocidas, los RNA
pequeos se han convertido en molculas clave que repercutirn en la forma
en que nos acercamos a los mecanismos de la vida.
Los microRNAs (miRNA) son RNA de cadena sencilla de 21-23 nucletidos de
longitud que regulan la expresin gnica. Fueron descritos por primera vez
por el grupo de Victor Ambros en 1993 como small RNAs, aunque el termino
micro RNA se acuo hasta el 2001 por Ruvkun [19,20]. Los miRNA son
codificados por genes que son transcritos mas no traducidos; estos transcritos
son procesados a un forma llamada pri-miRNA que originan las estructuras
premiRNA que contienen una pequea horquilla; finalmente se originan los
miRNA maduros. Los genes que los originan son transcritos primariamente a
pri-miRNA con una CAP y una cola de poli A que es procesado en el ncleo
de la clula a un segmento corto de 70 nucletidos con estructura de pasador
llamado pri-miRNA. Este procesamiento lo realiza un complejo llamado
Microprocessor complex, que incluye una nucleasa llamada Drosha y una
protena de unin a RNA de doble cadena denominada Pasha.
Posteriormente, en el citoplasma, el pre-miRNA es procesado a su forma
madura por la nucleasa Dicer que inicia la formacin del complejo RISC
(complejo inductor del silenciamiento de RNA). El corte por Dicer origina dos
molculas pequeas complementarias de RNA, de las cuales solo una,
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Tcnicas de extraccin
La preparacin de la muestra puede tener un impacto mu y significativo en la
sensibilidad y reproducibilidad del mtodo diagnstico. En general, el mtodo
de preparacin de la muestra debe liberar el ADN intracelular, rompiendo la
pared de la clula fngica, la membrana celular y la membrana nuclear.
Adems, debe concentrar las molculas blanco del ADN que puedan estar
presentes en pequeas cantidades y debe eliminar los restos de protenas,
contaminantes, posibles inhibidores y otros materiales extraos, sin que se
degrade el cido nucleico.
Existe una gran diversidad de protocolos individualizados y tcnicas caseras
de extraccin. Las divergencias entre ellos se centran fundamentalmente en el
mtodo de ruptura de envoltorios . Todos los hongos no presentan las mismas
necesidades en este sentido, de forma que algunos se lisan de manera sencilla
con un choque osmtico y detergentes, mientras que otros precisan de la
combinacin de varias estrategias para poder exponer el genoma. En general,
los mecanismos de ruptura y lisis de pared y membranas pueden ser de tres
tipos: mecnico, osmtico y enzimtico o bioqumico, pudindose combinar
entre ellos.
A pesar de tanta variedad, existen protocolos ya estandarizados de uso muy
frecuente para un amplio nmero de especies fngicas. Entre los protocolos de
extraccin comercializados, Microbial DNA Isolatio n Kit (Mo Bio
Laboratorios, CA, EE.UU.) y QIAmp DNA Mini Kit (QIAGEN, CA, EE.UU.)
son fiables pero su precio es elevado; entre los protocolos de extraccin
caseros, el publicado por White y col. es uno de los que presenta mayores
garantas [14].
En caso de no disponer de un protocolo estandarizado, algunos detalles
prcticos pueden ayudar a elegir entre los disponibles. Un aspecto importante
es el tipo de muestra (con o sin inhibidores) y la cantidad de que se dispone de
la misma. En general los mtodos de biologa molecular no precisan de
grandes cantidades de muestra, de hecho es otra de las ventajas de estas
tcnicas, pero en ocasiones hay que tenerlo en cuenta (muestras oculares) para
elegir mtodos con alto rendimiento [3]. Por otra parte, es muy importante
valorar la presencia de la diana que se va a tratar de detectar. Algunos
mtodos de extraccin suponen una gran prdida del ADN, o una dilucin
sustancial de este, durante el procesado de la muestra. Cuando la tcnica
elegida incluye la amplificacin de la diana, el problema es menor que si se
han elegido tcnicas de hibridacin u otras que no multiplican la secuencia a
detectar. Las dianas que estn presentes en un alto nmero de copias a lo
largo del genoma del hongo originan menos problemas en este sentido. Si
adems se utilizan tcnicas de amplificacin de las mismas, el efecto de
prdida de ADN asociado a la extraccin es menor. Por ltimo, y muy
importante, es imprescindible tener en cuenta las peculiaridades del hongo a
detectar, especialmente la posible presencia de envoltorios u otras estructuras
Dianas ribosmicas
La regin genmica ms frecuentemente utilizada para detectar ADN fngico e
identificar especies, es la que incluye el complejo ribosomal (genes 18S, 5.8S y
28S). Estos genes contienen secuencias conservadas comunes a todos los hongos
y tambin, dominios variables y regiones espaciadoras internas (ITS), altamente
variables. Las secuencias conservadas se pueden utilizar para detectar la
infeccin fngica, mientras que las variables se pueden emplear para la
identificacin de las especies implicadas. Esta regin adems, se encuentra en el
genoma en un alto nmero de copias. En levaduras concretamente, se estiman
unas 150 repeticiones en tandem de los genes ribosmicos [20] lo que garantiza
la sensibilidad del mtodo de deteccin. De hecho, se han obtenido magnficos
resultados en este sentido con dichas secuencias ribosmicas [3,21,22]. La
organizacin de este complejo en los hongos, representada en la Figura 20.1,
permite disear sondas y cebadores que hibriden y detecten tanto secuencias
muy conservadas e inespecficas, como variables y muy especficas,
dependiendo del objetivo del mtodo.
Figura 20.1. Estructura del ADN ribosmico, con los fragmentos ITS (Internal Transcriber Spacers). La
amplificacin de estas zonas de ADNr utilizando los iniciadores ITS-1 e ITS-4 y posterior secuenciacin de los
fragmentos amplificados, permite diferenciar entre la mayora de las especies fngicas. La tcnica de PCR en
tiempo real permite automatizar el proceso y cuantificar la deteccin.
(por encima de especie). Existen trabajos que utilizan esta regin para detectar
infeccin fngica por amplificacin PCR, pero centrndose en las regiones
variables [2].
Regin de los espaciadores. Esta regin incluye los espaciadores intergnicos
ITS1 e ITS2 y el gen de la subunidad 5.8S. Actualmente, este es el fragmento
ms utilizado como diana para la deteccin e identificacin de hongos. El
fragmento completo tiene una longitud aproximada de 600 pares de bases (su
tamao vara segn la especie). El gen 5.8S no es vlido para filogenia ni
identificacin, pero es una excelente diana para unin de cebadores universales
puesto que la secuencia est muy conservada y es de pequeo tamao. Las
regiones espaciadoras tienen secuencias con variabilidad interespecie (con
algunas excepciones). En conjunto ofrecen una magnfica diana puesto que las
regiones conservadas facilitan el diseo de cebadores que se unen en todos los
hongos; adems, el fragmento que flanquean posee secuencias variables para
las diferentes especies de un gnero. Por otra parte, el pequeo tamao del
segmento facilita el estudio y comparacin de la secuencia. La mayora de las
tcnicas moleculares se centran en el estudio de esta regin [3,28,29].
El hallazgo de zonas variables, como los fragmentos ITS 1 y 2 del ADN
ribosmico (ADNr) o las zonas D1/D2 del 28S de ADNr, estn desplazando las
pruebas basadas en la deteccin del 18S. Para seleccionar la diana ms
adecuada en cada caso primero hay que preguntarse qu se busca?
Obviamente, se busca ADN fngico pero es importante definir una de las dos
estrategias posibles:
1. Inespecfica (mtodos no orientados): Detecta cualquier hongo que se
encuentre en la muestra.
2. Especfica (mtodos orientados): Detecta hongos de una especie
determinada, por ejemplo Candida albicans, o de un gnero concreto
(Candida, Aspergillus, etc.).
Para cada uno de los planteamientos se combinar una diana determinada y un
mtodo de deteccin. Se pueden detectar dianas diferentes aunque se trabaje en
la misma regin del genoma (ADN ribosmico) y, dependiendo de la
metodologa utilizada, desarrollar una estrategia de tipo especfico o
inespecfico.
Mtodos de amplificacin y deteccin
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR Polymerase Chain Reaction) ha
sobrepasado a otras tcnicas de diagnstico basadas en los cidos nucleicos,
como el Southern Blot, debido a su simplicidad, sensibilidad, rapidez y
especificidad. La PCR permite la amplificacin de la regin del genoma
seleccionada para anlisis, en un tiempo mnimo (aproximadamente 31/2 h).
No obstante, los mtodos de hibridacin siguen teniendo cierto lugar en
diagnstico, por lo que se comentan brevemente.
Figura 20.2. Representacin del proceso de amplificacin de fragmentos de cido nucleico medinte la tcnica de la
Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR). Los tres pasos que se repiten representan un ciclo completo, con las fases
de desnaturalizacin (separacin de cadenas), unin de los cebadores a cada hebra y sntesis de la copia del fragmento
diana. El proceso se repite tantos ciclos como se programe, obtenindose un elevado nmero de copias idnticas de la
diana.
Tcnicas de hibridacin
Emplean sondas de ADN para detectar la presencia de un organismo
determinado. La sonda es una cadena nica de ADN que se ha sintetizado para
que sea complementaria a la secuencia que se quiere detectar y que va marcada
para poder identificarla despus de la hibridacin. Las tcnicas ms extendidas
dentro de este grupo son las que detectan AD N ribosmico de Histoplasma
capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Penicillium marneffei y
Cryptococcus neoformans. Algunas de estas tcnicas se han llegado a
comercializar empleand o quimioluminiscenci a como sistema de revelado (
AccuProbe: Gen-Probe, San Diego, EE.UU.). Se parte de una pequea porcin
de la colonia a identificar, se extrae el RNA y luego se permite que hibride con
sondas marcadas con steres de acridina, captndose la luz emitida por medio
de un luminmetro [7].
Las pruebas de hibridacin in situ se han empleado para localizar cidos
nucleicos de los microorganismos en tejidos. Esta tcnica ha sido usada para la
identificacin de Candida spp. y Aspergillus spp. Aunque el proceso es rpido y
sencillo de realizar, la sensibilidad de la prueba es frecuentemente ms baja que
las pruebas de amplificacin de cidos nucleicos. La hibridacin in situ y
revelado mediante la observacin microscpica de fluorescencia, se ha aplicado
tambin para la identificacin de Candida spp. y algunos hongos filamentosos
directamente en muestras clnicas. Habitualmente, la diana empleada es el
fragmento 18S del RNA ribosmico, que tiene una especificidad limitada, con
abundantes falsos positivos.
Tcnicas de amplificacin
Adems de la PCR convencional ltimamente ya estn apareciendo trabajos
para la deteccin de ADN fngico mediante PCR a tiempo real. La PCR consiste
bsicamente en la localizacin de secuencias especficas por complementariedad
de bases, como en la hibridacin; pero una vez halladas, la PCR las copia
mltiples veces amplificando su presencia y por tanto su seal mientras que la
hibridacin simplemente las marca. En la hibridacin suelen utilizarse
compuestos que emiten una seal fluorescente para marcar las secuencias
diana. El producto (amplicn) generado en la PCR clsica se suele detectar
mediante electroforesis en gel de agarosa, teido con bromuro de etidio.
Figura 20.3. Obtencin de fragmentos especficos de cido nucleico mediante la tcnica de la PCR anidada. Se
parte del producto de la primera PCR (Figura 20.1) y se somete a una nueva amplificacin que puede ser: con
cebadores nuevos que hibriden en regiones comprendidas en la primera diana (PCR Anidada o Nested PCR); o
con un cebador igual a la primera amplificacin junto con uno nuevo que hibrida dentro de la regin amplificada
(PCR Semianidada o Seminested PCR).
PCR a tiempo real (Real Time PCR). Con esta tcnica, la recoleccin y el
anlisis de datos se producen al mismo tiempo que la reaccin de amplificacin
de dianas. Para ello, al mismo tubo de reaccin se aaden marcadores de ADN
o sondas fluorescentes; de esta forma, durante la amplificacin se mide la
aparicin de ciertos componentes y as es posible recoger y analizar los datos al
mismo tiempo (Figura 20.4). Por lo tanto, con esta tcnica no hay transferencia
de muestras, no se aaden nuevos reactivos ni tampoco se utiliza el gel de
agarosa para ver los resultados. Con todo ello se consigue minimizar el
problema de la contaminacin denominada carry over que proviene de los
mismos amplicones obtenidos en PCRs anteriores. La cantidad de ADN diana
inicial determina el incremento de fluorescencia que se va obteniendo en cada
ciclo.
El sistema ms utilizado en los laboratorios asistenciales es el LightCycler
(Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Esta tecnologa combina la
amplificacin rpida en capilares mediante aire caliente, junto a la deteccin
simultnea del amplicn, mediante un sistema de marcado con fluorocromos. El
sistema de deteccin se basa en la transferencia por resonancia de energa
fluorescente con dos sondas especficas distintas. La primera sonda de
hibridacin marcada con fluorescena y una segunda sonda de hibridacin
marcada con el fluorforo LightCycler Red 640. Ambas sondas hibridan con el
amplicn en posicin cabeza-cola, es decir que el marcador fluorescente y el
fluorforo quedan muy prximos. En esa posicin se produce una transferencia
de energa entre ambos, lo que determina la emisin de fluorescencia que es
medida por el sistema, siendo proporcional a la cantidad de ADN generado
durante el proceso de PCR. A da de hoy, la fluorescencia con SYBR Green I es
el indicador de eleccin para la PCR a tiempo real, pero existen variantes
dependiendo del marcador y la tcnica utilizada [5,15,35].
Figura 20.4. Representacin del sistema de amplificacin y lectura de PCR a tiempo real (real time PCR). La unin
de SYBR Green I a la doble cadena de ADN durante su sntesis va acompaada de la emisin de una seal que
permite detectar en cada momento la presencia del fragmento diana y extrapolar la cantidad de la misma en la
muestra inicial.