PRACTICA 1: EXTRACCIN DE ADN Y VISUALIZACIN DEL ADN

a
Jacobo Prez, bMaria Cecilia Morcillo, cSebastian Vasquez
a
jacoperez11@hotmail.com, bmmariace@gmail.com,
c
vasquezsebastian049@gmail.com
Universidad Icesi, Facultad de Ciencias Naturales, Programa de Qumica,
Laboratorio de Bioqumica
Santiago de Cali, Colombia
Enero 27 de 2017-1

RESULTADOS. Una protena se puede purificar

Se depositan en una probeta
aproximadamente 5mL de saliva de
los cuales se toman
aproximadamente 2,5mL y se
depositan en un tubo Falcn. Se
adicionan 2,5mL de solucin SDS al
10% y se agita. Posteriormente se
adicionan 50L de solucin de NaCl
5M y se agita nuevamente. Luego de
esto se agregan 10mL de etanol frio
para retirar las sales del compuesto y
terminar su precipitacin.
Despus de realizar el procedimiento
previamente enunciado se observa la
aparicin de un precipitado turbio
color blanco que queda suspendido
en medio de la solucin.
Usando una micropipeta se toman
5L de DNA con 10L de SYBR y se
lleva esto al espectrofotmetro y se
esperan los resultados. En este caso
en ambas longitudes (240-260) los
resultados fueron mayores a dos por
lo que se procedi a realizar una
dilucin. Posterior a la realizacin de
la dilucin los resultados no
cambiaron significativamente por lo
que se dio por terminada la prctica.
ANLISIS DE RESULTADOS
A lo largo de la prctica se emplearon
varios agentes qumicos con el fin de
purificar y homogeneizar una muestra
de DNA y posteriormente analizarla.
sometiendo la mezcla impura del
material de partida a una serie de
separaciones basadas en las
propiedades fsicas como el tamao y
la carga (Stryer, Berg, & Tymoczko,
2016). Cada uno de estos agentes
tiene una funcin especial a la hora
de reaccionar con la muestra y son
los responsables de poder llevar a
cabo este tipo de experimentacin.
Se debe fraccionar la clula en sus
componentes y precisar qu
componente est enriquecido en la
protena de inters. Las protenas se
pueden purificar de acuerdo a su
solubilidad, tamao, carga y afinidad.
(Stryer, Berg, & Tymoczko, 2016)
En la adicin de SDS se logra
comenzar el proceso de lisis celular
obligada debido a su carcter
detergente; este proceso rompe la
estructura tridimensional de las
macromolculas como las protenas o
los cidos nucleicos y se consigue su
desnaturalizacin (Brinboim, 1979).
La posterior adicin de NaCl (cloruro
de sodio) a la solucin incentiv el
proceso de purificacin del DNA. El
NaCl logra tornar insoluble la mezcla,
porque el sodio neutraliza la carga
negativa de los grupos fosfatos
(Ornstein, 1964).
Luego se utiliz el alcohol para seguir
con la purificacin del DNA. El DNA
es insoluble en alcohol, por lo que se
puede precipitar en una solucin de
etanol fro y recuperar
posteriormente. El alcohol del
sobrenadante se lleva las sales
aadidas previamente. Esto permite
empezar a evidenciar pequeas
hebras de ADN que luego se
utilizaron para la tincin con SYBR
(Davis, 1964). Es importante tener en
cuenta que cada reactivo se debe
aadir completamente a la solucin,
sin ello es posible que la solucin no
precipite completamente.
La adicin de SYBR Green hace que
la sustancia se intercale entre las
bases aromticas nitrogenadas a lo
largo de las cadenas de DNA. Al ser
una sustancia fluorescente, el SYBR
logra la tincin del DNA y finalmente
la visualizacin de este bajo luz UV.
Se tiene que recordar que entre ms
cantidad de DNA se haya logrado
precipitar en el paso anterior, ms
DNA se va a lograr evidenciar en la
tincin.
Con base a los resultados obtenidos
en la prctica se pueden empezar a
analizar las razones por las cuales los
resultados no fueron los esperados.
Por ejemplo, se puede llegar a
considerar que el instrumento
utilizado no es lo suficientemente
sensible para el caso, se debe
recalcar que el instrumento apropiado
para realizar la prueba es un
nanodrop, el cual trabaja con
muestras extremadamente pequeas,
como 1L, mientras que el
instrumento usado fue un
espectrofotmetro. Por otro lado, la
muestra pudo haber estado
contaminada con carbohidratos,
protenas y con las sustancias
qumicas usadas para su
precipitacin lo cual pudo causar
resultados tan altos sin importar que
se realizara una dilucin. Lo ms
seguro es que la muestra nunca
haya quedado homognea,
dificultando el paso de la luz y
explicando los valores tan elevados
de absorbancia.
La tcnica de espectrofotometra se
rige bajo la ley de Lambert-Beer. Esta
propone que la absorbancia de una
muestra a determinada longitud de
onda depende de la cantidad de
especie absorbente con la que se
encuentre la luz al pasar por la
muestra. Es decir, la absorbancia
depende de la concentracin de la
muestra y de la longitud de la
trayectoria de la luz a travs de la
muestra. La ley de Lambert-Beer se
define como:
Donde:
absorbancia de la muestra
Intensidad de la radiacin
que entra en la muestra.
Intensidad de la radiacin
que sale de la muestra.
Concentracin de la
muestra en moles/litro.
Longitud de la trayectoria
de la luz a travs de la
muestra, centmetros.
absortividad molar,
litros/(mol*cm)
(Yurkanis Bruice, 2008)
CONCLUSIONES
La calidad de la determinacin
de un compuesto depende de
las condiciones en que este
tenga y loa forma en la que
este se trate.
Un factor relevante en la
determinacin de compuestos
es que el instrumento que se
use sea el ms adecuado para
el proceso que se llevara a
 cabo y que su sensibilidad y
calibracin sean las mejores.
Los resultados obtenidos
dependen casi por completo
de los mtodos y los
elementos que se empleen
para llegar a ellos.
Bajo condiciones no tan
buenas, como fue el caso de la
prctica, los resultados pueden
salirse bastante de los rangos
esperados, con lo que se
llegan a considerar
infructuosos.

REFERENCIAS

- Ornstein L (diciembre de 1964). DISC

ELECTROPHORESIS. I. BACKGROUND
AND THEORY.. Ann N Y Acad Sci. 121:
321-349.
- Davis BJ (diciembre de 1964). Disc
Electrophoresis. 2, Method and
application to human serum
proteins. Ann. New York Acad. Sci 121:
404-427.
- Birnboim HC, Doly J (1979) A rapid
alkaline extraction procedure for
screening recombinant plasmid DNA.
Nucleic Acids Research 7: 1513-1523.
Artculo original que describe el mtodo
de lisis alcalina.
- Stryer, L., Berg, J. M., & Tymoczko,
J.L.(2016). BIOQUMICA CON
APLICACIONES CLNICAS Volumen I
(Sptima ed). Barcelona - Espaa:
Editorial Revert.
- Yurkanis Bruice, P. (2008). QUMICA
ORGNICA (Qunta edic). Mexico D.F.:
Pearson Educacin.