Universidad Nacional Autnoma de Mxico

Facultad de Estudios Superiores Cuautitln

Departamento de Ciencias Biolgicas
Seccin Bioqumica Y Farmacologa Humana

BIOQUMICA DIAGNSTICA

Genetica Molecular Laboratorio

Grupo: 2651

Informe de la Prctica:

No. 6 Amplificacin de un fragmento de DNA por PCR

Equipo No. 2

Integrantes:

Cortes Garcia Alberto

Hernandez Torres Susana Vanessa
Roldn Flores Miguel ngel.

Fecha de Entrega:
09/Mayo/2016

Profesoras:
Dra. Ana Paola Rojas Meza
Q.F.B. Nydia Berenice Gonzlez ngeles
B.Q.D. ngeles
Aplicacin de la tcnica de PCR de gradiente y PCR de punto final en la
amplificacin de los exones 3 y 4 (380 pb) del gen SURF1 humano
 Resumen

La reaccin en cadena de polimerasa (PCR) es una una tcnica que permite

sintetizar muchas veces un fragmento de ADN ,una parte importante en el
proceso es el alineamiento de los primers, donde la temperatura es vital ,esta
debe mantenerse en un intervalo entre 40 y 60C (llamada de alineamiento), a
esta temperatura se forman y se rompen constantemente los puentes de
hidrgeno entre los oligonucletidos y el ADN. La polimerasa se une a este
pequeo pedazo de ADN de doble cadena y comienza a copiar en sentido 5 a 3.
El objetivo de este estudio es determinar las condiciones ideales (temperatura
de alineamiento y adicin de formamida ) para amplificar los fragmentos
correspondientes a los exones 3 y 4 del gen SURF 1 mediante una PCR de
gradiente con y sin formamida , comparando diferentes recursos como regla de
Wallace y Bioinformtica ,por otro lado, comparar el uso de aditivos como la
Formamida en el efecto a estas condiciones y posteriormente realizar una PCR
de punto final a dicha temperatura de alineamiento para amplificar el fragmento
deseado.
Se realiz , una PCR de gradiente con y sin formamida del fragmento
correspondiente a los exones 3 y 4 del gen SURF 1 con las siguientes
temperaturas: 53.8 , 54.6 , 56.9 , 60, 63 , 65.2C Adicionando formamida a
53.8, 54.6 y 56.9 C y posteriormente se realiz una electroforesis en gel de
agarosa, para determinar la temperatura de alineamiento idnea para la
amplificacin deseada, resultando 60C sin formamida las condiciones ideales
para el alineamiento de los oligonucletidos; Despus se realiz una PCR de
punto final para amplificar el fragmento de los exones 3 y 4 del gen SURF 1 , a
continuacin se realiz una electroforesis en gel de agarosa para comprobar el
estado del fragmento amplificado, obtenindose satisfactoriamente los
fragmentos amplificados deseados.
En conclusin , las condiciones ideales para la amplificacin del fragmento de los
exones 3 y 4 del gen SURF 1 , son a 60C sin formamida.

Palabras clave: PCR de gradiente, Temperatura de alineamiento, Formamida, PCR

de punto final, Primers

Summary

The polymerase chain reaction (PCR) is a technique to synthesize many times a

DNA fragment, an important part of the process is the alignment of the primers,
where the temperature is vital, it must be kept in a range between 40 and 60
C (called alignment), at this temperature,is constantly formed and break the
hydrogen bonding between the oligonucleotide and DNA. The polymerase binds
to this small piece of double-stranded DNA and starts copying from 5 'to 3'.
The objective of this study is to determine the ideal conditions (annealing
temperature and addition of formamide) to amplify the fragments corresponding
to exons 3 and 4 of SURF 1 gene by PCR gradient with and without formamide,
comparing different resources like Wallaces rule and Bioinformatics, on the
other hand, compare the use of additives as formamide in the effect of these
conditions and subsequently performing a PCR endpoint to said annealing
temperature to amplify the desired fragment.
, PCR gradient was performed with and without formamide corresponding to
exons 3 and 4 of SURF 1 gene with the following temperature fragment: 53.8 ,
54.6 , 56.9 , 60 , 63 , 65.2 C Adding formamide 53.8 , 54.6 and 56.9 C
and then electrophoresis was performed on agarose gel, to determine the
temperature suitable for the desired amplification alignment, resulting 60 C
without formamide ideal conditions for the alignment of oligonucleotides; After
PCR endpoint was performed to amplify the fragment of exons 3 and 4 of SURF 1
gene then it was performed an electrophoresis on agarose gel to check the
status of the amplified fragment, successfully obtaining the desired amplified
fragments.
In conclusion, the ideal fragment for amplification of exons 3 and 4 of SURF 1
gene, conditions are at 60 C without formamide.

Keywords: Gradient PCR, Annealing emperature, Formamide, PCR endpoint,

Primers.

Introduccin

La PCR, siglas de reaccin en cadena polimerasa, es una tcnica para la

amplificacin de molculas de ADN, que han introducido una verdadera
revolucin en la tecnologa del ADN y sus aplicaciones, permitiendo su
generalizacin a una multitud de disciplinas, no slo en la biologa y medicina,
sino tambin en otras ciencias como la paleontologa, antropologa, medicina
forense entre otras, abriendo perspectivas hasta hace poco insospechadas, en
tan diversas ramas.
Su desarrollo se debe a Kary Mullis, en 1984, quien de una forma sencilla ide un
proceso repetitivo para la duplicacin de molculas de ADN previamente
seleccionadas, multiplicando las cadenas existentes en cada ciclo, lo que
permitir la obtencin de cantidades considerables del fragmento designado
(ms de 100 millones en pocas horas), partiendo de porciones iniciales
minsculas, incluso de una sola molcula. (Teijn, 2006)
Esta tcnica se basa en una replicacin exponencial in vitro de una molcula de
ADN genmico (ADNg) o ADN complementario (ADNc), mediante ciclos
repetitivos que constan de tres temperaturas. En cada uno de los ciclos las
molculas se duplican hasta que los reactivos se agotan. (Armendariz, 2011).
La longitud del producto amplificado la delimitan los iniciadores, tambin
llamados primers u oligonucletidos, de cuyo diseo adecuado depende el xito
de la PCR. Los iniciadores deben ser especficos, no formar estructuras
secundarias entre ellos no hibridaciones inespecficas entre ellos u otra parte de
la cadena. (Armendariz, 2011).
La amplificacin de la PCR se apega a las mismas reglas de la replicacin; esto
es, se basa en una secuencia qu le sirve de molde y, por complementariedad,
sintetiza la cadena antiparalela. Tambin, la sntesis de la cadena sigue la
direccin de 5-3, ya que requiere de un nucletido con el extremo 3 libre que
proporcione el grupo OH para la adicin del siguiente nucletido, con lo que se
hace el enlace fosfodister. (Armendariz, 2011).
Para que se lleve a cabo la PCR se requiere una cadena ADNg o ADNc que sirva
de molde, una enzima ADN polimerasa, Mn+2 o Mg+2 cofactores necesarios para
la actividad correcta de la ADN polimerasa, desoxinucletidos (dNTPs) para la
sntesis del producto de PCR y oligonucletidos o primers. Estos reactivos se
mezclan y se someten en el termociclador a los ciclos de amplificacin
(Armendariz, 2011).
Esquema convencional de un PCR, el ciclo del PCR consta de los pasos de
desnaturalizacin, alineacin y extensin. Estos pasos se realizan mediante el
cambio automtico de temperaturas en un termociclador. La temperatura de
desnaturalizacin permite el rompimiento de los puentes de hidrgeno entre las
cadenas del DNA, mientras la temperatura de alineamiento proporciona las
condiciones cinticas favorables para la unin de los iniciadores con su
secuencia complementaria. En la temperatura de extensin la enzima
polimerasa los dNTPs y forma la cadena complementaria basndose en el molde
al cual hbrido el primer correspondiente. (Armendariz, 2011).

Los ciclos iniciales de PCR se caracterizan por un aumento exponencial en la

amplificacin del blanco. Si los componentes de la reaccin llegan a ser
limitantes, el ndice de la amplificacin del blanco disminuye hasta que se
alcanza una meseta y hay poco o nada de aumento neto en producto de PCR.
Los factores que afectan a una PCR son temperatura y tiempo de
desnaturalizacin, temperatura de hibridacin y diseo de iniciador, tamao de
iniciador, temperatura y tiempo de elongacin, tampn y nmero de ciclos.
Entre sus aplicaciones podemos mencionar la clonacin, en el campo de la
biologa molecular, la PCR se utiliza para la observacin de genes y su
secuenciacin nucleotdica; anlisis y cuantificacin de la expresin gnica
basado en el estudio de la cantidad de RNAm; en diagnstico clnico que
involucra a la gentica mdica para el diagnstico de enfermedades hereditarias
y de algunas cromosomopatas comunes, en microbiologa para diagnstico
rpido y preciso de infecciones bacterianas o virales, en arqueologa para
anlisis de muestras biolgicas antiguas, en medicina legal para realizar anlisis
de paternidad o identificacin de individuos, entre muchas ms. (Torres, 1995).
En resumen, la tcnica como tal es de gran importancia al facilitar o apoyar a
distintas y bastantes reas para lograr resultados precisos y confiables, de
mayor exactitud y reduciendo tiempos; es decir facilitando y beneficiando a
grandes rasgos. En el caso del Gen SURF 1, su amplificacin es importante
debido a que su prdida de la funcin del gen, est asociado al Sndrome de
Leigh, una enfermedad neurodegenerativa gentica mitocondrial (de herencia
materna) humano (Solano, 2001); y con esto se pueden desarrollar tcnicas de
estudio para profundizar en dicha patologa.

El objetivo de este estudio es, realizar la amplificacin de un fragmento de 380

pb de DNA genmico correspondientes a los exones 3 y 4 del gen SURF1,
mediante la realizacin de una PCR de gradiente a distintas temperaturas (53.8,
54.6 , 56.9, 60, 63, 65.2) para conocer las condiciones ptimas de
amplificacin (Tm y Ta, uso de formamida), comparando diferentes recursos
como regla de Wallace y Bioinformtica ,por otro lado, comparar el uso de
aditivos como la Formamida en el efecto a estas condiciones, y posteriormente
realizar una PCR de punto final, que se evaluar mediante electroforesis en gel
de agarosa, con la finalidad de comprobar la presencia del gen SURF 1 del
cromosoma 9 humano, corroborando as que el donador de la muestra, no
presenta una patologa relacionada la deficiencia del gen y afirmar que la
muestra elegida presenta las caractersticas apropiadas (integridad, pureza,
cantidad de DNA) para poder llevar a cabo dicho estudio.

Metodologa

La metodologa, materiales y reactivos utilizados para este estudio se

encuentran descritos en el Manual de prcticas de gentica molecular.
Prctica No. 6 Amplificacin de un fragmento de DNA por PCR pag 47-49.
Para esta prctica se hicieron modificaciones en la Parte B: Amplificacin del
fragmento correspondiente a los exones 3 y 4 del gen SURF; paso 1, para la
preparacin de los reactivos de la PCR de punto final, respecto a que la adicin
se realiz de manera conjunta teniendo un volumen de 7.5 L donde la cantidad
de DNA genmico agregado fue de 5 L.

Observaciones, Resultados y Discusin.

 Figura No. 1: Fotografa de la corrida electrofortica correspondiente a una
tcnica de PCR de gradiente

Figura 1. M 100 pb: Carril con marcador de peso molecular utilizado. En rojo se representan los
carriles de productos de amplificacin a diferentes temperaturas (T1: 53.8 C; T2: 54.6 C; T3: 56.9
C; T4: 60.0 C; T5: 63.0 C; T6: 65.2 C; T1: 53.8 C + formamida; T2: 54.6 C + formamida; T3:
56.9 C + formamida). En azul rey: Ausencia de productos amplificados. En naranja: Productos
inespecficos (PI). En azul cielo: Carril de producto de amplificacin sin PI, con T4 como la
temperatura de alineamiento ptima (Ta Opt.).

Corrida electrofortica de los fragmentos de 380 pb del gen SURF1 por la tcnica
de PCR de gradiente, donde se eligi una temperatura de alineamiento ptima
de 60.0 C por obtener un producto de amplificacin de calidad; es decir, con
ausencia de productos inespecficos y con una cantidad de producto adecuada.
Por lo tanto el resto de las muestras fueron descartadas debido a la presencia de
productos inespecficos, visualizados como una zona o banda de opacidad justo
debajo del producto amplificado correspondiente a los exones 3 y 4 del gen de
estudio y cuyos fragmentos tenan una longitud de aproximadamente 600 pb
respecto al marcador utilizado de 10 pb.

Para la amplificacin del fragmento de 380 pb correspondiente al exn 3 y 4 del

gen SURF 1 se realiz la optimizacin de las condiciones de amplificacin a partir
de una PCR de gradiente. En la cual se trabaj con una mezcla de reaccin que
contienen reactivos donde incluyen: DNA genmico, los Primers (sentido y
antisentido), un Master Mix y agua estril. Donde el DNA genmico es el DNA
molde, cuya secuencia sirve de molde para la amplificacin del fragmento de
380 pb en la regin del exn 3 y 4 del gen SURF 1, el Master Mix contiene: un
buffer el cual proporciona el pH y concentraciones de sales adecuadas para la
correcta funcin de la ADN polimerasa,los dNTPs (desoxinucletidos) son
necesarios para que la polimerasa pueda sintetizar la nueva hebra del DNA; los
desoxinucletidos libres, cuando no forman cadenas de cidos nucleicos, se
encuentran en su forma trifosfatada, estructura molecular necesaria para su
estabilidad y para proporcionar el grupo fosfato con el que se formar el enlace
fosfodister en la unin nucletido-nucletido . Los desoxinucletidos
trifosfatados deben adicionarse en una concentracin ptima de entre 50-200
M , cantidad suficiente para sintetizar de 6.5 a 25 g de DNA. Cantidades mayores
de 200M pueden producir incorporaciones errneas, mientras que
concentraciones menores de 50 M se consideran insuficientes para una sntesis
adecuada, cloruro de magnesio, el magnesio acta como cofactor de la DNA
polimerasa y se suplementa a una concentracin de entre 1- 2.5 mM, esta
concentracin debe optimizarse de manera experimental para cada PCR, ya que
un exceso de magnesio produce una amplificacin inespecfica de productos de
PCR, mientras que una baja concentracin disminuye la produccin del
amplificado y por ltimo contiene la enzima Taq polimerasa, la cual tiene como
funcin polimerizar una nueva cadena de DNA tomando como molde otra ya
existente. Debido a que en cada ciclo de la PCR se lleva la mezcla de reaccin a
temperaturas de 95C, se requiere de una DNA polimerasa capaz de soportar
dichas temperaturas, por lo que la Taq polimerasa fue aislada a partir de
bacterias Thermophilus aquaticus ya que soporta dichas temperaturas de
desnaturalizacin, por lo que la tcnica es ms eficiente y la cantidad aadida de
la enzima debe ser suficiente para suplementar los 25 a 40 ciclos de
amplificacin (Oliva, R. 2004) ; los Primers utilizados son los oligonucletidos
con secuencias especficas que se utilizan para reconocer por
complementariedad secuencias blanco en el DNA molde y delimitan los extremos
del producto que se desea amplificar, cuya funcin radica en proporcionar un
extremo 3 libre al cual se han de aadir los nucletidos consecutivos mediante
enlace fosfodister (van Pelt-Verkuil,Elizabeth. 2008), ya que la DNA polimerasa
requiere iniciar la sntesis partiendo de un 3OH preexistente, el primer sentido
es complementario y antiparalelo a la cadena 3-5 del DNA molde, por lo que la
polimerasa, al adicionar nucletidos en l , origina una cadena sentido (5-3);
mientras que el primer antisentido es complementario y antiparalelo a la cadena
5-3 del fragmento de DNA a amplificar, por lo que su polimerizacin origina a la
cadena 3-5, adems de tomar en cuenta que la concentracin ptima de los
primers para una PCR debe de ser aproximadamente de 0.3 a 1 M/reaccin, ya
que un exceso favorece la formacin de dmeros entre dos primers parcialmente
complementarios o estructuras secundarias por complementariedad parcial de
un primer con el mismo. (Armendariz, 2011). Aparte de la reaccin mencionada
en el primer tubo se prepar un segundo tubo que adems de contener los
reactivos anteriores tambin inclua formamida al 99% empleado comnmente
en aplicaciones de electroforesis e hibridacin que, si bien en ciertas referencias
 lo mencionan como un aditivo cuya funcin es la de estabilizar la estructura
secundaria del DNA en un rango de concentracin de 1% - 5%, ste se comporta
como un agente desnaturalizante; degrada el DNA y el RNA para separar las
bandas de doble hlice, lo cual puede comprometer una ptima amplificacin al
ser un factor que afecta el valor de la temperatura de alineamiento (Ta).
Los sistemas anteriormente mencionados fueron sometidos a las temperaturas
indicadas en la metodologa (pg. 48) por medio de un termociclador, aparato
en el que se efecta la PCR convencional. Todo el proceso de la PCR est
automatizado mediante un aparato llamado termociclador, este es capaz de
cambiar la temperatura de la muestra en segundos lo que permite calentar y
enfriar los tubos de reaccin mediante una resistencia elctrica de una placa
metlica, que distribuye la temperatura de manera homognea durante tiempos
programados. Normalmente los rangos de temperatura van de 4 a 96 C. Debido
a que se incuban soluciones acuosas, los equipos cuentan con una placa
metlica de manera de tapa, la cual se mantiene a 103C para evitar la
condensacin del agua en la tapa de los tubos donde ocurre la reaccin. De esta
manera, se evita que la concentracin de los solutos se modifique, lo que
alterara las condiciones ptimas para la DNA polimerasa y termodinmica de
hibridacin de los primers. (Oliva, R. 2004)

Tabla 1: Primers utilizados para la amplificacin del exn 3 y 4 de SURF1

Primers 5-3 Tamao del fragmento

Forward: TTCGAGGGCTTCTGGCTCCA 380 pb
Reverse: AAGTAAAACAGGCCCTAGG

Figura No. 2: Localizacin del gen SURF1 en el cromosoma 9

Figura 2: impresin de pantalla obtenida de NCBI, Gene ID: 6834, secuencia NC_000009.12. La
flecha roja indica la localizacin del gen SURF 1 en el cromosoma 9 de Homo sapiens.: 9q34, de
este gen se amplificaron las regiones de los exones 3 y 4.

Figura No. 3 : Anlisis de primer forward en Oligo Analyzer

 Figura 3: Se muestra en el primer recuadro la secuencia del primer, seguido de su secuencia
complementaria, Longitud de 20 pb, Contenido de G-C 60% , Temperatura de fusin 61.1 C, peso
Molecular de 6100 g/mol y coeficiente de extincin de 178500 L/(mol.cm)

En el anlisis general de las condiciones del primer sentido realizado en Oligo

Analyzer se muestran las caractersticas principales del primer, indispensables
para la tcnica de PCR, para ser utilizado, en este caso una de las ms
importantes es el contenido de G-C; este no debe ser ms del 55% de la
secuencia o, en su defecto, oscilar entre 40-60% ya que de lo contrario su Tm y
su TA aumentarn debido a que las uniones entre las bases G-C se encuentran
unidas por 3 puentes de hidrgeno es decir la unin es ms fuerte y estable, por
tanto se requerir mayor temperatura para romper el enlace; otra caracterstica
importante radica en su tamao, ste oscila entre 15-25 pares de bases.
Si no se respetan estas reglas, existe adems la posibilidad de la formacin de
dmeros de primers, es decir, de productos inespecficos. Esto repercutir en el
rendimiento de la reaccin, as como en la especificidad del producto esperado.
(Tamay de Dios, L. 2013)

Figura No. 4: Anlisis del primer reverse en OligoAnalyzer

Figura 4: Se muestra en el primer recuadro la secuencia del primer, seguido de su secuencia

complementaria, Longitud de 19 pb, Contenido de G-C 47.4% , Temperatura de fusin 51.7 C,
peso Molecular de 5854.9 g/mol y coeficiente de extincin de 198200 L/(mol.cm)

Anlisis general del oligo reverse para ser utilizado en la amplificacin del gen
SURF1, se encuentra dentro del contenido de %G-C, pero su Tm difiere 9.4C con
respecto al oligo Forward (Figura No. 2), y no cumple con las condiciones de
 idealidad para el diseo de primers don de la diferencia debe ser no mayor a 5
c. (van Pelt-Verkuil,Elizabeth. 2008)

Clculo de la Tm y Ta de los primers para el fragmento de 380 pb (exn 3 y 4)

del gen SURF1 por Regla de Wallace

TM = 2(A + T) + 4(G + C)

TMForward = 2(8) + 4(12) = 64 C

TMReward = 2(10) + 4(9) = 56 C

Ta = TM - 5

TaForward = 64 - 5 = 59 C

TaReward = 56 - 5 = 51 C

La diferencia entre las temperaturas de fusin es de 8 C, cuando idealmente se

pretende trabajar con primers cuyas temperaturas de fusin sean no mayores a
5 C para una ptima amplificacin. (van Pelt-Verkuil,Elizabeth. 2008). Existen
muchos mtodos para calcular la temperatura de fusin, pero siempre, despus
de efectuado el clculo es necesario ir al laboratorio y ensayar con diferentes
temperaturas de asociacin cercanas a la temperatura de fusin para determinar
la temperatura ptima para cada reaccin. (Tamay de Dios, L. 2013)

Figura No. 5: Posibles estructuras secundarias que forma el primer forward con
su complemento

Figura 5: En color amarillo se muestra el G de las estructuras secundarias que forma el primer
con su complemento, seguido de las Temperaturas de Fusin, H y s.

La formacin de estos bucles no afecta la reaccin ya que sus Tm se encuentran

muy por debajo de la Tm=60C de la reaccin. (Cortzar, A. 2004)

Figura No. 6: Posibles estructuras secundarias que forma el primer reverse con
su complemento
 Figura 6: En color amarillo se muestra el G de las estructuras secundarias que forma el primer
con su complemento, seguido de las Temperaturas de Fusin, H y s.

Anlisis de estructuras secundarias obtenida de Oligo Analyzer, este programa

nos muestra los posibles bucles que se forman con este primer, la existencia de
estructuras secundarias pudieran afectar la tcnica de PCR, pero las
temperaturas en las se forman (recuadro rojo) se encuentran por debajo de la
Tm de nuestra reaccin Tm=60C. Por tanto estas estructuras se desharn
cuando aumente la temperatura del termociclador.

Figura No. 7: Posibles homodmeros formados por el oligonucletido reverse

 Figura 7: Valor mximo de delta G : energa libre de la secuencia unida a su complemento perfecto.
Delta G calculado a partir del tramo de bases complementarias ms largo.

Aquellas bases que se unen por lneas son las que se toman en cuenta para el
clculo del delta, aquellas que se observan en puntos son bases
complementarias que influyen en la estructura del dmero pero no ejercen
impacto en el delta G. Impresin de pantalla obtenida de Oligoanalyzer muestra
las posibles uniones entre el Oligo Reverse con su antisentido; Pese a que su G
es menor a -9 Kcal/mol. estos 2 posibles heterodmeros no interfieren con la
amplificacin del producto, siempre y cuando no rebasen el % G= 30%, que es
el marcado en color verde en la imagen.

Figura 8: Anlisis de Heterodmeros entre la pareja de primers

Figura 8: Primary Sequence: Forward; Secondary Sequence: Reverse; Valor mximo de delta G :
energa libre de la secuencia unida a su complemento perfecto. Delta G calculado a partir del
tramo de bases complementarias ms largo.

Aquellas bases que se unen por lneas son las que se toman en cuenta para el
clculo del delta, aquellas que se observan en puntos son bases
complementarias que influyen en la estructura del dmero pero no ejercen
impacto en el delta G.

El anlisis de Oligoanalyzer, muestra la formacin de una estructura entre los

primers, esto se debe a que su G es menor a - 9 kcal/mol, pero el % G es
menor al 30% permitido, por tanto no habr problema para la amplificacin de
nuestro producto (exn 3 y 4 del gen SURF1).

Forward: 5-TTCGAGGGCTTCTGGCTCCA-3

Figura No. 9: Captura de Blast

Figura 9: Esta imagen indica la relacin de la secuencia del oligo forward con la secuencia del gen
 SURF1 y muestra la secuencia del gen SURF1 a la que se pega el primer.

Reverse: 5-AAGTAAAACAGGCCCTAGG-3

Figura No. 10: Relacin de primer con SURF1

Fig 10 :Esta captura de pantalla extrada de Blast nos permite comprobar que nuestro primer
reverse se pega a la secuencia del gen SURF1.

Figura No. 11: Amplificacin del exn 3 y 4 en forma grfica, con la herramienta
bioinformtica Primer Blast

Fig 11: el recuadro rojo nos muestra la regin que amplifican nuestros primers forward y reverse
utilizados en la prctica (tabla 1). Con esto podemos comprobar de manera grfica que los primers
utilizados son especficos para el exn 3 y 4 del gen SURF1 humano.
Figura No. 12: Anlisis de pareja de primers y longitud del producto que
amplifica

Figura 12: En esta figura se muestra la longitud del producto que amplifican este par de primers
(recuadro amarillo), el cual coincide con los resultados del manual de prcticas de gentica
molecular, en el recuadro morado se muestran las caractersticas generales de los primers como %
GC y Tm de los primers, ya analizadas por Oligoanlyzer (figuras 3 y 4), podemos observar que los
% de GC coinciden en ambas bases, pero las temperaturas varan dependiendo de la base de
datos.

En el anlisis general de nuestros primers (recuadro morado), ambos cumplen

con el % de GC requerido, pero sus Tm difieren 10C, es decir no cumplen con la
idoneidad para un buen diseo de primer, pero cumplen con la amplificacin del
producto deseado.
Las imgenes 11 y 12 extradas de Primer Blast, son originadas a partir de la
secuencia NG_008477.1 extrada de GeneBank.
 Figura No. 13: Fotografa de la corrida electrofortica correspondiente a una
tcnica de PCR de punto final del grupo 2651

Figura 13. M 100 pb: Carril con marcador de peso molecular utilizado. En rojo: Carriles
correspondientes al nmero de equipo del grupo 2651. Flechas naranja: Productos inespecficos
(PI). En azul cielo: Corrimiento electrofortico de la muestras. Flechas blancas: Primers no
hibridados al fragmento de DNA de estudio.

Corrida electrofortica de amplificacin del fragmento de 380 pb del gen SURF1

por tcnica de PCR de punto final con Ta = 60.0 C de cada uno de los equipos
del grupo 2651, cuyos tamaos varan entre 400 - 600 pb respecto al marcador
de peso molecular utilizado y que presentan amplificacin de productos
inespecficos adems de la presencia primers sin hibridar que se visualizan como
una ligera nubosidad hasta debajo de los carriles electroforticos, a excepcin
del carril 2; adems de visualizar bandas al inicio de los carriles que es
caracterstico de la degradacin de DNA genmico y que no sera este el caso al
cual se puede asociar debido a que la muestra de DNA no era de este tipo. En el
caso de los carriles 2 y 7 podemos inferir que la estructura del DNA utilizado,
tambin influye en el corrimiento electrofortico, por tanto podemos especular
que la banda del carril 2 se encuentra por debajo del resto de las muestra.

En el caso particular de la muestra que se encuentra en el carril N 2

seleccionamos la obtenida por el mtodo de extraccin de perclorato de sodio,
que era la que presentaba mayor pureza del DNA obtenido, como se puede
observar en la imagen (fig.13) la banda obtenida en esta carril se encuentra en
la marca de los 400 pb, indicativo de que nuestro fragmento de 380 pb fue
amplificado, tambin se observan productos inespecficos por debajo de las
bandas del producto amplificado y en el caso de la muestra N2 por encima del
producto amplificado, gracias al anlisis bioinformtico podemos deducir que
hubo la formacin de homodmeros y heterodmeros (productos inespecficos),
que se pueden observar en todas la muestras. (Cortzar, A. 2004)
A pesar de haber realizado una PCR de gradiente, esto para evaluar las
condiciones ptimas de trabajo donde se pretende que los primers puedan
hibridar de forma especfica y con alta afinidad sobre las cadenas de DNA y as
poder obtener la amplificacin del fragmento del gen SURF1 deseado, se
demostr que se obtuvieron productos inespecficos los cuales en teora se
supone no deberan de presentarse en la corrida electrofortica para la tcnica
de PCR de punto final pero que a pesar de ello, se obtuvo la amplificacin de los
exones 3 y 4 que se deseaban, no hubo degradacin del material gentico y la
presencia de otros fragmentos amplificados no afecta la visualizacin y anlisis
de aquellos que se buscaban obtener; adems cabe sealar que la cantidad de
producto amplificado es aceptable y de gran utilidad an siendo que slo se
carg una quinta parte de la reaccin para la realizacin de la PCR, lo cual hace
referencia a una tcnica experimental realizada adecuadamente por parte del
grupo 2651 de Gentica Molecular; debido a lo anterior recordamos que una de
las caractersticas ms atractivas de la PCR es que la cantidad y calidad de la
muestra de DNA sujeta a amplificacin no necesita ser alta. Una sola clula o un
lisado celular crudo o especmenes con una longitud promedio de unos pocos
cientos de pares de bases son usualmente adecuadas para una amplificacin
exitosa. El criterio esencial es que la muestra contenga al menos una cadena de
DNA intacta que abarque la regin que va a ser amplificada y que las impurezas
sean suficientemente diluidas como para no inhibir la polimerizacin.
(Nussbaum, R. L. 2008)
Estos resultados fueron satisfactorios y se defiende el haber elegido como
temperatura de alineamiento ptima los 60.0 C puesto que el haber
seleccionado el valor de temperatura anterior a ste (56.9 C), o uno despus
(63.0 C) habra afectado con gran impacto el resultado al cual se pretenda
llegar; analizando la figura 1 podemos darnos cuenta de la banda de producto
inespecfico tan ntida para el carril de la T3, haber seleccionado esta
temperatura en las condiciones de trabajo para la PCR de punto final, hubiera
imposibilitado interpretar los fragmentos del gen SURF 1 de los exones 3 y 4 por
gran presencia de otros fragmentos ms que se lograron amplificar por la DNA
polimerasa al no haber una hibridacin especfica por parte de los primers sobre
el DNA; caso contrario sera el establecimiento de la T5 como la Ta ptima, pues
en ella no se obtuvo siquiera un producto de amplificacin por la tcnica de PCR
de gradiente al estar expuesto el material gentico una temperatura tan alta.
(Cortzar, A. 2004)

Es altamente recomendable realizar una PCR de gradiente como parte de la

metodologa para la optimizacin de las condiciones de amplificacin,
asegurando de esta forma productos de calidad tiles para fines de
investigacin, sealando la importancia de realizar siempre el anlisis de las
temperaturas de fusin y alineamiento de los primers diseados para amplificar
un fragmento en especfico de cualquier gen de inters, pero no fiarse
nicamente de programas de bioinformtica para la realizacin de estos
clculos, sino apoyarse con la regla de Wallace, verificando as la diferencia
existente entre ambos primers que delimitar la obtencin de resultados
confiables.
(Nussbaum, R. L. 2008)

Conclusiones

La reaccin en cadena de polimerasa es una tcnica comn en los estudios

relacionados con la gentica, por lo que es de especial importancia tener en
cuenta las condiciones adecuadas para su realizacin, las caractersticas de los
oligonucletidos y las caractersticas de la muestra para obtener un producto de
amplificacin deseado.

En este estudio se amplific un fragmento de ADN mediante una PCR

correspondiente al exn 3 y 4 del gen SURF1, para lograr esto, se realiz primero
una PCR de gradiente a las siguientes temperaturas , para obtener las
condiciones de alineamiento adecuadas, posteriormente se realiz una
electroforesis en gel de agarosa cuales , en la cual se observ que el mejor
resultado fue a 60C sin formamida ya que no se obtuvieron productos
inespecficos a estas condiciones y la cantidad de ADN era adecuada
posteriormente se realiz una PCR de punto final con las condiciones resueltas
con la PCR de gradiente y mediante una electroforesis en gel de agarosa, se
revel que se obtuvo un producto amplificado de los exones 3 y 4 del gen SURF
1, al igual que un producto inespecfico con un peso molecular mayor al del
fragmento deseado, por lo que se deduce que no existe una total especificidad
de los primers utilizados

A partir del anlisis con herramientas bioinformticas podemos inferir las

ventajas y desventajas que podra tener el uso de una pareja de cebadores para
amplificar un producto deseado, ya que brindan una idea muy aproximada a lo
que se obtendr en el laboratorio, es por ello que el uso de herramientas
bioinformticas y la prctica en el laboratorio pueden coadyuvar para obtener
mejores resultados y optimizar el trabajo en el laboratorio.

Bibliografa
- Oligoanalyzer: https://www.idtdna.com/calc/analyzer
- Primer Blast: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
- Solano, A. (2001). Enfermedades genticas del ADN mitocondrial humano.
Instituto NAcional de Salud pblica, Mxico; vol.43 no.2 Cuernavaca. En lnea:
http://www.scielo.org.mx/scielo.php?pid=s0036-
36342001000200010&script=sci_arttext consultado: 06 mayo 2016
- Armendariz, Juan (2011). Biologa Molecular. Ed. Mc Graw Hill, Mxico. En
lnea:https://books.google.com.mx/books?
id=DCSEBgAAQBAJ&pg=PA153&dq=PCR+de+punto+final&hl=es&sa=X&ei=Ma
w1VZunA_eJsQSL7YCgDg&ved=0CCgQ6AEwAg#v=onepage&q=PCR%20de
%20punto%20final&f=false Consultado 05/mayo/2016
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6834
- Oliva, R; Ballesta, F; Oriola, J. & Clria, J. (2004). Gentica Mdica. (3ra ed.).
Espaa: Publicacions i Edicions, Universitat de Barcelona (UB). 289-293
- Tamay de Dios, L; Ibarra, C; Velasquillo, C. (2013). Fundamentos de la reaccin
en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigacin en
Discapacidad. 2(2). 71-77
- van Pelt-Verkuil,Elizabeth; van Belkum, Alex. & P. Hays, John. (2008). Principles
and Technical Aspects of PCR Amplification. The Netherlands: Springer. 119-125
- Garrido, A; Teijn, J; et al. (2006). Fundamentos de Bioqumica Estructural. (2da
ed.). Madrid, Espaa: Editorial Tbar. 281-288
- Nussbaum, R. L; McInnes, R. R; Willard, H. F. (2008). Thompson & Thompson.
Gentica en medicina. (7ma ed.). Barcelona, Espaa: Elsevier Masson. 51-54
- Cortzar, A. & Silva, E. (2004). Mtodos Fsico-Qumicos en Biotecnologa.
Mxico: UNAM - Instituto de Biotecnologa. 8-13, 29-32. Consultado: 06/05/16.
Disponible en: http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/pcr.pdf