SPECTROSCOPIE

de FLUORESCENCE
MOLECULAIRE
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 SOMMAIRE
n I - Thorie de la fluorescence molculaire
n 1) Les processus de relaxation
n 1.1 Les raies de rsonance et dplacement de Stokes

n 1.2 Relation entre les spectres dexcitation et de

fluorescence
n 2) Les espces fluorescentes
n 2.1 Fluorescence et structure
n 2.2 Effet de la rigidit
n 2.3 Effet de temprature et de solvant
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n II - Effet de la concentration sur
lintensit de fluorescence
n III - Les appareils de fluorescence
n IV - Applications des mthodes de
fluorescence
n 1) Mthodes utilises pour les espces
inorganiques
n 2) Les mthodes pour les espces organiques et
biochimiques

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n I - Thorie de la fluorescence molculaire

La figure (a) est le

diagramme partiel des
niveaux dnergie
dune espce
molculaire
hypothtique.

Lorsque les molcules sont irradies par une bande de rayonnement constitue des l.o 1
5, les 5 tats vibrationnels du niveau nergtique lectronique excit E1 sont momentanment
peupls. Idem lorsque la bande est constitue des l.o 1 5.

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n 1) Les processus de relaxation

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 Avec certains drivs, un autre phnomne appel conversion intersystme peut se produire.

Une molcule dans ltat vibrationnel le plus bas de ltat excit (tat singulet c.a.d quil ny a pas
eu de retournement de spin au cours de labsorption) passe dans un tat triplet, tat possdant
un niveau dnergie intermdiaire entre les tats fondamental et excit.

Processus : excitation.

Processus : relaxation
vibrationnelle non radiative.

Processus : Conversion
interne.

Processus : Fluorescence.

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 La conversion intersystme seffectue avec retournement de spin (processus ). La
molcule tombe alors dans ltat vibrationnel le plus bas de ltat triplet par relaxation
vibrationnelle (processus ).
Ltat triplet a une dure de vie beaucoup plus leve que ltat singulet prcdent (usuellement
de 10-4 s qqs min). La molcule peut alors revenir dans son tat fondamental par mission
dune radiation (processus ).
Ce type de luminescence sappelle phosphorescence.

Dfinition de la chimiluminescence : cest un phnomne de raction chimique ayant pour

consquence la production de lumire. Une raction de ce type est loxydo-rduction du luminol
(3-aminophtalhydrazine) par leau oxygne, par exemple, ou par un quelconque hydroxyde :

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 En criminologie, le phnomne permet de mettre en vidence des traces de sang peu ou
pas visible loeil nu (dans ce cas, le luminol ragit avec les ions fer des globules rouges,
en produisant de la lumire).

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n 1.1 Les raies de rsonance et dplacement de Stokes

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n 1.2 Relation entre les spectres
dexcitation et de fluorescence

Le spectre dabsorption, ou spectre dexcitation, et

le spectre de fluorescence dun compos apparaissent
souvent comme les reflets approximatifs lun de lautre
avec concidence de la raie de rsonance.

n 2) Les espces fluorescentes

La plupart des molcules ne fluorescent pas, car

leur structure est telle que la relaxation non
rayonnante peut se produire plus rapidement que
lmission fluorescente.

Le rendement quantique de fluorescence

molculaire est le rapport entre le nombre de
molcules fluorescentes et le nombre totale de
molcules excites (ou le rapport entre les photons
mis et les photons absorbs).

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n 2.1 Fluorescence et Structure

Les composs qui contiennent des noyaux

aromatiques produisent lmission fluorescente
molculaire la plus intense et donc la plus utilise.

La plupart des hydrocarbures aromatiques non

substitus sont fluorescents en solution et le
rendement quantique avec le nombre de cycles et
leur degr de condensation (on parle de condensation
chimique, lorsque 2 molcules se lient pour nen
former quune. Elle permet de constituer de grandes
molcules ou polymres).

Les htrocycles simples prsents ci-contre ne

prsentent pas de fluorescence, mais les structures
cycles accols contenant ces htrocycles fluorescent
la plupart du temps.

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la substitution sur un cycle aromatique provoque des dplacements de l.o des maxima
dabsorption et des modifications quivalentes des pics de fluorescence. On observe que la
substitution affecte souvent lefficacit de la fluorescence :

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n 2.2 Effet de la rigidit
On a constat exprimentalement que la
fluorescence est particulirement intense si
la molcule est rigide.

Exemple ci-contre, cette diffrence de

comportement est due pour lessentiel l
de rigidit qui rsulte du pontage par le
groupement mthyle dans le fluorne.

Cette rigidit la vitesse de relaxation non rayonnante au point que la relaxation par
fluorescence le temps de se produire.
Le facteur rigidit explique l de fluorescence de certains agents chlatants organiques aprs
quils aient form un complexe avec un ion mtallique.

Cest ainsi que lintensit de fluorescence

de lhydroxy-8-quinoline est beaucoup plus
faible que celle de son complexe avec le
zinc.

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n 2.3 Effet de temprature et de solvant
Le rendement quantique lorsque la temprature parce que laccroissement de la
frquence des collisions aux tempratures leves la probabilit quil y ait relaxation par
collision.
La de viscosit du solvant conduit au mme rsultat.
Le solvant peut aussi :
absorber le rayonnement incident et lintensit I0;
absorber la radiation de fluorescence (effet de filtre interne);
diffuser la lumire incidente (figure ci-dessous) :

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n II - Effet de la concentration sur lintensit de
fluorescence

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 Le graphique F = f(C) est linaire aux
faibles cc. Lorsque C devient assez grand
pour que A 0,05 (Ou T 95 %), la relation
cesse dtre linaire et F est infrieur aux
valeurs tires de la droite extrapole.

Cet effet rsulte de lauto-dsactivation

(self-quenching).

Cest un phnomne o des molcules

absorbent la fluorescence mise par dautres; il
arrive mme que F atteigne un maximum et se
mette ensuite mesure que C .

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n III - Les appareils de fluorescence
Un fluorimtre, tout comme un
photomtre, utilise des filtres comme
slecteur de l.o. Par contre, la plupart
des spectrofluorimtres sont la fois
d o t s d e fi l t r e s q u i l i m i t e n t l e
rayonnement dexcitation et dun
monochromateur rseau qui disperse le
rayonnement de fluorescence mis par
lchantillon. On peut obtenir volont
des spectres dexcitation ou des spectres
de fluorescence.

Les appareils de fluorescence double

faisceau compensent les fluctuations de la
source. Le rayonnement fluorescent est
mis par lchantillon dans toutes les
directions, mais il sobserve
perpendiculairement au faisceau incident;
aux autres angles, l de la diffusion
lumineuse par la solution et par les parois
de la cellule conduit des erreurs
importantes sur la mesure de lintensit.

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n IV - Applications des mthodes de
fluorescence

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n 1) Mthodes utilises pour les espces inorganiques

Elles sont de 2 types :

Mthodes directes : elles sont bases sur la raction de lanalyte avec un agent chlatant pour
former un complexe fluorescent.

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 Mthodes indirectes : elles dpendent de la ou
dsactivation (quenching) de la fluorescence dun ractif
cause par sa raction avec lanalyte. La dsactivation
est surtout utilise pour le dosage des anions.

Les meilleurs ractifs fluorimtriques disponibles pour

doser les cations st des composs aromatiques qui
possdent au moins 2 groupements fctionnels donneurs
permettant de former un chlate avec lion mtallique,
comme, par ex., lhydroxy-8-quinoline.

Remarque : La relaxation non rayonnante des

chlates des mtaux de transition est tellement
efficace que ces espces st rarement fluorescentes.
Il ft souligner que la plupart de ces mtaux
absorbent par contre dans lUV ou le visible. Pour
cette raison, la fluorimtrie et la spectrophotomtrie
st svt complmentaires en tant que mthode de
dosage des cations.

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n 2) Mthodes utilises pour les espces organiques et
biochimiques
Le nbr dapplications des mthodes fluorimtriques au dosage de substances organiques
est impressionnant.

Exemple :

ladnine, lacide anthranilique, des hydrocarbures polycycliques aromatiques, la

cystine, la guanidine, lindole, des naphtols, des protines, lacide salicylique, le scatole, le
tryptophane, lacide urique et le warfarin.

Des produits mdicaux tq ladrnaline, lalkylmorphine, la chloroquine, la digitaline, la

dithylamide de lacide lysergique (LSD), la pnicilline, le phnolbarbital, la procane et la
rserpine.

Remarque : Les applications principales de la fluorimtrie concernent surtout

lanalyse des produits alimentaires, des produits pharmaceutiques, des prlvements
mdicaux et des produits naturels. La sensibilit et la slectivit de la mthode en font
un outil particulirement bien adapt ces domaines.

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