DTPa-HBV-IPV+Hib (Nombre comercial: Infarix Hexa)

V201502667 VAR
Multiproductos_CONFORMIDAD_Infarix_Boostrix
_Pa Granel

Internacional

Esta declaracin es CONFIDENCIAL y de la propiedad del grupo de compaas GlaxoSmithKline.

Contiene informacin de la propiedad y secretos comerciales y es presentada a la autoridad regulatoria

para el solo propsito de autorizar el producto identificado. La reproduccin, divulgacin o uso de la
presentacin o informacin contenida en la misma, en su totalidad o en parte salvo que para el propsito
mencionado se prohba al menos a la solicitud expresada o con el consentimiento escrito del solicitante.

Marzo 2017
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DTPa-HBV-IPV+Hib (Nombre comercial: Infarix Hexa) Granel Internacional

Pa

S.2.2 Descripcin del Proceso de Fabricacin y el Control del Proceso

Informacin General y Diagrama de Flujo
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1. RESUMEN DEL PROCESO Y DIAGRAMA DE FLUJO

Produccin de los antgenos de la pertussis acelular (aP) (toxina de la pertussis desintoxicada (PT),
hemaglutinina filamentosa tratada con formaldehido (FHA), pertactina tratada con formaldehido (PRN o
69 kDa protena fuera de la membrana (OMP)) puede dividirse en las siguientes etapas:
Fermentacin
Extraccin
Purificacin
Desintoxicacin
Absorcin
Almacenamiento

Los antgenos de pertussis acelulare se purifican a partir de bacterias de Bordetella pertussis. La

separacin de los tres antgenos se logra aadiendo el caldo de fermentacin al gel de hidroxiapatita que se
une a los antgenos PT y FHA, dejando el antgeno PRN en el caldo de fermentacin. Mltiples etapas de
extraccin y purificacin conducen al aislamiento de cada antgeno, estril y purificado. A continuacin se
realiza un proceso de desintoxicacin en cada antgeno. Finalmente, la los antgenos desintoxicados se
adsorben por separado en el coadyuvante de hidrxido de aluminio.

Un diagrama de flujo del proceso de produccin del granel purificado absorbido del PT, FHA y PRN se
proporciona en la Figura 1 y Figura 2. Una descripcin detallada del proceso se proporciona a
continuacin.

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CONFIDENCIAL
Pgina 1

Resumen del proceso y diagrama de flujo aP Pgina 81

Pa
S.2.2 Descripcin del Proceso de Fabricacin y del Control de Proceso
Informacin General y Diagrama de Flujo
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Figura 1. Diagrama de flujo para la produccin del granel purificado de PT; FHA y PRN fermentacin, extraccin, extraccin,
purificacin

Escala del tiempo

(mnima)*

Da 1 Fermentacin
Pre-cultivo de matraz Pruebas durante el proceso
Pruebas durante el proceso
Pre-cultivo fermentador del tamao intermedio
Cultivo fermentador Pruebas de liberacin de QC/en el proceso
Da 7
Extraccin
Ajuste del pH
Da 8 Absorcin en el lote
PT + FHA en gel de hidroxiapatita PRN
(Fraccin del gel) (Supernadante)

Ajuste del pH Pruebas durante el proceso

Lavado en la columna Floculacin y lavado Pruebas durante el proceso
y elucin Tratamiento de calor Pruebas durante el proceso
Da 8 Filtracin Clarificacin Pruebas durante el proceso
Pruebas durante el proceso
Da 10 Filtracin Pruebas durante el proceso
Purificacin Purificacin
Ajuste de pH Cromatografa de intercambio de iones Pruebas durante el proceso
Interaccin hidrofbica Ajuste de pH
Cromatografa Pruebas durante el proceso Interaccin Hidrofbica
Afinidad cromatogrfica Pruebas durante el proceso Cromatografa Pruebas durante el proceso
Cromatografa de tamao de exclusin Pruebas durante el proceso Precipitacin del Sulfato de Aluminio Pruebas durante el proceso
Cromatografa del tamao de la exclusin Pruebas durante el proceso
Da 10 PT Purificado + FHA purificado Da 13 PRN purificado
Dilucin Pruebas durante
Pruebas durante el
el proceso
proceso Dilucin
Filtracin estril Pruebas durante el proceso
Filtracin estril
Granel de PT purificado antes de la desintoxicacin
Granel de FHA purificado antes de la desintoxicacin Granel de PRN purificado antes de la desintoxicacin
Pruebas de liberacin QC
Pruebas de liberacin QC

*Escalas de tiempo del proceso mnimo se reportan solamente para informacin; escalas del tiempo del proceso podran variar en la rutina de acuerdo a los tiempos de espera validados
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CONFIDENCIAL
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Figura 2 Diagrama de flujo del Proceso de la produccin del granel purificado para PT, FHA y PRN desintoxicacin, adsorcin,
almacenaje

Escala de tiempo
(Mnima)*

Granel de PT purificado antes de la desintoxicacin Granel deFHA purificado antes de la desintoxicacin Granel de PRN purificado antes de la desintoxicacin

Desintoxicacin
(Mnima)*
Desintoxicacin de la toxina PT Tratamiento de FHZ/PRN formaldehido
(Mnima)*

Da 10 Tratamiento de Da 10 Tratamiento de Da 13 Tratamiento de

glutaraldehdo y glutaraldehdo y glutaraldehdo y
Formaldehido Formaldehido Formaldehido
Homogenizacin y Da 18 Homogenizacin y Da 21 Homogenizacin y
Da 18 tamizado tamizado tamizado
Ultrafiltracin Ultrafiltracin Ultrafiltracin

Granel de PT purificado antes de la desintoxicacin Granel deFHA purificado antes de la desintoxicacin Granel de PRN purificado antes de la desintoxicacin

Prueba de liberacin de QC Prueba de liberacin de QC

Prueba de liberacin de QC

(Mnima)* (Mnima)*
(Mnima)*

Adsorcin Da 19 Adsorcin Da 22 Adsorcin

Da 19
(Mnima)* (Mnima)* (Mnima)*
Ajuste de pH Ajuste de pH Ajuste de pH
Granel absorbido de PT Granel absorbido de FHA Granel absorbido de PRN
(Mnima)* (Mnima)* (Mnima)*
Pruebas durante el proceso Pruebas durante el proceso Pruebas durante el proceso

Almacenamiento Da 20 Almacenamiento Da 22 Almacenamiento

Da 20
(Mnima)* (Mnima)* (Mnima)*

*Escalas de tiempo del proceso mnimo se reportan solamente para informacin; escalas del tiempo del proceso podran variar en la rutina de acuerdo a los tiempos de espera validados
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1.1. Fermentacin
El procedimiento de fermentacin consiste en cultivar material de siembra en etapas de pre-cultivo
consecutivas de escala creciente (matraces de 50 ml, 500 ml y 5 litros), para amplificar clulas bacterianas
y, finalmente, inocular fermentadores de escala creciente (20L, 100L y 800L), tal como se presenta en la
Figura 1 Diagrama de flujo para el paso de fermentacin aP (escala de 3 x 800L) a continuacin. El
proceso se controla, en particular, midiendo la densidad ptica del cultivo. Los tres antgenos (PT, FHA y
PRN) no siempre se procesan a partir de cada prueba de fermentacin.

Figura 1 Diagrama de flujo para el paso de fermentacin aP (escala de 3 x 800L) muestra el esquema de
fabricacin para las sucesivas etapas de fermentacin aP a una escala de 3 x 800L.

Figura 1 Diagrama de flujo para el paso de fermentacin aP (escala de 3 x 800L)

Semillas de trabajo

Matraz Erlenmeyer de 50 mL

Matraz Erlenmeyer de 500 mL

Matraz Erlenmeyer de 5 L

Fermentador de 20 L

Fermentador de 100 L
Respaldo Respaldo Respaldo

Fermentador de 800 L

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Fermentacin aP Pgina 84
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Pasos del Pre-cultivo en Matraz Pa

S.2.2 Descripcin del Proceso de Fabricacin y Control del Proceso
Fermentacin

1.1.1

Se descongela un vial de semilla de trabajo a temperatura ambiente y se aade el inculo al medio lquido
modificado Stainer-Scholte (SS) (composicin descrita en S.2.3 materia prima Pa: Seccin 1.1.1) en dos matraces de
50 ml. El crecimiento es monitoreado. En el siguiente paso, se inocula una alcuota de cada pre-cultivo previo en dos
matraces ms grandes (500 ml) que contienen medio lquido modificado SS, y se monitoriza el crecimiento.
Finalmente, una alcuota de cada uno de los ltimos pre-cultivos se inocula en tres matraces ms grandes (5L) que
contienen medio SS modificado, y se deja incubar.

La Tabla 1 a continuacin proporciona una visin general del proceso, resumiendo el equipo y los parmetros del
proceso pertinentes

Tabla 1 Etapas de pre-cultivo en los parmetros del proceso de matraces.

Pasos del Proceso Equipo y Parmetros del proceso Objetivo Intervalo

Volumen del matraz (mL) 50 N/A
Pre-cultivo lquido 1 en matraz de 50 ml Volumen de inoculacin WS (mL) 0.100(1) 0.005
Volumen del cultivo (mL) 7.5 0.1
Temperatura (C) 35 1
Final del criterio del cultivo (OD650nm) 1.5 0.5
Volumen del matraz (mL) 500 N/A
Comenzando OD650nm (utilizados como 0.04 N/A
Pre-cultivo lquido 2 en matraz de 500 ml una medida para calcular el volumen del
inoculo)
Volumen del cultivo (mL) 100 1
Temperatura (C) 35 1
Final del criterio del cultivo (OD650nm) 1.5 0.5
Volumen del matraz (L) 5 N/A
Comenzando OD650nm (utilizados como 0.04 N/A
Pre-cultivo lquido 3 en matraz de 5 L una medida para calcular el volumen del
inoculo)
Volumen del cultivo (L) 1 N/A
Temperatura (C) 35 1
Final del criterio del cultivo (OD650nm) 24 4
(1)
Es posible que sea necesario adaptar el volumen si se utiliza una nueva semilla de trabajo

1.1.2. Etapas de pre-cultivo en fermentadores de tamao intermedio

El contenido total de dos matraces de 5L se agrupa para inocular un fermentador pre-esterilizado de 20L. El
crecimiento es permitido y controlado. Los cultivos se transfieren luego a un (os) fermentador(es) pre-esterilizado (s)
de tamao intermedio (100L) que contiene medio estril modificado SS.

Se utilizan rompedores mecnicos de espuma durante el pre-cultivo en fermentadores de tamao intermedio.

La Tabla 2 a continuacin proporciona una visin general del proceso, resumiendo los parmetros relevantes del
equipo y del proceso.

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Fermentacin aP Pgina 85
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S.2.2 Descripcin del Proceso de Fabricacin y Control del Proceso
Fermentacin

Tabla 2 Pre-cultivo en fermentadores de tamao intermedio - Parmetros del proceso

Pasos del Proceso Equipo y Parmetros del proceso Objetivo Intervalo

Volumen del inoculo (L) 2x1.0 N/A
Volumen del Cultivo (L) 13 0.5
Pre-Cultivo en 20 L- Fermentador Temperatura (C) 35 1
DO* (%) 25 15
Fin del cultivo, por OD o por 1.2 >1.0
duracin del cultivo (h) N/A 8-12
Volumen del inoculo (L) 15 0.5
Volumen del Cultivo (L) 50 2
Pre-Cultivo en 100 L- Fermentador Temperatura (C) 35 1
DO* (%) 25 15
Fin del cultivo, por OD o por 1.2 >1.0
duracin del cultivo (h) N/A 8-16
*OD- Oxgeno Disuelto

El contenido de un fermentador de 100L se transfiere a un fermentador pre-esterilizado (800L) que

contiene medio SS modificado estril. La fermentacin 800L es la ltima fermentacin. Se utilizan
rompedores mecnicos de espuma durante el crecimiento en fermentadores. Al final de la fermentacin, el
caldo se enfra antes de la extraccin.

La Tabla 3 a continuacin proporciona una visin general del proceso, resumiendo los parmetros
relevantes del equipo y del proceso.

Tabla 3 Crecimiento en los parmetros del proceso del recipiente de fermentacin

Pasos del Proceso Equipo y Parmetros del proceso Objetivo Intervalo

Volumen del inoculo (L) 65 2
Volumen del Cultivo (L) 515 10
Fermentacin en 800 L- Fermentador Temperatura (C) 35 1
pH* 7.2 0.2
DO** (%) 25 0-40
Velocidad de agutacin (rpm) N/A 0-210
Duracin del cultivo (h) N/A*** 25-40
* PH mantenido por adicin peridica de cido actico al 50% (composicin descrita en S.2.3 materias primas Pa:
Seccin 1.1.2)

** DO - oxgeno disuelto: mantenido slo hasta 210 rpm se alcanza la velocidad de agitacin

*** La fermentacin de 800L finaliza cuando el medio se agota o se detiene antes del final del intervalo de duracin
validado

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Fermentacin aP Pgina 86
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Extraccin y Purificacin

TABLA DE CONTENIDO

PGINA
1. EXTRACCIN............ 3
1.1 Lote de adsorcin en hidroxiapatita 3
1.2 Extraccin de PT y FHA. 3
1.3 Extraccin de PRN.. 4
1.3.1 Floculacin del Cloruro de Bario.. 4
1.3.2 Tratamiento de Calor 5
1.3.3 Clarificacin... 5

2. PURIFICACIN. 6
2.1 Purificacin de PT y FHA 6
2.1.1 Cromatografa de Interaccin Hidrofbica (HIC) 6
2.1.2 Cromatografa de Afinidad 6
2.1.3 Cromatografa de Exclusin de Tamao (SEC) 7
2.1.4 Dilucin y filtracin estril 8
2.2 Purificacin de PRN 8
2.2.1 Cromatografa de Intercambio de Iones. 8
2.2.2 Cromatografa de Interaccin Hidrofbica (HIC). 9
2.2.3 Precipitacin de Sulfato de Amonio 10
2.2.4 Cromatografa de Exclusin de Tamao (SEC) 11
2.2.5 Dilucin y filtracin estril 11

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Extraccin y Purificacin aP Pgina 87

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Extraccin y Purificacin

LISTA DE TABLAS

PGINA
Tabla 1 Lote de adsorcin en los parmetros del proceso de hidroxiapatita 3
Tabla 2 Extraccin de PT y FHA- Parmetros del proceso 4
Tabla 3 Parmetros del proceso de la floculacin del cloruro de bario. 5
Tabla 4 Parmetros del Proceso del tratamiento de calor 5
Tabla 5 Parmetros del Proceso de Clarificacin.. 5
Tabla 6 Cromatografa de Interaccin Hidrofbica Parmetros del proceso 6
Tabla 7 Cromatografa de Afinidad. Parmetros del Proceso 7
Tabla 8 Cromatografa de Exclusin de Tamao Parmetros del Proceso. 7
Tabla 9 Parmetros del Proceso de Dilucin y filtracin estril 8
Tabla 10 Condiciones de la carga de la columna de Q-Sefarosa, diseo, almacenamiento 9
y temperatura
Tabla 11 Cromatografa de Intercambio de Iones- Parmetros del proceso 9
Tabla 12 Cromatografa de Interaccin Hidrofbica- Parmetros del proceso 10
Tabla 13 Precipitacin de Sulfato de amonio- Parmetros del proceso 10
Tabla 14 Cromatografa de Exclusin de Tamao- Parmetros del proceso 11
Tabla 15 Dilucin y filtracin estril- Parmetros del proceso 11

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Extraccin y purificacin aP Pgina 88

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S.2.2 Descripcin del Proceso de Fabricacin y Control del Proceso
Extraccin y Purificacin

1. EXTRACCIN
2.
Despus de la etapa de fermentacin, se contina el proceso de fabricacin mezclando transformador es
continuado por los caldos de fermentacin agrupados procedentes de dos o tres fermentadores separados de
800L. La extraccin y purificacin de la biomasa de 1600L (2 x 800L) es un proceso opcional utilizado en caso
del fallo de uno de los fermentadores, y se realiza utilizando el mismo equipo y las mismas condiciones de
operacin que para la escala 2400L (3 x 800L).

La extraccin comienza ajustando el pH del caldo de fermentacin enfriado (que contiene los antgenos PT, FHA
y PRN). El caldo se transfiere a continuacin en un depsito estril que contiene una suspensin de gel de
agarosa HA (hidroxiapatita) en una solucin amortiguadora de fosfato; esto permite la adsorcin de antgenos de
PT y FHA en gel HA. En el siguiente paso, el sobrenadante, que contiene la bacteria Bordetella pertussis, se
separa del gel HA y los antgenos se extraen de cada una de las fases y se procesan por separado.

1.1. Adsorcin por lotes sobre hidroxiapatita

Se ajusta el pH del caldo de fermentacin enfriado. El caldo se transfiere a un tanque estril que contiene una
suspensin de agarosa HA gel en una solucin amortiguadora de fosfato (composicin descrita en S.2.3 materias
primas Pa: Seccin 1.1.3), y se agita. Bajo estas condiciones, el PT y FHA se unen al gel, mientras que las
clulas (en las cuales se fija la PRN transmembrana) permanecen en el caldo de suspensin. Cuando se detiene
la mezcla, el gel que contiene PT y FHA se separa del caldo de suspensin (fase superior) por decantacin. El
caldo se recupera para la extraccin de PRN.

La Tabla 1 a continuacin proporciona una visin general del proceso, resumiendo el equipo y los parmetros
del proceso pertinentes.

Tabla 1 Adsorcin de los lotes en los parmetros del proceso de hidroxiapatita

Pasos del Proceso Equipo y Parmetros del Proceso 2 o 3 x 800L escala

Objetivo Intervalo
Ajuste de pH pH 6.2 0.2
volumen del gel HA (L) 54* 50-60
Concentracin final de HA (%) 4.7 o 3.1** N/A
Adsorcin del lote de Hidroxiapatita Duracin de la agitacin (h) 12 10-21
Temperatura (C) N/A 5-15
Duracin de la sedimentacin (min) 65 o 75** 15
*: Esto corresponde al volumen de gel HA total para 2 columnas; 27L se aplica entonces en cada columna
**: para proceso 2x800L y 3x800L, respectivamente

1.2. Extraccin de PT y FHA

La suspensin de gel de HA se divide en dos fracciones iguales y cada fraccin se transfiere sobre una columna y se
lava con una solucin amortiguadora de fosfato (composicin descrita en S.2.3 materias primas Pa: Seccin 1.1.3)
bajo agitacin.

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Extraccin y Purificacin aP Pgina 89

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Pa
S.2.2 Descripcin del Proceso de Fabricacin y Control del Proceso
Extraccin y Purificacin

El lavado se contina en una columna empaquetada con soluciones amortiguadoras de fosfato (el primer lavado con
solucin amortiguadora descrito en S.2.3 materias primas Pa: Seccin 1.1.3, luego segundo lavado con solucin
amortiguadora descrito en S.2.3 materias primas Pa: Seccin 1.1.4). PT y FHA se eluyen despus del gel
(composicin de la solucin amortiguadora de elucin descrita en S.2.3 materias primas Pa: Seccin 1.1.5).
Finalmente, el eluido se somete a una filtracin para asegurar la eliminacin de cualquier bacteria potencial viable de
Bordetella pertussis.

La Tabla 2 a continuacin proporciona una visin general del proceso, resumiendo el equipo y los parmetros de
proceso pertinentes.

Tabla 2 Extraccin de los parmetros del proceso PT y FHA

Pasos del Proceso Equipo y Parmetros del Proceso 2 o 3 x 800L Escala

Objetivo Intervalo
Lavado en columna agitada Tasa de Flujo de Lavado (L/min) 8 N/A
Volumen de Lavado por columna (L) 620 600-675
Tasa de flujo del primer lavado (L/min) 1.5 0.1
Lavado en columna enpaquetada Volumen del primer lavado (L) 2CV* 2-2.5 CV
Tasa de Flujo del segundo lavado (L/min) 1.5 0.1
Volumen del segundo lavado (L) 12 CV 12-13 CV
Elution Tasa de flujo de la Elucin (L/min) 1 0.1
Volumen de la Elucin (L) N/A 3.5-3.8 CV
Filtration Porosidad del Filtro (urn) 0.2** N/A
Storage Temperatura (C) N/A 2-8
Tiempo de Espera Mximo (das) N/A <3
* Volumen de columna de CV; 1 CV = 27L para proceso de 2 o 3 x 800L (2 columnas).
**: La porosidad del filtro es 0.2 o 0.22 m de acuerdo con la hoja de datos del fabricante

1.3. Extraccin de PRN

El sobrenadante del gel HA se procesa por separado de los otros dos antgenos a purificar PRN. Primero, el pH del
caldo de fermentacin en suspensin se ajusta al valor correcto. Luego, la bacteria Bordetella pertussis se concentra
por floculacin y se separa del caldo de fermentacin. El tratamiento de calor permite la extraccin de antgeno PRN.
A continuacin se efecta una clarificacin adicional por centrifugacin y filtracin.

1.3.1. Floculacin del cloruro de bario

El pH del caldo de fermentacin en suspensin se ajusta primero al valor correcto. A continuacin se aade cloruro
de bario (composicin descrita en S.2.3 materias primas Pa: Seccin 1.1.6) para inducir la floculacin de clulas de
B. pertussis que, a su vez, permite la concentracin de clulas bacterianas por sedimentacin por gravedad. El
sobrenadante, que contiene los componentes no utilizados del medio de crecimiento (sales, aminocidos, minerales,
etc.) y otros componentes liberados en el caldo durante la fermentacin, se descarta. Finalmente, para reducir la
concentracin de cloruro de bario, las clulas concentradas se lavan repetidamente aadiendo una solucin
amortiguadora Tris (composicin descrita en S.2.3 materias primas Pa: Seccin 1.1.7), mezclando la suspensin y
luego dejndola sedimentar. El procedimiento de floculacin/lavado se lleva a cabo tres o dos veces dependiendo de
si la extraccin es de una biomasa de 3 x 800 L o 2 x 800 L, para obtener una concentracin final de cloruro de bario
en la suspensin de 0,05% (p/v) Dilucin de 20 veces desde la concentracin inicial.
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Extraccin y Purificacin

La Tabla 3 a continuacin proporciona una visin general del proceso, resumiendo el equipo y los parmetros de proceso
pertinentes.

La Tabla 3 Parmetros del proceso de floculacin del cloruro de bario

Pasos del Proceso Equipo y Parmetros del proceso Objetivo Intervalo

Ajuste de pH pH 8.8 0.05
Floculacin BaCl2 Volumen de BaCl2 (%w/v) 1 N/A
Temperatura (C) N/A 5-15
Lavado Duracin de la Suspensin por agitado (min) 5 N/A
Dilucin de la concentracin de BaCl2 en la solucin amortiguadora de Tris (fold) 20 N/A

1.3.2. Tratamiento trmico

La suspensin celular se calienta posteriormente, para extraer el antgeno PRN. Se mantiene una distribucin uniforme de la
temperatura por agitacin. Despus del tratamiento trmico, el contenido del depsito se enfra antes de la clarificacin.

La Tabla 4 a continuacin proporciona una visin general del proceso, resumiendo el equipo y los parmetros del proceso
pertinentes.

Tabla 4 Parmetros del proceso de tratamiento trmico

Pasos del Proceso Equipo y Parmetros del proceso Objetivo Intervalo

Tratamiento trmico Volumen (L) 720 N/A
Temperatura (C) 60 5
Duracin (min) 30 25-60
Enfriamiento Temperatura (C) N/A 5-15

1.3.3. Aclaracin

La clarificacin se realiza por centrifugacin seguida de filtracin. La suspensin floculada enfriada se centrifuga primero. La
clarificacin se evala a travs de la medicin de la turbidez del sobrenadante de PRN.

El sobrenadante clarificado que contiene PRN se filtra a continuacin. El filtrado se recoge en un tanque de acero inoxidable y se
mantiene a la temperatura adecuada hasta el procesamiento posterior.

La tabla 5 a continuacin proporciona una visin general del proceso, resumiendo los parmetros del equipo y del proceso
pertinentes.

Tabla 5 Parmetros del proceso de clarificacin

Pasos del Proceso Equipo y Parmetros del proceso Objetivo Intervalo

Centrifugacin Velocidad (g) 14690 N/A
Almacenamiento Temperatura (C) N/A 5-15
Tiempo de Espera Mximo (das) N/A <51
Filtracin Porosidad del Filtro (urn) 0.2* N/A
Almacenamiento Temperatura (C) 4 2-8
Tiempo de Espera Mximo (das) N/A <51
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S.2.2 Descripcin del Proceso de Fabricacin y Control del Proceso
Extraccin y Purificacin

*: La porosidad del filtro es de 0,2 o 0,22 m segn la hoja de datos del fabricante

1: Mximo de 5 das considerando las dos duraciones de almacenamiento: extracto PRN sobrenadante antes de la
filtracin y extracto de PRN filtrado antes de la cromatografa de intercambio inico

2- PURIFICACIN

Cada antgeno se somete a un proceso de purificacin distinto, que implica varios mtodos cromatogrficos,
seguido por una filtracin.

2.1 Purificacin de PT y FHA

2.1.1 Cromatografa de Interaccin Hidrofbica (HIC)

Esta etapa de purificacin se lleva a cabo en una cmara fra (2-8 C). El eluato de HA se carga en la columna HIC.
La cromatografa de interaccin hidrfoba est destinada a purificar el eluato de HA mediante la unin selectiva de
protenas a la matriz. Se emplean soluciones amortiguadoras especficas para las etapas de lavado, lavado y elucin,
segn se detalla en S.2.3 materias primas Pa (vanse las secciones 1.1.8, 1.1.9 y 1.1.10, respectivamente). PT y FHA
se eluyen juntos (el perfil de elucin se controla a 280 nm). Se recuperan las fracciones que contienen los antgenos.

La Tabla 6 a continuacin proporciona una visin general del proceso, resumiendo los parmetros del equipo y del
proceso relevantes.

La Tabla 6 Interaccin hidrofbica Cromatografa - parmetros del proceso

Pasos del Proceso Equipo y Parmetros del Proceso 2 o 3 x 800L Escala

Objetivo Intervalo
Diametro (cm) 30 N/A
Altura del lecho (cm) 9.5 8.5-10.5
Cromatografa Ajuste del pH 7.6 0.1
De Interaccin Carga Mxima (g/L gel) N/A <33
Hidrofobica Tasa de Flujo (Carga, Lavado, elucin) (L/h) 36 N/A
Volumen de enjuague (L) >2CV* N/A
Volumen de lavado(L) >10CV N/A
Volumen de Elucin (L) >15CV N/A
* CV: Volumen de columna; 1 CV = 6.7L para 2 o 3 x 800L proceso.

Esta etapa de purificacin se lleva a cabo en una cmara fra (2-8 C). El eluido HIC de PT y FHA se diluye con
agua para inyeccin y se aplica a una cromatografa de afinidad de colorante. La columna separa las molculas en
funcin de su respectiva afinidad por el colorante. PT y FHA, unidos a la columna, se eluyen juntos aumentando el
pH y la fuerza inica (el perfil de elucin se controla a 280 nm). Se recuperan las fracciones que contienen los
antgenos.

La Tabla 7 a continuacin proporciona una visin general del proceso, resumiendo los parmetros del equipo y del
proceso pertinentes.
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Tabla 7 Cromatografa de afinidad - parmetros del proceso

Pasos del Proceso Equipo y Parmetros del Proceso 2 o 3 x 800L escala

Objetivo Intervalo
Factor de dilucin de eluato de HIC en agua 2.5 x N/A
Eluato HIC pH (en agua) <6.5 N/A
Conductividad del Eluato HIC (En agua) (mS/cm) <10 N/A
Cromatografa de Afinidad
Diametro (cm) 45 N/A
Altura del lecho (cm) 9.5 8.6-10.4
Carga Mxima (g/L gel) N/A <10
Tasa de flujo (carga, lavado, elucin) (L/h) 108 N/A
Volumen de Lavado** (L) >5CV* N/A
Volumen de Elucin*** (L) >5CV N/A
* CV: Volumen de columna; 1 CV = 15,1L para proceso de 2 o 3 x 800L
** Composicin de la solucin amortiguadora de lavado descrito en la Seccin 1.1.11.
*** Composicin de la solucin amortiguadora de elucin descrito en la Seccin descrita en la Seccin 1.1.12.

2.1.3. Cromatografa de exclusin de tamao (SEC)

Esta etapa de purificacin se lleva a cabo en una cmara fria (2-8 C) .El eluido de afinidad de colorante se inyecta en tres
columnas de cromatografa de permeacin de gel. Este tipo de columna separa las molculas segn su tamao. FHA y PT
eluyen por separado debido a su respectiva velocidad lineal superior e inferior en la columna. El perfil de elucin se
controla a 280 nm. Se recuperan las fracciones que contienen los antgenos.

La Tabla 8 a continuacin proporciona una visin general del proceso, resumiendo los parmetros del equipo y del proceso
pertinentes.

Tabla 8 Cromatografa de exclusin de tamao - parmetros del proceso

Paso del Proceso Equipo y Parmetros del Proceso 2o3x 300L escala
Objetivo Intervalo
Dimetro (cm) 80 N/A
Altura del lecho Total** (cm) 100 10
Cromatografa de Exclusin por Tamao HETP* (cm) N/A <0.06
Como* factor 1 0.75-
1.50
Tasa de flujo de la carga (L/h) 48 N/A
Carga Mxima (volumen %) N/A <9
Tasa de Flujo del Corrido (lavado/Elucin) (L/h) 72 N/A
Volumen de Elucin*** (L) 1.2 CV* N/A
* CV: Volumen de la columna (1 CV = 503 L para un proceso de 2 o 3 x 800 L); HETP: Altura Equivalente de una Placa
Terica; Como: Asimetra
** Altura total del lecho para las columnas de 3 SEC
*** Composicin de la solucin amortiguadora de elucin descrito en la Seccin 1.1.13.

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2.1.4. Dilucin y filtracin estril

Los antgenos purificados se diluyen a la concentracin requerida (solucin amortiguadora de dilucin de composicin
descrito en la Seccin 1.1.13) antes de ser esterilizados a travs de dos filtros consecutivos de membrana.

La Tabla 9 a continuacin proporciona una visin general del proceso, resumiendo los equipos y parmetros de proceso
relevantes.

Tabla 9 Parmetros del proceso de dilucin y filtracin estril

Pasos del Proceso Equipo y Parmetros del Proceso 2 o 3 x 800L escala
Objetivo Intervalo
Dilucin PT concentration after dilution (g/mL) 200 100*-250
FHA concentration after dilution (g/mL) 400 100
Filtracin estril Filter porosity (urn) r\ n** N/A
Filtration duration - PT (min) N/A <90
Filtration duration - FHA (min) N/A < 120
Almacenamiento Storage temperature (C) N/A 2-8
Maximum holding time for PT purified bulk before N/A <5
detoxification (days)
Maximum holding time for FHA purified bulk before N/A <5
detoxification (days)

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