I.

INTRODUCCIN

De acuerdo al Centro Internacional de la Papa (CIP), la papa (Solanum

tuberosum L.), es uno de los cultivos de mayor influencia a nivel mundial,
ocupando el cuarto lugar en importancia para el hombre, despus del arroz,
maz y trigo, siendo la especie vegetal que se siembra en mayor extensin
entre los cultivos que se reproducen vegetativamente (Shekhawat et al., 1992).
La papa como cultivo de propagacin vegetativa, es propensa a la infeccin
acumulativa por bacterias, hongos, virus, viroides y fitoplasmas, a este proceso
se le conoce como degeneracin.

Las enfermedades virales de la papa, generalmente reducen el vigor de

la planta, disminuyendo los rendimientos desde un 20 hasta un 95 %, lo que
limita la posibilidad de usar los tubrculos como semilla (Salazar, 1997). La
papa es infectada por ms de 30 especies diferentes de virus degenerando la
semilla (Gopal et al., 1998) situalcin que conlleva tambin a una disminucin
en la calidad y presentacin del tubrculo.

La produccin de semilla sana es el mtodo de control viral ms

aplicado. Con los conocimientos modernos de la Biotecnologa Vegetal es
posible comenzar un programa con material completamente sano obtenido por
medio de herramientas de esta disciplina, como lo es el cultivo de tejidos
vegetales y su posterior multiplicacin (micropropagacin) a travs de
generaciones sucesivas evitando o reduciendo la reinfeccin (Salazar, 1995).
Para verificar el saneamiento de las vitroplantas, antes de ser propagadas de
manera masiva, es necesario realizar diversas pruebas de biologa molecular e
inmunolgica para tener la certeza de que el material a micropropagar vaya
libre de patgenos con el fin de generar la semilla sana.

1
 La biotecnologa vegetal tiene como una de sus pilares fundamentales al
cultivo de tejidos vegetales, el cual consiste en una serie de tcnicas que
permiten el cultivo y manipulacin, bajo condiciones artificiales y controladas,
de clulas, tejidos y rganos vegetales. Entre las aplicaciones del cultivo de
tejidos se pueden mencionar a la micropropagacin o clonacin in vitro de
plantas.

Mtodos convencionales para producir variedades de papa libres de

patgenos o semillas-tubrculo bsica y certificada se inicia mediante la
micropropagacin de plntulas sanas, establecidas in vitro a travs del cultivo
de tejidos en un medio nutritivo a partir de meristemos en un laboratorio de
cultivo de tejidos vegetales. Las plantas producidas in vitro, despus de un
periodo de aclimatacin en invernadero, se transfieren a vivero donde son
producidos los tubrculos. El xito o fracaso de la tuberizacin depende en
gran medida del sustrato que se use para este fin. La desinfeccin adecuada
del suelo regularmente se realiza con agentes qumicos como el bromuro de
metilo, el cual elimina microorganismos tanto patgenos como benficos. Esta
tcnica resulta en un bajo rendimiento de minitubrculos por planta,
generalmente cinco o menos (Daniels et al., 2000; Pereira y Fortes, 2003).

El desarrollo de un sistema ms eficiente y productivo con menor

impacto ambiental, por ejemplo sin el uso de biocidas proscritos como el
bromuro de metilo, o el benlate, es capaz de mejorar la calidad del material de
propagacin usado por los productores de papa, aumentar el rendimiento de
las cosechas y reducir los costos de produccin (Pereira and Fortes, 2003;
Pereira and Fortes, 2004).

Tambin es posible producir minitubrculos de papa in vitro en medio

semislido, en medio lquido en inmersin temporal; y ex vitro en un sistema
hidropnico. Es conveniente sealar que cuando se usa suelo es conveniente

2
reducir los riesgos de contaminacin de las races y tubrculos por patgenos;
asimismo evitar el uso de desinfectantes qumicos, generalmente nocivos para
la salud humana y ambiental.

El objetivo del presente trabajo fue el de evaluar tres sistemas para

producir minitubrculos de papa: in vitro en medio semislido y en inmersin
temporal; y ex vitro a partir de vitroplantas aclimatadas, trasplantadas en un
sustrato preparado con turba, agrolita y vermiculita, esterilizado mediante calor.

En cada uno de los sistemas se evalu rendimiento (cantidad de

minitubrculos/planta y peso).

1.1. Justificacin del estudio

El cultivo de papa es una elemental fuente de ingresos para los

agricultores y generador de empleo, ya que requiere de aproximadamente 70
jornales por hectrea para las labores del cultivo, principalmente en la cosecha;
y es generador de empleos indirectos relacionados con el transporte, la
comercializacin e industrializacin (Caldern et al., 2004).

Las papas son susceptibles a una serie de enfermedades que reducen el

rendimiento y la calidad de los tubrculos. Adems, los patgenos se acumulan
durante la clonacin sucesiva del tubrculo y en el suelo donde se cultivan. Por
eso la produccin sostenible de papa depende de la renovacin constante del
material de siembra libre de enfermedades.

Una innovacin importante para la industria de la papa es la adopcin

generalizada del cultivo de tejido vegetales como sistema para multiplicar
plantas libres de enfermedades, que se pueden usar para producir tubrculos
semilla sanos para los agricultores.

3
 En Mxico se siembraron 66,027 ha de papa en el ao 2006, en las
cuales se obtiene un rendimiento medio de 23.3 ton/ha (SIAP/SAGARPA,
2007). Un factor limitante en la produccin de papa son las enfermedades
virales, tales como el virus del enrollamiento de la hoja de papa (PVRL)
causando las mayores prdidas en rendimiento seguido por el virus Y de la
papa (PVY) y el virus X de la papa (PVX) (Salazar, 1997), tambin por
organismos patgenos como hongos y bacterias. Algunos de estos patgenos
habitan el suelo y afectan el rendimiento del cultivo; otros son transportados por
el aire o por otros medios y causan epifitotias que deben controlarse aplicando
productos de control qumico. De estos organismos los ms importantes son
los causantes de enfermedades virales porque se perpetan en la
descendencia clonal.

En muchos pases, la imposibilidad de producir semilla bsica para

cubrir la demanda de los productores de modo estable, ha incrementado la
importacin de sta en cantidades significativas. La importacin y manipulacin
de grandes volmenes de semilla trae consigo la introduccin y el
establecimiento de plagas y enfermedades. Por lo que es necesario desarrollar
mtodos avanzados de produccin de semilla en aquellos sitios donde, adems
de importar esa semilla, haya focos de infeccin viral todo el ao (Roca y
Mroginski, 1991).

La Confederacin Nacional de Productores de Papa (CONPAPA) en su Plan

Rector Nacional Papa. Sistema Producto Papa (2010) seala, entre otras
propuestas, que con el fin de perfeccionar el proceso productivo en los
eslabones de este sistema, es conveniente fomentar la produccin de
semilla certificada mexicana; contar con variedades apropiadas para
cada regin y uso; e identificacar variedades resistentes, tolerantes y
de alta productividad. Tambin es necesario investigar qu mecanismos son
los adecuados para el abastecimiento de forma oportuna de insumos e
incursionar en el diseo y/o adaptacin de tecnologas que garanticen la

4
produccin de semillatubrculo (laboratorios e invernaderos) libres de
patgenos, de variedades resistentes o tolerantes y de alta productividad.

Tambin, otro aspecto prioritario que se indica en el mencionado plan, es

la escasa disponibilidad de semilla-tubrculo en el pas, por lo que es necesario
importar volmenes considerables ya que se utilizan de una a dos toneladas de
semilla para el establecimiento de una hectrea. Adems los problemas
fitosanitarios representan gran preocupacin debido a la adquisicin de semilla-
tubrculo (con patgenos) y la movilizacin de papa comercial, que puede
afectar terrenos que se haban mantenido libres de plagas y enfermedades, y
en consecuencia disminuir considerablemente el rendimiento hasta llegar a
perderse totalmente la produccin, y cuando sta es baja se puede ver
afectada la calidad del producto. En este ltimo tema se recomienda reforzar
las normas fitosanitarias y la vigilancia en aduanas del material gentico que
provenga del exterior o del interior del pas donde existan problemas sanitarios.

Por lo anterior, se propuso en el presente trabajo evaluar tres sistemas

para producir minitubrculos de papa libre de patgenos con el fin de contribuir
a mejorar la calidad fitosanitaria y rendimiento de la papa en el estado de
Zacatecas.

1.2. Pregunta cientfica

Cul es el sistema de produccin de semilla libre de patgenos de

papa ms conveniente desde el punto de vista de rendimiento, economa y
rapidez?

1.3. Hiptesis

De los sistemas de produccin de semilla pre-bsica de papa (medio

semislido, SIT y sustrato ex vitro), el ms conveniente desde el punto de vista
en rendimiento, economa y rapidez es el Sistema de Inmersin Temporal.

1.4. Objetivo General

5
 Comparar la eficiencia de tres sistemas de cultivo, para producir semilla
pre-bsica de papa (Solanum tuberosum L.), libre de patgenos.

1.5. Objetivos Particulares

1. Mediante el cultivo de meristemos establecer in vitro plantas de papa

libres de patgenos.

2. Producir microtubrculos de papa mediante cultivo en medio semislido,

en sistema de inmersin temporal y vitroplantas in vivo.

3. valuar rendimiento de la produccin en cada uno de los sistemas.

II. REVISIN DE LITERATURA

2.1 Origen del germoplasma de la papa

La papa es un cultivo originario de Sudamrica, fue llevado al resto del

mundo despus del siglo XVI. La domesticacin de este cultivo se origin en
las montaas de los Andes. Muchas especies silvestres crecen en diversos
lugares desde Chile a travs de Amrica Central y hasta Amrica del Norte.
Correll (1962) seala que la domesticacin se realiz debido a la no
disponibilidad de otros cultivos para la alimentacin. Se cree que a travs de la
Costa del Pacifico y Mxico pudieron haber sido cultivadas, seleccionadas y
distribuidas especies silvestre de papa y ser llevadas hasta la parte central de
Arizona y Nuevo Mxico.

Hoy en da la papa es el principal cultivo domesticado presente en Per

y Bolivia, y jug un papel importante en aquella sociedad. Es posible que la
agricultura extensiva del Imperio Inca haya incluido centros para el
almacenamiento y evaluacin del Germoplasma. Se ha sugerido que Machu
Picchu, con sus principales microclimas y terrazas fueron un prototipo ancestral
de los actuales bancos de germoplasma (Weatherford, 1988).

6
 La fecha precisa de introduccin de la papa en Europa es incierta, pero
fue probablemente despus de 1570. De acuerdo a Wilson (1993), fue incluida
en la dieta del hospital de Sevilla en el ao de 1573. De acuerdo a Salaman
(1926), la primera mencin registrada de la papa en Europa ocurri en 1587
cuando el botnico Australiano Clusius describi algunos tubrculos que l
recibi de Espaa. Un ao despus en Londres, Gerarde, famoso por su
Gerardes Herbal, recibi algunos tubrculos posiblemente de Virginia. Sin
embargo fue hasta 1730 que se dio la primera descripcin de las diferentes
variedades de papa, la que fue realizada por el escritor irlands Rye, en su
trabajo denominado Consideraciones sobre la Agricultura.

2.2 Importancia de la papa

La papa en Mxico tienen diferentes destinos: el 80 % es consumido

como alimento fresco, 7% para uso industrial y alimentos procesados (papas
fritas, almidn, alcohol, industria farmacutica) y el 13% restante, se utiliza
como semilla. El 60% del rea de cultivo de papa en Mxico es ocupada por la
variedad Alfa, seguida por la variedad Lpez con un 25% y el resto lo
componen entre las variedades Atlantic, White Rose, Bintje, Nortea, Rosita,
Mexiquense, Gigant, entre otras.

En trminos de nutricin, 100 g de papa aportan cerca del 10% de la

dosis diaria de protena recomendada para nios, una consideracin importante
para pases que buscan mejorar la dieta de sus pobladores. Estos 100 g
tambin proporcionan el equivalente al 10% de los requerimiento de un adulto
de tiamina, niacina, vitamina B6 y cido flico, y cerca del 50 % de vitamina C
(Dilmer, 2000). En la figura 1 se muestra un diagrama dode se resume el uso
integral de la papa.

2.3 Solanum tuberosum L.

Se considera a la papa originaria de Amrica del Sur, Per, Ecuador y

Bolivia. En Per ya la cultivaban los incas desde hace 2000 aos, y los
espaoles la llevaron a Europa en el ao 1537. Fue introducida a Irlanda entre
el periodo de 1600 a 1845, los cuales la trajeron a Norteamrica en el ao
1719.
7
 La papa es una planta herbcea anual y perenne por su reproduccin,
debido a su propagacin vegetativa. Los tallos son de dos tipos: tallos areos,
que son angulosos, de color verde, semierectos y/o rastreros; y los
subterrneos, que estn compuestos por rizomas y por tubrculos (parte
comestible). Las hojas son compuestas, formadas por foliolos largos de forma
ovoide. Las flores son de color blanco, purpura o veteadas de acuerdo al
cultivar.
Es una planta semirresistente al fro, se desarrolla desde alturas de 500
a 3000 msnm. La temperaturas ptima ambiental para obtener los mximos
rendimientos oscilan entre 15.5 y 18.5C.

Figura 1. Uso integral de la papa (Egsquiza, 2000)

Edmon (1981), seala que la papa se desarrolla bien en suelos francos y

arenosos, con buen contenido de materia orgnica y optimo drenaje. La
podemos clasificar como altamente tolerante a la acidez as como a la
salinidad.

8
 El suelo debe ser de textura media, abonado y fertilizado. Los suelos
arcillosos no se deben utilizar en la siembra del cultivo, pues provocan grandes
deformaciones en los tubrculos por su compactacin

El cultivo de la papa prefiere altitudes que oscilan entre los 1500 y 2000
msnm, pero debido a la gran existencia de variedades con que se cuenta, se le
puede cultivar a muy diversas altitudes.

Esta planta en su lugar de origen, se desarroll desde latitudes de 3

norte, hasta 22 sur, pero despus de su propagacin por el mundo, se ha
adaptado a regiones templadas, como son los pases europeos hasta 60 de
latitud norte.

2.4 Taxonoma

Clasificacin botnica de Solanum tuberosum L.

Reino Vegetal
Divisin Fanergama
Subdivisin Angiosperma
Clase Dicotiledneas
Subclase Simptala
Orden Tubiflorneas
Familia Solanaceae
Gnero Solanum
Especie S. tuberosum

2.5 Descripcin botnica y gentica

La papa Solanum tuberosum L. es una planta dicotilednea herbcea

anual, perteneciente a la familia de las Solanceas. Potencialmente es una
planta perenne debido a que es capaz de reproducirse de tubrculos
(Montaldo, 1984).

9
 Las hojas maduras son compuestas, consisten en un peciolo con un
foliolo terminal, foliolos laterales, foliolos secundarios y, algunas veces, foliolos
terciarios. Las hojas son pilosas presentando mayor cantidad de estomas en la
superficie interior que en la parte superior de la hoja. Existen diferencias en la
forma, numero, tamao y color de los foliolos entre distintos cultivares. Luego
de desarrollar de seis a nueve hojas, pueden aparecer botones florales en
todas o algunas de las ramas apicales (Alonso, 1996).

Los tallos son herbceos, de color verde y que en el corte de seccin

transversal son huecos y triangulares. Se considera como un tallo principal el
que crece directamente del tubrculo madre y como secundarios los que
provienen del tallo principal (Montaldo, 1984).

Las flores son pentmeras, de colores que varan del blanco al morado,
poseen estilo y estigma simple y un ovario bilocular. El numero de flores es
variable y depende del cultivar que se trate, lo mismo se puede decir de los
frutos que se forman a partir de ellas (Alonso, 1996).

El sistema radical, al encontrarse en suelos sin mayores limitaciones

fsicas, puede alcanzar entre los 60 y 90 cm de profundidad (Contreras, 2001).
El tubrculo puede ser considerado un tallo subterrneo modificado que se ha
acortado y ensanchado con hojas dbilmente desarrolladas, adaptado para el
almacenamiento de carbohidratos y para la reproduccin. Este se forma en el
extremo de un estoln como consecuencia de la acumulacin de reservas que
se produce por el rpido desarrollo y divisin celular (ver Figura 2) (Montaldo,
1984).

La papa comercial es un autotetraploide, cuyo nmero cromosmico

bsico es X = 12, repetido cuatro veces en su genotipo, 2n = 4x = 48
(Swaminathan, 1954). Ha evolucionado de especies diploides y existen
evidencias de que la especializacin de esta planta es del ms bajo nivel de
ploida hacia el ms alto. La papa cultivada a nivel tetraploide es una planta
preponderantemente autgama, tiene de 20 a 25% de entrecruzamiento. Es de
reproduccin sexual y asexual. La papa es una especie heterocigtica y
muestra depresin por endogamia (Glendining, 1976).

10
Fig 2. Solanum Tuberosum, a) ilustracin esquemtica de una planta
entera: A, Flores. B, Hoja compuesta. C, yemas. D, Tubrculos. E,
Tubrculo semilla usado para la plantacin. F, Races. b, flor. c, frutos
(bayas).

2.6 Produccin mundial, nacional y estatal de papa

La produccin de papa a nivel mundial, se ha ido incrementando mucho

ms rpido que otros cultivos. La produccin en la regin de Asia est
creciendo alrededor del 6 % anualmente. En la actualidad China cultiva
alrededor del 20 % de la produccin mundial de papa. India tiene un dramtico
incremento en su produccin en relacin a las dcadas pasadas a travs de la
revolucin caf, la cual es una consideracin realista con lo proyectado
anualmente en el mundo, que es alrededor del 2.8 % en las prximas dos
dcadas (Jansky et al., 2009).
El sector mundial de la papa atraviesa grandes cambios. Hasta inicios
del decenio de 1990, casi la totalidad de las papas se producan y consuman
11
en Europa, Amrica del Norte y en los pases de la antigua Unin Sovitica.
Desde entonces se ha producido un espectacular aumento de la produccin y
la demanda de papa en Asia, frica y Amrica Latina, donde la produccin
aument de 30 millones de toneladas a principios del decenio de 1960 a ms
de 165 millones en 2007. En 2005, por primera vez, la produccin de la papa
de los pases en desarrollo excedi la produccin de los pases desarrollados.
China se ha convertido en el primer productor mundial de papa, y poco menos
de una tercera parte de todas las papas hoy se cosechan en China y la India
(FAOSTAT, 2013).

Segn datos de la FAO (2008) en el periodo comprendido entre 1992-

2001, la produccin mundial de papa registr un incremento de 11 por ciento, al
pasar de 277 millones de toneladas en 1992 a 308 millones en 2001. Para el
ao 2013, la produccin aument hasta 368 millones de toneladas, lo que
denota la tendencia en el inters a nivel mundial por este cultivo. Actualmente
el 60 por ciento de la produccin mundial de papa se concentra en China, India,
Federacin de Rusia, Ucrania, Estados Unidos de Amrica, Alemania y
Bangladesh, como se puede apreciar en el Cuadro 1. Mxico ocupa el lugar
nmero 36 con una produccin de 1,629,938 Toneladas, con una superficie de
60,875 ha y un rendimiento de 26.775 Ton/ha (FAOSTAT, 2013)

El cultivo de papa tiene en Mxico una gran importancia econmica, ya

que es de los pocos cultivos que se desarrolla en casi todo el territorio nacional.
Actualmente se cultiva en veintitrs estados del pas, pero slo seis aportan el
66% de la produccin total, aproximadamente. Los principales estados
productores por orden de importancia son: Sinaloa, Sonora, Chihuahua, Estado
de Mxico, Guanajuato y Nuevo Len (SIAP/SAGARPA, 2007). Se cultiva en
los ciclos Otoo-Invierno y Primavera-Verano; tanto en la modalidad de riego
como en la de temporal. En la Figura 3, se seala cmo ha variado la
produccin de papa en nuestro pas entre los aos 2002 al 2011.

Cuadro 1. Principales pases productores de papa y la

produccin que lograron en el ao 2013 (FAOSTAT, 2013)

Pas Produccin (TonX103)

12
 China 88,925.0
India 45,343.6
Federacin de Rusia 30,199.1
Ucrania 22,258.6
Estados Unidos de Amrica 19,843.9
Alemania 9,669.7
Bangladesh 8,603.0
Francia 6,975.0
Holanda 6,801.0
Polonia 6,334.2
Belars 5,913.7
Reino Unido 6,045.0
Irn 5,560.0
Egipto 4,800.0
Canad 4,620.0
Per 4,570.7
Mundial 368,096.36

Fig. 3. Comportamiento de la produccin nacional de papa, del

periodo 2002-2011 (SIAP/SAGARPA, 2007).

Zacatecas no figura entre los principales productores de papa, sin

embargo en el ao 2008, se sembr una superficie de 559 ha, obtenindose un
13
rendimiento de 46.70 ton/ha, siendo el estado con el mayor rendimiento. Los
principales municipios productores de papa son: Villa de Cos (300 ha),
Guadalupe (150 ha), Pnuco (100 ha) y Jerez (9 ha) (SIAP SAGARPA, 2012).
En la figura 4, se indica cmo ha variado la produccin entre los aos 2002 y
2011, y se puede apreciar que en los ltimos 4 aos, se ha incremetado de
manera gradual.

Fig. 4. Comportamiento de la produccin estatal de papa, del periodo

2002-2011. Ntese que la produccin estatal en los ltimos aos va
en ascenso. (SIAP/SAGARPA, 2007).

2.7 Plagas y enfermedades comunes en la papa

2.7.1 Palomilla de la papa (Phthorimaea operculella)

La palomilla de la papa (ver figura 5A), Phthorimaea operculella (Zeller,

1873), es originario de las regiones productoras de papa de la Cordillera Andina
de Amrica del Sur, pero se ha propagado a reas mas tropicales y
subtropicales productoras de papa. La palomilla est establecida en el
Noroeste del Pacifico de los Estados Unidos y ha provocado serias inquietudes
por el dao que causa al cultivo de la papa (Lacey et al., 2010)

14
 2.7.2 Chicharritas

Los principales gneros y especies de chicharritas en el centro de

nuestro pas son Carneocephala sp., Empoasca kraemeri Ross & Moore, E.
mexara Ross & Moore, E. solanaDeLong, Elymana sp., Oncopsis sp., Phera
centrolineata (Signorete), Scaphytopius sp., Agallia barretti Ball, Paraphlepsius
sp., Agalliopsis sp., Aceratagallia sp. Y Draeculacephala minerva Ball. Las
chicharritas (ver figura 5B) son insectos comunes en diversos cultivos de
importancia econmica en Mxico, varias de sus especies causan daos
econmicos a cultivos como frijol, maz, jitomate, betabel, alfalfa, aguacate,
meln, tabaco, vid, algodn, henequn y arroz. Su dao directo (alimentacin)
es mnimo con la transmisin de agentes patgenos causantes de diversas
enfermedades como el virus del enrollamiento de la punta, amarillamiento del
ster y punta morada (Munyaneza, 2003).

2.7.3 Pulgones de la papa

Los pulgones o fidos (ver figura 5C) son responsables de transmitir una
gran variedad de virus de importancia para la papa, ya que sus vuelos
de colonizacin coinciden con el desarrollo del cultivo en el campo. Los fidos
rara vez causan dao directo apreciable al alimentarse en las plantas de papa,
pero se les considera peligrosos por su habilidad de transmitir virus. La
importancia relativa de cada virus de papa, est determinada por su
prevalencia y el efecto econmico que produce. PRLV y PVY son los virus ms
importantes, seguidos por PVX, PVM, PVA y algunos otros de distribucin mas
localizada.
La diseminacin de virus en el cultivo, es principalmente por las formas
aladas que llegan de campos vecinos o de plantas dentro del campo.
Los pulgones transmisores de virus en la papa son:

Mysus persiae (Sulzer) pulgn verde del duraznero

15
 Aulacorthun solani (Kealtenbach) pulgn manchado de la papa

Macrosiphun euphorbiae pulgn de la papa (Romn y Hurtado,

2002).

2.7.4 Pulgn saltador o salerillo

El salerillo (ver figura 5D), Bactericera cockerelli (sulc) es una de las

plagas ms importantes del chile, jitomate y papa en Mxico. Ocasiona daos
directos a la planta al succionar la savia e indirectos al transmitir fitoplasmas.
Dichos fitoplasmas producen la enfermedad punta morada en papa, sus
sntomas se deben a la interferencia que tienen los fitoplasmas en el transporte
de nutrientes, a los daos mecnicos ocasionados por la alimentacin, y las
toxinas que inyectan los adultos al alimentarse (Garzn et al., 2004).

2.7.5 Nemtodos patgenos de la papa

Globodera rostochiensis y G. pallida son dos especies de nemtodos

(ver figura 5E) que forman quistes en la papa, los cuales pueden causar
principalmente bajo rendimiento en los cultivos de la papa. Los nemtodos
juveniles infectivos se mueven a un mximo de alrededor de un metro en el
suelo. Muchos de los movimientos hacia nuevas localidades se realizan por
transporte pasivo. Las principales rutas de dispersin son semillas de papa
contaminadas y el movimiento del suelo, por ejemplo a travs de maquinaria
agrcola de suelos contaminados a otras reas. La infeccin ocurre cuando el
segundo estadio juvenil se incuba desde el huevo y entra a la raz cerca de la
punta por herida a travs de la pared de las clulas de la epidermis con su
estilete y entonces a travs de la pared de las clulas internas. Eventualmente
empieza alimentndose de las clulas de la corteza, periciclo o endodermis.
Cada nemtodo se alimenta de un grupo de clulas dando origen a clulas
gigantes llamadas Sincytia. El nemtodo permanece ah por el resto de su
desarrollo y pasa a travs de dos estados juveniles antes de su diferenciacin
en macho o hembra. Las hembras permanecen unidas a la raz y los huevos se
desarrollan dentro de las mismas. Cuando las hembras estn completamente
maduras, mueren y se transforman en quistes o cubierta protectora de los

16
huevos. Cada quiste puede contener entre 400 a 500 huevos. Las plantas de
papa infestadas reducen su sistema radical, y debido al decremento de la
absorcin de agua, la planta puede morir eventualmente (Smith et al., 1997).

2.7.6 Tizn tardo

Es la enfermedad ms grave de la papa en todo el mundo, es producida

por un hongo llamado Phytophthora infestans (ver figura 5F), que destruye las
hojas, los tallos y los tubrculos. En aos recientes ha sido motivo para
estudiarse molecularmente, incluyendo el desarrollo de nuevas herramientas
para la transformacin y el silenciamiento de genes, y de un mapeo muy
exhaustivo de su genoma (Birch & Whisson, 2001).

2.7.7 Costra negra

La enfermedad conocida como Costra Negra de la papa, es causada por

el hongo Rhizoctonia solani Khn (ver figura 5G). Este patgeno est presente
en todas las reas productoras de papa, provoca cncer de tallo y estoln, as
como costras sobre los tubrculos, adems reduce la emergencia de los
brotes, el vigor de la planta y frecuentemente, los tubrculos infectados se
agrietan o se deforman. Este hongo tambin puede causar lesiones en el tallo
en ms del 90% de las plantas y reducir significativamente el rendimiento hasta
en un 31.5%, as como la dao especifico de los tubrculos (Carling, et al.,
1989).

2.7.8 Pudricin seca/marchitez

Es una de las ms importantes enfermedades de la papa causada por

Fusarium ssp (ver figura 4H), afecta los tubrculos almacenados y la semilla
despus de plantada. La pudricin seca de los tubrculos usados como
semillas puede reducir el establecimiento del cultivo por muerte de brotes.
La prdida del rendimiento atribuible a la pudricin seca ha sido
estimada en un promedio entre 6 y 25%. Hay muchas especies de Fusarium
reportadas que causan pudricin seca a nivel mundial (El-Hassan, et al., 2007).

17
 2.7.9 Punta morada de la papa (Paratrioza cockerelli (Sulc.) )

Los sntomas de la PMP se caracterizan por un achaparramiento de la

planta, abultamiento del tallo en los lugares de insercin de las hojas,
formacin de tubrculos areos y una decoloracin en las hojas superiores, las
cuales tienden a tornarse moradas en algunas variedades. Los tubrculos
provenientes de plantas con sntomas de PMP desarrollan un pardeamiento
interno y generalmente no brotan, o si lo hacen, sus brotes son muy delgados o
ahilados. Se ha demostrado que los sntomas descritos previamente pueden
estar asociados con la presencia de fitoplasmas (Cadena et al., 2003) y con el
efecto de una posible toxina inyectada a las plantas por el pslido de la papa
Bactericera cockerelli Sulc.

2.7.10 Sarna comn

Streptomyces scabies (ver figura 5I) es una bacteria que afecta al cultivo
de papa, produciendo una seria enfermedad llamada sarna comn. Esta
enfermedad reduce la calidad y el procesamiento de la papa, as como la
calidad de los tubrculos semilla, debido a los sntomas externos y la
naturaleza de transmisin de los patgenos. La mayora de las variedades de
papa cultivadas son susceptibles a la sarna, la cual se ha reportado en
Amrica, frica y sia (Wanner, 2006).

18
 Fig. 5. Diferentes patgenos que atacan a la papa. A) Palomilla de la
papa. B) Chicharritas. C) Pulgones. D) Pulgn saltador o salerillo. E)
Globodera rostochiensis F) Tizn tardo (Phytophthora infestans) G)
Costra negra (Rhizoctonia solani Khn). H) Pudricin seca (Fusarium
ssp.) I) Sarna comn (Streptomyces scabies).

2.8 Virus de la papa

Los virus se multiplican en clulas vivas y son transmitidos a plantas

sanas por insectos, nemtodos, hongos, o contacto mecnico. Cuando las
plantas son susceptibles, el virus se multiplica y posiblemente invade a los
tejidos de la planta.

Como las plantas infectadas crecen y maduran, la mayora de esos

virus pueden invadir todas las partes vegetativas de la planta, incluyendo los
tubrculos. La mayora de los virus de las papas pasan de generacin a
generacin a travs de tubrculos infectados. Las infecciones originadas a
partir de tubrculos enfermos se denominan infecciones secundarias.

19
 La prdida causada por los virus de las papas produce una
disminucin en la calidad y en el rendimiento. La severidad y prdida
depende de la planta y condiciones ambientales, y del virus involucrado. Al
menos 37 virus de manera natural infectan a la papa. Algunos de estos son el
virus X, S, A o M de la papa (PVX, PVS, PVA, PVM) pueden reducir el
rendimiento de un 5 a un 40%; otros, tales como el virus del enrollamiento de
la hoja de la papa (PLRV) o infecciones combinadas de virus X y Y de la
papa (PVX + PVY) causan disminucin del rendimiento hasta un 90% (Salim
et al., 2003).

2.8.1 Virus del enrollamiento de la hoja de la papa (PLRV)

El virus del enrollamiento de la hoja de papa (PLVR) es transmitido por

fidos, principalmente por el pulgn verde del duraznero. Cuando el fido
adquiere el virus a partir de una planta infectada, el virus circula a travs del
fido, entrando a las glndulas salivales. Entonces es transmitido cuando el
fido degusta la planta sana de la papa. Un fido puede adquirir PLRV despus
de pocos minutos de comer, pero generalmente requiere de 24 a 48 horas para
ser capaz de transmitir el virus (Rouze et al., 2001).

Una vez infectado con PLRV, un fido permanecer con l toda la vida.
Las plantas producidas a partir de tubrculos infectados muestran sntomas al
principio en la parte baja de las hojas, y los sntomas gradualmente progresan
hacia arriba. Sobre las plantas, las hojas son enrolladas hacia arriba y se
vuelven frgiles, adquiriendo una textura como de piel. Estas plantas por lo
regular son clorticas y pueden ser un poco achaparradas. El PLRV puede ser
controlado utilizando semilla certificada libre de virus. Las plantas infectadas en
su totalidad deben ser aisladas y removidas. Un buen control de fidos debe
ser practicado para reducir la poblacin de vectores de los virus (Johnson,
1994; Taliansky et al, 2003; Stevenson et al., 2004).

2.8.2 PVX

20
 Potato virus X (PVX, virus X de la papa), es un potexvirus cuyo genoma
consiste de una cadena sencilla de ARN, en forma de barra flexuosa, rgida,
cuya longitud es de 470 a 580 nm por 11 a 13 nm de dimetro. Su genoma es
de cadena sencilla positiva de ARN (5.8 - 7.0 kb) y este virus tienen una
especie simple de subunidad de protena. El ARN codifica para cinco protenas,
incluyendo la ARN polimerasa del virus, la protena de cubierta y la protena de
movimiento clula a clula. Los potexvirus carecen de vectores pero son
transmitidos fcilmente por el contacto de plantas sanas con infectadas y
mediante el manejo de plantes durante su cultivo (Salim et al., 2003).

2.8.3 PVY

Entre los virus mas importantes que afectan al cultivo de papa, se ha

reportado la presencia del virus Y de la papa (PVY), un potyvirus con un amplio
rango de hospedantes y uno de los mas importantes y frecuentes en el cultivo
de papa a nivel mundial; este virus presenta tres diferentes variantes PVYO
(variante comn), PVYC (lnea punteada) y PVYN (necrosis de la nervadura del
tabaco), la cual comprende un aislamiento denominado PVYNTN (Necrosis del
tubrculo de la papa) que puede reducir el rendimiento y la calidad del
tubrculo. Se pueden diagnosticar a menudo por los patrones del mosaico en
las hojas y mal formaciones de la hoja y del tubrculo (Steveson, et al., 2004).

2.8.4 PVA

El PVA es muy similar al PVY. Cuando est presente en ciertos

cultivares, es generalmente menos severo que el PVY. La prdida del
rendimiento puede llegar hasta un 40 %. PVA causa mosaico (algunas veces
muy severo), as rugosidad, y las hojas brillantes. Los sntomas de PVA son
menos severos, pero no pueden ser fcilmente distinguidos de aquellos
producidos por PVY (Salazar, 1995).
2.8.5 PVS

El PVS es comn y causa sntomas leves. Tienen poco efecto en

relacin al rendimiento del cultivo. Es transmitido a travs de tubrculos
infectados, por contacto, y por fidos en algunas variedades de papa. La
infeccin es normalmente latente aunque en algunos cultivares reaccionan con
mosaico leve o un bandeado suave en las nervaduras. Pocos cultivares

21
sensibles reaccionan originando un bronceado severo, puntos necrticos o aun
cada de hojas (CABI, 2007).

2.8.6 PVM

El PVM es menos comn que el PVX, PVY o PVS, y sus efectos son
poco conocidos en el rendimiento del cultivo. Es transmitido a travs de
tubrculos infectados, por contacto, y por fidos. El virus es latente en algunos
cultivares, aunque en otros causa un mosaico leve o en algunas ocasiones un
mosaico severo y hojas rugosas. Dentro de ciertas condiciones ambientales, la
sensibilidad de los cultivares puede tambin desarrollar necrosis del peciolo y
nervadura de las hojas (Loebestein et al., 2001).

2.9 Biotecnologa Vegetal

La biotecnologa vegetal es una de las disciplinas cientficas que ms

desarrollo ha mostrado en los ltimos aos. Actualmente ofrece una alternativa
real para la resolucin de un gran nmero de problemas relacionados con el
mejor aprovechamiento de las plantas por parte del hombre, incluyendo el
saneamiento de diversas especies vegetales, a travs de la eliminacin de
patgenos y posteriormente la regeneracin masiva de vitroplantas sanas. Esta
disciplina es sin duda una herramienta invaluable para incrementar tanto la
calidad como la cantidad de los alimentos de origen vegetal, as como para
obtener nuevos productos con diversas aplicaciones a partir de las plantas.

La biotecnologa vegetal tiene como una de sus bases al cultivo de

tejidos vegetales, el cual consiste en una serie de tcnicas que permiten el
cultivo y manipulacin, bajo condiciones artificiales y controladas, de clulas,
tejidos y rganos vegetales. Entre las aplicaciones del cultivo de tejidos
vegetales se tienen la micropropagacin de plantas, la obtencin de materiales
mejorados mediante la seleccin in vitro u otras tcnicas, la conservacin de
germoplasma vegetal la criopreservacin o almacenamiento en condiciones de
crecimiento mnimo, la seleccin de variantes somaclonales y mutantes, la
obtencin de metabolitos secundarios a escala industrial, la produccin
continua y controlada de sustancias difciles de obtener por extraccin o por
sntesis qumica y el cultivo de brotes y races principalmente para la obtencin

22
de aceites esenciales y compuestos que requieren de cultivo de tejido de
cultivos diferenciados (Robles-Zepeda et al., 2009).

2.9.1 Cultivo de Tejidos Vegetales

Se le llama Cultivo de Tejidos Vegetales (CTV) al conjunto de tcnicas

que permiten el establecimiento, mantenimiento y desarrollo de cualquier parte
de una planta, desde una clula hasta un organismo completo, bajo
condiciones artificiales, axnicas y controladas.

Existen tres vas diferentes para la regeneracin de plantas in vitro: la

brotacin y proliferacin de yemas, la embriognesis somtica y la
organognesis. En el primer caso se parte de meristemos ya formados para la
obtencin a partir de ellos de una o varias plantas completas, mientras que en
la embriognesis somtica y la organognesis se parte de tejidos no
meristemticos y se requiere un proceso de desdiferenciacin y
rediferenciacin de los tejidos para dar lugar a embriones somticos o brotes
adventicios. Otra diferencia bsica es que en el primer sistema, las nuevas
plantas se originan a partir de estructuras multicelulares, mientras que en los
sistemas de embriognesis somtica y organognesis las nuevas plantas se
originan al parecer a partir de una sola clula (Prez-Molphe-Balch et al.,
1999).

Los meristemos apicales y axilares (contenidos dentro de las llamadas

yemas), al ser de manera natural los puntos de crecimiento en los vegetales
tienen la capacidad de formar nuevos brotes. Esa capacidad natural la
mantienen cuando se establecen y cultivan in vitro. Debido a lo anterior, el
cultivo de yemas apicales o axilares es una manera sencilla de obtener nuevos
brotes, los cuales pueden enraizarse y producir nuevas plantas. Este sistema
de propagacin se basa en la formacin de nuevos brotes a partir de
meristemos preexistentes. La propagacin por cultivo de meristemos y yemas
es un sistema de regeneracin menos complejos que cuando esto se hace por
medio de organognesis o embriognesis somtica.

En el CTV se manejan tres principios bsicos que definen el xito de los

experimentos: la eleccin del explante (rgano, tejido o segmento vegetal) que
ser utilizado para iniciar y por regla general entre ms joven y menos
23
diferenciado est, ms fcil ser su adaptacin y respuesta al cultivo in vitro. La
eleccin del medio es otro principio, tiene dos componentes importantes, uno
son los elementos o nutrientes esenciales para el crecimiento y desarrollo, y el
otro grupo est integrado por sustancias que determinan el tipo de respuesta y
el xito del establecimiento in vitro (fitohormonas). El ltimo principio es la
condicin asptica del medio con la esterilizacin del mismo y del material
vegetal. Estos tres principios determinan la respuesta del tejido, siendo una
respuesta no deseable la muerte o necrosis del mismo (Prez-Molphe-Balch et
al., 1999).

2.9.2 Cultivo de meristemos

En este tipo de cultivo, los meristemos deben aislarse mediante

diseccin con ayuda de un microscopio estereoscpico. El explante aislado es
muy pequeo, usualmente de menos de 1mm de dimetro, y consta del domo
apical del meristemo con un pequeo nmero de primordios foliares. Se
excluye el tejido vascular diferenciado. El aislar y trabajar con explantes tan
pequeos implica una cierta dificultad; adems, el mismo tamao del explante
reduce la probabilidad de que se establezca y prospere in vitro, y se requiere
generalmente un medio de cultivo ms complejo. Sin embargo, a medida en
que el explante aislado es ms pequeo, tiene una mayor probabilidad de estar
libre de patgenos. El principal uso de este tipo de cultivo es la produccin de
plantas libres de virus y de cualquier otro agente patgeno (Grout, 1990).

Ha sido demostrado que los puntos de crecimiento (meristemos) de

brotes y races de plantas infectadas con algn virus estn libres de l o lo
llevan solamente en concentraciones muy bajas (Kassanis, 1957).

Morel fue el primer cientfico en demostrar que podan obtenerse,

mediante el cultivo de meristemos, plantas de papa libres de virus a partir de
plantas infectadas. En la planta, porciones de tejido con capacidad embrionaria
persisten durante toda su vida; estos tejidos perpetuamente jvenes son los
meristemos.

El cultivo de meristemos in vitro puede usarse para producir plantas

libres de patgenos a partir de una planta que est sistmicamente infectada,
ya sea por virus, micoplasmas (Jacoli, 1978), hongos, o bacterias. El resultado
24
final del trabajo de saneamiento debe comprobarse mediante tcnicas precisas
de diagnostico para virus y otros patgenos. De esta manera, el proceso de
saneamiento incluye cuatro pasos importantes:

Aplicacin de Pruebas de Propagacin

Identificacin
las tcnicas de las plantas de las plantas
del virus.
eliminacin regeneradas sanas
2.9.3
Tcnicas para la deteccin de patgenos en papa

Los virus y bacterias causan enfermedades en plantas que son difciles

de controlar, debido a que se carece de productos qumicos eficientes para
realizar un tratamiento en condiciones de campo. Por consecuencia, las
medidas preventivas para evitar plantar material contaminado son de suma
importancia para su control. Es muy importante realizar pruebas del material de
plantacin libre de patgenos, como medida preventiva (Janse and Wenneker,
2002). Sin duda alguna, un desarrollo muy importante que ha tenido lugar en
los ltimos 25 aos, es la tcnica comnmente llamada ELISA por sus siglas en
ingls (enzyme linked immunosorbent assay), que es el ms significativo
avance, especialmente en la deteccin de virus.

Se usa para la determinacin de virus (antgeno), cuando un anticuerpo

para ese antgeno lo reconoce. La interaccin antgeno-anticuerpo en el
laboratorio puede ser utilizada para determinar si una planta est infectada o no
por el virus que reconoce el anticuerpo.

Las cuatro fases de un ensayo ELISA son las siguientes:

1.- Conjugacin del anticuerpo con una enzima (peroxidasa o fosfatasa

alcalina). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos
directos e indirectos, sndwich, etc. El antgeno marcado se emplea en
ensayos de competicin de antgeno. Dicha unin anticuerpo-enzima se
produce durante un determinado periodo de tiempo en aras de producir una
solucin coloreada y que pueda ser valorada visualmente o cuantificada por
medio de un espectrofotmetro (normalmente a una longitud de onda 414 nm).

25
Si no transcurre el tiempo adecuado para que se realice la reaccin no se
evidenciar la coloracin, interpretndose este resultado como un falso
negativo y disminuyendo la sensibilidad de la tcnica.

2.- Unin del antgeno a los pocillos. La unin de antgenos se realiza

con facilidad a la superficie de plsticos tratados, que tienen gran afinidad por
protenas. As, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe realizarse
cuidadosamente. Si se usa mucho antgeno, se pueden obtener falsos
positivos. Por el contrario, si se usa poco antgeno, el exceso dar lugar a una
reaccin falsa negativa.

3.- Formacin de una o ms capas de inmunocomplejos. En el caso del

antgeno unido a la placa, se puede detectar mediante un anticuerpo anti-
antgeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-
antgeno y un secundario anti-primario marcado (ELISA indirecto). Este
segundo mtodo permite la amplificacin de la seal al poderse unir uno o ms
anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo
unido a la placa, se incuba con una mezcla de antgeno y antgeno marcado.
Se ensayan diferentes relaciones de antgeno frente a una cantidad fija de
anticuerpo marcado. Es el ensayo de competicin del antgeno. En esta etapa
es muy importante controlar los factores tiempo y temperatura de incubacin
para evitar la aparicin de falsos negativos. En el caso del tiempo, si es inferior
a 15 min, no ocurrir la interaccin antgeno-anticuerpo y el color no ser
evidente al final del ensayo, dando un falso negativo. Por su parte, si la
temperatura de incubacin es muy baja, la formacin del complejo antgeno-
anticuerpo tampoco se establecer en el tiempo establecido, mientras que si es
muy alta, las protenas (antgeno y anticuerpo) se desnaturalizan y, por lo tanto,
disminuyen su capacidad para interaccionar, dando igualmente falsos
negativos.

4.- Revelado de la reaccin enzimtica. Despus de un lavado para

eliminar las molculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos, se
aade el sustrato enzimtico en solucin. Se deja reaccionar, luego mediante la
incorporacin de una base fuerte se desnaturaliza la enzima para detener la
reaccin, y a continuacin se lee la densidad ptica mediante
espectrofotometra o leector de pruebas de ELISA (AGDIA, 2012).
26
 2.9.4 Micropropagacin

Se le llama micropropagacin a la propagacin asexual de plantas

utilizando las tcnicas de cultivo de tejidos in vitro. sta es una de las
aplicaciones ms utilizadas de entre todas las tcnicas que componen la
llamada biotecnologa vegetal, ello se debe a su enorme productividad al
comparrsele con las tcnicas tradicionales de propagacin de plantas.

Dentro de las principales ventajas que ofrece la micropropagacin es

que se trata de un sistema de propagacin clonal, manteniendo todas las
caractersticas genotpicas del material inicial seleccionado; por otro lado,
debido a que se realiza todo el proceso en el laboratorio bajo ambientes
controlados, no se ve afectado por las estaciones del ao. Las plantas que se
obtienen con la micropropagacin estn libres de bacterias, hongos y
nemtodos fitopatgenos, y con tcnicas ms especficas se pueden liberar
incluso de virus y viroides. Otra ventaja que presenta es que estas plantas
pueden enviarse ms fcilmente a otros pases debido a que hay menos
impedimentos fitosanitarios. De igual manera permite tener en un espacio
relativamente pequeo un gran nmero de plantas.

La micropropagacin de cualquier especie vegetal consta de cinco

etapas bsicas, cada una de ellas fundamental para el xito del sistema.

1) La seleccin de la plante madre, se escoge el genotipo ideal.

2) El establecimiento de los cultivos axnicos.

3) Manipulacin del tejido, activacin de yemas axilares y generacin de

brotes.

4) Elongacin y enraizamiento, adquisicin de races por parte de los brotes.

27
 5) Adaptacin a condiciones ambientales (Prez-Molphe-Bach, 1999).

2.9.5. Gnesis de los tubrculos de papa

El desarrollo de una planta de papa ocurre a travs de una serie de

etapas fenolgicas y que se clasifica en desarrollo de brote, establecimiento de
la planta, inicio de tuberizacin, llenado del tubrculo y maduracin de ste, y la
duracin de cada una depende del genotipo, de factores ambientales tales
como la altitud y la temperatura, del tipo de suelo, de la disponibilidad de
humedad y de la localidad. En la primera etapa (desarrollo del brote), los
tubrculos han dejado la condicin de reposo y tienen la capacidad de brotar,
siempre que las condiciones ambientales sean favorables para el crecimiento
(alta temperatura); la segunda etapa (establecimiento de la planta) se refiere al
periodo comprendido entre la brotacin y la iniciacin del tubrculo,
caracterizada por el crecimiento de hojas y ramas en la parte area, y de races
y estolones en la parte subterrnea; la tercera etapa (inicio de tuberizacin),
comprende a la formacin del tubrculo en la punta del estoln, no obstante
que su crecimiento puede ser imperceptible. En muchas variedades, el trmino
de este evento coincide con el inicio de la floracin. En la cuarta etapa (llenado
del tubrculo), las clulas de la papa se expanden debido a la acumulacin de
agua, nutrientes y carbohidratos, el tubrculo llega a ser el sitio dominante en la
deposicin de carbohidratos y compuestos inorgnicos. Este es el periodo de
crecimiento crtico para el rendimiento y calidad del tubrculo, y los factores
que los afectan son la temperatura, fertilizacin, edad fisiolgica, la distancia
entre plantas, fechas de siembra, riego y manejo de plagas y enfermedades; en
la quinta etapa (madurez del tubrculo), el follaje cambia a color amarillo y es
acompaado por la prdida de hojas, ocurre una disminucin en la fotosntesis,
el crecimiento del tubrculo se hace ms lento y alcanza la mayor acumulacin
de materia seca, adems de un adecuado grosor del peridermo o piel (Dwelle,
2003).

La tuberizacin es un proceso morfofisiolgico altamente coordinado que

est influenciado por variables genticas, fisiolgicas, y medio ambientales y

28
tiene lugar en los estolones subterrneos bajo la influencia de factores
extrnsecos e intrnsecos (Sarkar, 2008). Sin embargo, despus de dcadas de
investigacin aun no se dispone de un modelo nico que integre todos los
eventos fisiolgicos, bioqumicos y moleculares que tienen lugar en la planta de
papa ante la presencia de diferentes factores inductores de la tuberizacin.

El tubrculo de la papa funciona como una reserva de almacenamiento

masivo y de una serie de macromolculas, principalmente almidn y protena.
Durante el crecimiento del tallo principal de la papa, brotes laterales
subterrneos (estolones), caracterizados por entre nudos alargados, extremo
apical curvado, y el crecimiento diageotrpico se desarrollan siguiendo las
seales ambientales especficas, que influyen fotoperiodo corto, alta intensidad
de la luz y bajos niveles de nitrgeno, los estolones son inducidos a formar
tubrculos. La transformacin de los estolones en tubrculos repercute en gran
medida en la fisiologa de la planta completa, porque los tubrculos en
desarrollo posteriormente se convierten en los mayores sumideros presentes
en la planta. Durante las primeras etapas de formacin de los tubrculos los
estolones modifican su hbito de crecimiento, cesa la elongacin y se inicia un
crecimiento radial en la zona subapical (Garca-Flrez et al., 2009). El aumento
de la divisin celular y la expansin es seguida rpidamente por un enorme
depsito de almidn y protenas de almacenamiento, como la patatina, como
resultado de la expresin coordinada de los genes implicados en la biosntesis
de almidn y protena.

Los requerimientos ambientales para que ocurra la tuberizacin varan

entre subespecies y cultivares de papas. S. tuberosum subsp. andigenum
requiere estrictamente fotoperiodo de da corto para la formacin del tubrculo.
Sin embargo, las plantas de esta subespecie con activacin del gen del
fitocromo B (que participan en la deteccin del fotoperiodo) tuberizan, incluso
en presencia de luz continua. Las plantas pertenecientes a S. tuberosum
subsp. Tuberosum son menos dependientes de la duracin del da (Jackson,
1999).

Las desventajas principales de un programa de semilla de papa basado

en mtodos de propagacin convencional estn relacionadas con la baja tasa
de multiplicacin de las plantas crecidas en campo lo que resulta en un sistema
29
lento e inflexible, con riesgo creciente de enfermedades virales, fngicas o
bacterianas a medida que se incrementa el nmero de multiplicaciones. Por
ello, una de las alternativas para disminuir el nmero de multiplicaciones
necesarias en campo para obtener suficiente cantidad de semilla, es producir
minitubrculos en ambientes protegidos (Lommen, 1992).

2.9.6 Produccin de microtubrculos de papa en medio semislido

La micropropagacin es la alternativa a la propagacin convencional de

papas. Los mtodos de propagacin in vitro usando domos meristemticos,
cortes nodales y microtubrculos son los mtodos ms confiables para el
mantenimiento gentico ntegro de los clones multiplicados, en contraste con la
desdiferenciacin (formacin de callos) y la subsecuente redifereciacin
(organognesis/embriognesis) que induce cambios genticos que han sido
reportados. El cultivo de meristemos provee un mtodo reproducible y
econmicamente viable para la produccin de plantas libres de patgenos.
Como los meristemos estn libres de virus, la eliminacin y la generacin de
plantas libres de virus se puede realizar a travs del cultivo de meristemos (Jha
and Ghosh, 2005). Varios trabajos han sido reportados mediante el uso del
medio MS semislido sin fitohormonas durante la etapa de proliferacin, pero el
crecimiento fue lento y toma de tres a cuatro semanas la proliferacin de
brotes.
En la figura 6 se puede aprecir un segmento de una una plntula
obtenida en medio MS suplementado con 5 mg de BA/L 8 g de agar/L, 30 g de
sacarosa/L, incubadas en un fotoperiodo de 18 h de luz por 6 h de oscuridad, a
una remperatura continua de 242 C.

30
Figura 6. Plntula de papa de donde es posible escindir explantes para
inducir microtuberizacin.

2.9.7 Produccin de microtubrculos en Sistema de Inmersin

Temporal (SIT-RITA)

Este mtodo consiste en la suspensin de clulas o tejidos vegetales las

cuales pueden ser cultivadas de manera satisfactoria cuando son sumergidas
en un medio de cultivo lquido, dndole agitacin para asegurar una adecuada
aereacin. El mtodo tambin puede ser usado para cultivar rganos de
algunas plantas (por ejemplo la proliferacin de brotes). Una alternativa al
sistema de agitacin permanente, que es una inmersin contnua, es el sistema
de inmersin temporal en el cual los recipientes estticos son peridica o
temporalmente llenados con el medio de cultivo (Ver figura 7). En este sistema
el medio es bombeado desde un contenedor reservorio hacia el recipiente que
contiene el cultivo, por intervalos de tiempos determinados experimentalmente
repetidos a lo largo de 24 h de manera cclica. Este sistema evita la anoxia y
tiene la ventaja que el medio puede ser fcilmente cambiado en el reservorio.
(Edwin et al, 2008).

Los principales problemas asociados con la produccin de

microtubrculos en contenedores convencionales son el bajo rendimiento de
tubrculos y el tamao pequeo del tubrculo que limita el trasplante directo a
condiciones de campo. Recientemente los sistemas de inmersin temporal
para la propagacin de brotes han proporcionado un mtodo para producir
tubrculos de calidad y en cantidades suficientes. Los microtubrculos tambin
31
pueden ser producidos en recipientes fermentadores mediante medio lquido
semicontinuo. En biorreactores tipo flujo se ha reportado que se pueden
producir de 1,600 a 1,700 tubrculos de papa en recipientes de cultivo de 10 L
en 18 semanas. Tales sistemas son caros, por lo que incrementan el costo de
produccin por unidad de propgulo. (Chun et al., 2003).

Figura 7. Ilustracin del Sistema de Inmersin Temporal usando

Recipientes de Inmersin Temporal Automatizados (RITA) (Tomado de
Edwin et al., 2008).

2.9.8 Produccin de minitubrulos mediante vitroplantas ex vitro

en sustrato

Con el cultivo in vitro de plantas a partir de segmentos nodales se

pueden producir plantas enraizadas que posteriormente se aclimatizan y

32
pueden plantarse en casas o cultivo en campo para producir minitubrculos
(Struik y Lommen, 1990 y 1999).
Los minitubrcuos son pequeos tubrculos de papa obtenidos despus
de la aclimatizacin de plantas cultivadas in vitro y plantadas a alta densidad en
casas de cultivo, canteros o contenedores donde se usan diferentes mezclas
de sustratos. Los minitubrculos pueden producirse durante todo el ao
siempre que las casas de cultivo cuenten con condiciones para ello y son
principalmente utilizados para la produccin de semilla prebsica o bsica por
siembra directa en campo (Lommen, 1999; Ritter et al.,2001). Con el uso de
minitubrculs en un programa de similla puede reducirse el nmero de
multiplicaciones en campo y el tiempo necesario para obtener volmenes
adecuados de semilla de un cultivar (Lommen y Struik, 1994).

Cuando se emplean plantas in vitro para obtener minitubrculos en

campo se afrontan dificultades con el traslado y se incrementan las prdidas
por los daos que estas sufren (Jimnez-Terry et al., 2011). En este sentido, los
microtubrculos tienen ventajas ya que su manipulacin y traslado es ms fcil
y se pueden almacenar (Lakhowa y Ellouze, 1993; Pruski et al., 2003; Kanwal y
Shoaib, 2006). No obstante, los microtubrculos obtenidos en medios de cultivo
semislido generalmente no tienen el dimetro y la masa fresca adecuada para
su plantacin directa en campo (Kanwal y Shoaib, 2006; Ebadi e Iranbakhsh,
2011).

El sustrato empleado en las casas de cultivo influye en el desarrollo de

las plantas in vitro y microtubrculos. Por ejemplo, Kowalski et al. (1999)
informaron diferencias significativas en la supervivencia y sanidad de
poblaciones de las plantas in vitro de papa en la fase de aclimatizacin cuando
utilizaron bolsas con sustrato zeolita 100%, de forma comparativa con
poblaciones de plantas in vitro plantadas en un suelo ferraltico rojo tpico. Por
su parte, Jimnez-Terry et al. (2011) plantearon que la produccin de
minitubrculos de papa cv. Desire en casa de cultivo con sustrato zeolita a
partir de plantas cultivadas in vitro puede incrementarse y que la supervivencia
y el rendimiento neto eran mayores que en campo, al igual que las prdidas
desde el traslado para la conservacin en frigorfico fueron menores.

33
34
 III. MATERIALES Y MTODOS

3.1 Lugar donde se realiz el estudio

El presente trabajo de investigacin se realizo en el Laboratorio de

Cultivo de Tejidos Vegetales de Unidad Acadmica de Agronoma de la
Universidad Autnoma de Zacatecas, ubicado en el Km 15.5 de la carretera va
corta Zacatecas-Guadalajara, Cieneguillas, Zacatecas, Zac., cuyas
coordenadas geogrficas son 22 43 42 N y 102 40 56 O, con una altitud de
2 240 msnm.

3.2 Establecimiento del cultivo in vitro por medio de meristemos

Los meristemos apicales y axilares (contenidos dentro de las llamadas

yemas), al ser de manera natural los puntos de crecimiento en los vegetales
tienen la capacidad de formar nuevos brotes. Para el cultivo de meristemos es
necesario aislarlos mediante diseccin con ayuda de un microscopio. El
explante aislado es muy pequeo, usualmente de menos de 1 mm de dimetro,
y consta del domo apical del meristemo con un pequeo nmero de primordios
foliares. Se excluye el tejido vascular diferenciado. El aislar y trabajar con
explantes tan pequeos implica una cierta dificultad; adems, el mismo tamao
del explante reduce la probabilidad de que se establezca y prospere in vitro, y
se requiere generalmente un medio de cultivo ms complejo. Sin embargo, a
medida en que el explante es de menos tamao, tiene una mayor probabilidad
de estar libre de patgenos. El principal uso de este tipo de cultivo es la
produccin de plantas libres de virus y cualquier otro patgeno (Grout 1990).
Para asegurar esta liberacin de patgenos el mtodo puede combinarse con
algn tipo de quimioterapia, o en el caso de virus, con termoterapia.

Los tubrculos de papa se lavaron con detergente y con un cepillo se

elimin la mayor cantidad de residuos de suelo. Posteriormente se les dio un
bao con una solucin de cido giberlico a una concentracin de 1g/L durante

35
10 min. A continuacin se colocaron en refrigeracin a una temperatura de 4 C
durante dos semanas, con el fin de inducir la brotacin de yemas.

A partir de brotes de aproximadamente 1 cm, se aislaron yemas de los

tubrculos y a continuacin se lavaron con detergente y agua corriente,
utilizando un cepillo de cerdas suaves. Posteriormente se llevaron a
condiciones de asepsia bajo campana de flujo laminar (Figura 8a), para
esterilizar externamente las yemas en una solucin de alcohol etlico al 70%
durante un minuto, enjuagndolas dos veces con agua destilada estril, a
continuacin se colocaron en una solucin acuosa de hipoclorito de sodio
(Cloralex) al 10% (V/V) durante 30 minutos, y finalmente se enjuagaron 4 veces
con agua destilada estril (Dodds, 1984).

El aislamiento de meristemos se realiz con el auxilio de microscopio

estereoscpico dentro de la campana de flujo laminar, a partir de los brotes
escindidos (Fig. 8b).

Figura 8. Explantes de tubrculo de papa. a) Yemas de papa separadas de

un tubrculo al que le indujo brotacin, y b) tubrculo de papa con brotes,
de donde se aislaron los meristemos para iniciar el cultivo in vitro.

El explante aislado estuvo conformado por el domo meristemtico y un

par de primordios foliares con un dimetro aproximado de 200 m.

36
 Se aislaron 100 explantes, los que se sembraron en un medio de cultivo
MS sin reguladores del crecimiento vegetal. Los explantes viables tuvieron un
alargamiento, desarrollo de clorofila y algunos se elongaron (entre una a dos
semanas).

Las plntulas se mantuvieron en desarrollo in vitro hasta que los

entrenudos fueron suficientemente elongados para permitir la diseccin de
explantes internodales.

3.3 Prueba de ELISA

Una vez que las plntulas de apariencia sana, alcanzaron una altura de
5 cm, bajo condiciones de asepsia, a cada una de ellas se les segment dos
hojas para realizar una prueba de ELISA para descartar las plntulas con
potyvirus. Para lo anterior se utiliz un kit de la marca Agdia, PathoScreen, que
es una prueba indirecta marcada con fosfatasa alcalina. El kit para 480 pruebas
contena el anticuerpo antipatgeno, conjugado con la enzima fosfatasa
alcalina, buffer de extraccin de la muestra indirecta (10X), tabletas del sustrato
PNP de 5 mg, buffer del sustrato PNP (5X), buffer ECI (5X), placas de 96
pozos, solucin para detener la reaccin (NaOH 3M), buffer de lavado PBST
(20X).

El antgeno (extracto vegetal) se diluyi 1:10 en buffer de extraccin 1X

(Na2CO3 0.159%; NaHCO3 0.293%; PVP 2%; pH 9.6). Se incubaron 100 l de
la dilucin en una placa de ELISA de 96 pozos, durante una hora a temperatura
de aproximadamente 20C. Previamnete se hizo un diagrama para identicar
cada muestra con las cavidades de la placa. A continuacin se lav tres veces
con PBS-Tween 20 1X (NaCl 0.8%, Na2HPO4 anhidro 0.115%. Posteriormente
se depositaron 100 l del anticuerpo anti-potyvirus en buffer ECI (BSA 0.2%;
PVP 2%; pH 7.4) en dilucin 1:200 durante dos horas a temperatura ambiente.
Se lav tres veces con PBS-Tween 20 1X. Se adicionaron 100 l de anticuerpo
conjugado a la fosfatasa alcalina (dilucin 1:200) en buffer de ECI durante una
hora a temperatura ambiente. Se lav tres veces con PBS-Tween 20 1X. Se
adicionaron 100 l de una solucin de para-nitro-fenil (PNP), que se prepar 15
minutos de antes de que terminara la incubacin sealada en el paso anterior,
la que se obtuvo a partir de una tableta de 5 g disuelta en 5 ml buffer PNP

37
(MgCl2 0.01%, dietanolamina 9.7%, pH 9.8). Se incub la placa durante 45 min
en ambiente hmedo y temperatura ambiente; a continuacin se agreg a cada
pozo 50 l de una solucin de hidrxido de sodio 3M, para detener la reaccin
enzima-sustrato.

La absorbencia de las posibles reacciones antgeno-anticuerpo se

registraron en un Microlector de placas de ELISA Bio-Tek EL-308 EIA con filtro
de 405 nm. La determinacin de punto de corte se realizo de la siguiente
manera: a) Se hicieron 50 pruebas: en 25 pozos de la placa de microtitulacin
se colocaron 100 l de savia diluida (1:10, savia:buffer de extraccin), extraida
de 25 muestras de hojas de plantas libres de potyvirus (papas de campo,
Solanum cardiophyllum, que se tenan en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos
Vegetales de la Unidada Acadmica de Agronoma, UAZ, de un trabajo previo),
y en los otros 25 pozos se coloc buffer de extraccin solo; b) Se obtuvo la
desviacin estndar de las 50 lecturas y se multiplico por tres. Este valor (3 dst)
se consider como fijo; c) Se calcul el valor medio de las muestras negativas y
se sum al valor fijo (3 dst); este valor se considero como el punto de corte
para la placa, es decir, todas las muestras que presentaron un valor igual o
mayor a ste, se considerarn positivas, con una probabilidad de error de p<
0.03 (Instituto Nacional de Referencias Epidemiologicas, SSA,1993).

3.4 Multiplicacin de plntulas

Luego de obtenidas las plntula completamente formadas con

aproximadamente 4-5 nudos y liberadas de potyvirus, se paso a la etapa de
multiplicacin, mediante cortes transversales para aislar entrenudos de
aproximadamente 1.2 cm de longitud, los cuales se sembraron en
contenedores con medio de cultivo MS, con diversas concentraciones de
reguladores del crecimiento vegetal, con el fin de inducir brotacin mltiple en
los explantes, y as establecer cul balance hormonal era el ptimo para la
multiplicacin in vitro de la papa.

En el Cuadro 2 se indican las combinaciones y concentraciones de los

reguladores del crecimiento vegetal que se utilizaron para la induccin de
brotes.

38
Cuadro 2. Combinaciones y concentraciones de los reguladores del
crecimiento vegetal utilizados para la induccin de brotacin mltiple.

BA (mg/L) 0 2 4 6

AIB (mg/L) 0 0.2 0.4 0.6

3.5 Enraizamiento

Para el enraizamiento se probaron las combinaciones de la auxina AIB

en concentraciones de 0, 1.0, 2.0 y 3.0 mg/l, y la citocinina BA a
concentraciones de 0, 0.2, 0.4 y 0.6 m/l, mediante un arreglo factorial, para dar
un total de 16 tratamientos (Ver Cuadro 3).

Cuadro 3. Combinacin de los diferentes reguladores del crecimiento

vegetal, utilizadas para el enraizamiento in vitro.

AIB (mg/l)

0 1 2 3

0 T1 T2 T3 T4

BA 0.2 T5 T6 T7 T8
(mg/l
) 0.4 T9 T10 T11 T12

0.6 T13 T14 T15 T16

3.6 Tuberizacin en medio semislido

Las plantas de aproximadamente 4 cm de altura regeneradas in vitro a

partir de meristemos, diagnosticadas como libres de patgenos, con un buen
sistema radicular, se sembraron en el medio de Murashige y Skoog (1962)
39
(MS) semislido (ver formulacin en el Cuadro 4) probndose diversos
tratamientos con la citocinina BA, combinada con la auxina AIB. Los diferentes
tratamientos se muestran en los cuadros 5 y 6 con diversas concentraciones de
BA y AIB; as como diversas concentraciones de sacarosa (30, 40, 50 y 60 g/L)
sin el uso de reguladores de crecimiento vegetal.

Las plntulas en el medio de cultivo se incubaron a 20-25 C, que es la

temperatura ptima para la formacin de microtubrculos, ya que de acuerdo a
Wang y Hu (1982) el nmero o promedio de microtubrculos es ms bajo a
mayor temperatura, cuando la papa se cultiva en el medio de nutritivo de MS.

Las plantas se subcultivaron a las 4, 8 y 12 semanas, y a la semana 16 se

extrajeron los microtubrculos generados, a los que se les midieron los
siguientes parmetros: nmero, peso, longitudes ecuatorial y polar, de los
microtubrculos por tratamiento. Posteriormente se hizo el procesamiento
estadstico para un experimento completamente al azar con todas las
repeticiones. Se incubaron durante 12 semanas a 24 C y un fotoperiodo de
18 h de luz/da.

3.7 Tuberizacin en Sistema de Inmersin Temporal

Se utiliz el sistema de inmersin temporal llamado RITA (Recipiente de

Inmersin Temporal Automatizado) empleando contenedores de un litro,
conectados a un sistema de aire proveniente de un compresor con
programador automtico para controlar la frecuencia y duracin de la
inmersin. Se evaluaron

Cuadro 4. Formulacin del medio de cultivo para tejidos vegetales desarrollado

por Murashige y Skoog (1962), conocido como M&S
Macronutrientes X 20
(Tomar 50 mll-1 de medio) Frmula P.M. [MS] (mgl-1) Stock (gl-1)

Nitrato de Amonio NH4NO3 80.05 1650 33

40
Nitrato de Potasio KNO3 101.11 1900 38
Cloruro de Calcio dihidratado CaCl22H2O 147.03 440 8.8
Sulfato de Magnesio MgSO47H2O 246.50 370 7.4
Heptahidratado
Fosfato de dicido de Potasio KH2PO4 136.09 170 3.4
Micronutrientes X 500 (mg/100ml)
(Tomar 2 mll-1 de medio)
Sulfato de Manganeso MnSO4H2O 169.01 16.90 845
monohidratado
Sulfato de Zinc heptahidratado ZnSO47H2O 287.56 8.60 430
cido Brico H3BO4 61.84 6.20 310
Ioduro de Potasio KI 166.00 0.83 41.5
Molibdato de Sodio dihidratado Na2MoO42H2O 241.95 0.25 12.5
Sulfato cprico heptahidratado CuSO47H2O 249.70 0.025 1.25
Cloruro de Cobalto CoCl26H2O 237.95 0.025 1.25
hexahidratado
Fierro X 200 (g/500ml)
-1
(Tomar 5 mll de medio)
Sal disdica
(Etilendiaminotetractico Na2EDTA 372.20 37.30 3.73
disdico)
Sulfato Ferroso heptahidratado FeSO47H2O 278.03 27.80 2.78
Compuestos Orgnicos X 200 (mg/100ml)
-1
(Tomar 5 mll de medio)
Tiamina HCl 0.10 2.0
cido Nicotnico 0.50 10.0
Piridoxina HCl 0.50 10.0
Glicina 2.00 40.0
Mio-inositol 100.00 2,000.0

Otros componentes

Sacarosa 30 g l-1
gar 7.5 g l-1

Cuadro 5. Tratamientos utilizados para inducir microtuberizacin, con una

concentracin de 30 g/L de sacarosa, en el medio de cultivo MS.

BA (mg/L)

0 2 4

AIB 0 T1 T2 T3
(mg/L)
1 T4 T5 T6

41
 Cuadro 6. Tratamientos probados para la induccin de la
microtuberizacin, en el medio nutritivo MS, sin reguladores del
crecimiento vegetal, solo aumentando la concentracin de sacarosa.

Sacarosa (g/l) 40 50 60

T7 T8 T9

dos frecuencias (cada 4 y 6 horas) con tres minutos de inmersin, dos plntulas
y 100 ml de medio de cultivo por biorreactor. El medio utilizado fue el MS
bsico lquido, evaluando los mismos tratamientos considerados para la
tuberizacin en medio semislido. Los biorreactores se mantuvieron en un
fotoperiodo de 18 horas de luz/da. El medio de cultivo se cambi cada 20 das,
durante cuatro meses para suministrar nutrientes a las plntulas. Al trmino de
los 120 das se cosecharon los microtubrculos y se midieron las mismas
variables consideradas que en los microtubrculos obtenidos en medio
semislido.
Los tratamientos considerados en este experimento fueron cuatro,
partiendo del medio de cultivo MS lquido con 50 y 60 g/L de sacarosa en
combinacin de cuatro y seis pulsos de tres minutos cada uno por da.

3.8 Tuberizacin en sustrato a partir de vitroplantas ex vitro

Veinte vitroplantas de 5 cm de altura, con un sistema radical vigoroso y

abundante, obtenidas en medio semislido se trasplantaron en recipientes
plsticos de 500 ml conteniendo un sustrato preparado a partir de una mezcla
de peat moss, agrolita, vermiculita y un fertilizante de liberacin lenta triple 14
(ozmocote), los tres primeros componentes en una proporcin del 33% y el
fertilizante 1%, humedeciendo este sustrato a capacidad de campo. El sustrato
sealado se ensteriliz a 121C durante 1 h.
42
 Para la etapa de aclimatacin, se extrajeron las plantas del frasco, se
lavaron sus races con agua corriente con mucha delicadeza para eliminar la
totalidad de medio de cultivo aadherido a sus races, para evitar crecimiento de
hongos y/o bacterias en el resto de medio nutritivo presente en las plantas. A
continuacin se colocaron en una solucin al 1% del fungicida llamado
Nitrasan-D, durante 5 minutos.

Las plantas colocadas en el recipiente, con el sustrato estril, se

cubrieron con una bolsa plstica transparente, fijando sta al contenedor con
una liga (banda elstica), con el fin de que la planta conservara su humedad.
Se incubaron en un ambiente de aproximadamente 20C, con iluminacin de
luz blanca provista por lmparas fluorescentes, con un fotoperiodo de 16 h de
luz por 8 h de oscuridad. Al da siguiente, a las bolsas se les hizo una
perforacin de aproximadamente 3 mm de dimetro, al siguiente da otro, y as
sucesivamente hasta que en un trmino de 2 semanas las vitroplantas se
encontraban totalmente libres de la proteccin plstica (Figura 9).
Posteriormente fueron nuevamente trasplantadas con su cepelln, en macetas
de aproximadamente de 10 litros de volumen, utilizando el mismo sustrato
estril y colocadas en condiciones de invernadero durante 16 semanas. Al
trmino de su ciclo vital, las plantas se extrajeron de las macetas, se aislaron
los minitubrculos, a los que se les evaluaron los parmetros considerados en
los microtubrculos obtenidos en medio semislido y de inmesin temporal, ya
descritos.

43
Figura 9. Plantas de papa en proceso de aclimatacin. a) plantas de papa
en etapa de aclimatacin. b) Planta de papa aclimatada despus de dos
semanas de iniciado el proceso.

3.9 Anlisis estadstico de resultados

En el Cultivo de Tejidos Vegetales cada una de las unidades

experimentales (frascos con medio de cultivo y tejido vegetal) se mantienen en
condiciones fsicas y qumicas homogneas, por lo que se acepta
estadsticamente para el anlisis de datos, bajo estas circunstancias, un diseo
completamente al azar. Esto se considera as adems, por los pocos
tratamientos, y en cuanto al nmero de repeticiones puede ser o no equilibrado.
Por lo anterior en este trabajo de investigacin se utiliz un diseo
completamente al azar, para realizar la comparacin de respuesta en lo
referente a la multiplicacin y tuberizacin in vitro.

Los datos cuantitativos registrados durante el proceso de multiplicacin y

tuberizacin, se sometieron a un anlisis de varianza (ANDEVA). Esta
herramienta estadstica es el mtodo mediante el cual se analiza la variabilidad
con respecto a los diversos tratamientos. Al considerar la variacin total, las
causas principales de variacin son la variacin entre tratamientos y la
variacin dentro del grupo, que recibi el mismo tratamiento. El anterior anlisis
permite establecer s al menos uno de los tratamientos fue diferente a los
dems. Las pruebas de hiptesis se indican en el Cuadro 7.

Cuadro 7. Hiptesis planteadas.

Los tratamientos T
Hiptesis nula HO: T1=T2=T3= ... Tn tienen la misma
respuesta
Existe cuando menos
Hiptesis Ha: Ti Ti i i, un tratamiento T con
Alternativa donde: diferente respuesta a
i, i {T1, T2, T3,..., Tn} los dems

44
 Para el presente trabajo se consider la Hiptesis Alternativa.

Cuando al menos uno de los tratamientos fue diferente a los dems, los
datos se sometieron a la prueba estadstica llamada Diferencia Mnima
Significativa (DMS), para jerarquizar la respuesta de cada uno de los
tratamientos.

45
 IV. RESULTADOS

IV.1 Establecimiento del cultivo in vitro por medio de meristemos

Se obtuvo una respuesta favorable del 16% en cuanto a la generacin

de plntula a partir de meristemos; un 57% de los meristemos se contaminaron.
Sin embargo, se puede afirmar que los mtodos de pre desinfeccin y
desinfeccin fueron los adecuados, ya que el ndice de contaminacin fue
relativamente bajo, considerando que los tubrculos de donde se aislaron los
meristemos provenan de campo. A pesar de que los explantes establecidos
fueron pocos se consideraron suficientes para inducir la proliferacin masiva de
plntulas. En el Cuadro 8 se detallan los resultados obtenidos en el proceso de
establecimiento a partir de meristemos.

Cuadro 8. Resultados en el proceso de establecimiento a partir de

meristemos.

Total Contaminados Sin Respuesta Respondieron

100 57 27 16

4.2 Prueba de ELISA

El valor medio de la absorbancia de las muestras negativa, para

establecer el punto de corte, fue de 0.04203, y la desviacin estndar de las
cincuenta pruebas consideradas fue de 0.01653. El punto de corte se calcul
de la siguiente manera:

PC = () + 3 (dst) = (0.04203) + 3 (0.01653) = 0.09162

De las 16 plntulas que se obtuvieron a partir de meristemos, solamente

dos resultaron negativas a la presencia de potyvirus ya que la lectura obtenida
en el lector de ELISA nos dio un valor menor al de punto de corte, mientras que
las otras 14 muestras sobrepasaron este valor. Por lo que el proceso de

46
propagacin masiva se inici a partir de estas dos plntulas. La absorbancia en
las plantas que fueron positivas a la presencia de potyvirus tuvo un rango de
0.105 hasta 0.910, con una media de 0.274.

4.3 Multiplicacin de plntulas

Durante 12 semanas se subcultivaron las dos plntulas libres de virus,

en el medio nutritivo MS sin reguladores del crecimiento vegetal, con el fin de
aumentar el nmero de individuos, para posteriormente determinar la tasa de
multiplicacin ms elevada con el uso de fitohormonas.

Se consideraron 12 yemas provenientes de los entrenudos de las

plntulas, de aproximadamente 1.5 cm, en cada uno de los cuatro tratamientos.
El nmero de brotes que se obtuvo en cada uno de los tratamientos se seala
en el cuadro 9. Ver Figura 10.

Cuadro 9. Cantidad de brotes que se obtuvieron en los tratamientos

probados durante el proceso de multiplicacin.

BA/AIB (mg/L)
T1 T2 T3 T4
(0/0) (2/0.2) (4/0.4) (6/0.6)
7 12 8 9
6 11 7 10
9 7 9 11
6 6 10 13
8 8 6 7
9 9 7 8
8 7 8 7
7 9 11 8
9 10 8 9
7 12 7 10
6 11 10 12
7 5 9 11
Valor medio () 7.417 8.917 8.333 9.583
Al realizar el anlisis de varianza se determin que al menos uno de los
tratamientos fue diferente a los dems. En el siguiente Cuadro 10 se indica el
resultado de dicho anlisis.

Cuadro 10. Anlisis de varianza de los datos registrados durante el

proceso de induccin de brotes para la multiplicacin de plntulas.

47
 FV GL SC CM Fc FT (0.05)

Tratamiento 3 30.3957 10.1319 3.1524 2.81

Error 44 141.4167 3.2140

Total 47 171.8125

Se realiz la comparacin de medias, mediante la prueba Diferencia

Mnima Significativa (DMS), ya que la Fc fue mayor que la FT, a un nivel de
significancia de 0.05, con el fin de jerarquizar los resultados de los diferentes
tratamientos considerados para la induccin de brotes. En el cuadro 11 se
indica lo anterior.

Cuadro 11. Comparacin de medias obtenidas durante el proceso de

induccin de brotes para la multiplicacin de plntulas.

Tratamiento Media

4 9.5833 A

2 8.9167 A

3 8.3333 AB

1 7.4167 B

48
Figura 10. Se presenta en a) un explante que se someti a la induccin de
brotes, y en b) Un segmento aislado para ser sometido al enraizamiento.

4.4 Enraizamiento

Segmentos de aproximadamente 4 cm de longitud, provenientes de

plntulas multiplicadas (Figura 10 b), se incubaron en el medio de cultivo MS
suplementado con BA y AIB, en diversas concentraciones para determinar
mediante este barrido hormonal, el mejor tratamiento para desarrollar un buen
sistema radicular.

El tratamiento control T1, el tratamiento T2 (1mg/l de AIB sin BA), y el

tratamiento T3 (2mg/l de AIB sin BA), generaron los sistemas radiculares ms
abundantes (Figura 11), y en los tres casos de una manera similar. En todos
los dems tratamientos hubo crecimiento de manera similar, con escasas
races, a las cuatro semanas de haberse iniciado el proceso de enraizamiento,
excepto en el tratamiento T4 (3mg/l de AIB sin BA) donde las plntulas
generaron un callo en la parte basal del explante, sin la emisin de races.

49
Figura 11. Tres vitroplantas con un excelente sistema radical, que permite
la aclimatacin con mayor eficiencia.

4.5 Produccin de microtubrculos en medio semislido

Se utilizaron plntulas de aproximadamente 4 cm de altura, con un

escaso sistema radicular para los tres tipos de tuberizacin. En el tratamiento
T1 (control) no se dio la produccin de microtubrculos, solamente se origin un
buen sistema radicular y un buen desarrollo de la plntula. En los tratamientos
T2 y T3 (2 y 4 mg BA/0 mg AIB, por litro respectivamente) tampoco se dio la
formacin de microtubrculos, solamente en la base de la plntula se origin
tejido calloso en ambos casos de tamao similar. En el tratamiento T 4 (0 mg
BA/1 mg AIB, por litro) tampoco se dio la formacin de minitubrculos,
solamente se obtuvieron plntulas con abundante raz y muy elongadas. Las
plntulas del tratamiento T5 (2 mg BA/ 1 mg AIB, por litro) presentaron
abundante callo en la parte basal, sin races pero con mucho vigor y tambin
muy elongadas. En el tratamiento T6 (1 mg BA/4 mg AIB, por litro) se
produjeron plntulas con abundantes races y callo, con mucho vigor y con un
promedio de 3.3 microtubrculos por repeticin.

En el tratamiento T7 (MS sin reguladores del crecimiento vegetal, con 40

g/L de sacarosa) se produjeron plantas elongadas, que presentaron pocas
races y con 4.5 microtubrculos en promedio por repeticin. En el tratamiento
T8 (MS sin reguladores del crecimiento vegetal, con 50 g/L de sacarosa)
presentaron un fenotipo similar al tratamiento T7, pero con un promedio de 6.1
microtubrculos por repeticin. El mayor rendimiento se obtuvo en el
50
tratamiento T9 (MS sin reguladores del crecimiento vegetal, con 60 g/L de
sacarosa) con 8.2 microtubrculos por repeticin en promedio.

Considerando solamente los tratamientos en donde se obtuvieron

microtubrculos, se realiz un anlisis estadstico para determinar si al menos
uno de los cuatro tratamientos era diferente a los dems se realizo un
ANDEVA, y posteriormente la comparacin de medias por medio de DMS a un
nivel de significancia de 0.05, cuyo resultado se seala en los cuadros (12; 13).

Cuadro 12. Anlisis de varianza de los tratamientos para inducir la

formacin de microtubrculos en medio de cultivo semislido.

FV GL SC CM FC FT

Tratamiento 3 157.729 52.5763 42.6426 2.83

s 1

Error 44 54.2500 1.2329

Total 47 211.9791

Cuadro 13. Comparacin de medias, mediante la prueba Diferencia

Mnima Significativa de los tratamientos donde se produjeron
microtubrculos.

Tratamientos Medias

9 8.1667 A

8 6.0833 B

7 4.5000 C

6 3.3333 D

51
 Con respecto al peso de los microtubrculos el promedio fue de 157
mg/tubrculo, dentro de un rango entre 206 a 62 mg. Ver Figura 12.

Figura 12. Microtubrculos de papa generados in vitro en medio

semislido, los que presentaron diversos pesos y tamaos.

4.6 Produccin de microturculos en Sistema de Inmersin

Temporal

Por este procedimiento se obtuvieron microtubrculos de muy diversos

tamaos, ya que el ms grande peso 1.107 g y el ms pequeo fue de 0.015 g
y un promedio general de 0.3267 g/microtubrculo. En el cuadro 14 se indica el
resultado de los cuatro tratamientos probados.

Cuadro 14. Cantidad de microtubrculos obtenidos en cada uno de

los cuatro tratamientos probados.
g sacarosa/L Pulsos por da Peso No. promedio de
3 min c/u Promedio (g) microtubrculos/plntaula

50 4 0.20733 8.5

6 0.3966 9.0

60 4 0.26943 9.5

6 0.4333 9.0
A pesar de la diferencia en el promedio del peso de los microtubrculos
entre los diversos tratamientos, cuando se sometieron al anlisis de varianza

52
(Cuadro 15) se encontr que no hubo diferencias significativas en los
resultados.

Cuadro 15. Anlisis de varianza del peso de los microtubrculos

obtenidos en los tratamientos probados en inmersin temporal.

FV GL SC CM FC FT
Tratamientos 3 0.33778 0.112595 1.0066 0.402
5

Error 36 4.02695 0.111860

8

Total 39 4.364744

En cuanto al nmero de microtubrculos por planta tampoco se encontr

diferencias desde el punto de vista estadstico entre los cuatro tratamientos.
Ver Figura 13.

Figura 13. Recipientes de inmersin temeporal, a) explantes en proceso

de multiplicacin para aumentar los brotes. b) Tubrculos de diversos
dimensiones producidos en RITA. c) Esta imagen corresponde al
recuadro sealado en la 13b, para apreciar los microtubrculos.
53
 4.7 Produccin de minitubrculos en sustrato a partir de
vitroplantas ex vitro

La capacidad de producir minitubrculos ex vitro, se determin en 20

plntulas vigorosas, de aproximadamente 6 cm de largo, con un sistema
radicular desarrollado. Se logr obtener 12 plantas aclimatadas luego de dos
semanas.

Se obtuvo un promedio de 21.67 minitubrculos en las 12 plantas

aclimatadas que se trasplantaron a maceta, en el sustrato preparado a partir de
peat moss, agrolita, vermiculita y ozmocote. El rango del peso de los
minitubrculos que se obtuvo fue entre 24.5 y 0.06 g, con un promedio de
5.926 g. El nmero de tubrculos que se obtuvo por cada planta tambin fue
muy heterogneo ya que el rango fue entre 37 y 12 minitubrculos por planta,
con un promedio de 21.67. Figura 14.

Figura 14. Obtencin de semilla bsica de papa en suelo desinfectado a)

Planta de papa en periodo de aclimatacin, antes de ser trasplantada a
contenedor de mayor tamao. b) Planta de papa al trmino de su ciclo
biolgico. c) Planta de papa a la que se le dej secar totalmente para
posteriormente extraer los minitubrculos. d) Planta a la que se le
aislaron sus minitubrculos antes de llegar a un secado total.

54
 V. DISCUSIN

El tamao de los meristemos aislados es determinante para la

eliminacin de virus de plantas infectadas. Garcia guila et al., (2001)
reportaron un 96.6% de sanidad cuando utilizaron meristemos dentro de un
rango de tamao de 0.1 a 0.06 mm. Sin embargo, el porcentaje de
regeneracin de plantas a partir de estos explantes tan pequeos es de tan
solo un 25% de sobrevivencia, mientras que con meristemos dentro de un
rango de 0.1 a 0.2 mm aumento la sobrevivencia a un 37%, mientras que el
saneamiento se redujo a una 6.6%. De acuerdo a nuestros resultados la
sobrevivencia fue solamente del 16% (16 plntulas obtenidas), y el
saneamiento del 2%, a pesar de que el tamao de los meristemos con el que
se estableci el cultivo fue de 0.2 mm. Este tamao, relativamente grande, fue
debido a que en la medida que el meristemo es menor (0.06 a 0.1 mm) se
aumenta la eficiencia en el saneamiento, pero se reduce el porcentaje de
sobrevivencia. George (1993), sugiri que el tamao ptimo de los meristemos
para iniciar en general diferentes especies es entre 1 y 0.2 mm, aunque
realmente el tamao a utilizar depende de los objetivos que se persigan con la
propogacin in vitro. En el presente trabajo se seleccion un tamao intermedio
con el fin de aumentar la sobrevivencia, pero tambin tener xito en el
saneamiento.

El rendimiento de saneamiento en los meristemos aislados que

sobrevivieron fue de solo el 12.5% (2/16). Este porcentaje fue muy bajo,
considerando que existen varios trabajos donde la eficiencia supera el 90%
(Nasir Muhammad et al., 2012). La razn por la que se obtuvo esta tasa tan
baja se debi en gran medida al tamao de los meristemos aislados, ya que fue
de aproximadamente 0.2 mm. Este tamao es relativamente grande para tener
una eficiencia alta en el proceso de saneamiento. Se opt por este tamao
grande de meristemos, con el fin de lograr la mayor sobrevivencia de los
explantes. El ndice de contaminacin de los explantes fue muy alta (57%),
creemos que se debi a que la fuente del material biolgico proveninte de
campo vena de origen contaminado con bacterias sistmicas que se
manifestaron en el cultivo in vitro.
55
 En nuestro trabajo se indujo brotacin mltiple para producir la mayor
cantidad de pltulas, y posteriormente pasar a la etapa de enraizamiento, a
diferencia de otros publicaciones donde solamente inducen la formacin de
nudos y elongan, para a partir de la plntula tomar un par de entrenudos para
regenerar nuevas plntulas. Consideramos que el procedimiento empleado en
el presente trabajo para micropropagar plntulas ofrece buenos rendimientos.
En nuestro caso se tuvo un rendimiento de 9.58 a 7.41 brotes por explante, con
un promedio de 6 nudos por brote, obtenindose alrededor de 48 nudos por
explante. Srivastava et al., (2012), tuvierno un promedio entre 8.5 y 4.8 nudos
por explante en 6 varidedades de papa estudiadas.

De los 16 tratamientos para inducir enraizamiento solamente

sobresalieron tres (MS sin reguladores del crecimiento vegetal; MS suplentado
con 1.0 y 2.0 mg de AIB/L sin BA), en stos se produjeron sistemas radicales
excelentes. Races de este tipo permiten una aclimatacin con suma facilidad.
Consideramos que el uso de la citocininina no contribuye en lo individual o
combinada con AIB, a la induccin de races. Otros reguladores del crecimiento
vegetal como ANA y AG3, segn Badoni Anoop y Chauhan (2009), son tambin
eficientes en el enraizamiento, sin embargo, en el presente trabajo no fue
necesario probarlo ya que los tratamientos utilizados nos ofrecieron buenos
resultados.

Debido a que el factor gentico es determinante en el proceso de

microtuberizacin se encuentran reportados cantidades muy diversas en el
nmero de microtubrculos por unidad biolgica. Con el uso de BA a
concentraciones de 0, 5 y 10.0 mg de BA/L y con 80 g de sacarosa por litro,
Rivera Caldern et al. (2008), obtuvieron en promedio en tres variedades de S.
tuberosum 3.32, 9.55 y 9.32 microtubrculos por cada unidad biolgica. Valores
muy similares a los que se obtuvieron en el presente trabajo en los tratamientos
T6 (1 mg BA/4 mg AIB, por litro, 30 mg de sacarosa/L) se obtuvieron 3.3
microtuberculos/UB; en el T7 (MS sin reguladores del crecimiento vegetal, con
40 g/L de sacarosa) se obtuvieron 4.5 microtuberculos/UB; en el T 8 (MS sin
reguladores del crecimiento vegetal, con 50 g/L de sacarosa) donde se
obtuvieron 6.1 microtuberculos/UB; y en el T 9 (MS sin reguladores del
crecimiento vegetal, con 60 g/L de sacarosa) se obtuvieron 8.2
56
microtuberculos/UB. Con respecto a la longitud polar de los microtubrculos
que se obtuvieron en el presente trabajo consideramos que superamos a la
obtenida por Rivera Caldern et al. (2008), dado que se logr obtener
microtubrculos en el mejor de los tratamientos (T 8) de 19.38 mm y un peso
promedio de 157 mg, ya que los autores sealados obtuvieron microtubrculos
en promedio de 5 mm.

Con respecto a los microtubrculos obtenidos por inmersin temporal, en

RITA de 1 L, los cuatro tratamientos probados dieron resultados
estadsticamente iguales, con microtubrculos en cantidad baja (9 en
promedio) y muy pequeos (0.3267 g en promedio) en comparacin con
autores como Montoya et al., ya que ellos obtuvieron 98 tubrculos por frasco
de cinco litros cuando en el medio de cultivo MS, suplementado con 80 g de
sacarosa/L de medio, donde el 86.6% de los microtubrculos tuvieron un peso
superior al los 80 mg. Estos resultados aparentemente superiores a los
obtenidos en el presente trabajo, consideramos que no se pueden considerar
como tales, ya que en este trabajo utilizamos recipientes de 1 litro de
capacidad, por lo que en volmenes iguales los autores citados hubieran
porducido 19.6 microtubrculos por recipiente de un litro. Sin embargo el peso
de los microtubrculos fue inferior a los obtenidos en el trabajo aqu reportado.
Es conveniente sealar que la concentracin de sacarosa (50 y 60 mg/L) no
influy en la tuberizacin in vitro.

La formacin de tubrculos en papa depende, entre otros factores, de la

disponibilidad de nutrientes y de la habilidad que tienen las plantas para
acumularlos. El rendimiento se entiende como un proceso fisiolgico complejo
determinado por el genotipo, el ambiente y la interaccin de stos (Milton y
Allen, 1995).

En relacin al proceso de produccin in vivo, los rendimientos que se

pueden esperar de semilla bsica en invernadero, a partir de vitroplantas
aclimatadas in situ y considerando una densidad de 100 vitroplantas por metro
cuadrado, van de 400 a 800 minitubrculos por metro cuadrado, de acuerdo a
datos proporcionados por la empresa dedicada a la produccin de semilla
tubrculo de papa libre de patgenos, llamada Invername (INVERNAMEX,
2015).
57
 De acuerdo a lo anterior en los invernaderos de la empresa sealada
obtienen de 4 a 8 minitubrculos por planta, sin embargo, no sealan ni peso ni
dimensiones de los tubrculos obtenidos.

En el presente trabajo fue posible obtener en promedio 21.67

minitubrculos por planta, lo cual se considera una cifra bastante aceptable. En
cuanto al porcentaje de los diferentes patrones de tamaos de los
minitubrculos, de acuerdo a la categorizacin estndar fue la siguiente:

Rango (cm) Categora No. De minitubrculos %

obtenidos

0.0 a 1.4 Cero 13 35.13

1.5 a 1.7 Uno 1 2.70

1.8 a 2.5 Dos 5 13.51

2.6 a 3.5 Tres 11 29.72

3.6 a 4.5 Cuatro 5 13.51

4.6 o mayor Grande 2 5.40

De acuerdo a lo anterior tambin son satisfactorios los resultados en

cuanto se refiere al tamao de los minitubrculos obtenidos.

El peso promedio de los minitubrculos logrados fue de 5.926 g en

promedio, los que consiguieron a partir de plantas obtenidas de vitroplantas
enraizadas. El peso es relativamente bajo si compara con lo obtenido por
Sarques y Coria, donde ellos reportan haber obtenido minitubrculos de papa
variedad alfa, sealando resultados de 10.94 g/tubrculo, cuyas plantas fueron
obtenidas a partir de semilla botnica. En el mismo artculo, en papas silvetres
obtenidas por este mismo mtodo, reportan resultados muy similares por los
obtenidos en el presente trabajo.

58
 VI. CONCLUSIONES

1. Se logr producir semilla de papa (Solanum tuberosum L.) libre de

patgenos en los tres sistemas estudiados.

2. Cada uno de los sistemas probados en este trabajo, deben aplicarse de

manera conctenada. Se determin que son eficientes de manera
particular en cada una de las etapas del proceso de produccin de
semilla de papa sana.

3. En medio semislido se consigui, con un bajo rendimiento, el

establecimiento del cultivo de papa a partir de meristemos aislados,
liberados de patgenos.

4. El Sistema de Inmersin Temporal result eficiente en la etapa de

proliferacin de brotes adventicios areos y radicales.

5. Para la tuberizacin el sustrato in vivo present un alto rendimiento en

cuanto a la cantidad y biomasa de minituberculos.

59
 VII. LITERATURA CITADA

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