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ISSN: 1665-2738
amidiq@xanum.uam.mx
Universidad Autnoma Metropolitana Unidad
Iztapalapa
Mxico
Revista Mexicana
de Ingeniera Qumica
Academia Mexicana de Investigacion y Docencia en Ingeniera Qumica, A.C.
ISSN 1665-2738
Vol. 12,
No. 1 (2013) 41-56
CONTENIDO
UN ANALISIS
DEL METABOLISMO DE Aspergillus niger
ANand
ANALYSIS
THE METABOLISM
213 Derivation
application of OF
the Stefan-Maxwell
equations
OF Aspergillus niger
GROWING OVER A SOLID SUBSTRATE
Stephen Whitaker
1
Resumen
of niger
sludge
bioreactors
totaluna
petroleum
weathering
soil
Se analiza el(Biodegradation
metabolismo demodeling
Aspergillus
A10
creciendoofsobre
placa dehydrocarbons
agar, utilizando
un modeloinestructurado
que
and
sediments)
describe a las
rutas
de la glicolisis (EMP), pentosa-fosfatos (PF), el ciclo de los a cidos tricarboxlicos (CAT), y la produccion de
biomasa, e incluye
la regulacion de S.
diferentes
enzimas C.A.
en EMP
y CAT en terminosL.deAguilera-Vzquez,
las concentracionesA.deJimneza cido ctrico y ATP
S.A. Medina-Moreno,
Huerta-Ochoa,
Lucho-Constantino,
en el micelio. Las predicciones del modelo se apoyan en una serie de experimentos con diferentes concentraciones de glucosa
Gonzlez y M. Gutirrez-Rojas
en el medio solido, as como mezclas binarias de sustratos como fuentes de carbono. Ademas de las mediciones de biomasa,
Crecimiento,
adaptacin
Bifidobacterium
infantis
a condiciones
cidas
el CO2 259
producido
y el O2 sobrevivencia
consumido se ymiden
en unade
caja
Petri modificada.
Se utiliza
el concepto
de disipabilidad de energa
(Atkinson, 1969), para analizar la eficiencia del crecimiento a concentraciones de glucosa inicial en la placa de agar que van de
(Growth,
survival and adaptation of Bifidobacterium infantis to acidic conditions)
25 a 250 gL1
.
L. Mayorga-Reyes, P. Bustamante-Camilo, A. Gutirrez-Nava, E. Barranco-Florido y A. Azaola-
Palabras clave: metabolismo de Aspergillus niger, sustrato solido, modelo estructurado, rutas metabolicas,
medicionesEspinosa
de biomasa, CO2 y O2 , caja Petri modificada.
265 Statistical approach to optimization of ethanol fermentation by Saccharomyces cerevisiae in the
Abstract
The metabolism of Aspergillus niger A10 growing on agar plates is analyzed using a structured model that includes the pathways
Valfor zeolite (PP),
NaA the Krebs cycle (TCA), and mycelial biosynthesis; and takes into account enzyme
for glicolysispresence
(EMP), of
pentose-phosphate
regulation in EMP and TCA either due to low or high levels of citrate and ATP in cytosol. Model predictions are supported by a
(Optimizacin estadstica de la fermentacin etanlica de Saccharomyces cerevisiae en presencia de
series of experiments measuring mycelial growth under different glucose concentrations in the agar plates, as well as the use of
Valfor
zeolite
NaA)
a two-carbonzeolita
sources
mixtures.
Besides
measurements of biomass, CO2 production and O2 consumption were also continuously
measured inG.theInei-Shizukawa,
gas-phase of a H.
modified
Petri dish. Atkinsons
energy chargeand
(1969)
concept is used to analyze the growth
A. Velasco-Bedrn,
G. F. Gutirrez-Lpez
H. Hernndez-Snchez
efficiency under increasing glucose concentration in the agar plates in the range: 25 to 250 gL1 .
Keywords:
Aspergillus
niger/ Process
metabolism,
structured model, continuous measurements of CO2 and O2 , modified
Ingeniera
de procesos
engineering
Petri dish, biomass growth on solid substrate.
271 Localizacin de una planta industrial: Revisin crtica y adecuacin de los criterios empleados en
esta decisin
Introduccion
Medina, R.L.
Romero
Prezproduce
El hongo J.R.
Aspergillus
niger
(A.y G.A.
niger)
diversos compuestos de gran interes para las industrias
farmaceutica y de alimentos (enzimas, a cidos
organicos), y es el principal productor de a cido
41
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medio lquido (Papagianni, 2007; Wolschek y col.,
1999). Sin embargo, no es posible conocer aun todos
los factores ambientales y fisiologicos que originan
esta acumulacion, ni saber como estos determinan la
morfologa del micelio, la cual podra, en principio,
usarse como un indicador del nivel de produccion del
a cido, al realizar mediciones del diametro promedio
de las madejas formadas por las hifas en el medio
lquido, que se cree corresponden a un medio con
altas concentraciones de glucosa, O2 y a cido ctrico,
antes de que la difusion de sustrato y O2 sea deficiente
cuando la madeja alcance un tamano crtico, de
acuerdo con el criterio de Thiele (Thiele, 1939;
Hellendoorn y col., 1998).
Por otro lado, puede ser mas facil estudiar la
morfologa y fisiologa de A. niger en un medio solido,
y determinar el efecto de los diferentes nutrientes y de
la concentracion inicial de glucosa, ya que no existe
la limitacion del O2 del aire. Sin embargo, es muy
difcil realizar estudios dinamicos en este sistema, ya
que no es posible lograr cambios rapidos en la entrada
al sistema como en el caso de un cultivo lquido,
ya que en e ste no se presenta el proceso difusivo de
nutrientes y sustrato como en un medio solido. De
estudios en medios solidos se ha observado que los
valores promedio de la longitud y del diametro de
las hifas distales varan en relacion inversa con la
concentracion inicial de glucosa (Larralde-Corona y
col., 1997; Reyes Ocampo, 2006), aunque es difcil
diferenciar entre hifas aereas, superficiales, y las que
penetran la placa de agar (Rahardjo y col., 2005).
Esto hace muy difcil obtener un modelo confiable
que describa la morfologa de A. niger y permita
predecir la produccion de a cido ctrico, ya sea e ste
modelo de tipo logstico, Monod o una combinacion
de ellos (Reyes Ocampo, 2006), que hasta ahora
han sido usados para describir el crecimiento de la
longitud promedio del micelio y su relacion con la
produccion de a cido ctrico usando un modelo de
tipo Luedeking-Piret (Luedeking y Piret, 1959). Ya
que en un medio solido el transporte de masa se da
por la difusion de los diversos nutrientes a traves de
e ste, los experimentos realizados no permiten conocer
facilmente el papel que juegan otros factores, como
la concentracion de diversos metales (Mn, Mg), de
otras fuentes de carbono y del pH, por la dificultad
de medir estas variables en el medio solido durante el
crecimiento, lo que no sucede en un medio lquido.
En el crecimiento en estado solido, normalmente
sobre una placa de agar en una caja Petri, es facil
medir la cantidad de biomasa producida para diversas
concentraciones iniciales de glucosa, pero no es facil
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como un sistema biologico abierto, es importante
conocer como se lleva a cabo la asimilacion de
diversas fuentes de carbono (glucosa, glicerol), y
cuando a una de e stas se les adiciona alguno de
los metabolitos que se sabe son excretados al medio
durante el crecimiento del microorganismo (acidos
ctrico y oxalico). El estudio se realiza entonces
comparando las mediciones de consumo de oxgeno
y produccion de CO2 en la fase gaseosa en la CPM,
simultaneamente con las mediciones de peso seco de
la biomasa producida en la caja Petri, analizando las
respuestas de los diversos experimentos realizados, y
comparandolas con las predicciones del modelo.
Materiales y metodos
2.1
El microorganismo de estudio
2.2
El sistema experimental
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seco de biomasa.
2.2.3 Ensayos analticos
La medicion continua de la produccion de CO2 y del
consumo de O2 durante el crecimiento de A. niger, se
realizo utilizando sensores Vernier para estos gases.
El sensor de CO2 mide los niveles de este gas en el
intervalo de 0 a 10,000 ppm (ajuste de rango bajo) o
de 0 a 100,000 ppm (ajuste de rango alto), controlando
la cantidad de radiacion infrarroja absorbida por las
moleculas de dioxido de carbono. El sensor de O2
mide la concentracion de este gas en el intervalo de
0 a 27% en mol utilizando una celda electroqumica
que contiene un a nodo de plomo y un catodo de oro
en un electrolito. Las moleculas de oxgeno que
entran en la celda se reducen en el catodo de oro; esta
reaccion genera una corriente que es proporcional a
la concentracion de oxgeno entre los electrodos. El
registro de los datos en lnea se llevo a cabo usando la
interfase LabPro y el software LoggerPro de Vernier.
2.3
Fig. 1. La caja Petri modificada que permite la
medicion en lnea del oxgeno consumido y el dioxido
de carbono producido durante el crecimiento de
Aspergillus niger A10.
en el centro de la caja utilizando una punta de
pipeta en un volumen pequeno de la suspension
de aproximadamente 20 L, obtieniendose as una
colonia circular.
2.2.2 Medicion del peso seco.
Las esporas inoculadas en la caja Petri crecieron
durante 5 das a una temperatura constante de 30 C.
Para la medicion del peso seco de la biomasa, se
inoculo la misma concentracion de esporas sobre la
hoja de papel celofan en 15 cajas Petri que contenan al
medio de cultivo. A diferentes tiempos se removio la
hoja de celofan conteniendo al micelio de la superficie
del agar, lo que permitio medir a la cantidad de
biomasa a diferentes tiempos, para cada condicion del
medio de cultivo. La hoja de papel celofan, que haba
sido previamente tratada y pesada, y que contiene al
micelio, se seco en una estufa a 60 C durante 24 horas,
para despues ser almacenada en un desecador por una
noche y ser pesada en la balanza analtica. El peso
seco de la muestra se obtuvo de la diferencia del peso
seco y el resultado se reporta como gramos de peso
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Diseno experimental
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GLUCOSA
BIOMASA
ATP
NADPH+
CO2
G6P
G6P
UTP
NADPH+
CO2
ATP
UTP
R5P
BIOMASA
PF
ATP
BIOMASA
Glutamina + UTP
ATP
ACIDO CITRICO
F16DP
ASP
EMP
OXALATO +
ACETATO
OAA
G3P
DHAP
BIOMASA
ATP + CO2
2 ADP
NAD+
CO2
ATP + NADPH 2
GLIC3P
NADPH+
PIR
MAL
ATP
GLICEROL
CAT
CO2 + ACIDO
FORMICO +
FORMALDEHIDO +
METANOL
CITRATO
ACIDO OXALICO
CO2
KGT
NADPH2 + NH3
ATP + NADPH2
GLUTAMINA
NH3
GLUTAMATO
BIOMASA
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da por un proceso de difusion pasiva en terminos de
un gradiente entre el exterior y la parte interna de la
membrana, de acuerdo con la permeabilidad de esta
pared para cada especie. El micelio crece de forma
homogenea como una serie de Nh tubos hifales de
igual longitud Lh (t) y diametro dh , que permanece
constante (Larralde, 1997), y los procesos difusivos
en la CPM se dan solo en una direccion normal a la
superficie de la placa de agar.
Los balances de masa para la especie n en la fase
(solido o gas) pueden expresarse como sigue:
2Cn
Cn
= D
t
z2
(1)
(2)
Cn
= Pn Cn CnC
z
(3)
V h = Lh 2 dh h = N h dh 2 Lh
4
(4)
Xn
dC nC
d
dV h
X V hC nC = X [V h
+ C nC
] = Vh
Rn j
dt
dt
dt
j=1
(5)
Entonces, el balance de masa dentro del micelio
para la especie n que participa en la reaccion j, para
un numero NRn , esta dada por la siguiente ecuacion:
NR
CnC
1 Xn
Rn CnC
=
dt
X j=1 j
(6)
1 dV h
2 dLh
1 dX
=
=
V h dt
Lh dt
X dt
(7)
1
1 + [CIT] +
[ATP]
K 2ATP
(9)
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(10)
Resultados y discusion
3.1
0.32
0.3
0.24
0.2
0.16
0.1
0.4
0.08
CO2, mM
(12)
0
0
40
80
120
Tiempo (h)
160
0
200
2
Peso seco de biomasa (g)
E=
0.4
ATP
0.5
CO producido (mM)
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1.5
0.5
0
0
50
100
150
Tiempo (h)
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0.05
X-100 g/L
X-150
X-200
X-250
Biomasa (g)
1.5
X-25 g/L
X-50
0.04
a
0.03
1
0.02
0.5
0.01
50
100
150
200
250
0
300
Tiempo (h)
Biomasa (g)
0.07
0.8
X-100 g/L
X-150
X-200
X-250
0.6
X-25 g/L
X-50
0.06
0.05
0.04
0.03
0.4
Biomasa (g)
48
Biomasa (g)
0.02
0.2
0.01
0
50
100
150
200
250
0
300
Tiempo (h)
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0.8
0.06
a
0.05
0.6
Biomasa (g)
Carga Energtica
0.07
Glucosa 25 g/l
50 g/l
100 g/l
150 g/l
200 g/l
250 g/l
0.4
0.2
0.04
0.03
0.02
0.01
0
0
50
100
150
200
250
300
0
Tiempo (h)
100
150
200
Tiempo (h)
250
300
250
300
0.014
Citrico-25g/l Glucosa
Citrico-50g/l Glucosa
0.012
0.01
Acido Ctrico (g)
50
0.008
0.006
0.004
0.002
0
0
50
100
150
200
Tiempo (h)
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ATP
ADP
AMP
H+eENERGIA
0.8
RED =
0.6
0.4
0.2
0
0
50
100
150
200
250
300
Tiempo (h)
NAD+
NADH2
NADP
NADPH2
NAD+C
NADH2C
0.8
0.015
Biomasa
3.2
0.6
0.4
0.005
0.2
0
0
50
100
150
200
250
0
300
Tiempo (h)
50
(13)
0.01
Biomasa (g)
producto oxidado
[NAD+ ]
=
[NADH] sustrato reducido
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sustratos que compiten, es decir por difusion pasiva,
aunque utilizan diferentes valores de la permeabilidad
de cada sustrato. Esto tambien plantea el problema no
solo de la selectividad en la asimilacion sino tambien
el de los posibles mecanismos por medio de los
cuales estos compuestos son asimilados y excretados
(difusion pasiva, facilitada, activa). La idea de utilizar
mezclas binarias con estos metabolitos fue sugerido en
parte por la aparente diauxia que se observa en la Fig.
9 para el caso de 25 gL1 de glucosa, que parece que
cuando e sta se agota el micelio metaboliza a algunos
de los productos excretados.
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0
20
40
60
80
100
120
Tiempo (h)
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Cociente Respiratorio
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
50
100
150
Tiempo (h)
200
250
0.8
0.7
Cociente Respiratorio
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
100
200
300
400
Tiempo (h)
500
600
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3.2.5 Predicciones del modelo
0.025
a
0.02
Biomasa (g)
0.015
0.01
X-Gluc
X-Gluc y Cit
X-Gluc y Ox
X-Gluc y Glic
0.005
0
0
100
150
200
Tiempo (h)
-7
CO2-G
CO2-GCit
CO2-GGlic
CO2-GOx
250
300
1 10
-6
8 10
-7
1.5 10
-7
6 10
-7
1 10
-7
4 10
-7
5 10
-8
2 10
-7
-7
Conclusiones
2
2 10
CO (moles/cm )
CO (moles/cm )
2.5 10
50
b
0
0
50
100
150
200
250
0
300
Tiempo (h)
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Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Hugo Velasco Bedran (ENCB,
IPN) sus importantes comentarios y observaciones a
este trabajo, as como al Dr. Ascencion Montoya
de la Fuente por facilitar la construccion de la
caja Petri modificada. El primer autor agradece al
Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa la beca
otorgada (No. 188486) para cursar el Doctorado en
Ingeniera Qumica dentro del Posgrado de Excelencia
en Ingeniera Qumica de la Universidad Autonoma
Metropolitana-Iztapalapa.
Nomenclatura
concentracion molar de la especie n en
el citosol, g L1
Cn concentracion molar de la especie n en
la fase , g L1
Cn0 concentracion molar inicial de la
especie n, g L1
dh
diametro de las hifas, m
D coeficiente de difusion, cm2 h1
e
carga energetica
kj
constante de velocidad de la reaccion
j
KJ
constante de equilibrio de la reaccion
j
Lh
longitud del tubo hifal promedio, cm
L
longitud de la fase , cm
Nh
numero de tubos hifales
Pn permeabilidad del componente n en la
fase , cm h1
Rn j velocidad de reaccion j que
consume/produce a la especie
n
rj
velocidad de la reaccion j
t
tiempo, h
Vh
volumen total del micelio, cm3
X
biomasa, g
z
coordenada axial en la fase , cm
Smbolos griegos
X densidad del micelio, g cm3
h fraccion volumetrica ocupada por la biomasa
Metabolitos
6PG
KGT
ACoA
54
6 fosfogluconato
alfa-cetoglutarato
acetil coenzima A
ADP
AMP
ASP
ATP
Cit
DHAP
E11
F16DP
G3P
G6P
GLIC3P
NAD+
NADH
NADP+
NADPH
NH3
OAA
PFK
Pir
R5P
UTP
adenosin difosfato
adenosin monofosfato
aspartato
adenosin trifosfato
citrato
dihidroxiacetona fosfato
termino de regulacion de la enzima
fructosa 1, 6 difosfato
gliceraldehdo 3 fosfato
glucosa 6 fosfato
glicerol 3 fosfato
nicotinamida adenina dinucleotido
nicotinamida adenina dinucleotido
reducido
nicotinamida adenina dinucleotido
fosfato
nicotinamida adenina dinucleotido
fosfato reducido
amonaco
oxaloacetato
termino de regulacion de la enzima
fosfofructoquinasa
piruvato
ribosa 5 fosfato
uridina trifosfato
Referencias
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