Paola Corts Garduo / paoco93@gmail.

com
02/11/16
Seminario de investigacin I / Protocolo de investigacin.
1.- Anlisis del potencial sinttico de polmeros a partir del
aislamiento de distintos hongos y levaduras marinas adicionando
distintas fuentes de carbono y minerales en laboratorio de celulosa y
papel (UdG).
Proceso metodolgico central
Objeto de estudio

Variables independientes
Variables dependientes
Lugar o condicin

Anlisis del potencial sinttico.

Potencial sinttico de polmeros a
partir de distintos hongos y
levaduras marinas.
Hongos y levaduras marinas.
Fuente de carbono y minerales.
Laboratorio de celulosa y papel
(UdG).

2.- Planteamiento del problema

Se requieren de alternativas rentables para sustituir materiales
contaminantes. Se necesita ms investigacin en cuanto al potencial de
sntesis de polmeros en hongos o levaduras marinas, ya que se sabe poco
de dichos organismos salinos.
2.1.- Problemtica:
Existen miles de datos que registran una contaminacin excesiva debido al
uso de polmeros de plstico. Un gran problema es que muchos de los
polmeros utilizados para producir plstico como el poliuretano, no se recicla
fcilmente y no se degrada. El 99 % de la totalidad de plsticos se produce a
partir de combustibles fsiles, lo que provoca una excesiva presin sobre las
limitadas fuentes de energa no renovables. En la actualidad es difcil
prescindir de los plsticos, no slo por su utilidad sino tambin por la
importancia econmica que tienen. Esto se refleja en los ndices de
crecimiento de esta industria que, desde principios del siglo pasado, supera a
casi todas las actividades industriales. No existen muchos estudios que
reflejen que los hongos pueden llegar a producir polmeros, pero debido al
potencial que tienen para crecer en carbono, existe la posibilidad de que
puedan sintetizar sustancias similares a polmeros de plstico. Existen
estudios en los que se demuestra la capacidad de diversos hongos para
crecer en ambientes como hidrocarburos en aguas marinas, lo cual puede
llegar a ser un medio de cultivo que ayude a sintetizar polmeros por la
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acumulacin de otras sustancias. Se ha intentado atacar la problemtica de
la acumulacin de plsticos en el ambiente a travs de procesos de
incineracin, reciclaje, fotodegradacin o reuso. Sin embargo estas medidas
presentan desventajas por lo que no se consideran como soluciones 100%
efectivas. Por ejemplo, durante el proceso de incineracin se puede
desprender cido cianhdrico y cido clorhdrico con potenciales daos para la
salud. En el caso del reciclaje, este es complicado y consume mucho tiempo,
adems de que la presencia de muchos aditivos en los plsticos, como
pigmentos y cubiertas, limita el proceso (Khanna y Srivastava 2005).
2.2.- Contexto:
En funcin de las propiedades de los plsticos, la estructura del mercado ha
crecido considerablemente. Para el ao 2000, la produccin mundial alcanz
los 160 millones de toneladas y en Mxico para el ao 2006, super los 4
millones de toneladas. Se calcula que anualmente cada persona en Mxico
consume 49 kg de plsticos. A nivel mundial, se calcula que 25 millones de
toneladas de plsticos se acumulan en el ambiente cada ao y pueden
permanecer inalterables por un periodo de entre 100 y 500 aos. Esto se
debe a que su degradacin es muy lenta y consiste principalmente en su
fragmentacin en partculas ms pequeas, mismas que se distribuyen en los
mares (en estos se han encontrado entre 3 a 30 kg/km 2), ros, sedimentos y
suelos, entre otros (Jornada Ecolgica, 2013). Es comn observar paisajes
en caminos, reas naturales protegidas, carreteras, lagos, entre otros, con
plsticos tirados como parte de lo mismo. Por su composicin y su origen
derivado del petrleo (un recurso agotable), los plsticos son un residuo de
alto valor, relativamente fcil de recuperar y abundante. Paradjicamente no
ha sido objeto de una separacin y recoleccin selectiva, pues en Mxico se
calcula que del total de residuos plsticos que se generan slo el 12 % se
recupera para su reciclaje (Cmo ves, 2015).
La biotecnologa fngica ha avanzado considerablemente en las ltimas cinco
dcadas. Se ha comprobado el potencial de produccin de metabolitos
secundarios de las especies Candida sp., Aspergillus sp., Penicillium sp.,
Trichoderma sp. y Debaryomyces sp. aislados de distintas zonas costeras y
de distintos sustratos como mangle, sedimentos marinos y rocas
(Raghukumar, 2008).

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2.3.- Pregunta de investigacin:

Cmo se establecer la eficiencia de la produccin de polmeros de hongos
marinos?
2.4.- Importancia de la investigacin:
Producir alternativas biolgicas eficaces y a su vez rentables en el sector
industrial, que logren sustituir materiales que como se ha mencionado
contaminan y tardan cientos de aos en degradarse.
Lograr cerrar un ciclo biolgico utilizando hidrocarburos u otros desechos que
proporcionen carbono, que a su vez se utilizarn como alimento para
microorganismos, estos degradarn el compuesto y posteriormente
sintetizarn compuestos similares al plstico, con la diferencia, que stos se
reintegraran al suelo.
Poder proporcionar ms informacin de especies marinas para produccin de
compuestos, siendo especficamente polmeros de origen natural
(polisacridos y protenas), que puedan ayudar en sector industrial como
alternativas rentables para uso en materiales.
Con esta alternativa, los beneficios a corto y largo plazo sern significativos
para empresas e industrias y para la humanidad en cuanto a brindarles una
garanta de salud y alternativas de consumo. El CUCBA se beneficiara, ya
que es un proyecto que busca innovar y utilizar herramientas de origen
biolgico, lo que le da prestigio. A nuestro centro le hacen falta proyectos
que no slo se vayan a quedar en investigacin, si no que vayan ms all. La
biologa es un campo muy aprovechable para poder solucionar diversas
problemticas sociales y nosotros como bilogos tenemos la obligacin de
utilizar nuestros conocimientos.
3.- Objetivos
Objetivo general
Identificar polmeros, provenientes de hongos y levaduras marinas,
para produccin de materiales alternativos rentables.

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Objetivos especficos

Aislar hongos y levaduras provenientes del ocano.

Distinguir qu enzimas producen los hongos marinos en su
metabolismo de carbono.
Analizar y evaluar el producto final de la composicin del hongo.
Lograr la identificacin de los polmeros que se almacenen en el hongo.
4.- Hiptesis
Hiptesis nula
Se producir un material resistente y rentable para produccin industrial.
Hiptesis alternativa
No se producir un material resistente y rentable para produccin industrial.
5.-Marco terico
Los polmeros son una estructura compleja formada por la repeticin de una
unidad molecular llamada monmero. Existen polmeros naturales y
polmeros sintticos. En muchos casos una molcula de un polmero est
compuesta de miles de molculas de monmeros. Los monmeros son los
pequeos eslabones que se repiten para formar un polmero mediante un
proceso llamado polimerizacin. Los polmeros se dividen en dos grandes
grupos: aquellos naturales, como celulosa, almidones, ADN y protenas. Por
otro lado, existen aquellos sintticos que fueron fabricados por el hombre y
que incluyen todos los derivados de los plsticos (EducarChile, 2007).
En muchas investigaciones se menciona el uso de instrumentos como el
liofilizador, el cual permite la eliminacin del agua de productos o
disoluciones, en condiciones de baja presin y temperatura lo que favorece
que estos productos deshidratados mantengan todas sus propiedades
estables. El agua se elimina por congelacin del producto y posterior
sublimacin del hielo en condiciones de vaco y temperatura. Al suministrar
calor el hielo pasa de su fase slida a la gaseosa (sublimacin), sin alcanzar
el punto de ebullicin del agua, y se evita el paso por la fase lquida (La
Ciencia y el hombre, 2013).

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Sobre la problemtica de este experimento, han existido diversos enfoques
en investigaciones alrededor del mundo donde se demuestra la produccin
de
diversos compuestos de origen fngico especficamente marino. A
continuacin se mencionan algunas investigaciones en las que se han
extrado y cuantificado diversos compuestos:
Un polmero reportado en una investigacin de Colombia fue el polisacrido
quitosano, el cual es el segundo polisacrido ms abundante que se
encuentra en la naturaleza, siendo poseedor de excelentes propiedades
mecnicas, las cuales permiten la formacin de fibras y pelculas, y es
adems un recurso renovable, con la gran ventaja de no ser un agente
contaminante (Alzate et al., 2015).
En un estudio en Veracruz, se report el primer aislamiento de la especie de
hongo Curvularia trifolii en un ambiente marino y que adems se obtuvo
Brefeldina-A, que es un compuesto citotxico potente anticancergeno.
Tambin se lograron aislar diversos compuestos de inters farmacolgico
(Urasilo, Ergosterol, entre otros.) (Couttolenc, 2015). Este estudio no
demuestra la capacidad de los hongos de producir polmeros, pero hace
mencin de que si se experimenta con los datos correctos, se pueden
obtener diversos compuestos diferentes a los que se extrajeron en la
investigacin, y estos son los polisacridos o protenas de alta resistencia.
En otro estudio en la India, se encontr que el hongo Fusarium culmorum
utilizado en el presente estudio, fue eficiente en sntesis de nano partculas
de plata, estas partculas mostraron un alta actividad antimicrobiana (Ingle
et al., 2010). Este artculo es relevante en la presente investigacin porque
explica algunos procesos de sntesis de polmeros que tienen ciertos hongos
al adicionar plata en su medio y que pueden ser aprovechados como
antimicrobianos.
En otro estudio en Brasil, se demostr que es factible usar desperdicios agroindustriales para produccin de poligalacturonasa y pectinliasa por
Penicillium viridicatum (Silva et al., 2002). Este artculo es bastante
importante en cuanto a la informacin que brinda sobre el gnero Penicillium
sp., ya que es la especie que se desea aislar en el experimento y adems se
describe el potencial del hongo para producir enzimas, lo cual puede darnos
un enfoque sobre la aplicacin que se le puede dar al hongo.
Diversos artculos se utilizarn como recopilacin de datos para poder llevar
a cabo el presente experimento, pero definitivamente est claro que no
existe tanta informacin en cuanto a la acumulacin de polmeros, por lo que
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se estarn brindando nuevos resultados al acervo de informacin de
biotecnologa microbiana.
Actualmente, no existe informacin brindada por la Universidad de
Guadalajara que pueda colaborar en el presente trabajo, por lo que ha sido
necesario buscar en todas las fuentes informativas alrededor del mundo.
Muchas de ellas son de muchos aos atrs y son pocas las investigaciones
que son de aos recientes, por lo que lo que cualquier artculo, relacionado al
tema a tratar, fue tomado como referencia.
El campo de estudio referente a microorganismos marinos, especficamente
hongos y levaduras, es muy poco estudiado, por lo que existe escasa
informacin al respecto y no se pueden tener tantas referencias que nos
encaminen a nuestro objetivo, por lo que se llevar a cabo el experimento a
prueba y error.
6.- Marco metodolgico
a) Referente emprico
La poblacin muestra sobre la que se har el presente trabajo sern
principalmente cepas de hongos marinos del gnero Aspergillus sp. y
Penicillium sp. y de levaduras marinas los gneros Candida sp. y
Debaryomyces sp., ya que son gneros que se han aislado previamente del
medio marino y que adems se ha comprobado su capacidad de acumular
sustancias de reserva, los cuales son los ya mencionados polmeros de origen
natural. La muestra ser tomada del arrecife de coral en Islas Marietas
ubicadas en Playa Punta Mita en el municipio de Nayarit, Jalisco.
El tamao de muestra se delimitar con base a lo que se espera obtener de
microorganismos, lo cual es suficiente diversidad para poder realizar
aislamientos por un mes. Esto quiere decir que se tomarn tres botes de 1 L,
cada uno con muestra obtenida del arrecife de coral en Islas Marietas.
Estudios revelan que el rea de crecimiento del halo (circunferencia) de un
hongo es el lmite que se le establezca, ya que presenta un desarrollo muy
proliferativo. En el presente trabajo se utilizarn Cajas de Petri que miden de
dimetro entre 9 y 10 cm.

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b) Tipo de mtodo
Se realizar un muestreo marino en la costa de Nayarit, el cual consistir en
recolectar muestras del arrecife de Islas Marietas, buceando a una
profundidad de entre 1 y 2 metros. Las muestras se tomarn por medio de
una extraccin de un pedazo de coral y de esponja, donde se colocarn en
botes de 1 L, para posteriormente ser depositadas en tubos de policarbonato
estriles de 50 mL y sern conservadas en agua de mar. Para el aislamiento
micelial, los corales y esponjas se lavarn primeramente a chorro de agua,
donde posteriormente sern desinfestados en hipoclorito de sodio al 2 %,
colocndose en cmaras hmedas. Se elaborar un medio de cultivo PDA
(agar dextrosa y papa) con 50 % de agua de mar, 1 % glucosa, 0.5%
extracto de levadura, 1.5% agar, adicionando dos diferentes antibiticos para
permitir selectividad de microorganismos: 0.01% estreptomicina y 0.01% de
cloranfenicol. Se incubarn a 25C para su desarrollo. Se identificar la
especie de cepa con ayuda de un microscopio identificando sus estructuras
reproductivas, fijando la muestra con lactofenol claro, con el uso de claves
taxonmicas. Se llevar a cabo un proceso de purificacin de la cepa una vez
identificada, en el cul se utilizar el medio salino ya mencionado PDA y ser
colocado en matraces Erlenmeyer con 50 mL de medio para cada cepa
fngica, se inocularn en dicho medio lquido y sern incubados nuevamente
a 25C a 100 rpm por 15 das. Finalizando el periodo de cultivo, se separar
la biomasa del caldo de cultivo. Con ayuda de un liofilizador se deshidratar
la biomasa y se extraer con una mezcla de metanol: cloroformo 1:1. Los
extractos obtenidos sern concentrados mediante destilacin a presin
reducida en un evaporador rotatorio y posteriormente sern empleados en
pruebas para evaluar el tipo de polisacrido o protena que acumular. Se
podr evaluar la cantidad por medio de la absorbancia de la biomasa extrada
con ayuda de un espectrofotmetro u otro mtodo podr ser empleando
colorantes lipdico en caso que se desee analizar algn cido graso.
Los elementos a observar y describir en las especies aisladas sern los
factores que determinan tipo de crecimiento del hongo, qu es lo que los
hace acumular el polmero, tambin se podra llegar a observar una especie
nueva al momento de llevar a cabo el aislamiento de la muestra. Ya que se
tenga la especie aislada e identificada y que se hayan analizado los
compuestos producidos, se comenzar un sometimiento a distintos
tratamientos para probar la produccin del polmero. ste anlisis puede
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tardar de 2 semanas a un mes dependiendo del desarrollo y metabolismo del
hongo o levadura. Se debe cuidar que no exista crecimiento bacteriano en
nuestras muestras, ya que muchas de stas crecen en condiciones similares
a las levaduras, por lo que es necesario adicionar antibiticos como los ya
mencionados: estreptomicina y cloranfenicol. Tambin existen otros que se le
pudieran aadir como la Penicilina G y sulfato de estreptomicina (150-500
mg/L) a nuestros medios de cultivo secos o hmedos.
Las principales condiciones que se debern de cuidar en el experimento ser
que no se olvide aadir medio salino o agua de mar al medio de cultivo, ya
que esto ser determinante en la observacin de produccin de polmeros.
Otro aspecto fundamental es cuidar la temperatura de inoculacin, ya que
sta determina el crecimiento del hongo.
Las variables dependientes sern las modificaciones del medio que se
establezcan en el experimento y las variables independientes sern los
distintos hongos que crezcan bajo las condiciones de salinidad que se
establezcan.
Cronograma
Actividad
Muestreo marino

Tiempo
1 da

Elaboracin de medio de 1 da
cultivo (PDA)

Aislamiento micelial

15 das

Qu requiere
Equipo
de
buceo
(preferentemente)
o
equipo snorkel, 5 botes
de plstico de 1 L con
tapa ancha, navaja con
filo, una hielera para
colocar
muestras
y
tubos de policarbonato
estriles de 50 mL.
2 matraz Erlenmeyer de
500 mL, 1 L agua de
mar,
glucosa,
agar,
extracto de levadura,
antibiticos, bscula en
miligramos.
Cajas
de
Petri,
hipoclorito de sodio,
Medio de cultivo PDA.
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Identificar cepa

7 das

Purificacin de la cepa

15 das

Extraccin
compuestos

de 7 das

Evaluacin de polmeros

15 das

Microscopio
ptico,
claves
taxonmicas,
lactofenol claro.
Medio de cultivo PDA,
dos
matraces
Erlenmeyer,
agitador
orbital.
Liofilizador, mezcla de
metanol y cloroformo,
evaporador rotatorio.
Colorantes lipdicos
espectrofotmetro.

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