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USO DE LA CMARA NEUBAUER

I. INTRODUCCIN

La cmara de Neubauer es un instrumento utilizado en medicina y


biologia para realizar el recuento de clulas en un medio liquido, que
puede ser un cultivo celular, sangre, orina, liquido sinovial, liquido
cefalorraquideo, etc, por lo cual el alumno deber desarrollar la
habilidad de enfocar de forma correcta la camara de Neubauer.

Esta cmara de contaje est adaptada al microscopio de campo claro


o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos que tiene dos
zonas ligeramente deprimidas y que en el fondo de las cuales se ha
marcado con la ayuda de un diamante una cuadrcula de dimensiones
conocidas. Se cubre la cmara con un cubrecmaras que se adhiere
por simple tensin superficial.

Luego se introduce el lquido a contar, al que generalmente se ha


sometido a una dilucin previa con un diluyente, por capilaridad entre
la cmara y el cubrecmara; puesto que tiene dos zonas esto permite
hacer dos recuentos simultaneamente. Para contar las clulas se
observa el retculo al microscopio con el aumento adecuado y se
cuentan las celulas.

Con base en la cantidad de clulas contadas, conociendo el volumen


de lquido que admite el campo del retculo, se calcula la
concentracin de clulas por unidad de volumen de la muestra lquida
inicial.

II. OBJETIVOS

Aprender a utilizar la cmara Neubauer , y similares para el


recuento de levaduras.

Realizar el recuento de Microorganismos

Conocer el funcionamiento general de la cmara neubauer.

III. FUNDAMENTO TERICO

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III.1. DEFINICIN

La cmara de Neubauer es una cmara de contaje adaptada al


microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata
de un portaobjetos con una depresin en el centro, en el fondo
de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una
cuadrcula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de
3 x 3 mm, con una separacin entre dos lineas consecutivas de
0.25 mm. As pues el rea sombreada y marcada L corresponde
a 1 milimetro cuadrado. La depresin central del cubreobjetos
est hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que
cuando se cubre con un cubreobjetos ste dista de la superficie
marcada 0.1 milmetro, y el volumen comprendido entre la
superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milmetro cbico, es
decir 0.1 microlitro.

El clculo de la concentracin de clulas se puede expresar as:

Partculas / l = (partculas contadas) / [ (superficie contada


(mm)profundidad de la cmara(mm) ] dilucin

Reticulo Neubauer.jpg

En la retcula central, la cmara de Neubauer tiene un


cuadrado primario que contiene nueve cuadrados secundarios,
cada uno de ellos dividido a su vez en 16 cuadrados terciarios.
El cuadrado secundario central contiene no 16, sino 25
cuadrados, cada uno de ellos dividido a su vez en 16 cuadrados
cuaternarios. En los bordes de este cuadrado central se
cuentan los hemates, utilizando slo los cuadrados de los
bordes del terciario central y uno de los centrales. En los
secundarios de los bordes superiores e inferiores de la cmara
se hace el recuento leucocitario.

NOTA: Adems del recuento de levaduras en placa el mtodo


de recuento con la cmara Neubauer es bastante til. Para
realizar un buen recuento, es necesario teir la muestra para
distinguir las clulas viables vivas de las muertas. Las muertas
son las que se tien. Los colorantes que se pueden utilizar son:
azul de tripn, azul de metileno o rodamina. La cmara consta
de un campo central o fondo de la cmara donde estn
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grabadas dos cuadrculas de recuento, que estn separadas
una de otra por una ranura. El fondo de la cmara del campo
central es de 0,1 mm ms bajo esto es la profundidad de la
cmara.

III.2. CARACTERISTICAS

En la Cmara de Neubauer
tradicional, est dividido en 16
cuadrados medianos y cada uno
de ellos se halla dividido a su vez
en 25 cuadrados pequeos (400
cuadrados pequeos en total).
Adems la ltima fila y la ltima
columna de cuadrados pequeos
est dividi-da al medio.

En cambio, en la cmara de
Neubauer modificada el cuadrado
grande central est dividido en 25 cuadrados medianos y cada
uno de ellos est dividido en 16 cuadrados pequeos (400
cuadrados pequeos en total). Cualquiera sea la cmara
empleada, este cuadrado grande central es el empleado en el
recuento eritrocitario y plaquetario.

III.3. RECUENTO CELULAR

Para realizar el recuento celular, debe colocarse el cubreobjetos


sobre el portaobjetos de esta cmara e introducir entre ambos
la muestra celular previamente preparada. Debe evitarse que
la muestra rebalse, porque si esto sucede las clulas a contar
tambin se perdern. La velocidad de llenado de la cmara
debe ser homogneo, evitando as una mala distribucin de las
clulas en el preparado que traer aparejado errores en el
recuento.

La muestra no debe secarse, por lo tanto es recomendable


guardar la cmara de Neubauer cargada dentro de una cmara
hmeda para que sedimenten las clulas. Luego se coloca la
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cmara en un microscopio ptico y se procede al conteo,
eligiendo para ello los cuadrados apropiados. Se debe elegir un
criterio para definir qu clulas se cuentan y cules no, cuando
las mismas quedan sobre uno de los bordes del cuadrado.

Una vez contadas las clulas se calcula la concentracin en la


muestra original, considerando: la dilucin de la muestra hecha
para el sembrado, la cantidad de cuadrados considerados, el
nmero de clulas contadas y el volumen de muestra debajo
de cada cuadrado.

IV. MATERIALES Y MTODOS

Bata de laboratorio.

Guantes de latex.

Microscopio compuesto o fotonico.

Cmara de Neubauer.

V. PROCEDIMENTO

Preparacin de la muestra:
Lavar la cmara y el cubre con agua destilada y alcohol de 96%.
Secar bien con papel suave.
Poner el cubreobjetos encima de la cmara.

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Homogenizar removiendo bien el cultivo en donde residen las
levaduras.
Tomar con pipeta una muestra.
Poner la punta de la pipeta en una de las dos ranuras de la cmara y
por capilaridad, las levaduras se distribuirn en la cmara.
Si se crea una cmara de aire repetir la operacin desde el principio.
Fijar la cmara de recuento en la platina del microscopio para realizar
la observacin microscpica.
Esperar unos minutos antes de contar para que las levaduras se
depositen en la cmara.
Preparativos del microscopio:
El enfoque del microscopio se empieza con el objetivo de menor
aumento que posteriormente pasaremos a uno de ms. Se centra el
objetivo del microscopio a ojo en el centro terico de la cruz de la
cmara, luego se coloca el objetivo lo ms cerca posible del
cubreobjetos pero sin tocarlo y posteriormente se ir alejndolo hasta
que la imagen sea la ms clara y ntida posible. Se aconseja trabajar
a 400 aumentos.
Para contabilizar las levaduras totales se aconseja siempre hacer la
media de levaduras contenidas en varios grupos de cuadros.
Las cmaras tienen 400 cuadrados tiles.

Preparacin Esterilizar los


de muestras materiales

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Observacin
Contabilizar las
en muestras
microscopio
VI. CONCLUSIONES

El conteo en cmara es efectivo, siempre y cuando se realice con


una muestra, para no realizar este conteo con muchas muestras de
concentracin desconocida podemos valernos de una curva patrn,
leyendo muestras ya contabilizadas en un espectrofotmetro, as al
leer Abs. De una mezcla podemos determinar la concentracin por
interpolacin en la curva patrn.

Al obtener diferentes muestras en relacin al tiempo con las que


construimos la curva patrn tambin calcular la velocidad de
reproduccin y as utilizar los M.O.en procesos estandarizados.

Factores como la homogenizacin de y /o de la muestra o azul


tripn, resuspensin de la muestra, exactitud y presin de los
volmenes tomados por las micropipetas, y la destreza de la
persona para contar las clulas pueden afectan los resultados, por
lo que son muy importantes estos aspectos, para obtener
resultados confiables. Se consider que los factores anteriores
fueron controlados adecuadamente dentro de lo posible (calibracin
dudosa de las micropipetas) pero lo resultados estn dentro de un
rango aceptable.

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VII. BIBLIOGRAFIA

1. Tecnicas y mtodos de laboratorio clnico. Gaonzales de


Buitrago J. 2004 Segunda edicin. Ediciones Masson. Barcelona,
Espaa. parte III, pag.278-279

2. Anatomia patolgica. Steves A, Lowe J. 2001 segunda edicin al


espaol. Ediciones Harcourt, Madrid Espaa. Capitulo 15,
enfermedades de los ganglios linfticos, Pag 310-311.

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