PRCTICA 1

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE HONGOS

INTRODUCCIN
Para poder trabajar con una especie determinada, ya sea para investigacin, identificacin,
aplicacin o control del microorganismo, es necesario contar con un cultivo puro, es decir
aqul en el cual solo existe un tipo de microorganismos, descendientes de un solo individuo
y por lo tanto, de caractersticas idnticas.
En todos los ambientes naturales habitan mltiples microorganismos de diversos tipos y
actividad fisiolgica. Para efectuar el estudio de un organismo particular es necesario
separarlo de la poblacin mixta en la que se encuentra. Para tal fin se emplean tcnicas de
aislamiento que conduzcan a la obtencin de un cultivo puro.
De manera general los mtodos de aislamiento incluyen:
1. Separacin fsica de los microorganismos mediante:
a) Diluciones seriadas y siembra por vertido en placa.
b) Siembra por agotamiento.
2. Utilizacin de medios de cultivo selectivos y diferenciales.
3. Aprovechamiento de caractersticas particulares de los microorganismos, tales como la
formacin de esporas, el metabolismo anaerobio y/ o facultativo, la capacidad para utilizar
sustratos poco comunes, etc.
Para facilitar el proceso de aislamiento y obtener mejores resultados, frecuentemente se
emplean combinaciones de las tcnicas anteriores.
Por otro lado, la estructura microscpica es decisiva para la clasificacin. Las
caractersticas visibles son muy importantes debido a que, a simple vista, el aspecto de las
colonias es a veces tan caracterstico que le permite identificar enseguida el tipo de hongo.
Sin embargo, es indispensable para la clasificacin final determinar las peculiaridades del
hongo al nivel microscpico que presentan estos microorganismos.
Generalmente por medio de una aguja de diseccin o un asa bacteriolgica con un
pequeo ganchito en la punta es posible desprender pequeas porciones de la colonia para
su estudio microscpico.
Sin embargo, quiz el mejor mtodo para el estudio microscpico es el MICROCULTIVO
que permite observar cuidadosamente y a intervalos las estructuras microscpicas intactas,
mientras que en la tcnica de desprender una porcin del cultivo se altera muy seriamente
la arquitectura microscpica tanto que a veces es imposible reconocer el hongo.

OBJETIVO
Aislar e identificar morfolgicamente un hongo de una muestra problema.

METODOLOGA
Material sesin 1.
14 Tubos estriles con tapa de rosca
14 Cajas Petri de vidrio
16 Pipetas graduadas de 1 mL
4 Matraz Erlenmeyer de 250 mL
1 Propipeta
1 Gradilla para tubos
1 Asa acodada
1 Agitador
2 Vasos de precipitados de 250 mL
1 Mechero
1 Piceta para agua destilada
1 Probeta de 100 mL
1 Esptula
Algodn Industrial
Manta de cielo
Papel estraza

Equipo
Autoclave
Incubadora
Vortex
Balanza Analtica
Reactivos y medios de cultivo
Peptona
Cloruro de Sodio
Agar Papa Dextrosa
Agua Destilada
Alcohol etlico al 70%
Ampicilina
Material Biolgico.
Muestra
problema
(S.
maydis,
Trichoderma harzianum,Trametes sp.,
Penicillium sp., Aspergillus niger)

PROCEDIMIENTO
1. Preparar 165 mL de Agua Peptonada (Peptona 1 g/l, NaCl 8.5 g/l, pH 7).
2. Agregar 9 mL de Agua Peptonada en cada uno de los 14 tubos con tapa de rosca
y 99 mL a los dos matraces de 250 mL.
3. Preparar PDA tal y como indica el proveedor.
4. Esterilizar en autoclave, a 1 atm, durante 15 minutos, los tubos y matraces con
Agua Peptonada, PDA, las pipetas de 1 mL y las cajas Petri.
5. Una vez esterilizados los medios de cultivo colocar un antibitico.
6. Vaciar el PDA, en las cajas esterilizadas.
7. Realizar las diluciones seriadas: tomar 1 mL de la muestra problema y aadirlo al
-1

matraz con 99 mL de agua peptonada sta ser la dilucin 10 ; homogeneizar

bien la solucin, tomar 1 mL y adicionarlo a un tubo con Agua Peptonada, sta
-2

-9

ser la dilucin 10 . Y as sucesivamente, hasta obtener la dilucin 10 (ver

Figura 1). Utilizar en todo momento, pipetas estriles y trabajar cerca del
mechero en condiciones aspticas.
8. Pasar 250 l de cada una de las diluciones perfectamente homogneas a una
caja Petri con PDA.
9. Sumergir el asa de vidrio en etanol, flamear en el mechero, enfriar el asa y
esparcir homogneamente los 250 l aadidos en toda la placa. (Figura 2).
10. Esperar a que la solucin aadida sea totalmente adsorbida en el medio de
cultivo. Incubar las cajas invertidas a temperatura ambiente durante una semana.

Figura 1. Diluciones seriadas.

Figura 2. Mtodo de siembra por extensin

Material sesin 2.
10 Cajas Petri de vidrio
1 Matraz Erlenmeyer de 250 mL
1 Asa recta
1 Agitador
1 Vasos de precipitados de 250 mL
1 Mechero
1 Piceta para agua destilada
1 Probeta de 100 mL
1 Esptula
5 Portaobjetos
5 Cubreobjetos
Algodn Industrial
Manta de cielo
Papel estraza

Equipo
Autoclave
Incubadora
Balanza Analtica
Microscopio
Reactivos y medios de cultivo
Agar Papa Dextrosa
Agua Destilada
Alcohol etlico al 70%
Azul de algodn
Material Biolgico.
Muestra
problema
(S.
maydis,
Trichoderma harzianum,Trametes sp.,
Penicillium sp., Aspergillus niger)

PROCEDIMIENTO
1. Preparar cajas con PDA y sembrar por duplicado cada uno de los hongos
identificados en la sesin 1.
2. Observar al microscopio cada una de las cepas identificadas en la sesin 1.
Material sesin 3.
6 Cajas Petri de vidrio
5 Soportes de vidrio
10 portaobjetos
1 pinzas
1 Bistur
2 Matraz Erlenmeyer de 250 mL
1 Pipeta graduada de 10 mL
1 Agitador
1 Asa recta
2 Vasos de precipitados de 250 mL
1 Mechero
1 Piceta para agua destilada
1 Probeta de 100 mL
1 Probeta de 10 mL
1 Esptula
Algodn Industrial
Manta de cielo
Papel estraza

Equipo
Autoclave
Balanza Analtica
Reactivos y medios de cultivo
Agar Papa Dextrosa
Agua Destilada
Alcohol etlico al 70%
Glicerol
Material Biolgico.
Muestra
problema
(S.
maydis,
Trichoderma harzianum,Trametes sp.,
Penicillium sp., Aspergillus niger)

PROCEDIMIENTO
1. Observar al microscopio cada una de las cepas identificadas en la sesin 2.
2. Preparar una caja con PDA y cortarla para que queden recuadros de 1 cm. Esterilizar el
sistema para el microcultivo todo junto (caja petri, soporte, portaobjetos). Esterilzar el
glicerol al 10 % que se utilizar para los microcultivos, as como el resto del material.
3. Colocar el 1cm sobre el portaobjetos y realizar el sembrado por picadura en los cuatro
lados de cada una de las muestras y situar el otro portaobjetos encima de ste; para cada
una de las cepas aisladas.
4. Agregar 10 mL de glicerol y cerrar la caja. Las cajas con los microcultivos se colocaran en
un recipiente con tapa el cual deber contener algodn hmedo, incubar a temperatura
ambiente por una semana.

CUESTIONARIO
1. Explica las principales diferencias entre los diferentes tipos de mtodos
de aislamiento?

2. De todos los mtodos de aislamiento cuales son los ms utilizados para

hongos y porqu?
3. Explica las principales caracteristicas macroscopicas y microscopicas de
los hongos aislados?
4. Explica el fundamento de un microcultivo.
5. Explica que mtodos de aislamiento utilizarias en una mezcla de
microorganismos que contienen bacterias gram + y -, levaduras y
hongos filamentosos, y se requiere tener un cultivo puro de un hongo
filamentoso.
BIBLIOGRAFA
1. Madigan, M. T., J. M. Martinko y J. Parker. 2003. Brock. Biologa de los
microorganismos. 10 Ed. Prentice Hall Iberia. Espaa.
2. Ramrez-Gama, R. M., B. Luna Milln, O. Velsquez Madrazo, L. Vierna Garca, A.
Meja Chvez, G. Tsuzuki Reyes, L. Hernndez Gmez, I. Mggenburg, A. Camacho
Cruz y M del C. Urza Hernndez. 2006. Manual de Prcticas de Microbiologa
General. 5 edicin. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
3. Tortora Gerard J., Fonke Beidell R. y Case Christine L. 1995. Microbiology an
Introduction. 5a. ed. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 801 pp
4. Vullo, D., M. Wachsman, L. Alche. 2000. Microbiologa en Prctica. Manual de
laboratorio para la enseanza de Microbiologa bsica y aplicada. 1 edicin. Atlante
S. R. L. Argentina