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Biotecnologa
Gua de clases tericas y problemas
Clase II
Licenciatura y Tecnicatura en Biotecnologa
1er Cuatrimestre 2017
- Programa Clase II
- Problemas Clase II
Programa Clase 2
Primera Parte
Comportamiento de sedimentacin:
El coeficiente de sedimentacin y el peso molecular de muestras de ADN se pueden
determinar por los mtodos ultracentrifugacin. Los pesos moleculares pueden
establecerse por comparacin de las velocidades de sedimentacin en un gradiente
de densidad de sacarosa, con la velocidad obtenida con una muestra de ADN de
tamao y coeficiente de sedimentacin conocidos.
La sedimentacin en equilibrio en gradientes de CsCl, se utiliza en la determinacin
de la densidad de flotacin de las molculas de ADN. Cuando una disolucin de
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Efecto hipercrmico:
El cambio fsico ms fcil de utilizar como medida de la desnaturalizacin del ADN
es el incremento de la absorcin luminosa observada a 260 nm y que se denomina
efecto hipercrmico. Las bases pricas y pirimidnicas as como sus
correspondientes nucletidos absorben la luz ultravioleta a 260 nm, sin embargo
el ADN doble cadena nativo absorbe mucha menos luz a 260 nm, de la que podra
predecirse por la suma de la luz absorbida por sus mononucletidos constituyentes.
Desnaturalizando el ADN de doble cadena nativo por calentamiento se observa un
gran incremento de la absorcin lumnica a 260 nm que puede llegar hasta un 40 %
segn la muestra. El total de luz absorbida por un ADN completamente
desnaturalizado es casi igual al de un nmero equivalente de los correspondientes
mononucletidos libres. El porcentaje de aumento de absorcin lumnica
inducido por calentamiento de una muestra de ADN nativo se halla
directamente relacionado con su contenido en pares de bases A-T, cuanto
mayor es la proporcin de pares A-T mayor es el incremento de absorcin
lumnica.
La absorcin lumnica, menos que aditiva, de las molculas de ADN de doble hlice
que se denomina hipocromismo se debe a las interacciones electrnicas entre las
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Kornberg investig las caractersticas estructurales del ADN preformado, que son
esenciales para la actuacin de la altamente purificada ADN polimerasa I de E coli.
Es significativo que el ADN duplohelicoidal nativo e intacto del que cabra esperarse
actuara como patrn para la replicacin, sin embargo no apoya la sntesis de ADN
En cambio los ADNs desnaturalizados, especialmente aquellos cuyas dos cadenas
estan, en su mayor parte separadas, son activos como patrones. Por otra parte todos
los ADNs desnaturalizados de muy diversos orgenes pueden sustentar la actividad
de la ADN pol I de E coli. Tambin se muestran activos aquellos ADNs doble cadena
que tienen una cadena mellada (se define como una rotura que produce la existencia
de un grupo 3 prima libre y otro 5 prima libre, situados en restos adyacentes), as
como los ADNs doble cadena que poseen un hueco o o brecha en una de sus cadenas.
El ADN monocatenario puede apoyar tambin la accin de la ADN polimerasa
porque puede formar una horquilla de extremos desiguales con formacin de un
dplex intracatenario.
A partir de tales experimentos se ha llegado a la conclusin de que el ADN
preformado ejerce dos funciones en la accin de la ADN polimerasa I: es requerido,
a la vez como patrn y como cebador. La enzima requiere la presencia de una
cadena de ADN que tenga un hidroxilo 3 prima libre, al cual se adicionan los
nuevos restos nucleotdicos para extender la cadena en direccin 5 prima 3
prima. A dicha cadena se la denomina cadena cebadora, (primer) y al nucletido 3
prima terminal se le designa terminal cebador.
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Conceptos
Las protenas son cadenas de aminocidos ligados por uniones peptdicas
Estructura secundaria
Configuracin espacial:
Alfa hlice
Forma de cilindro, la secuencia de aminocidos se enrolla sobre un cilindro
imaginario por formacin de puentes de hidrogeno ntrelos grupos NH2 de unos
aminocidos con los grupos carboxilo de otros situados cuatro posiciones ms
adelante en la misma cadena
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Estructura terciaria
Es consecuencia de plegamiento de las estructuras secundarias generando una
conformacin tridimensional ms compleja
El plegamiento se origina porque aminocidos ubicados en lugares distantes entre
s, en la cadena se relacionan qumicamente. Segn este plegamiento se originan
protenas fibrosas o globulares.
Dominio funcional: lleva a cabo una funcin bioqumica ejemplo sitio hemo de la
hemoglobina o sitio cataltico de una enzima.
Dominio estructural componente estable de la estructura.
Uniones no covalentes son las uniones dbiles tipo ptes de H, uniones inicas o
electrostticas, interacciones hidrofbicas e interacciones de Van der Waals.
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Las protenas tienen cargas positivas y negativas pero en el pto. Isoelctrico la carga
neta es cero. El pH del medio en el cual se encuentra una dada protena es el que
dar su carga de acuerdo a como estn ionizados los distintos grupos de los aa.
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Debe considerarse que las enzimas aisladas del contexto celular tambin cumplen
la funcin catalizadora ah radica su importancia desde el pto de vista
biotecnolgico.
Como por ejemplo; las celulasas en la fabricacin de papel y jugos de frutas,
proteasas, nucleasas que cortan cidos nuclecos, entre otras.
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Clase 2 problemas
1-Desnaturalizacin: 30 seg a 94 C
2-Apareamiento: 60 seg a 42 C
3- Extensin: 120 seg a 72 C
Preguntas:
Cul es el tamao en pares de bases del producto de PCR?
Cul es el peso molecular del producto de PCR? Dato: 1 par de bases pesa
650 Daltons
Cul sera el producto de PCR si se omitiera:
Uno de los primers?
Los dos primers?
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El ADN molde?
7. Cules de estas son necesarias para formar una hlice o una hoja plegada
?
10. Mencione las caractersticas de las enzimas. Defina: sustrato, producto, sitio
activo, energa de activacin, cofactor.
11. Dibuje un esquema de una protena con tres dominios estructurales y otra
con tres subunidades.
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