ACARA II

PENGECATAN BAKTERI

A. Tujuan Praktikum
Tujuan dari praktikum Acara II Pengecatan Bakteri adalah sebagai berikut:
1. Mempelajari morfologi bakteri dan membedakan jenis bakteri dengan
metode pewarnaan negatif.
2. Mempelajari morfologi bakteri dan membedakan jenis bakteri dengan
metode pewarnaan gram.
3. Mengetahui ada tidaknya kapsul pada bakteri dengan metode kapsul.
4. Mengetahui ada tidaknya endospora dengan metode pewarnaan
endospora.
B. Tinjauan Pustaka
Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak
hampir tembus pandang (transparan); bila diamati dengan mikroskop
cahaya biasa sehingga sukar dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai
indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang
bersifat cair. Kontras antara sel dan latar belakangnya dapat dipertajam
dengan cara mewarnai sel-sel tersebut dengan zat warna. Pewarnaan yang
paling umum dignakan adalah pewarnaan sederhana; disebut demikian
karena hanya digunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme
tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna
sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa). Zat-
zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya alkalin
(komponen kromoforiknya bermuatan positif). Pewarnaan sederhana
memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam tipe morfologi
(kokus, vibrio, basilus, spirilum, dan sebagainya) dan bahan-bahan lainnya
yang ada pada olesan yang diwarnai (Hadioetomo, 1990).
Pewarnaan negatif merupakan metode bukan pewarnaan bakteri,
melainkan mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Metode ini
meliputi pencampuran mikroorganisme di dalam setetes nigrosin lalu
menyebarkan di atas sebuah kaca obyek yang bersih. Pada pewarnaan ini
mikroorganisme kelihatan transparan dan tampak jelas di antara medan
yang gelap karena pewarna-pewarna tersebut tidak menembus
mikroorganisme. Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan
ukuran sel. Berbeda dengan metode pewarnaan lain, pada pewarnaan
negarif olesan tidak mengalami pemanasan ataupun perlakuan keras
dengan bahan-bahan kimia (Hadioetomo, 1990).
Pada praktikum pengecatan bakteri dengan metode pengecatan
negatif, gelas obyek yang akan digunakan dibersihkan dengan alkohol
kemudian dipanggang diatas lampu nyala spirtus. Mikroorganisme yang
akan diamati dicampur dalam setetes nigrosin lalu disebarkan diatas kaca
obyek dengan batang gelas obyek hingga menjadi lapisan tipis.
Selanjutnya preparat dikeringkan, dan diamati dengan mikroskop
perbesaran kuat. Pada pengambilan mikroorganisme, proses harus
dilakukan secara akseptis (Hadioetomo, 1990).
Prosedur pewarnaan sederhana memungkinkan kita untuk melihat
bakteri dengan jelas, tetapi tidak dapat membedakan jenis-jenis bakteri
yang berbeda dengan morfologi yang sama. Pewarnaan gram merupakan
salah satu prosedur yang amat penting dan paling banyak digunakan dalam
klasifikasi bakteri. Dengan metode ini bakteri dapat dibedakan menjadi
dua kelompok besar yaitu : (1) organisme yang dapat menahan kompleks
pewarna primer ungu kristal iodium sampai pada akhir prosedur (sel-sel
tampak biru gelap atau ungu), disebut gram positif; (2) organisme yag
kehilangan kompleks warna ungu kristal pada waktu pembilasan alkohol
namun kemudian terwarnai oleh pewarna tandingan, safranin (sel-sel
tampak merah muda), disebut gram negatif. Karena kemampuannya untuk
membedakan suatu kelompok bakteri tertentu dari kelompok lainnya,
pewarnaan gram disebut juga pewarnaan diferensial (Burrows et al.,
1968).
 Komposisi dinding sel bakteri gram positif berbeda dari bakteri
gram negatif dan ini diduga berperan dalam terjadinya reaksi gram yang
berbeda-beda. Dinding sel yang lebih tebal pada bakteri gram positif
menyusut oleh perlakuan alkohol karena terjadinya dehidrasi,
menyebabkan pori-pori dinding sel menutup sehingga mencegah lunturnya
kompleks ungu kristal iodium pada langkah pemucatan. Sementara itu
pada bakteri gram negatif mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi
pada dinding selnya dan lipid pada umumnya larut dalam alkohol dan
aseton. Larutya lipid oleh pemucat yang digunakan dalam pewarnaan gram
memperbesar pori-pori dinding sel dan menyebabkan proses pemucatan
pada sel-sel gram negatif berlangsung lebih cepat. Dinding sel pada gram
positif menjadi penghalang terhadap pemucatan sel-sel gram positif.
Perbedaan reaksi gram bukanlah suatu fenomena yang sangat mutlak dan
kaku, melainkan merupakan perbedaan laju lepasnya kompleks ungu
kristal-iodium dari sel pada langkah pemucatan. Organisme gram positif
sekalipun dapat memperlihatkan reaksi gram negatif bila mengalami
pemucatan yang berlebihan. Faktor-faktor lain yang juga dapat
menimbulkan keragaman dalam reaksi gram ialah : (1) pelaksanaan fiksasi
panas terhadap olesan; (2) kerapatan sel pada olesan; (3) konsentrasi dan
umur reagan-reagan yang digunakan untuk pewarnaan; (4) sifat,
konsentrasi, dan jumah pemucat yang dipakai; dan (5) sejarah biakan.
Olesan bakteri yang dipanaskan secara berlebihan akan menyebabkan
pecahnya dinding sel. Dalam keadaan demikian maka sel-sel gram positif
akan melepaskan warna primer dan menerima pewarna tandingan. Hal ini
mendukung teori bahwa reaksi gram bergantung pada struktur dinding sel.
Pada pewarnaan gram, olesan yang terlampau tebal tidak akan memucat
secepat seperti olesan dengan kerapatan sel yang normal. Sebagai
pemucat, etanol 95% bekerja paling lambat, sedangkan aseton paling cepat
sehingga pemucat yang paling banyak digunakan adalah campuran etanol
95% dan aseton (1:1). Namun bagi mahasiswa yang baru belajar sebaiknya
menggunakan pemucat lambat yaitu etanol 95% yang untuk memperkecil
kemungkinan terjadinya pemucatan yang berlebihan (Hadioetomo, 1990).
Pada pewarnaan gram, rekasi bakteri terhadap larutan warna
sangatlah penting untuk menentukan jenis bakteri gram positif atau gram
negatif. Pada bakteri gram positif, reaksi bakteri berwarna ungu pada
penambahan kirstal violet ungu; pada penambahan laritan iodin kompleks
kristal ungu dan iodin terbentuk di dalam sel, sel tetap berwarna ungu;
pada penambaha alkohol dinding sel mengalami dehidrasi, pori-pori
menciut dan daya merembes kristal ungu dan iodin menurun, sehingga
kristal ungu dan iodin tidak dapat keluar sel dan sel tetap berwarna ungu;
pada penambahan safranin sel tidak terpengaruh dan tetap berwarna ungu.
Sementara pada bakteri gram negatif, rekasi bakteri berwarna ungu pada
penambahan kristal ungu; pada penambahan iodin kompleks kristal ungu
dan iodin terbentuk di dalam sel, sel tetap berwarna ungu; pada
penambahan alkohol lipid terekstraksi dari dinding sel, pori-pori
mengembang, kompleks kristal ungu dan iodin keluar dari sel, sehingga
sel menjadi tidak berwarna; pada penambahan safranin sel berwarna merah
karena menyerap larutan safranin tersebut (Pelczar dan Chan, 1986).
Fiksasi dalam pewarnaan digunakan untuk merubah sel yang
semula non permeabel menjadi permeabel sehingga dapat ditembus
dengan air dan pewarna dan sel dapat terwarnai dengan baik. Selain itu,
fiksasi yang dilakukan juga dapat memperkuat posisi bakteri pada gelas
benda dan memperkuat dinding sel bakteri (Hayama, 2007). Fiksasi
dilakukan secara cepat, karena waktu fiksasi preparat
dapat merusak kapsul (karena isi kapsul sebagian besar
adalah air), maka dengan pemanasan akan mengakibatkan
kapsul mengerut. Apabila mengerut begitu besar akan
berakibat kapsul tidak tampak (Koesnijo, 1974).
Biakan organisme gram positif yang lebih tua dan ditumbuhkan
dalam medium asam seringkali tampak gram negatif atau gram variabel
(biakan yang sama menampakkan sel-sel baik gram positif ataupun gram
negatif). Hal ini berkaitan dengan permeabilitas dinding sel pada biakan
tua yang menyebabkan hilangnya sifat gram positif. Namun gram negatif
tidak menjadi gram positif terlepas dari umur atau medium yang
dipergunakan (Hadioetomo, 1990).
Jenis-jenis bakteri tertentu, terutama yang tergolong ke dalam
genus Bacillus dan Clostridium, membentuk suatu struktur di dalam sel
pada tempat-tempat yang khas, disebut endosprora. Endospora dapat hidup
dalam keadaan kekurangan nutrien, tahan terhadap panas dan unsur-unsur
fisik lainnya seperti pembekuan, kekeringan, radiasi sinar UV serta
terhadap bahan-bahan kimia yang dapat menghancurkan bakteri yang tidak
membentuk spora. Ketahanan disebabkan oleh adanya selubung spora
yang tebal dan keras. Endospora merupakan bentuk kehidupan yang paling
resisten sejauh ini; organisme yang bersangkutan dapat bertahan dalam
debu dan tanah selama bertahun-tahun. Sifat endospora yang demikian
menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk mewarnainya.
Prosedur pewarnaan gram tidak dapat mewarnainya. Hanya bila diberi
diberi perlakuan panas yang cukup, pewarna yang sesuai dapat menembus
endospora. Tetapi, sekali pewarna tersebut memasuki endospora, sukar
dihilangkan. Ada dua metode yang umum dipakai, yaitu metode Schaeffer
Fulton dan metode Dorner. Metode Dorner menggunakan nigrosin dan
menghasilkan spora bewarna merah dan sporangium yang tak bewarna
(Hadioetomo, 1990).
Mikroorganisme terdapat di mana-mana dan karenanya harus
sangat berhati-hati untuk mencegah masuknya organisme yang tidak
dikehendaki ke dalam biakan murni. Mikrooganisme luar yang tidak
dikehendaki itu dapat masuk melalui kontak langsung dengan permukaan
atau tangan yang tercemar, tersentuhnya media atau permukaan tabung
bagian dalam oleh benda yang belum disterilkan, ataupun melalui aliran
udara (Hadioetomo, 1990).
Secara garis besar berdasarkan pengecatan gram, bakteri
dikelompokkan menjadi dua, yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri
gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna gram A yang
mengandung kristal violet, sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis
ini akan berwarna ungu dibawah mikroskop, sedangkan bakteri gram
negatif akan berwarna merah atau merah muda, karena warna ungu dapat
dilunturkan kemudian mengikat cat gram D sebagai warna kontras.
Perbedaan klarifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan
pada perbedaan struktur dinding sel bakteri. Pada bakteri gram positif
susunan lebih sederhana terdiri atas 2 lapis namun memiliki lapisan
peptidoglikan yang tebal sementara pada dinding sel bakteri gram negatif
lebih kompleks terdiri atas 3 lapis namun lapisan peptidoglikan tipis
(Juliantina, et al., 2009).
Sebuah endospora terdiri dari lapisan luar kompleks protein yang
disebut mantel spora. Di dalam lapisan ini adalah korteks spora, tebal,
berat dan kompleks silang lapisan peptidoglikan. Selanjutnya adalah
membran, mengelilingi sitoplasma kering dan stabil dan materi kromosom.
Morfologi bakteri endospora sangat stabil dilingkungan sehingga paling
sulit ditembus secara tradisional dan semua pewarna. Proses pewarnaan
untuk endospora menggunakan acridine orange, sebuah pewarna
nukleotida standar yang murah dan stabil untuk mikroskop cahaya.
Acridine orange (AO) adalah neon populer noda untuk asam nukleat
dalam banyak jenis sel. Endospora dalam perlakuan dan pewarnaan tidak
terwarnai seluruhnya, melainkan dalam karakteristik bentuk oval hijau. Sel
vegetatif diwarnai seluruhnya hijau, dan mudah dibedakan dari endospora
(Schichnes, et al., 2006).
Spora mirip protein yang kehilangan airnya, sehingga
menunjukkan bahwa dalam spora terdapat sejumlah besar bahan kaya
protein yang terdapat dalam ruangan sempit. Spora merngandung hampir
seluruh massa kering sel induknya, tetapi volumenya hanya sepersepuluh
dari volume sel induk. Bila ada keragu-raguan, spora dapat dibedakan
menggunaan pewarna spora, untuk menentukan apakah memang ada
endospora sejati. Bila preparat apus bakteri yang difiksasi dengan
pemanasan dimasak dengan karbol fukhsin, spora akan menyerap warna
ini dengan tidak akan melepaskannya lagi meskipun diberi etanol atau
asam asetat 1 molar, sedangkan ruang sel selebihnya akan kehilangan
warnanya (Schmidt, 1994).
Pewarnaan gram isolat bakteri A diambil 1 ose dan digores-
goreskan pada permukaan preparat steril kemudian dilakukan fiksasi.
Kristal violet sebanyak 1 tetes ditambahkan ke permukaan preparat yang
terdapat lapisan bakteri tersebut dan didiamkan selama 1 menit. Setelah 1
menit, preparat dibilas dengan air sampai zat warna luntur. Preparat
dikeringkan di atas api spiritus. Setelah kering, larutan iod sebanyak 1
tetes ditambahkan ke permukaan preparat tersebut dan didiamkan selama 1
menit. Setelah 1 menit, preparat dibilas dengan air. Preparat dibilas dengan
alkohol 96% sampai semua zat warna luntur kemudian dicuci dengan air.
Preparat dikeringkan di atas api spiritus. Setelah kering, safranin sebanyak
1 tetes ditambahkan ke permukaan preparat dan didiamkan selama 45
detik. Preparat dicuci dengan air dan dikeringkan. Preparat diamati
menggunakan mikroskop dengan perbesaran 1000x. Pewarnaan diulang
untuk isolat bakteri B, C dan D (Pratita dan Putra, 2012).
Bakteri Bacillus spp. merupakan bakteri yang berbentuk batang
dapat dijumpai di tanah dan air termasuk pada air laut. Beberapa jenis
menghasilkan enzim ekstraseluler yang dapat menghidrolisis protein dan
polisakarida kompleks. Bacillus spp. membentuk endospora, merupakan
gram positif, bergerak dengan adanya flagel peritrikus, dapat bersifat
aerobik atau fakultatif anaerobik serta bersifat katalase positif. Marga
Bacillus merupakan salah satu dari enam bakteri penghasil endospora.
Endospora tersebut berbentuk bulan, oval, elips, atau silinder
(Hatmanti, 2000).
Beberapa jenis bakteri dan sianobakteri mengeluarkan bahan-bahan
yang amat berlendir dan lengket pada permukaan selnya, melingkupi
dinding sel. Bahan ini disebut kapsul. Kapsul pada bakteri dapat berfungsi
sebagai cadangan makanan, perlindungan terhadap fagositosis atau
perlindungan terhadap dehidrasi. Pada beberapa jenis bakteri, adanya
kapsul merupakan petunjuk bahwa organisme tersebut bersifat virulen
misalnya Streptococcus pneumoniae. Bakteri yang memiliki kapsul
misalnya Leuconostoc mesenteroides dan Bacillus anthracis. Tanpa
pewarnaan, kapsul bakteri sangat sukar diamati dengan mikroskop cahaya
biasa karena tidak berwarna dan mempunyai indeks bias yang rendah.
Metode pewarnaan kapsul ini dilakukan fiksasi dengan panas supaya
organismenya melekat pada kaca objek. Olesan bakteri yang telah difiksasi
ditetesi larutan ungu kristal dan digenangi selama 1 menit kemudian dicuci
dengan hati-hati. Bila pewarnaan yang dilakukan baik maka kapsul akan
tampak sebagai lingkaran berwarna biru pucat mengelilingi sel-sel
berwarna biru tua sampai ungu (Hadioetomo, 1990).
Pewarnaan endospora dilakukan untuk isolat bakteri C. Isolat
bakteri c diambil sebanyak 1 ose dan digoreskan pada permukaan preparat
steril kemudian dilakukan fiksasi. Preparat yang telah diberi bakteri
tersebut lalu dibungkus dengan menggunakan kertas saring lalu ditetesi
malachite green sebanyak 1 tetes dan didiamkan selama 4 menit. Setelah
itu kertas saring dilepaskan dan preparat dibilas dengan air mengalir.
Setelah itu preparat dikeringkan di atas api spiritus. Setelah preparat
kering, safranin sebanyak 1 tetes ditambahkan ke permukaan preparat.
Preparat tersebut kemudian didiamkan selama 5 menit. Preparat kemudian
diamati menggunakan mikroskop dengan perbesaran 1000x
(Pratita dan Putra, 2012).
Pada pewarnaan endospora reagen yang digunakan adalah
malachite green dan carbol-fuchsin. Endopora yang telah terwarna dengan
baik akan menunjukkan warna hijau yang menunjukkan bahwa bakteri
tersebut memiliki endospora (Pratita dan Putra, 2012).
Endospora yang dihasilkan oleh Bacillus mempunyai ketahanan
yang tinggi terhadap faktor kimia dan fisika, seperti suhu ekstrim, alkohol,
dan sebagainya. Jenis-jenis tersebut seluruhnya mengandung Dipicolinic
Acid (DPA) dan mereka mempunyai derajat dormansi unparalel pada
 bentuk kehidupan yang lain. Spora tersebut membawa siklus
perkembangan dimana sel vegetatif dapat membentuk spora dan spora
kemudian dapat tumbuh berkecambah menjadi sel vegetatif. Proses
tersebut pertama kali ditunjukkan pada tahun 1876 oleh Koch pada B.
anthracis dan oleh Cohn pada B. subtilis (Hatmanti, 2000).
Pseuodomonas flourescens adalah bakteri gram negatif, berbentuk
batang, dan bukan bakteri patogen. Bakteri ini hidup di tanah, tumbuhan,
dan air. Nama bakteri ini berasal dari pigmen pijar yang dapat
dihasilkannya dibawah keadaan besi yang terbatas. Bakteri tersebut
merupakan mikroorganisme tanah yang berperan penting dalam proses
denitrifikasi tanah (Alemu dan Tesfaye, 2013).
Tinta cina bersifat asam dan tidak dapat menembus atau
berpenetrasi ke dalam sel bakteri karena tinta cina memiliki muatan
negatif dari komponen kromoforik yang akan bertolakan dengan muatan
negatif yang dimiliki oleh sitoplasma bakteri sehingga tinta cina hanya
akan memberi warna hitam pada latarnya saja. Selain itu, pada pewarnaan
negatif ini lingkungan akan terwarnai hitam yang disebabkan oleh
pewarna yang digunakan adalah nigrosin atau tinta cina yang memiliki
warna dasar hitam. Hal ini juga sesuai dengan pustaka yang menyebutkan
bahwa zat pewarna asam membawa suatu muatan negatif, maka pada sel
yang permukaannya juga negatif akan ditolak oleh sitoplasma sel sehingga
zat warna ini akan berkaitan dengan lingkungan yang mengelilingi sel dan
bagian dalam sel akan tetap berwarna bening (Dwidjoseputro, 1998).
C. Metodologi
1. Alat
a. Gelas benda
b. Gelas penutup
c. Bunsen
d. Pipet tetes
e. Ose
f. Mikroskop
 g. Beaker Glass
2. Bahan
a. Biakan murni Lactobacillus lactis
b. Biakan murni Pseudomonas fluorences
c. Larutan kristal violet ungu
d. Larutan iodin
e. Larutan safranin
f. Larutan tinta cina
g. Aquades
h. Larutan aseton
i. Alkohol
j. Minyak Imersi
k. Malachite Green
l. Susu
3. Cara Kerja
a. Pewarnaan Negatif

Alkohol Pembersihan gelas objek dengan alkohol

Pengfiksasian gelas objek di atas bunsen

Pengfiksasian ose

Lactobacillus lactis
Pengambilan biakan Lactobacillus lactis secara akseptis dengan menggunakan ose

Penambahan 1 tetes tinta cina di atas biakan Lactobacillus lactis dalam gelas objek

Minyak Imersi
Amati preparat dengan mikroskop perbesaran kuat dengan minyak imersi

Gambar 2.1 Diagram Alir Pengecatan Bakteri dengan Pewarnaan Negatif

 b. Pewarnaan Gram

Alkohol
Pembersihan gelas objek dengan alkohol

Pengfiksasian gelas objek di atas bunsen

Pendingin anginkan gelas objek

Lactobacillus lactis Pengfiksasian ose

atau Pseudomonas
fluorences
Pengambilan biakan Lactobacillus lactis atau Pseudomonas fluorences secara akseptis dengan menggunak

Perataan biakan Lactobacillus lactis atau Pseudomonas fluorences pada gelas objek

Pengfiksasian biakan di atas bunsen

Kristal Violet

Pemberian 1 tetes larutan kristal violet pada olesan biakan Lactobacillus lactis atau Pseudomonas fluore
 Aquades
Pencucian dengan aquades

Larutan
Pemberian 1 tetes Iodin iodin pada olesan biakan Lactobacillus lactis atau Pseudomonas fluorences
larutan

Pendiaman selama 1 menit

Aseton
Pencucian dengan aseton

Larutan
Penambahan 1 tetes larutan safranin
Safranin

Pendiaman selama 30 detik

Aquades Pencucian dengan aquades

Pengamatan dengan mikroskop

Gambar 2.2 Diagram Alir Pengecatan Bakteri dengan Pewarnaan Gram

 c. Pewarnaan Kapsul
Alkohol
Pembersihan gelas objek dengan alkohol

Pengfiksasian gelas objek di atas bunsen

Susu
Pemberian 1 tetes susu pada gelas objek

Pengfiksasian sampel di atas bunsen

Kristal Violet
Pemberian 1 tetes kristal violet
Aquades

Pembilasan dengan aquades

Pengamatan dengan mikroskop

Gambar 2.3 Diagram Alir Pengecatan Bakteri dengan Pewarnaan Kapsul

 d. Pewarnaan Endospora

Alkohol
Pembersihan gelas objek dengan alkohol

Pengfiksasian gelas objek di atas bunsen

Pendingin anginkan gelas objek

Pengfiksasian ose
Lactobacillus lactis

Pengambilan biakan Lactobacillus lactis

Perataan biakan Lactobacillus lactis pada gelas objek

Malachite Green

Pemberian 1 tetes larutan malachite green

Aquades
Pemberian 1 tetes aquades

Pengamatan dengan mikroskop

Gambar 2.4 Diagram Alir Pengecatan Bakteri dengan Pewarnaan Endospora
D. Hasil dan Pembahasan
Tabel 2.1 Hasil Pengamatan Pewarnaan Negatif

Kelompok Nama Gambar Keterangan

Bakteri
10 Lactobacillus Tidak
berspora
lactis
Sel
berbentuk
batang
Warna latar
orange

Perbesaran 10 x 10
14 Lactobacillus Tidak
berspora
lactis
Sel
berbentuk
batang
Warna latar
coklat
muda

Perbesaran 40 x 10
12 Lactobacillus Tidak
lactis berspora
Sel
berbentuk
batang
Warna
latar
kuning

Perbesaran 10 x 10
Sumber : Laporan Sementara
Dalam pengamatan pengecatan bakteri dengan metode pewarnaan
negatif digunakan sampel Lactobacillus lactis. Menurut Hadoetomo
(1990), pengecatan negatif merupakan pengecatan latar belakang dari
bakteri dengan bakteri tidak menyerap warna cat terseut. Hal tersebut
dilakukan untuk mengetahui morfologi bakteri. Namun, pewarnaan negatif
merupakan metode bukan pewarnaan bakteri, melainkan mewarnai latar
belakangnya menjadi hitam gelap. Metode ini meliputi pencampuran
mikroorganisme di dalam setetes nigrosin atau tinta cina lalu menyebarkan
di atas sebuah kaca obyek yang bersih. Pada pewarnaan ini
mikroorganisme kelihatan transparan dan tampak jelas di antara medan
yang gelap karena pewarna-pewarna tersebut tidak menembus
mikroorganisme. Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan
ukuran sel. Berbeda dengan metode pewarnaan lain, pada pewarnaan
negarif olesan tidak mengalami pemanasan ataupun perlakuan keras
dengan bahan-bahan kimia.
Pewarnaan bakteri dengan metode negatif menggunakan tinta cina
atau nigrosin. Menurut Dwidjoseputro (1998), tinta cina bersifat asam dan
tidak dapat menembus atau berpenetrasi ke dalam sel bakteri karena tinta
cina memiliki muatan negatif dari komponen kromoforik yang akan
bertolakan dengan muatan negatif yang dimiliki oleh sitoplasma bakteri
sehingga tinta cina hanya akan memberi warna hitam pada latarnya saja.

Berdasarkan hasil pengamatan seperti yang terdapat pada Tabel 2.1

dapat dilihat bahwa bakteri Lactobacillus lactis memiliki bentuk batang.
Hasil yang terlihat sesuai dengan teori Hatmanti (2000), yang menyatakan
bahwa bakteri dengan genus bacillus mempunyai bentuk batang.
Pengamatan pengecatan bakteri dengan metode negatif ini memudahkan
menentukan jenis bakteri dengan melihat morfologi dan bentuk sel bakteri.
Sehingga dalam pengamatan ini bakteri Lactobacillus lactis termasuk
bakteri berbentuk batang atau bacillus.
Tabel 2.2 Hasil Pengamatan Pewarnaan Gram
Kelompo Nama Bakteri Gambar Keterangan
k
 11 Lactobacillus Bakteri
gram
lactis
positif
Sel
berbentuk
batang
Bakteri
bewarna
ungu

Perbesaran 10 x 10
15 dan 16 Pseuodomona Bakteri
gram
s flourescens
negatif
Sel
berbentuk
batang
Bakteri
bewarna
merah

Perbesaran 40 x 10
Sumber : Laporan Sementara
Pewarnaan gram bertujuan untuk memudahkan pengamatan yang
dilakukan oleh peneliti, agar objek atau bakteri yang ditentukan dapat
terlihat. Selain itu, pewarnaan gram juga merupakan salah satu metode
yang bertujuan untuk mengetahui klasifikasi bakteri yang diamati, baik
sifat, spesies, atau jenis bakteri tersebut. Pada umumnya pewarnaan gram
ditujukan membedakan antara bakteri gram positif atau bakteri gram
negatif. Menurut Pratita (2012), pewarnaan gram bertujuan
mengelompokkan bakteri menjadi 2 yaitu gram positif dan gram negatif.
Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu dari kristal violet
sehingga ketika diamati dengan mikroskop akan menunjukkan warna ungu
sedangkan bakteri gram negatif menunjukkan warna merah.
Metode pewarnaan gram menggunakan 4 jenis zat, yang pertama
adalah kristal violet sebagai pewarna utama, kemudian larutan iodin
sebagai pengikat warna ungu, kemudian dilunturkan dengan alkohol, dan
yang terakhir adalah larutan safranin sebagai pewarna kedua (Pratita dan
Putra, 2012). Prinsip penggunaan dua pewarnaan ini adalah untuk
membedakan dua jenis bakteri, bakteri gram positif dan negatif. Menurut
Pelczar (1986), gram negatif tidak dapat mempertahankan warna ungu dari
kristal violet ketika dilakukan pencucian sehingga sel bakteri menjadi
berwarna merah karena menyerap larutan safranin. Sedangkan gram positif
pada penambahan safranin sel tidak terpengaruh dan sel tetap berwarna
ungu.
Pada pewarnaan gram dilakukan fiksasi preparat. Fiksasi dalam
pewarnaan digunakan untuk merubah sel yang semula non permeabel
menjadi permeabel sehingga dapat ditembus dengan air dan pewarna dan
sel dapat terwarnai dengan baik. Selain itu, fiksasi yang dilakukan juga
dapat memperkuat posisi bakteri pada gelas benda dan memperkuat
dinding sel bakteri (Hayama, 2007). Dalam praktikum, fiksasi dilakukan
dengan memanaskan kaca preparat secara cepat dan berulang-ulang.
Perbedaan klarifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama
didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri. Pada bakteri gram
positif susunan lebih sederhana terdiri atas 2 lapis namun memiliki lapisan
peptidoglikan yang tebal sementara pada dinding sel bakteri gram negatif
lebih kompleks terdiri atas 3 lapis namun lapisan peptidoglikan tipis
(Juliantina, et al., 2009). Menurut Pelczar (1986), bakteri Pseuodomonas
merupaka bakteri gram negatif dan menurut Hatmanti (2000) jenis bakteri
Bacillus merupakan bakteri gram positif.
Berdasarkan hasil praktikum pada Tabel 2.2 digunakan bakteri
Lactobacillus lactis dan Pseuodomonas flourescens. Pada bakteri
Lactobacillus lactis tampak berwarna ungu pada pengamatan
menggunakan mikroskop. Hal tersebut sesuai dengan teori menurut
Hatmanti (2000) bahwa bakteri Bacillus merupakan bakteri gram positif,
ditunjukkan dengan warna tetap ungu. Sedangkan pada bakteri
Pseuodomonas flourescens, hasil pengamatan warna tampak merah muda
sehingga bakteri ini merupakan bakteri gram negatif menurut Alemu
(2013).
Tabel 2.3 Hasil Pengamatan Pewarnaan Kapsul
Kelom Nama Gambar Keterangan
pok Bakteri
13 Pseudomonas Kapsul tidak
berwarna
Tidak berspora
Ada lapisan
lendir

Perbesaran 10 x 10
17 Pseudomonas Berbentuk
batang
Mengikat warna
kristal violet
Tidak berspora,
kapsul

Perbesaran 10 x 10
18 Pseudomonas Menghasilkan
warna ungu
pada sel
Berbentuk
batang pendek
Tidak berspora
Ada lapisan
lendir

Perbesaran 10 x 10
Sumber : Laporan Sementara
Pewarnaan kapsul merupakan pewarnaan yang
memudahkan pengamatan sehingga kapsul pada bakteri
dapat terlihat dengan jelas. Tanpa pewarnan, kapsul bakteri
sangat sukar diamati dengan mikroskop cahaya biasa
karena tidak berwarna dan mempunyai indeks bias yang
rendah. Karena kapsul bakteri bersifat non ionik, maka
pewarnaanya tidak dapat dilakukan dengan prosedur
pewarnaan sederhana biasa. Masalah utama dalam
pewarnaan kapsul ialah bila olesan bakteri yang telah
disiapkan itu difiksasi dengan panas menurut metode yang
biasa, maka kapsul tersebut akan rusak, namun bila tidak
difiksasi dengan panas, organisme tersebut akan meluncur
pada waktu pencucian (Hadioetomo, 1990). Jadi
pemanasan dilakukan dengan suhu yang sesuai.
Pada praktikum ini, pewarnaan kapsul dilakukan
dengan menggunakan sampel susu. Susu diambil dengan
pipet tetes dan diletakkan pada gelas objek yang
sebelumnya sudah dibersihkan dengan alkohol terlebih
dahulu. Preparat kemudian dilakukan fiksasi dengan tujuan
untuk menghambat kapsul meluncur atau ikut terbawa air
saat dilakukan pembilasan. Fiksasi dilakukan secara cepat,
karena waktu fiksasi preparat dapat merusak kapsul
(karena isi kapsul sebagian besar adalah air), maka dengan
pemanasan akan mengaibatkan kapsul mengerut. Apabila
mengerut begitu besar akan berakibat kapsul tidak tampak
(Koesnijo, 1974). Preparat yang sudah difiksasi diberi kristal
violet. Preparat dengan kristal violet kemudian dibilas
dengan air dan setelah itu dilakukan pengamatan
mikroskop dengan perbesaran 10 x 10.
Beberapa jenis bakteri dan sianobakteri mengeluarkan
bahanbahan yang sangat berlendir dan lengket pada
permukaan selnya, melindungi dinding sel. Bila bahan
berlendir tersebut kompak dan tampak sebagai suatu
bentuk yang pasti (bundar atau lonjong) maka disebut
kapsul, tetapi bila tidak teratur bentuknya dan menempel
pada sel kurang erat, maka disebut lapisan lendir.
Kebanyakan bakteri mempunyai lapisan lendir yang
menyelubungi dinding sel seluruhnya. Jika lapisan lendir ini
cukup tebal, maka bungkus itu disebut kapsul. Kapsul
terdiri dari air dan bagian padat yang terlarut (tetapi hanya
sekitar 2%). Bagian yang padat itu terutama adalah
polisakarida dan pada beberapaspesies mengandung
polipeptida atau protein, sebagai contoh: Bacillus authraci,
Pneumococci, Pyogenic streptococci (Hadioetomo, 1990).
Kapsul berfungsi sebagai pelindung terhadap serangan
dari luar, misalnya bacteriophage, colicin (yaitu zat yang
dihasilkan oleh bakteri E. Coli untuk membunuh bakteri
golongan coli lainnya, supaya memungkinkan dirinya hidup
subur tanpa gangguan), dan lysozym. Karena kapsul
sebagai pelindung, maka bakteri dalam kapsul bersifat
aktif, yaitu hidup dan berkembangbiaknya tidak akan
terganggu (Koesnijo, 1974).
Hasil praktikum pewarnaan kapsul seperti yang
terlihat pada Tabel 2.3 dilakukan oleh kelompok 13, 17
dan 18. Bakteri yang digunakan adalah bakteri
Pesudomonas yang terdapat pada sampel susu yang sudah
dipasteurisasi. Pemberian kristal violet pada preparat
sampel berfungsi sebagai decolourisator (penghapus warna
utama) kapsul, sehingga kapsul akan berwarna biru terang,
kontras dengan warna ungu pada sel. Pada sekitaran
dinding sel tersapt lapisan lendir. Kapsul yang terlihat pada
pengamatan mikroskop berbentuk batang pendek dan
tidak berspora.
Tabel 2.4 Hasil Pengamatan Pewarnaan Endospora
Nama Gambar Keterangan
Bakteri
Bacillus cs Bakteri yang
digunakan
bakteri
Bacillus
a. Endospora

Sumber : Jurnal Sains dan Seni Pomits Vol 2 (2) 2337:3520

Pada pewarnaan endospora, reagen yang digunakan adalah
malachite green dan safranin untuk pewarnaan spora. Hasil dari
pewarnaan endospora bakteri dapat dilihat dengan menggunakan
mikroskop menunjukkan warna hijau yang menunjukkan bahwa bakteri
tersebut memiliki endospora. Endospora merupakan struktur yang tahan
terhadap keadaan lingkungan yang ekstrim seperti kering, pemanasan dan
keadaan asam. Endospora berbentuk sangat padat dan refraktil karena
memiliki kandungan air yang sangat rendah. Bakteri yang memliki
endospora sangat sulit diwarnai sehingga dibutuhkan pewarnaan spesifik.
Pewarnaan spesifik dapat menggunakan malachite green. Bakteri yang
menghasilkan spora akan mengikat kuat senyawa pewarna yaitu malachite
green dan ketika dilakukan pewarnaan selanjutnya menggunakan safranin,
sel spora tidak berikatan dengan pewarna lain karena sudah berikatan
dengan malachite green. Bakteri yang tidak memiliki spora cenderung
tidak tahan terhadap pengecatan karena hanya memiliki sel vegetatif.
Sehingga ketika dilakukan pengecatan dengan safranin, warna yang
dihasilkan ketika diamati dengan mikroskop adalah warna merah muda
(Pratita, 2012).
 Endospora (Bacillus dan Clostridium) merupakan struktur bakteri
yang dapat bertahan pada keadaan yang tidak menguntungkan seperti
kekeringan, kekurangan nutrien, pembekuan, suhu yang tinggi, radiasi
serta bahan-bahan kimia beracun (desinfektan, antibiotik). Endospora
merupakan fase tidur dari bakteri dan mampu bertahan sampai kondisi
lingkungan menguntungkan. Kemudian membentuk proses germinasi dan
membentuk bakteri baru. Fungsi dari pengecatan endospora adalah untuk
mengetahui adanya endospora pada bahan pangan. Sehingga dapat
dilakukan tindak lanjut untuk memusnahkannya dan menjamin keamanan
pangan.
Bacillus sp merupakan bakteri termofilik. Bakteri termofilik dapat
dimanfaatkan dalam bidang bioteknologi karena memiliki efisiensi dalam
keadaan suhu tinggi. Semakin tinggi temperatur maka semakin tinggi pula
laju difusi. Selain itu, enzim pada bakteri termofilik juga mampu
mengakatalisis reaksi biokimia pada suhu tinggi dan umumnya lebih stabil
dari bakteri mesofilik. Enzim yang terdapat pada bakteri termofilik juga
dapat dimanfaatkan pada industri antara lain enzim amylase, selulase,
xilanase, kitinase dan protease (Hatmanti, 2000). Protease dapat
digunakan untuk beberapa aplikasi seperti detergen, farmasi, pengempukan
daging dan proses pengolahan limbah industri (Pratita, 2012).
Menurut metode Pratita (2012) pewarnaan endospora yaitu preparat
ulas dibuat pada gelas benda, difiksasi diatas api bunsen. Preparat ditutup
dengan kertas merang dan ditetesidengan malachit hijau, didinginkan.
Preparat diletakkan di atas kawat yang dipanaskan diatas air mendidih
selama 5 menit. Preparat dicuci secara hati-hati dengan air mengalir.
Preparat ditetesi de-ngan menggunakan safranin, didiamkan selama 60
detik, kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan dengan hati-
hati. Preparat diamati dengan mikroskop, uji positif jika sel vegetatif
berwarna merah dan spora berwarna hijau (Misgiyarta, 2002), seperti
terdapat pada Tabel 2.4.
 Pada pewarnaan endospora, reagen yang digunakan adalah malachite
green dan safranin untuk pewarnaan spora. Endospora merupakan struktur
yang tahan terhadap keadaan lingkungan yang ekstrim seperti kering,
pemanasan dan keadaan asam. Endospora berbentuk sangat padat dan
refraktil karena memiliki kandungan air yang sangat rendah. Bakteri yang
memiliki endospora sangat sulit diwarnai sehingga dibutuhkan pewarnaan
spesifik. Pewarna spesifik yang digunakan adalah malachite green. Bakteri
penghasil spora tahan terhadap pewarnaan. Bakteri yang menghasilkan
spora akan mengikat kuat senyawa pewarna yaitu malachite green dan
ketika dilakukan pewarnaan selanjutnya menggunakan safranin, sel spora
tidak dapat berikatan dengan pewarna lain karena sudah berikatan dengan
malachite green. Oleh karena itu warna bakteri spora adalah hijau.
Bakteri yang tidak memiliki spora cenderung tidak tahan terhadap
pengecatan karena hanya memiliki sel vegetatif. Saat diwarnai dengan
malachite, sel vegetatif akan mampu berikatan dengan pewarna tersebut
tetapi dapat dilunturkan setelah dilakukan pencucian karena tidak
berikatan kuat dengan pewarna malachite green. Setelah itu dilakukan
pengecatan dengan menggunakan safranin dan sel vegetatif akan berikatan
dengan pewarna safranin sehingga warna yang dihasilkan ketika diamati
oleh mikroskop akan menunjukkan warna merah muda (Pratita, 2012).
E. Kesimpulan

Berdasarkan hasil praktikum acara II Pengecatan Bakteri dapat

disimpulkan sebagai berikut :

1. Pada pengecatan negatif, Lactobacillus lactis memiliki bentuk

batang dengan warna latar orange.

2. Bakteri gram positif memiliki warna ungu sedangkan bakteri gram

negatif memiliki warna merah. Bakteri Lactobacillus lactis
merupakan bakteri gram positif sedangkan bakteri Pseudomonas
fluorescens merupakan bakteri gram negatif.

3. Ditemukan adanya endospora pada bakteri Bacillus sp. dengan

warna hijau setelah adanya pengecatan.

4. Bakteri Pseudomonas memiliki kapsul yang dapat mengikat warna

ungu.
 DAFTAR PUSTAKA

Alemu, Fekadu dan Tesfaye Alemu. 2013. Antifungal activity of secondary

metabolites of Pseudomonas fluorescens isolates as a biocontrol agent of
chocolate spot disease (Botrytis fabae) of faba bean in Ethiopia. African
Journal of Microbiology Research, Vol. 7 (47) : 5364 5373.
Burrows, William, James William Moulder, Robert Murdoch Lewert dan John
Williard Rippon. 1968. Textbook of Microbiology. W. B. Saunders
Company. London.
Dwidjoseputro, D. 1998. Dasar-dasar Mikrobiologi. Gramedia. Jakarta.
Hadioetomo, Ratna Sri. 1990. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Gramedia
Pustaka Utama. Jakarta.
Hatmanti, Ariani. 2000. Pengenalan Bacillus Spp. Oseana Vol. 25 (1) : 31-32.
Hayama, M., K. Oana., T. Ozakani., S. Umeda, J. Fujimoto, H. Ota, dan Y.
Kawakani. 2007. Proposal of A Simplified Technique for Staining Bacterial
Spores Without Applying Heat-Successful Modification of Moellers Method.
Journal of Medical Research Vol. 12 (1) : 356 358.
Juliantina, Farida R., Dewa Ayu Citra M, Bunga Nirwani, Titis Nurmasitoh dan
Endrawati Tri Bowo. 2009. Manfaat Sirih Merah (Piper crocatum) Sebagai
Agen Anti Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif.
Jurnal Kedokteran dan Kesehatan Indonesia, Fakultas Kedokteran
Universitas Islam Indonesia. Yogyakarta.
Koesnijo. 1974. Kapsula Bakteri dan Fungsinya, Berkala Ilmu Kedokteran
Gadjah Mada Jilid VI (4). Universitas Gajah Mada. Yogyakarta.
Misgiyarta, Sri Widowati. 2002. Seleksi danKarakterisasi Bakteri Asam Laktat
(BAL) Indigenus. Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika
Pertanian Bogor.
Nasikhin, Roksun, dan Maya Shovitri. Isolasi Karakteristik Bakteri Pendegradasi
Solar dan Bensin dari Perairan Pelabuhan Gresik. Jurnal Sains dan Seni
Pomits Vol 2 (2) : 2337 3520. Jurusan Biologi, Fakultas MIPA Institut
Teknologi Sepuluh Nopember. Surabaya.
Pelczar, Michael J., E. C. S. Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Penerbit
Universitas Indonesia. Jakarta.
Pratita, Maria Yuli Indah dan Surya Rosa Putra. 2012. Isolasi dan Identifikasi
Bakteri Termofilik dari Sumber Mata Air Panas di Songgoriti Setelah Dua
Hari Inkubasi. Jurnal Teknik Pomits Vol. 1 (1) : 1 4.
Schichnes, Denise, Jeffery A. Nemson, dan Steven E. Ruzin. 2006. Fluorescent
Staining Method for Bacterial Endospores. Microscope Vol. 54 (2) : 9193.
Schmidt, Karin. 1994. Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada University Press.
Yogyakarta.
Suntoro, S. Handari. 1983. Metode Pewarnaan. Bhratara Karya Aksara. Jakarta.
 DOKUMENTASI

Gambar 2.5 Pemberian Kristal Gambar 2.6 Warna Sampel

Violet pada Sampel Biakan Setelah Diberi Kristal

Violet
Gambar 2.7 Pengolesan Biakan pada

Kaca Preparat Gambar 2.8 Pembilasan Sampel

dengan Aquades