BIT-170 Laboratorio Bioprocesos 2016

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

ESCUELA DE INGENIERA EN BIOTECNOLOGA

GUA N2. FERMENTACIN DE CULTIVO DE LEVADURA EN

MODALIDAD LOTE ALIMENTADO

1.- Objetivo de la experiencia

Disear y preparar un medio de cultivo para llevar a cabo un cultivo lote alimentado de una
levadura en reactor de 2L (primera parte), adems del monitoreo de la cintica del cultivo a
travs de la generacin de biomasa y el consumo de sustrato a travs de la experiencia
(Segunda parte).

2.- Marco terico

El cultivo por lote alimentado (CLA) o fed batch es una modalidad de fermentacin, cuyas
caractersticas propias hace atractiva su aplicacin a una variada gama de procesos de
fermentacin. Es una operacin discontinua, durante la cual los nutrientes o parte de ellos
ingresan al fermentador por una corriente de alimentacin, y que al no existir una descarga,
provoca una continua variacin del volumen de fermentacin. Las condiciones iniciales de un
cultivo por lote alimentado se logran a travs de una etapa previa obligatoria de cultivo por
lote (CL). Una vez alcanzadas estas condiciones se inicia la alimentacin, lo que marca el
comienzo del CLA.

F SF X: concentracin celular en fermentador (g/L)

V: volumen de caldo en fermentador (L)
S: concentracin sustrato limitante en
fermentador (g/L)
X
SF: concentracin de sustrato en la
VX
alimentacin (g/L)
P: concentracin de producto en fermentador
Vf
S (g/L)
V0 V F: Flujo volumtrico de alimentacin (g/L)
P 0: inicio de CLA
f: trmino de CLA
Figura 1: Representacin esquemtica CLA

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La programacin de la velocidad de alimentacin se hace en funcin de la velocidad de

consumo (demanda del microorganismo), siendo esta definida por las condiciones de
crecimiento impuestas por el proceso que se desea llevar a cabo y puede variar durante el
proceso, de tal modo que es indispensable determinarla con anterioridad para realizar
adecuadamente la programacin de la velocidad de alimentacin (oferta de nutrientes).

Demanda

Oferta

En esta experiencia trabajaremos CLA con velocidad de alimentacin constante, con lo cual F y
SF son conocidos y constantes. Se requiere dividir el CLA en dos zonas de acuerdo al tipo de
crecimiento que experimenta la masa celular (XV). Una zona de crecimiento exponencial de
la masa celular, donde la oferta es superior a la demanda de nutriente limitante y como
consecuencia se tendr una acumulacin de este nutriente en el medio de cultivo, con lo cual
la masa celular crecer a su mxima velocidad especfica (max). A medida que transcurre la
fermentacin la demanda por el nutriente limitante aumentar debido al aumento de masa
celular, y a que la velocidad de alimentacin es constante generndose una zona de
crecimiento limitado de la masa celular, instante en que la demanda o velocidad de consumo
ser igual a la oferta y de all en adelante una vez consumido el sustrato acumulado, la masa
celular tendr que disminuir su velocidad especifica de crecimiento ( M) para adecuar su
velocidad de consumo a la de entrada del nutriente. El tiempo exacto en que se dividen ambas
zonas es denominado Tiempo de transicin (tT).

Zona crecimiento exponencial

Zona crecimiento limitado

Tiempo de Transicin

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Figura 2: Variacin de la masa celular (XV), velocidad especifica de crecimiento (),

concentracin de sustrato (S) en un cultivo por lote alimentado.

2.- Metodologa experimental

1. Disear y preparar el medio de cultivo por lote y el medio de alimentacin.

2. Montaje del reactor y equipamiento asociado.
3. Calibracin de la bomba de alimentacin.
4. Esterilizacin de los medios de cultivo, materiales y reactor. (La fuente de carbono y energa
debe ser esterilizada en forma separada para evitar pardeamiento enzimtico).
5. Inoculacin del medio de cultivo por lote, seguir la cintica hasta alcanzar una
concentracin celular de 2 g/l (cultivo en fase exponencial).
6. Iniciar la alimentacin y monitoreo de la cintica de crecimiento (monitoreo de la
generacin de biomasa y consumo de sustrato limitante) hasta llegar a una concentracin
celular de 6 g/l.
7. Determinar la variacin de la masa celular y masa de sustrato.

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3.- Condiciones operacionales del cultivo

3.1 Condiciones etapa cultivo por lote (CL):

1. Condiciones operacionales: volumen total: 1L, 30C, 200 r.p.m., pH 4,6 (utilizar tampn
citrato 0,1 M)

2. Consideraciones para el diseo del medio de cultivo:

- Se prepara la fuente de carbono para producir un crecimiento celular (X) de 2 g/L

- Se prepara la fuente de nitrgeno para producir un crecimiento celular (X) de 2 g/L,

adicionando un 50% de exceso.

- Se preparan el resto de las sales y el extracto de levadura para producir un

crecimiento celular (X) de 6 g/l adicionando un 50% de exceso (se consideran las
sales necesarias para el cultivo completo: CL + CLA)

3.2 Condiciones etapa cultivo por lote alimentado (CLA):

1. Condiciones operacionales: 30C, 200 r.p.m., pH 4,6 (utilizar tampn citrato 0,1 M),
aireacin 1 vvm

- Volumen Inicial: 1L
- Volumen Final: 2L
- Flujo de alimentacin: 7 ml/min

2. Consideraciones para el diseo del medio de alimentacin:

- Se prepara la fuente de carbono para producir un crecimiento celular (X) de 6 g/L

- Se prepara la fuente de nitrgeno para producir un crecimiento celular (X) de 6 g/L,

adicionando un 20% de exceso.

- Se considera que la biomasa inicial (Xo) de la etapa de lote alimentado es de 2 g/l

- Se considera el consumo completo del sustrato limitante (S) en el cultivo por lote
alimentado.

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4.- Metodologa analtica

4.1.- Determinacin de concentracin de biomasa mediante peso seco y turbidimetra

Mtodo: Gravimtrico y turbidimtrico.

Principio: La cuantificacin por peso seco se realiza determinando en una balanza analtica la
masa de una muestra de levadura previo secado completo de esta a 105C. Al tratarse de una
suspensin homognea de clulas, es posible cuantificar la capacidad de absorcin de luz la
muestra utilizando un haz de luz de 650 nm.

Procedimiento:

Curva de calibrado:

De un cultivo en matraz se toman por triplicado 20 ml de caldo de cultivo en tubos o capachos

de centrfuga.

Posteriormente, las muestras se centrifugan a 10.000 r.p.m. por 5 minutos, retirando el

mximo sobrenadante, evitando tomar biomasa. El pellet obtenido es lavado 3 veces con agua
destilada, con el objeto de obtener una biomasa celular sin medio del cultivo.

Luego del ltimo lavado, el pellet obtenido en el fondo del tubo de centrfuga es resuspendido
en un pequeo volumen de agua destilada. En este punto se usa un vrtex para homogeneizar
y asegurar una resuspencin total de la biomasa.

Posteriormente la biomasa es trasladada, en su totalidad, a un capacho de papel aluminio que

es previamente secado durante 12 hrs. a 105C, enfriado en desecadora y determinado su
peso en una balanza analtica.

Las muestras obtenidas son secadas en estufa a 105C durante 24 hrs, luego se enfran en la
desecadora y se llevan nuevamente a la estufa por 2 hrs. ms para asegurarnos obtener un
peso constante. La masa celular se obtiene por diferencia de masas con respecto al capacho
portador.

La concentracin celular se calcula dividiendo la masa celular en gramos por el volumen inicial
centrifugado, en litros.

Luego se toman muestras del mismo cultivo y convenientemente se diluyen en 10 volmenes

distintos y se determina la absorbancia de cada una de ellas utilizando para ello el
espectrofotmetro a una longitud de onda de 650 nm. (Para el blanco se reemplaza el cultivo
por agua destilada).

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Con los datos obtenidos por espectrofotometra se correlaciona con la concentracin celular
correspondiente, con lo cual se obtiene la curva de calibrado.

Determinacin de la concentracin celular de una muestra

Un volumen de 1 ml de muestra es tomado para medir su densidad ptica. Si no se encuentra

dentro del rango de valores de confianza (0.100-0.600) o no se encuentra en un rango lineal,
es diludo y posteriormente leda su absorbancia a una longitud de onda de 650 nm.

El valor de concentracin celular se interpola de la curva de calibrado.

4.2. Determinacin de concentracin de sustrato limitante (glucosa) mediante mtodo DNS

Mtodo: Turbidimtrico.

Principio: Mediante el mtodo de DNS se detecta la presencia del grupo carbonilo libre (C=O)
propio de los azcares reductores. Este involucra la oxidacin del grupo aldehdo de la
glucosa. Simultneamente, el cido 3,5-dinitrosaliclico es reducido al cido 3-amino, 5
nitrosaliclico, bajo condiciones alcalinas, la cual es detectada espectrofotomtricamente.

Procedimiento:

Preparacin del reactivo DNS (100 ml):

1. Disolver 1,6 g de NaOH con 50 mL de agua destilada

2. Adicionar 30 g de tartrato de sodio y potasio.
3. Agregar lentamente 1 g de DNS (cido dinitrosaliclico), agitando bajo calentamiento.
4. Aforar a 100 mL con agua destilada.
5. Almacenar a temperatura ambiente protegido de la luz.

Medicin:

1. Toma una muestra de cultivo de 2 ml, se separan las clulas mediante centrifugacin a
10000 r.p.m. durante 15 minutos; luego se toma 1 ml del sobrenadante y se diluye en
agua destilada.

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2. Agregar a un tubo de ensayo con tapa rosca 1 mL de muestra del punto anterior y 1 mL de
reactivo DNS.
3. Dejar en un bao de agua a ebullicin durante 15 minutos.
4. Enfriar en un bao de hielo por 5 minutos.
5. Adicionar 10 mL de agua destilada.
6. Dejar reposar 15 minutos a temperatura ambiente
7. Leer en espectrofotmetro a 540 nm contra un blanco
8. Blanco reemplazar muestra por agua destilada (1mL)

Curva de calibrado:

La curva de calibrado se obtiene aplicando el mismo protocolo descrito a distintas soluciones

de glucosa obtenidas por dilucin de una solucin estndar de glucosa de 2 g/L.

5.- Equipos y materiales requeridos.

pHmetro
Estufa
Shaker o agitador orbital
Espectrofotmetro
Centrifuga para tubos de 50 mL
Centifuga para tubos eppendorf
Desecadora
Balanza granataria
Balanza analtica
Vrtex
Tubos eppendorf 2 mL
Gradilla para tubos eppendorf
Mangueras esterilizables n 13
Celdas plsticas para espectrofotmetro de 2 mL
10 Capachos de centrifuga de 50 ml (tubos falcon)
1 placa agitadora con calefaccin
2 barra magntica.
2 esptulas
1 Probeta de 100, 500 mL y 1L
2 Vasos precipitados de 100, 250 mL, 500 mL y 1 L.
1 Matraz de aforo de 500 mL
1 Matraz de aforo de 250 mL
1 Matraz de aforo de 100 mL.

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1 frasco Duran Schott de 2 L

2 Matraces erlenmeyer de 1 L
2 matraces erlenmeyer de 250 mL
50 tubos de ensayo con tapa rosca de 10 mL con gradilla
5 pipetas de 1mL
5 pipetas de 5 mL
5 pipetas de 10 mL
1 Propipetas (para pipeta de 1 mL)
2 Micropipeta graduada de 100 a 1000 ul
Pipetas azules de 1000 ul
1 Mechero, trpode y placa de asbesto.
1 Plumn indeleble.
1 cinta maskin tape
Papel aluminio
Tijera
Algodn hidrfobo
Gasa
Guantes

6.- Reactivos (stock 1 Kg cada uno).

Sulfato de amonio.
Sulfato de magnesio.
Fosfato de potasio.
Cloruro de calcio.
Sulfato de hierro.
cido ctrico.
Hidrxido de sodio.
Tartrto de sodio y potasio
Acido dinitrosalicilico (DNS)
Acido clorhdrico
Extracto de levadura
Glucosa
Agua destilada
Hielo