TINCIONES PARA BACTERIAS

Nombre: Naomy Diseree Rivera Cahuana Cdigo: 2014-118008

1) TINCION GRAM

El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las clulas bacterianas

(tanto gram positivas como gram negativas) a travs de la pared bacteriana. El
lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de
potasio) y Sl (Siulterio), los cuales estn presente para solubilizar el yodo, y actan
de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la
pared de la clula bacteriana. El I 2 entra en las clulas y forma un complejo
insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta..

La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin,

ya que en la misma es soluble el complejo I 2/cristal violeta. Los organismos gram
positivos no se decoloran, mientras que los gram negativos s lo hacen.

Para poner de manifiesto las clulas gram negativas se utiliza una coloracin de
contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la
fucsina. Despus de la coloracin de contraste las clulas gram negativas son
rojas, mientras que las gram positivas permanecen violetas.

Colorantes y reactivos :

Solucin violeta de genciana al 1%

Lugol de Gram

Alcohol etlico 95 % o alcohol acetona al 20 %

Solucin de Safranina al 1 %

Procedimiento:
Despus de fijado el frotis a la llama del mechero, colocar la lmina sobre el
puente de coloracin.

1. Verter la solucin de violeta de genciana, hasta cubrir el frotis, dejando que

el colorante actu por espacio de 30 segundos.

2. Lavar la preparacin ligeramente con agua corriente.

3. Echar sobre la preparacin el lugol de Gram., hasta cubrir el frotis dejando

que actu durante 30 segundos.

4. Lavar la lmina con agua corriente.

5. Echar sobre la preparacin el alcohol etlico 95 % o el alcohol acetona al 20

%, hasta que se evidencie que este solvente no extrae ms el colorante
violeta. Esta operacin debe durar aproximadamente de 1 a 2 minutos.

6. Lavar la lmina con agua corriente.

7. Echar sobre la preparacin la solucin de safranina, dejndola actuar por

espacio de 30 segundos.

8. Lavar con agua corriente.

Secado de lmina :

Al concluir el proceso de coloracin, la lmina se debe colocar de canto para que

se escurra. Debe tenerse en cuenta que el agua y en especial, el agua destilada,
es un agente decolorante, por lo que si se deja sobre el portaobjetos despus de
teirlo demasiado tiempo quita parte del colorante. Lo ideal es escurrir la lmina
ponindola de canto y seguidamente secarla con papel de filtro.
 2)

TINCION
ZIEHL NEELSEN

Fundamento
Las
paredes celulares de ciertas bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos)
de cadena larga (50-90 tomos de C) que les confieren la propiedad de resistir a la
decoloracin con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por
esto se denominan cido-alcohol resistentes (o cidorresistentes). Las
micobacterias como Mycobacterium tuberculosis y M. marinum se caracterizan por
sus propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-
Neelsen requiere de calentamiento para que el colorante atraviese la pared
bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento aumenta la energa
cintica de las molculas del colorante lo cual tambin facilita su entrada a las
bacterias. Las bacterias que resisten la decoloracin son de color rojo, sobre un
color azul (que lo provee el colorante de contraste Azul de metileno).

Procedimiento:
a) Frotis
Colocar los frascos con las muestras en orden consecutivo de izquierda a
derecha
Poner las lminas en la mesa (en este caso dentro de la CSB) y numerarlas
con los nmeros correspondientes a las muestras usando 1/3 de la lmina al
reverso (para que al momento de hacer la decoloracin no se borre)
Abrir el frasco de la muestra de manera firme y lenta
Ver el contenido del frasco y obtener la parte ms purulenta
Con un palillo de madera escoger la porcin ms
purulenta/sanguinolenta/slida, no se debe batir demasiado la muestra
 Extender la muestra en un frotis de una capa no muy gruesa (sobre loso 2/3 de
lmina sobrante) sin llegar a los bordes
Si es necesario, desmenuzar las partculas grandes con las puntas del palillo
de madera quebrado por la mitad
Desechar el aplicador en un frasco de boca ancha con alcohol o cloro
Dejar secar el frotis
Tomar la lmina por el extremo numerado con la muestra hacia arriba, pasarla
tres veces por la llama del mechero para fijar el frotis, dejar enfriar el frotis (2-3
min.)

b) Tincin:
Cubrir todo el portaobjeto con fucsina filtrada
Calentar hasta la emisin de vapores (aprox. 5 min.)
Lavar con agua (poniendo la lmina de una manera inclinada para evitar
barrer la muestra) y escurrir
Cubrir con solucin decolorante durante 2 min.
Lavar con agua (poniendo la lmina de una manera inclinada para evitar
barrer la muestra) y escurrir
Cubrir con azul de metileno de 45seg.-1min.
Lavar con agua y luego poner en la tabla de secado (para escurrir)
 3) TINCION FLAGELAR DE LEIFSON

Los flagelos son estructuras, cuyo dimetro no excede de los 30mm, lo cual est
muy por debajo del poder de resolucin del microscpico ptico. Para hacer
visibles a los flagelos se requiere aumentar su grosor, para lo cual se emplea una
suspensin de cido tanico que al precipitarse sobre su cubierta forman una capa
que aumenta aparentemente su dimetro. Lo que propicia que al ser
posteriormente coloreado, tanto los flagelos como su disposicin con respecto al
bacilo se hagan visibles al microscopista.

Colorantes y reactivos

Solucin A:

Fucsina bsica (certificada para colores flagelos) ...........1,2g

Alcohol etlico 95% ......................................................... 100.0 ml

Mezclar y dejar a temperatura ambiente

Solucin B

cido tanico.................................... 1,5g

Cloruro de sodio............................. 0,75g

Agua destilada................................ 100,0 ml

Preparacin

1. Mezclar a volumen iguales A y la B. Ajustar el pH con N aOH/1N.

2. Envasar en alcuotas de 50 ml. Guardar congelado en refrigeracin (Tiempo

de conservacin: 1 mes).

Requisitos a tener en cuenta

Para que la tincin de los flagelos sea efectiva se requiere cumplir con los
siguientes requisitos

Los medios de cultivo empleado para el desarrollo de las cepas deben ser
adecuados.

Los cultivos tienen que ser jvenes.

 Las lminas portaobjetos y cubreobjetos deben estar escrupulosamente
limpias sin el ms mnimo vestigio de grasa.

Las lminas a emplear deben calentarse previamente y enfriarse a la

temperatura corporal, para que los frotis se sequen con rapidez.

Procedimiento

Coloque sobre la mesa de trabajo 3 lminas portaobjetos limpios y

acabados de calentar.

Deposite una gota grande de una suspensin bacteriana joven, procedente

de un cultivo lquido o del agua de condensacin de un cultivo slido, casi al
extremo de cada una de las tres lminas e inclnelas suavemente para que
la gota se deslice (no extender con asa).

Espere a que las lminas se sequen al aire.

Eche sobre cada lmina portaobjetos 1mL del colorante de Leifson y djelo
actuar con un tiempo diferente para cada preparacin. Una de las lminas
por espacio de 8 minutos, la segunda por espacio de 10 minutos y la
tercera 15 minutos.

Lave con agua corriente.

Cubra cada frotis con solucin de azul de metileno 1:1,000 en solucin

acuosa 1:2,000 de borax y deje actuar el colorante por espacio de 10
minutos.

Lave con agua corriente y espere a que las preparaciones se sequen al

aire.
 4) TINCION DE HISS

Fundamento:
La cpsula es una sustancia viscosa producida por algunas especies que la
sintetizan a partir de polipptidos, polmeros de glucosa u otros amino azucares
que contienen nitrgeno, que despus de combinarse con el agua es segregada
por todo el contorno de la pared celular como un moco gelatinoso. Cuando la
cpsula ha sido producida puede observarse en los frotis coloreado por el mtodo
de Gram como un halo incoloro alrededor de la bacteria. Cuando se requiere ver la
cpsula con ms detalle o inducir su produccin se recurre a coloraciones
especiales.

Colorante capsular de Hiss:

Mezclar 5 mL de solucin alcohlica satura de violeta de genciana en 95 mL de

agua destilada.
Procedimiento:
Sobre una lmina portaobjetos mezcle partes iguales del material a teir
con suero especfico. Haga un frotis fino y djelo secar al aire.
Fije la preparacin a la llama del mechero.
Cubra el frotis con el colorante de Hiss.
Proceda a pasar la llama del mechero por debajo de la lmina hasta que el
colorante se caliente y empiece a emitir vapores. Esperar de 5 a 10
segundos.
Lavar el colorante con solucin acuosa de sulfato de cobre al 20%.
Dejar que la preparacin se seque al aire y examinar al microscopio.

5) TINCION WIRTZ-CONKLIN

Fundamento:

Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los
factores ambientales adversos. Adems, estas cubiertas hacen que las esporas
aparezcan en el microscopio ptico como estructuras refringentes y de difcil
tincin.

La tincin especfica de esporas requiere dos colorantes:

a) Verde malaquita: capaz de teir las esporas en caliente.

b) Safranina: colorante de contraste que tie las formas vegetativas.

Las endosporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en el lavado con

agua, y s lo harn las formas vegetativas, que quedarn teidas con el segundo
colorante.

Realizacin
Se emplearn cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias
produzcan las esporas. Esta tincin es delicada en su realizacin y para poder
obtener unos resultados satisfactorios hay que seguir cuidadosamente las
instrucciones.

Preparar los frotis bacterianos indicados.

Teir con verde malaquita. Con unas pinzas

de madera colocar la muestra encima de la
llama del mechero de forma que el colorante
humee durante 5 min.

Lavar con abundante agua el exceso de

colorante.

Teir con safranina 1 min.

Lavar con abundante agua el exceso de

colorante.

Secar la preparacin.

Observar la preparacin al microscopio. Anotar la disposicin y la

morfologa de las tres especies del gnero Bacillus
 6) Tincin de Granulos Metacromaticos

Son estructuras variables presentes en las clulas bacterianas con una funcin,
probablemente, de reserva.
Puede ser de Polimetfosfato, como en Corynebacterium difteriae y otros
difterioides, pueden ser de cido beta amino butrico, o polmeros de glutamato
como en Corynebacteriun Glutmicum.

TINCION DE GM POR METODO DE ALBERT

Colorante de Albert.
Lugol de Albert.
Portaobjetos.
Asa Bacteriolgica.
Goteros
Prepare un frotis con una
colonia de Corynebacterium

Procedimiento
Cubra la muestra con el colorante de Albert por un minuto.
Escrrala placa sin lavar.
Cubra cuidadosamente con Lugol de Albert.
Lave cuidadosamente con agua, escurra y seque con papel secante o al
aire.
Observe al microscopio con aceite de inmersin.
Los grnulos metacromticos se observan de azul oscuro