Desarrollo del cultivo celular de Ralstonia eutropha

DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO
CELULAR POR LOTES DE Ralstonia

eutropha NRRL B-14690
INFORME N 1
C-3
INTEGRANTES:
LAZARO CAJUSOL Jeniffer

BIOPROCESOS LOPEZ BENITES Ana Maria
OLIVARES CANO Veronica
SALVADOR REYES Rebeca
SOTELO HERRERA Medali
BIOR
PROFESOR:
Ing. Augusto Castillo Caldern

INDICE
GRUPO : C
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA
Facultad de Ingeniera
E.A.P Ingeniera Agroindustrial
INDICE
I. RESULMEN ............................................................................................................... 4
II. INTRODUCCION........................................................................................................ 5
III. OBJETIVOS: .............................................................................................................. 7
1. GENERAL:..................................................................................................................... 7
2. ESPECFICOS: ................................................................................................................ 7
IV. MATERIALES Y METODOS.......................................................................................... 8
3.1 MATERIALES INSTRUMENTOS Y REACTIVOS ............................................................... 8 2
3.2 METODOLOGIA EXPERIMENTAL ............................................................................. 10
3.2.1 DISEO DE MEDIOS DE CULTIVO: ................................................................. 10
A. Formula estimada del m.o.:................................................................................ 10
B. Requerimientos nutricionales:............................................................................ 10
C. Condiciones de cultivo: ...................................................................................... 10
D. REFERENCIAS DE COMPOSICIN DE MEDIOS DE MANTENCIN, ACTIVACIN Y
CULTIVO PARA Ralstonia eutropha NRRL B-14690: ................................................. 11
E. COMPSICION DE LOS MEDIOS A UTILIZAR EN ESTA PRCTICA: ............................. 12
3.2.2 PREPARACION DE MEDIOS Y PROGRAMA DE MUESTREO: .............................. 13
A. PREPARACION DEL Medio solido de mantencin PGY-Agar (50 ml)...................... 13
B. SIEMBRA EN MEDIO DE MANTENCION: .............................................................. 14
C. PREPARACION DEL Medio liquido de activacin (30 ml) ...................................... 14
D. ACTIVACION DE LA CEPA: ................................................................................... 15
E. PREPARACIN DEL MEDIO DE FERMENTACIN, segn la TABLA 03 para el cultivo
de Ralstonia eutropha NRRL B-14690 ..................................................................... 16
F. PREPARACION DE LA SOLUCION DE SALES: segn tabla N04 ............................... 17
G. FERMENTACION DEL LA CEPA:............................................................................ 17
3. 2.3 MONTAJE DEL EQUIPO EXPERIMENTAL, CULTIVO DEL M.O, ETC. ................... 18
A. DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES: MTODO DEL DNS (CIDO
DINITROSALICLICO) ............................................................................................... 18
B. DETERMINACIN DE LA CINTICA DE CRECIMIENTO DE LA BIOMASA .................. 19
C. Determinacin de la concentracin celular por D.O ............................................. 20
V. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL ............................................................................ 21
4.1 Preparacin Del Medio De Mantencin ................................................................... 21
4.3 Determinacin de La Curva de Calibrado de DNS ..................................................... 22
4.4 Preparacin Del Medio De Activacin para la cinetica. ............................................. 24
4.6 Preparacin Del Medio De Fermentacin para la Cintica. ...................................... 26

4.7 Determinacin De La Cintica De Crecimiento De La Biomasa................................. 27
4.8 Obtencin de la curva de Calibrado de Biomasa ...................................................... 30
VI. RESULTADOS Y DISCUSION ..................................................................................... 32
VIII. REFERENCIAS BILIOGRAFICAS ................................................................................. 53
IX. ANEXOS ................................................................................................................. 55
3
I. RESULMEN
En el presente trabajo aborda todo lo referente al desarrollo del inculo y cultivo

celular por lote de la cepa Ralstonia eutropha NRRL B-14690, desarrollado por
alumnos del curso de Bioprocesos realizado en este referido laboratorio.
Este trabajo se inicio realizando su manipulacin desde su estado en forma de cepa

refrigerada (inactivada). Para la cual se procedi a preparar sus medios de
4
mantencin, activacin y fermentacin; adems de seguir una serie de
procedimientos secuenciales tales como inoculacin en agar (30 ml), el cual tuvo
todos los nutrientes que esta cepa requiere para su ptimo desarrollo, dndoles
as todas las facilidades para que pueda crecer. Luego de un evidente crecimiento
de la cepa en el medio, la totalidad de ste fue diluido dentro de otro medio al que
se denomina medio de fermentacin (120 ml) por sus limitaciones en cuanto a
nutrientes, ya que este contiene solo los componentes necesarios para que el
microorganismo pueda subsistir tales como fuente de carbono que en nuestro
caso fue glucosa.
La experiencia consisti en obtener la cintica de crecimiento de Ralstonia

eutropha NRRL B-14690 (en el matraz Shaker por 10 h.). Observar y comparar
como se va produciendo el crecimiento celular con los nutrientes exactamente
necesarios para tal accin y al mismo tiempo como va disminuyendo el sustrato en
este caso principalmente la glucosa. Y esto fue posible de determinar haciendo
evaluaciones tales como crecimiento de biomasa mediante lecturas de absorbancia
(640 nm) en el Espectofotmetro y con el ensayo de determinacin de azucares
reductores con reactivo (DNS-absorbancia 540 nm) para el caso del sustrato.
Para el caso de las conclusiones se evalu tanto el crecimiento de biomasa y

consumo de sustrato en un determinado tiempo y expresados en grficas adems
de ser comparados con una curva de calibrado para ambos casos, que nos darn
informacin sobre el microorganismo tales como el rendimiento y la
productividad.
II. INTRODUCCION
El objetivo general en la prctica fue disear y realizar una experiencia de

cultivo celular por lotes en matraces, empleando una cepa de Ralstonia
eutropha NRRL B-14690, evalundose el efecto de la razn Co/No en la cintica
de crecimiento microbiano.
En la actualidad muchos de los alimentos son obtenidos gracias al manejo y

5
conocimiento del crecimiento de microorganismos. Resulta entonces
importante el conocimiento de las condiciones en que estos microorganismos
puedan optimizar sus productos. Para ello la preparacin de medios de cultivo
para estos microorganismos es un buen punto de partida para conocer sobre su
comportamiento as como tambin el seguimiento de la cintica que nos
proporcionara datos mucho ms prcticos y exactos sobre la velocidad y
caractersticas del crecimiento del microorganismo tratado.
La bacteria Ralstonia eutropha NRRL B-14690 es la ms utilizada en la

produccin de poli--hidroxibutirato (PHB) por su capacidad de acumular
polmero hasta en un 80% de su peso seco y puede fijar carbono utilizando CO2
como fuente de carbono, utilizar la urea de la orina como fuente de nitrgeno y
utilizar el hidrgeno como fuente de energa para crear densos cultivos que
pueden servir como fuente de protenas. El PHB es de gran importancia como
material para aplicaciones biomdicas tales como filamentos de suturas,
portadores de drogas y generacin de constructos para el crecimiento celular
debido a que resulta biocompatible. Es particularmente importante el hecho
que el producto de la degradacin del PHB, es decir D(-)3hidroxibutirato, es
un metabolito intermedio comn presente en las clulas animales. Para la
produccin del polmero por R. eutropha, la estrategia de fermentacin ms
empleada es el cultivo por lote alimentado en el cual las clulas crecen hasta
una determinada concentracin sin limitacin de nutrientes, luego un nutriente
esencial es limitado para permitir la sntesis de PHAs. Durante esta etapa, la
Concentracin de biomasa permanece constante presentndose acumulacin

de polmero.
Es as que para esta prctica hemos centrado nuestra atencin en el

tratamiento de este microorganismo (Ralstonia eutropha NRRL B-14690).
Iniciando desde su resiembra partiendo desde su estado en cepa, para luego
sembrarlo en un medio apropiado procurando su rpida activacin, para que
luego de un determinado tiempo podamos sembrar la bacteria pero en un
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medio mnimo; es decir con los mnimos requerimientos; en el cual es ms
factible determinar la cintica de crecimiento.
La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de fermentacin es

una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos.
Los componentes de los medios constituyen los efectores externos de

naturaleza qumica que desempean un rol esencial en los procesos ya que
deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formacin de
productos y adems suministrar energa para la sntesis de metabolitos y para
el mantenimiento celular. No obstante que los microorganismos varan
considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar.
III. OBJETIVOS:
1. GENERAL:
Disear y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en matraces,

empleando una cepa de Ralstonia eutropha NRRL B-14690, evalundose el
efecto de la razn Co/No en la cintica de crecimiento microbiano.
2. ESPECFICOS:
Disear y preparar los medios de cultivo para Ralstonia eutropha NRRL B-

14690.
Activacin celular y desarrollo del inoculo.
Determinar la cintica de consumo de la fuente de carbono.
Determinar el y los rendimientos de nutriente limitante en clulas y
productividad.
Determinar el valor de pH al inicio y al final de la alimentacin.
IV. MATERIALES Y METODOS
3.1 MATERIALES INSTRUMENTOS Y REACTIVOS
Material Biolgico: Ralstonia eutropha NRRL B-14690
Medios de Cultivos:
Extracto de Levadura 8
Peptona de casena
Agar
Glucosa
Solucin de Sales
Reactivos:
K2HPO4
(NH4)2 SO4
MgSO4.7H2O
DNS (ACIDO DINITROSALICILICO)
NaOH 2N
Tartrato de Sodio
Potasio Tetrahidratado
EDTA
Instrumentos:
Balanza analtica
Espectrofotmetro
Autoclave
Centrifuga
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Agitador Orbital(Shaker)
Peachimetro
Estufa Elctrica ( Incubadora)
Estufa Elctrica ( Horno de esterilizacin)
Campana de Desecacin.
Asa bacteriolgica.
Mechero bunsen.
Tubos de ensayo con tapa para medio de cultivo.
Mechero.
Fiola 100ml.
Papel para hacer los capachos de muestra.
Esptula.
Micro pipeta.
Matraz de 200ml.
Vasos de precipitado.
Piceta.
Tapones de algodn y gasa.
Papel metlico.
3.2 METODOLOGIA EXPERIMENTAL
3.2.1 DISEO DE MEDIOS DE CULTIVO:
A la hora de disear un medio de cultivo no slo hay que tener en cuenta los
nutrientes sino tambin las condiciones fsicas que permitan el crecimiento de
los microorganismos. La cantidad y naturaleza de los nutrientes en un medio de
10
cultivo viene determinada por el rendimiento de un producto en especial
adems de los requerimientos nutricionales del microorganismo.
Para la formulacin del diseo de cultivo se tiene en cuenta los siguientes

requerimientos nutricionales para el cultivo Ralstonia eutropha NRRL B-
14690.
A. Formula estimada del m.o.:

. . .
= .
B. Requerimientos nutricionales:
- Fuente de Carbono : Glucosa
- Fuente de Nitrgeno : Sulfato de amonio
- Fuente de Potasio : Fosfato bicido de Potasio
- Fuente de Magnesio : Sulfato de Magnesio Heptahidratado
C. Condiciones de cultivo:
- Tipo de medio de cultivo: qumicamente definido
- Estado del medio : liquido
- Temperatura : 28C
- Velocidad de agitacin : 200 rpm
- pH : 7.0
D. REFERENCIAS DE COMPOSICIN DE MEDIOS DE MANTENCIN,

ACTIVACIN Y CULTIVO PARA Ralstonia eutropha NRRL B-14690:
CONCENTRACION
MEDIO NUTRIENTE
(g/L)
Extracto de 3.5
levadura 7.0
Peptona de 1.0
SOLIDO DE casena 20
MANTENCION K 2 HPO4 1.4 11
(PGY-Agar) Agar
Glucosa
Ajustar pH: 7.0

Extracto de 1.0
levadura 1.0
Peptona de 1.0
casena 1.4
K 2 HPO4
ACTIVACION
Glucosa
Ajustar pH: 7.0

T=28C ;
N=200rpm
Glucosa
(NH4 )2 SO4
K 2 HPO4
EDTA 20 ml/L
MgSO4 . 7H2 O
FeSO4 . 7H2 O
FERMENTACION*
Solucin de Sales 10 ml/L
Ajustar pH: 7.0

T=28C ;
N=200rpm
*Las concentraciones de los componentes del medio de cultivo para la

fermentacin sern calculados a partir de la frmula del m.o.; para las fuentes
de carbono y nitrgeno las concentraciones iniciales ya se han establecido de
acuerdo con cada sub-grupo de trabajo.
E. COMPSICION DE LOS MEDIOS A UTILIZAR EN ESTA PRCTICA:
- TABLA N01: Medio solido de mantencin PGY-Agar para 50 ml
CONCENTRACION
MEDIO NUTRIENTE PESO (g)
(g/L)
Extracto de levadura 3.5 0.175
Peptona de casena 7.0 0.35
SOLIDO DE K 2 HPO4 1.0 0.05
Agar 20 1.00 12
MANTENCION
(PGY-Agar) Glucosa 1.4 0.07
Ajustar pH: 7.0
- TABLA N02: Medio Liquido de Activacin para 20 ml
CONCENTRACION
MEDIO NUTRIENTE PESO (g)
(g/L)
Extracto de levadura 1.0 0.02
Peptona de casena 1.0 0.02
K 2 HPO4 1.0 0.02
ACTIVACION Glucosa 1.4 0.028
Ajustar pH: 7.0

T=28C ; N=200rpm
- TABLA N03: Medio de Fermentacin de Ralstonia eutropha NRRL B-14690

en biomasa de 1.5 g/L para 120ml.
CONCENTRACION
ELEMENTO NUTRIENTE PESO (g)
(g/L)
C Glucosa 6.0* 1.799
N (NH4 )2 SO4 0.8* 0.453
K K 2 HPO4 0.3524 0.0264
EDTA 20 ml/L 6 mg
Mg MgSO4 . 7H2 O 0.1141 0.12 ml
Fe FeSO4 . 7H2 O 0.0224 0.18 ml
Solucin de Sales 10 ml/L 1.2 ml
Ajustar pH: 7.0

T=28C ; N=200rpm
* Las concentraciones de carbono y nitrgeno (fuentes limitantes) se
establecieron previamente por subgrupo.
**Los clculos de estas concentraciones y pesos se detallan en ANEXO 1 y

2
- Tabla N04: Composicin de la solucin de sales 100 veces concentrado,
utilizadas en los medios de cultivo en g/l
Nutriente Concentracin (g/l)

CaCl2.2H2O 2
ZnSO4.7H2O 0.1
CuSO4.5H2O 0.01
CoCl2.6H2O 0.2 13
MnCl2.6H2O 0.005
Fuente: Wang y Yu, (2001)
3.2.2 PREPARACION DE MEDIOS Y PROGRAMA DE MUESTREO:
La precisin y concentracin durante la preparacin de los medios son factores

determinantes de los resultados a obtener en nuestra experiencia. En cada
medicin es importante ser exacto para evitar desvos en los resultados.
A. PREPARACION DEL Medio solido de mantencin PGY-Agar (50 ml)
PESAR <Nutrientes Tabla N01>
50 ml Agua destilada
<Matraz Erlenmeyer 250 ml>
DILUIR
<Ebullicin por 1 minuto>

CALENTAR-AGITAR
DIVIDIR <7 ml en 6 tubos de ensayo c/t>
<Autoclave 121C-20 minutos>

ESTERILIZAR
ENFRIAR <Tubos inclinados/ T ambiente>
RESERVAR
B. SIEMBRA EN MEDIO DE MANTENCION:

- Materiales y equipos a utilizar:
Aza bacteriolgica
Tubo de ensayo con medio slido donde se encuentra el M.O.
Mechero Bunsen, trpode y rejilla.
- Procedimiento:
- Esterilizar los materiales y equipos a utilizar.
- Colocar la aza bacteriolgica en el mechero hasta que se torne roja,
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luego enfriar.
- Flamear la boca del tubo de ensayo con el agar preparado
previamente y con el aza extraer la cepa.
- Sembrar en la superficie realizando la mayor cantidad de estras en
la superficie.
- Tapar el tubo de ensayo y repetir en mismo procedimiento con los
dems tubos.
- Incubar a 28C por 24 48 horas.
C. PREPARACION DEL Medio liquido de activacin (30 ml)
Para la preparacin de este medio lquido, previamente se deben esterilizar

los nutrientes por separado de la siguiente manera:
- TUBO 01: Extracto de levadura enrasado a 5ml con agua destilada.

- TUBO 02: Sales y nutrientes enrasadas a 5 ml con agua destilada
- Matraz (250ml): Glucosa con 10 ml de agua destilada
Los pesos de cada nutriente se extraen de la TABLA N02:

ESTERIZAR (por
<121C por 15 minutos>
separado)
ENFRIAR <Temperatura ambiente>
CALENTAR
<Matraz con glucosa>
Tubo 01-Tubo 02
AADIR <Uno por uno>
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AGITAR <Varilla de vidrio>
AJUSTAR pH <pH=7.0>
ESTERILIZAR <121C por 15 minutos >
ENFRIAR <Temperatura ambiente>
RESERVAR
D. ACTIVACION DE LA CEPA:
- Materiales y equipos:
Matraz de 125 ml.
Algodn Gasa
Agua destilada
Aza bacteriolgica
Shaker
Mechero Bunsen, trpode y rejilla
- Procedimento:
- Esterilizamos el Aza bacteriolgica y el matraz con la flama del
mechero.
- Enfriamos el aza.
- Extraemos con el aza la cepa de los tubos de resiembra preparados.
- Inoculamos los 30 ml de medio de mantencin preparados.
- Tapamos con un tampn de algondon y gasa.
- Llevamos al shaker a 28C y 200rpm por 24 horas.

- Notaremos el desarrollo y crecimiento en biomasa por la turbidez
del medio.
E. PREPARACIN DEL MEDIO DE FERMENTACIN, segn la TABLA 03 para el

cultivo de Ralstonia eutropha NRRL B-14690
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PESAR <Nutrientes Tabla N03>
- Glucosa enrasada 2 hasta 100ml

- (NH4 )2 SO4 enrasada 2 hasta 10ml
- K 2 HPO4 enrasada 2 hasta 10ml DISOLVER <Por separado>
- MgSO4 . 7H2 O enrasada 2 hasta 10ml
- FeSO4 . 7H2 O enrasada 2 hasta 10ml
ESTERILIZAR <Considerando EDTA y Sol .

(por separado) Sales/121C- 15 min>
CALENTAR <Matraz de 1000 ml>
AADIR-AGITAR <uno a uno>
<Temperatura ambiente>
ENFRIAR
RESERVAR
F. PREPARACION DE LA SOLUCION DE SALES: segn tabla N04
PESAR <Sales Tabla N04>
5 ml Agua destilada
DILUIR <tubo de ensayo >
Agua destilada
ENRASAR <en el tubo de ensayo >
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AGITAR <Varilla de vidrio>
ESTERILIZAR < por 15 minutos>
G. FERMENTACION DEL LA CEPA:

Materiales y equipos
Matraz de 1 L conteniendo el medio de fermentacin

pH-metro
Gasa y algodn
Tubos de ensayo
Procedimiento:
- Esterilizar los materiales a utilizar.

- En un matraz de 1000 ml, que contiene 80 ml de medio definido,
anadir los 40 ml de caldo (medio+biomasa) preparados
previamente.
- Mezclar y tomar 5 ml para el anlisis del biomasa y sustrato inicial.
- Tapar con un tapn de gasa y algodn.
- Llevar al shaker a 28C y 200rpm.
- Recoger y analizar muestras de 5 ml cada hora por 24 horas.
3. 2.3 MONTAJE DEL EQUIPO EXPERIMENTAL, CULTIVO DEL M.O, ETC.
A. DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES: MTODO DEL DNS

(CIDO DINITROSALICLICO)
La preparacin del reactivo DNS se requiere de lo siguiente:
10 g/l de cido 3,5 dinitrosaliclico (DNS)

200 ml/l de NaOH 2N
300 g/l de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado
18
Para la preparacin de este reactivo, se disuelve el tartrato en
aproximadamente 500 600 ml de agua, paralelamente se disuelve
el cido DNS. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de
1 litro y se agita hasta la completa disolucin de todos los
componentes, para posteriormente aforar hasta un litro.
Se precisa realizar los siguientes pasos para el anlisis de la muestra:
1.- Se aade un volumen del reactivo DNS a un volumen de

muestra a analizar.
2.- Se mantiene la mezcla en un bao de agua a ebullicin durante

5 minutos para luego dejar enfriar.
3.- Se aaden 10 volmenes de agua destilada.
4.- Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco.
5.- La concentracin se obtiene interceptando la medida de

absorbancia en la curva de calibrado.
La curva de calibrado para el azcar se obtiene a partir de muestras

de concentracin conocida y analizadas segn este
procedimiento.
Determinacin de la cintica de consumo de la fuente de carbono.
-dS / dt = (1/ YX/S) (dX/dt)

Reemplazando en esta ecuacin y conociendo YX/S.
Tenemos -dS / dt = (1/ YX/S) m X,

Conociendo m ya para diferente concentraciones finales
podemos determinar la cintica de consumo de sustrato.
B. DETERMINACIN DE LA CINTICA DE CRECIMIENTO DE LA BIOMASA

Materiales y equipos
Matraz de 1 L conteniendo el medio de fermentacin

Espectrofotmetro
pHmetro
Gasa y algodn
Centrifuga
Tubos de ensayo
Capachos de papel aluminio
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Procedimiento: Al inicio y cada hora por 10 horas se realizara lo siguiente
EXTRAER 5ml del medio de cultivo
SEPARAR 3ml para el tubo de espectrofotmetro y el

resto se le agreg al tubo de centrifugado.
MEDIR Absorbancia a 640nm y pH
COMPLETAR 5ml en el tubo de centrifugado, se devuelve.
CENTRIFUGAR A la mxima velocidad por 20 minutos
El sobrenadante en viales y ponerlos en

VERTER Y GUARDAR refrigerador
Utilizando la ecuacin ln(X/ X0) = t, determinamos distintos valores de .

Tabular Si vs. i
Con la ecuacin 1/ = 1/m + (KS/ m) 1/S, graficamos. La intercepcin con el
eje y ser el valor de 1/m siendo su inversa el valor de m, adems la
pendiente m= KS/ m conocido anteriormente m determinamos KS.
dX / dt = m X .()
X = X0 e mt
C. Determinacin de la concentracin celular por D.O

Materiales y equipos:
Espectrofotmetro.
Centrfuga.
Estufa.
Reactivos:
Muestra del medio.
Agua destilada.
Procedimiento: 20
El mtodo se basa en el aumento de la turbidez del medio, al incrementarse la
concentracin de microorganismos, esto puede ser detectado fcilmente por
espectrofotometra a 640nm. Para esta determinacin es necesario que
previamente se elabore una curva de calibrado, para lo cual las concentraciones
de microorganismos en el medio son determinadas por peso seco de acuerdo al
siguiente procedimiento:
TOMAR MUESTRA Volumen 5 ml

conocido
CENTRIFUGAR 5000 rpm ; Tiempo: 20
agua destilada RESUSPENSER Sobrenadante
ELIMINAR Centrifugado con agua destilada
5000 rpm ; Tiempo: 20

CENTRIFUGAR
A fin de eliminar restos de sustrato
NUEVAMENTE
que pudieran alterar la
determinacin.
V
ELIMINAR Sobrenadante
V
REDISOLVER Precipitado
V
SECAR Estufa: 80 C hasta peso
constante
V. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
4.1 Preparacin Del Medio De Mantencin
Primero pesamos los componentes de la

tabla N 1, luego lo diluimos con agua y lo
llevamos a ebullicin por 1 min
aproximadamente. Finalmente la solucin
se coloco en dos tubos de ensayos y 21
posteriormente se llevo a esterilizar por 15
min. Luego se dejo reposar en forma
inclinada para posteriormente sembrar.
4.3 Determinacin de La Curva de Calibrado de DNS
HIDRLISIS ACIDA DE LA MUESTRA
Se tuvo una solucin estndar de fructosa 5g/l, de la cual se prepararon7 tubos

de ensayo a diferentes concentraciones, indicados en la siguiente tabla:
ml. Solucin ml. Agua Concentracin

N TUBOS Estndar destilada g/l 22
1 0.500 0 1
2 0.400 0.100 0.8
3 0.300 0.200 0.6
4 0.200 0.300 0.4
5 0.100 0.400 0.2
6 0.050 0.450 0.1
7 0.00 0.500 0
A los 7 tubos que contenan

diferentes concentraciones de
fructosa, se les agreg a cada
uno 0.5 ml de HCl concentrado y
se agito.
Se adicin 500 l de DNS a cada

tubo y luego se llevaron a
ebullicin por 5, luego se llev a
agua con hielo por 3 minutos.
23
Despus de reposar los tubos, se

agit en el Maxi mix 8 agitador de
tubos). Luego se llev al
espectrofotmetro y a 540 nm se
midi la absorbancia.
4.4 Preparacin Del Medio De Activacin para la cinetica.
24
Se pes todos los componentes descritos en la tabla N02 en la

balanza analtica para un medio de activacin de 20 ml. Previo a
esto se elabor un tapn hecho de gaza y algodn, para
colocarlo en el matraz para evitar la contaminacin del medio.
En un tubo de ensayo se coloc el extracto de levadura y malta y

se le agreg 5ml de agua destilada, en otro tubo se agreg 0.1ml
de la solucin de sales y agregamos 4.9ml de agua destilada. En
un matraz se adiciono la glucosa y lo aforamos con agua.
25
Luego se llevaron a esterilizar los 2 tubos y el matraz

en la olla a presin, se cubri los tapones con papel
aluminio, se control 15 minutos a partir de la
primera burbuja.
Luego de enfriar, se vaci el contenido de los tubos al

matraz, en torno al mechero, as se tuvo preparado el
medio de activacin con todas las indicaciones de asepsia.
Luego se inocul (en el medio de activacin) y se llev el
matraz al Shaker por 10h a 38C y 200rpm.
4.6 Preparacin Del Medio De Fermentacin para la Cintica.
26
De acuerdo con la tabla N 03, se pes las cantidades requeridas en

la balanza analtica, sobre capachos de papel aluminio.
Se disolvi los compuestos con agua destilada de la siguiente

manera:
1.799 g glucosa en un matraz de 500ml con 80ml de agua
destilada.
(NH4)2SO4 + KH2PO4 + EDTA en un tubo de ensayo.
MgSO4.7H2O + 1ml de solucin de sales+ 14 ml de agua.
Dentro de los 80 ml de H2O destilada se consider 2ml por las
prdidas en evaporacin durante la esterilizacin.
27
Se esteriliz las diluciones en la olla a presin por 15min. (A partir de la

primera burbuja). Terminada la esterilizacin, se dej enfriar para luego
observar la cintica de crecimiento y luego se agrego el medio de
activacin y finalmente se llevo a pH 7 y se dejo por 10 horas en el
Shaker.
4.7 Determinacin De La Cintica De Crecimiento De La Biomasa
Cerca al mechero se prepar el

medio de fermentacin. Se vaciaron
las mezclas de los tubos en el
matraz (con su debido flameado). El
medio de fermentacin era un
medio traslcido. Se sac el matraz
de medio de activacin de la
incubadora y se mezclaron frente al
mechero. Seguido se agit el medio
de fermentacin con el medio de
activacin.
Con una pipeta limpia y estril se

procedi a sacar 5 ml del medio de
activacin. Los 4 ml de muestra se
agregaron en una celda del
espectrofotmetro, y se realiz la
lectura a 640 nm. se coloc el
matraz en el Shaker, para las
prximas lecturas.
28
Todas las lecturas registradas a travs

de las horas de fermentacin se
anotaron en una hoja de registro para
ir evaluando el crecimiento durante
10 horas.
LUEGO DE REALIZAR LAS EVALUACIONES DE CRECIMIENTO SE REALIZA LOS
SIGUIENTES PASOS:
Una vez realizada la lectura en el

espectrofotmetro, la muestra de la celda
se coloc en un tubo de ensayo, y este se
centrifug por 15 minutos
29
y este se centrifug por 15 minutos
Terminado la centrifugacin, se retir el

tubo de ensayo, y se coloc el
sobrenadante en un vial, el
Se tuvo cuidado de que la biomasa no se

combinen con el sobrenadante.
El sobrenadante depositado en los viales se

colocaron en un recipiente (taper), y este se
coloc en la refrigeradora, para su posterior
anlisis de azucares reductores. DNS.
4.8 Obtencin de la curva de Calibrado de Biomasa
Tabla 1: Diluciones De Muestra
N Diluciones ml de ml de H2O
Muestra destilada
1 1:1 5 ml 0ml
30
2 1:2 2.5 ml 2.5 ml
3 1:3 1.67 ml 3.33 ml
4 1:4 1.25 ml 3.75 ml
5 1:5 1 ml 4 ml
El matraz previamente preparado el

cual contena el medio de
fermentacin, luego empezamos a
realizar las diluciones de la tabla 1.
Se hizo por triplicado cada muestra y

luego lo llevamos 4ml de la muestras
a espectrofotmetro y lemos su
absorbancias.
31
Luego se centrifug los tubos por 15 minutos, seguido se elimin el

sobrenadante y se qued con el pellet (slido); luego se lav (dos
veces) con 5ml de agua destilada aprox. (por posibles sales que
quedan), luego se coloc el pellets al capacho, que previamente
haban sido rotulados y colocados en la estufa, para que despegue
presurizar con agua destilada. Se coloc los capachos con pellets en
la estufa, por 24 horas a 80 C.
VI. RESULTADOS Y DISCUSION
CINETICA DE CRECIMIENTO: = . /
GRUPO B1: 2.5 (g glucosa/ g sulfato de amonio)

0.18
0.175
ABSORBANCIA
0.17
0.165 32
0.16
0.155
0.15
0.145
0 2 4 6 8 10
TIEMPO

0.21
0.2
0.19
ABOSRBANCIA
0.18
0.17
0.16
0.15
0.14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
TIEMPO

0.172
0.17
0.168
ABSORBANCIA
0.166
0.164
0.162
0.16
0.158
33
0.156
0.154
0.152
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tiempo
Guindonos de las absorbancias obtenidas en estas tres experiencias se

mantuvo la concentracin de Carbono constante y aumento la concentracin
de Nitrgeno en el medio. Podemos observar en las dos primeras graficas un
crecimiento inicial, seguido de una fase estacionaria corta y posteriormente
una fase de declive o muerte. Sin embargo, en la tercera donde la
concentracin de nitrgeno es mayor (2.4 g/L) la fase estacionaria es ms
prolongada que las anteriores, adems la recta de su fase exponencial es
ms inclinada que las dos anteriores por lo que se deduce su es mayor a
las dems.
Las bacterias usadas en la

produccin de PHAs pueden ser
dividas en dos grupos basados en las
condiciones de cultivo requeridas
para la sntesis de PHA (Lee, 1995). El
primer grupo de bacterias requiere
la limitacin de un nutriente esencial
como nitrgeno, fsforo, magnesio,
potasio, oxgeno o azufre; dentro de
este grupo se encuentran R.
eutropha, Protomonas extorquens y
Pseudomonas sp. (Hang et al., 2002)
Mariana Cardona y Lina Agudelo en

2012 realizaron un estudio de los requerimiento nutricionales mnimos para

Ralstonia eutropha ATCC 17699, en el determinaron que la relacin
Carbono/Nitrgeno para no limitar el crecimiento celular era de 6,91gC/gN. Al
emplear Glucosa como fuente de carbono y Sulfato de Amonio como fuente de
nitrgeno la relacin C/N determinada fue 3,4562 g glucosa/g sulfato de
amonio.
Por tanto, si la relacin Glucosa/Sulfato de amonio que no limita el crecimiento

celular es 3.4562, para una concentracin de 3g/L de glucosa, la concentracin
34
de sulfato de amonio inicial debera ser 0.87 g/L. Tanto en B1, B3 y B3, se
utilizaron concentraciones mayores de Sulfato de amonio (1.2; 1.9 y 2.4 g/L
respectivamente) por lo que no hubo limitacin de crecimiento por parte del N.
CINETICA DE CRECIMIENTO: = . /
Grupo C1= 5.625 (g C/ g N)

0.18
0.16
0.14
0.12
Abosbancia
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo
Grupo C2= 6.25 (g C/ g N)

0.16
0.14
0.12
ABSORBANCIA
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0 2 4 6
Tiempo 8 10 12
Grupo C3= 7.5 (g C/ g N)

0.3
0.25
ABOSRBANCIA
0.2
0.15
0.1
35
0.05
0
0 2 4 6 8 10 12
TIEMPO
Las tres graficas tienen comportamientos diferentes:
- Para 5.625 (g C/ g N): se observa un crecimiento notable a las 4 horas

que cae en la siguiente toma de muestra.
- Para 6.25 (g C/ g N): no existen fases definidas, pues la absorbancia
sube y baja en cada hora.
- Para 7.5 (g C/ g N): se observa un comportamiento similar al
anterior.
Ninguna experiencia de este grupo mostro crecimiento al final de la
fermentacin.
Una metodologa propuesta por Duarte (1995) determino el siguiente

balance de materiales para la fermentacin de Ralstonia Eutropha:
Con base en esta ecuacin se estableci la relacin carbono/nitrgeno en

6.85 g C/gN para no limitar el crecimiento celular. Manteniendo esta
relacin Barboza, M. et al. en el 2005 examino el crecimiento de R.
Eutropha utilizando 3 concentraciones iniciales de fructosa (5, 10 y 15 g/L).
Examinando el comportamiento de la biomasa y el consumo de sustrato,
mediante anlisis de diseo DCA determino que no exista una diferencia

significativa entre las fermentaciones a diferentes concentraciones de
glucosa.
Las investigaciones afirman que es el nitrgeno el limitante del

crecimiento de la R. Eutropha ya que una limitacin de este unido a un
exceso de fuente de carbono hace que el microorganismo empiece la
sntesis de PHA (Gonzales et al., 2013).
36
Basados en estos estudios, nuestras curvas de cintica de crecimiento
debieron ser optimas en C2 y C3 debido a que sus relaciones de C/N era
de 6.25 y 7.5 contaban con el sustrato suficiente para el crecimiento de
biomasa. Sin embargo en nuestra experiencia no hubo crecimiento en
ambos casos, por lo que se deduce hubo problemas en la medida de los
dems nutrientes.
CINETICA DE CRECIMIENTO: Concentracin De Solucin Salina

Debido a los resultados obtenidos en los experimentos anteriores, se
decidi variar la concentracin de sales en las siguientes cinticas de
crecimiento.
Grupo D1: Con Solucion de sales a 10 mL/L

1
0.9
0.8
0.7
ABSORBANCIA
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo
Grupo D2: Sin solucion de sales

0.35
0.3
0.25
ABSROBANCIA
0.2
0.15 37
0.1
0.05
0
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo
Comparando ambos grficos es evidente la diferencia en la cintica

de crecimiento de ambas. La primera grafica conserva la misma
concentracin de sales utilizada por los grupos anteriores (10 mL/L), y
su comportamiento es similar tiene un punto de crecimiento y luego
la cepa empieza a morir. Por otro lado, en la segunda grafica donde
se sustituy la solucin de sales por agua destilada la cintica del
microorganismo es casi normal, aunque no hay una fase exponencial
clara si hay crecimiento de biomasa.
El diseo de un medio de fermentacin tiene como finalidad la eleccin de

los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formacin de
productos correspondientes al proceso a desarrollar (Shilpi, et al., 2005).
Los nutrientes se pueden clasificar en: Micronutrientes, agregados en
cantidades de gramos por litro que estn representados por las fuentes de
C, N, S, P, K y Mg; y Micronutrientes o elementos trazas representados por
las sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en
cantidades de miligramos o microgramos por litro (Repaske, 1981;
Becerra, 2013). Debido a que se necesitan en menor proporcin los
micronutrientes pueden ser aadidos por medio de soluciones salinas.(

Ramrez et al., 2004)
El efecto en el que la concentracin salina provoca cambios en un cultivo

bacteriano depende del balance osmtico requerido para tal cultivo.
Algunas bacterias requieren un nivel increblemente alto de sal para
comenzar con el cultivo, mientras que otras bacterias mueren
inmediatamente en niveles altos de sal (Ramrez et al., 2004; Gonzlez et
al., 2013; Repaske, 1981). 38
Halfilo es el adjetivo que se aplica a los organismos que viven en medios

con presencia de gran cantidad de sales (Quillaguamn, et al., 2006). Ello
es posible gracias a diversas adaptaciones fisiolgicas que les permiten
retener agua (Pohlmann, et al., 2006). Uno de los mecanismos que han
desarrollado es albergar en el interior de sus estructuras concentraciones
de un soluto compatible a las sales (cido polihidroxibutrico o PHB)
mayores que en el exterior. As el agua penetra por smosis (Jacquel et al.,
2008). R. eutropha es conocida por producir y secuestrar plsticos de tipo
Polihidroxialcanoato (PHA) cuando crece expuesta a un exceso de
azcares como sustrato (Shilpi, K. et al., 2005; Kim, et al., 2005; Barbosa, et
al., 2005).
Otro factor importante a considerar es la actividad de agua (Aw). El agua

es el sustrato de muchas reacciones metablicas (Ramrez et al., 2004). En
medios con grandes concentraciones de sales y azucares la Aw es baja,
cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con actividad de
agua menor que la que necesita, su crecimiento se detiene. Esta detencin
del crecimiento no suele llevar asociada la muerte del microorganismo,
sino que ste se mantiene en condiciones de resistencia durante un
tiempo ms o menos largo (Cramm., 2009).
Estos fundamentos explican el por qu la diferencia de las cinticas de

crecimiento D1 y D2; la Ralstonia Eutropha necesita de sales para su
crecimiento la concentracin de estas no debe ser mucha, pues la baja
actividad de agua poder producir lo de la cintica D1, una fase
estacionaria sin crecimiento de los microorganismos.
CINETICA DE CRECIMIENTO: con Solucin de sales a 1.5 mL/L
0.6
0.5
0.4 39
ABS
0.3
0.2
0.1
0
-0.5 0.5 1.5 2.5 3.5 4.5 5.5 6.5 7.5 8.5 9.5
Tiempo (h)
La cinetica de crecimiento para el medio con 1.5 mL/L de

concentracin de sales mostro una curva de crecimiento normal. Al
principio una fase de latencia hasta la tercera hora, para luego
empezar su fase exponencial hasta la 6.5 horas donde inicia su fase
estacionaria para luego entrar a la fase de muerte.
DETERMINACION DE LA CONCENTRACION (x) EN (g/L):

Reemplazando los valores de absorbancia en la ecuacin:
y = 0.4734 x + 0.0081 (Obtenido de la curva propia)

40
N Hora T(H) ABS 640 X (g/L)
Se trabaj con los datos de la cintica
1 09:21 a.m. 0 0 0.035 0.0568
2 10:51 a.m. 1.3 1.5 0.066 0.1223 de crecimiento de-Ralstonia eutropha
3 12:20 p.m. 2.3 3 0.119 0.2343 NRRL B-14690 obtenidos por el grupo
4 01:20 p.m. 1 4 0.215 0.4371 B, ya que estos son los datos ms
5 02:20 p.m. 1 5 0.363 0.7497 cercanos posibles a la realidad y que
6 03:50 p.m. 1.3 6.5 0.543 1.1299 siguen la cintica de crecimiento
7 05:20 p.m. 1.3 8 0.553 1.1510 esperada.
8 06:50 p.m. 1.3 9.5 0.530 1.1025
Curva de Crecimiento Microbiano

1.4000
1.2000
1.0000
x (g/L)
0.8000
0.6000
0.4000
0.2000
0.0000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tiempo
FASES DURANTE LA ETAPA DE CRECIMIENTO
FASE DE LATENCIA FASE EXPONENCIAL

0.5000 1.2000
y = 0.2611x - 0.5697 41
0.4000 1.0000
R = 0.9955
0.8000
0.3000
x (g/L)
x (g(L)
0.6000
0.2000
0.4000
0.1000 0.2000
0.0000 0.0000
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 0 1 2 3 4 5 6 7
Tiempo Tiempo
FASE ESTACIONARIA FASE MUERTE

1.3000 1.3000
1.2000 1.2000
x (g/L)
x (g/L)
1.1000 1.1000
1.0000 1.0000
6.3 6.8 7.3 7.8 8.3 7.8 8.3 8.8 9.3 9.8
Tiempo Tiempo
Para poder analizar en el comportamiento de la Ralstonia eutropha NRRL B-14690

teniendo como sustrato a la glucosa, tenemos primero que linealizar los datos de la
fase exponencial; as tenemos:
T(H) ABS 640 X (g/L) Ln (X/Xo)

3 0.119 0.2343 1.4165
4 0.215 0.4371 2.0401 42
5 0.363 0.7497 2.5797
6.5 0.543 1.1299 2.9900
LINEALIDAD
3.5000
y = 0.4481 x + 0.1841
3.0000
R = 0.9627
2.5000
LN /x/xo)
2.0000
1.5000
1.0000
0.5000
0.0000
2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7
Tiempo
DETERMINACIN DEL LA VELOCIDAD MXIMA DE CRECIMIENTO

EXPONENCIAL ( MAX)
Para determinar el max, luego de linealizar la curva de la fase exponencial se procedi a
trabajar con la ecuacin que obtuvimos, y la relacionamos con la ecuacin de Monod.
X
ln max .t
X0
La ecuacin lineal es: y = 0.4481x + 0.1841 43
Reemplazando las variables segn las grficas:

= 0.4481 + 0.1841
0
Entonces:
= .
Determinacin del tiempo de fermentacin:
X
ln max .t
X0
Reemplazando:
1.1025
ln = 0.4481
0.0568
= 6.6176 h
Esto es aproximadamente t = 6.62 horas.
Existen diversos
Todas estos factoresobtenidos
parmetros que pueden
son elafectar la curva
base a la velocidad mxima de
de calibracin debiomasa
crecimiento
que
como la temperatura, 2 el ph, la presin osmtica, la Aw y la concentracin
posee el valor de R = 0.997 y cuya ecuacin fue ABS = 0.4734 (Clulas g/L) + 0.0081, inicial de
sustrato
esto para(Ching-Yee y Kumar, de
hallar la concentracin 2007; Ashyby,
biomasa 2004) . alCuando
y con respecto consumoeldesustrato se
sustrato se
2
encuentra en concentraciones
utiliz la curva de calibracin dealtas es facil
DNS que poseey rpido
el valorllegar
de R a= la fase yexponencial
0.9988 cuya ecuacinya
lafuevelocidad
ABS = 1.6242 (Glucosa
mxima de g/L) 0.0193. sin embargo este crecimiento luego es
crecimiento;
limitado por la concentracin de clulas la cual produce una fase estacionaria en el
crecimiento(Barbosa,2005).
DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES:

La frmula usada fue: = . . con R2=0.998
Donde y =Absorbancia a 540 nm y x = Concentracin glucosa (g/l)

44
Glucosa La mayora de estos trabajos de
Tiempo Tubo F.D. Abs. (540 nm) Glucosa (g/L) x F.D.
(g/L) investigacin utilizan cepas
0 1 1:6 0.825 0.5199 3.1189 mutantes de R. eutropha capaces
1.5 2 1:6 0.922 0.5795 3.4772 de crecer sobre glucosa. Sin
3 3 1:6 0.921 0.5789 3.4735 embargo, la cepa nativa crece en
4 4 1:5 1.030 0.6460 3.2302 fructosa, por lo cual es necesario
5.5 5 1:5 1.013 0.6355 3.1778 establecer las condiciones para la
7 6 1:1 1.633 1.0173 1.633 acumulacin del polmero.
8 7 1:1 1.518 0.9464 1.518 Para la produccin del polmero
9 8 1:1 1.594 0.9932 1.594 por R. eutropha, la estrategia de
fermentacin ms empleada es el
cultivo por lote alimentado en el
CONSUMO DE LA FUENTE DE CARBONO cual las clulas crecen hasta una
4 determinada concentracin sin
limitacin de nutrientes, luego un
3 nutriente esencial es limitado para
Glucosa (g/L)
2
permitir la sntesis de PHAs.
Durante esta etapa, la
1 concentracin de biomasa
permanece constante
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
presentndose acumulacin de
Tiempo (Horas) polmero (Lee, 1996a; Madison y
Huisman, 1999).
PRODUCCIN DE BIOMASA Y CONSUMO DE LA GLUCOSA:
BIOMASA SUSTRATO
1.8 4
1.6 3.5 45
1.4 3
1.2
2.5
X (g/L)
1
2
0.8
1.5
0.6
0.4 1
0.2 0.5
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tiempo (hr)
En la presente grafica se puede observar la relacin que existes entre el crecimiento microbiano y el consumo de
sustrato podemos observar que el microorganismo cuando consume ms rpido el sustrato ah se da el crecimiento
exponencial.
El crecimiento exponencial depende parcialmente de la concentracin inicial del sustrato limitante (Khanna. S, 2006;
Ching-Yee y Kumar, 2007), esto implica que el cultivo pasa de un estado en el cual crece con exceso de sustrato a otro
de carencia de sustrato.
Calculo de Rendimiento celular:
Con referencia a los datos de consumo de sustrato y crecimiento microbiano:
X X0
YX / S
S0 S
N T(H) X (g/L) Glucosa (g/L)

1 0 0.0568 3.1189
2 1.5 0.1223 3.4772 46
3 3 0.2343 3.4735
4 4 0.4371 3.2302
5 5 0.7497 3.1778
6 6.5 1.1299 1.633
7 8 1.1510 1.518
8 9.5 1.1025 1.594
1.1025 0.0568
/ =
3.1189 1.594
/ = . /
Clculo de la Productividad Celular:
X X0
QX / S
t t0
1.1025 0.0568
/ =
6.6176 0
/ = 0.1580 /
La productividad de la Ralstoni eutropha se determina por la relacin entre la

biomasa producida en el tiempo. La productividad puede ser afectada por diversos
factores destacando la temperatura, el ph y la concentracin de sustratos al inicio
del cultivo. La productividad de la Ralstonia eutropha para una concentracin de
C/N de 6.91 segn Barbosa en el 2005 es de 0.1245 g/L. h, con una velocidad de
crecimiento mxima de 0.5171 h(-1)
DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES: GRUPO C1
La frmula usada fue: = . . con R2=0.998
Donde y =Absorbancia a 540 nm y x = Concentracin glucosa (g/l)
tiempo(h) Tubo F.D. Abs. Inicial Glucosa (g/L)L) Glucosa (g/L) 47

(540 nm)
0 1 1:10 1.429 0.8679 8.67935
1.5 2 1:10 1.442 0.8759 8.75939
1.5 3 1:10 1.448 0.8796 8.79633
1 4 1:10 1.420 0.8624 8.62394
1 5 1:10 1.424 0.8649 8.64857
1 6 1:10 1.443 0.8766 8.76555
2 7 1:10 1.435 0.8716 8.71629
2.25 8 1:10 1.414 0.8587 8.58700
1.5 9 1:10 1.421 0.8630 8.63009
Consumo del Sustrato

8.85000
8.80000
Glucosa (g/L)
8.75000
8.70000
8.65000
8.60000
8.55000
0 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo
Para poder determinar el comportamiento de la Ralstonia eutropha NRRL B-14690

tomando en cuenta las concentraciones utilizadas por el grupo C1 y poder compararlas
con las grficas elaboradas a partir de su comportamiento ptimo se determin su
produccin de biomasa.
LA DETERMINACION DE BIOMASA
Usando la frmula
48
y= 0.4734x+0.0081
CINETICA DE C3
N HORA Tiempo T(H) ABSORBANCIA x (g/L)

1 08:37 00:00 0 0.038 0.1099537
2 10:05 01:30 1.5 0.035 0.10127315
3 11:35 01:30 3 0.038 0.1099537
4 12:35 01:00 4 0.168 0.48611111
5 13:35 01:00 5 0.035 0.10127315
6 14:35 01:00 6 0.035 0.10127315
7 16:35 02:00 8 0.031 0.08969907
8 19:00 02:25 10.5 0.073 0.21122685
9 20:30 01:30 12 0.037 0.10706019
BIOMASA
0.6
0.5
0.4
X(g(L)
0.3
0.2
49
0.1
0
0 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo
PRODUCCION DE BIOMASA Y CONSUMO DE

SUSTRATO (C1)
0.6 8.85000
0.5 8.80000
0.4 8.75000
X(g(L)
0.3 8.70000
SUSTRATO
0.2 8.65000 BIOMASA
0.1 8.60000
0 8.55000
0 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo
DETERMINACIN DEL LA VELOCIDAD MXIMA DE CRECIMIENTO EXPONENCIAL ( MAX)
N Tiempo ABSORBANCIA X (g/L) LN(X/Xo)

1 00:00 0.204 0.414 0
2 01:30 0.194 0.393 -0.05239543
3 01:30 0.163 0.327 -0.23482458
4 01:00 0.174 0.350 -0.16621913
5 01:00 0.184 0.372 -0.10768867
6 01:00 0.167 0.336 -0.20932925 50
7 01:00 0.244 0.498 0.18580366
8 01:00 0.142 0.283 -0.38051107
9 01:00 0.212 0.431 0.04002535
10 01:00 0.112 0.219 -0.63417543
PRODUCCIN DE BIOMASA Y CONSUMO DE LA GLUCOSA:
10.0000 1.8
1.6
9.5000
1.4
9.0000 1.2
glucosa(g/l)
1
8.5000
0.8 sustrato
8.0000 0.6 biomasa
0.4
7.5000
0.2
7.0000 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
tiempo(h)
Para poder hallar el valor de mx., se debe hacer a partir de la linealidad que experimenta la etapa
de crecimiento exponencial, sin embargo en nuestra grafica no se puede identificar cual es esta
etapa ya que presenta cadas y subidas en numerosas ocasiones, lo que dificulta su identificacin,
por lo cual solamente se hall el valor de mx., tomando en cuenta la curva de crecimiento
elaborada por el grupo B.
Calculo de Rendimiento celular:
Con referencia a los datos de consumo de sustrato y crecimiento microbiano:
X X0
YX / S
S0 S
N T(H) X (g/L) Glucosa (g/L) 51

1 0 0.10127 8.8101
2 1.5 0.19097 8.8901
3 3 0.34433 8.9270
4 4 0.62211 8.7546
5 5 1.05035 8.7793
6 6.5 1.57118 8.8963
7 8 1.60012 8.8470
8 9.5 1.53356 8.7177
1.53356 0.10127
/ =
8.8101 8.7177
/ = . /
Clculo de la Productividad Celular:
X X0
QX / S
t t0
1.53356 0.10127
/ =
9.5 0
/ = 0.15 /
Vemos que el consumo de glucosa es menor en y por ello la produccin de biomasa es

minima y por ello el rendimiento es menor respecto al anterior.
VII. CONCLUSION
El diseo de la experiencia de cultivo celular por lotes en matraces, empleando

una cepa de Ralstonia eutropha NRRL B-14690 se realizo para determinar los
parmetros de la cinetica de fermentacin.
52
En la grafica de produccin de biomasa y consumo de sustrato se puede
observar la relacin que existes entre el crecimiento microbiano y el consumo
de sustrato podemos observar que el microorganismo cuando consume ms
rpido el sustrato ah se da el crecimiento exponencial.
Se diseo con las tablas en paginas anterior los medios de cultivo de para el
respectiva fermentacin.
El PH al inicio fue 7.03 y al final fue de 6.9.

VIII. REFERENCIAS BILIOGRAFICAS
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eutropha H16. J Mol Microbiol Biotechnol 16 (12): pp. 3852.
- Pohlmann, A., Fricke, W., Reinecke, F., Kusian, B., Liesegang, H., Cramm, R.,
Eitinger, T., Ewering, C., Potter, M., Schwartz, E., Strittmatter, A., Vob, I.,
Gottschalk, G., Steinbuchel, A., Friedrich, B. and Bowien, B. (2006). Genome 53
sequence of the bioplastic-producing Knallgas bacterium Ralstonia eutropha

H16. Nature Biotechnology 24 (10): pp. 12571262
- Repaske, R. (1981). Nutritional Requirements for Hydrogenomonas
eutropha. J Bacteriol. 83 (2): pp. 418422
- Shilpi Khanna , Ashok K. Srivastava. (2005). Statistical media optimization
studies for growth and PHB production by Ralstonia eutropha. Process
Biochemistry 40: 2173 - 2182
- Becerra Jimnez Monica. (2013). Produccin De Un Polmero Tipo
Polihidroxialcanoato (Pha) Empleando Residuos De La Produccin De
Biodiesel. Tesis revisada de la Universidad Nacional de Colombia
- Ramrez N, Sandoval AH, Serrano JA. (2004). Las bacterias halfilas y sus
aplicaciones biotecnolgicas. Rev. Soc. Ven. Microbiol. v.24 n.1-2
- Barbosa Marcela, Espinosa Hernndez Armando, Malagn Romero Dionisio,
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- Yolanda Gonzlez Garca, Juan Carlos Meza Contreras, Orfil Gonzlez
Reynoso
- Y Jess Antonio Crdova Lpez. (2013). Sntesis y biodegradacin de

polihidroxialcanoatos: plsticos de origen microbiano. Rev. Int. Contam.
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- Jacquel, N.; et al. (2008). Isolation and purification of bacterial poly(3-
hydroxyalkanoates). Biochem. Eng. J. 39 (1): pp. 1527.
- Mariana Cardona Betancur; Lina Mara Agudelo Escobar MsC. (2012).
54
Produccin de bioplsticos a partir de bacterias empleando sustratos no
convencionales.
Universidad de Antioquia. Grupo de Biotransformacin Escuela de
Microbiologa
- Jorge Quillaguamn ; Osvaldo Delgado; Bo Mattiasson; Rajni Hatti-Kaul.
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Production and characterization of a biodegradable poly (hydroxybutyrate-
co-hydroxyvalerate) (PHB-co-PHV) copolymer by moderately
haloalkalitolerant Halomonas campisalis MCM B-1027 isolated from Lonar
Lake, India. Bioresource Technology 110: 97659771
- Jin Seol Kim, Bong Hee Lee, Beom Soo Kim. (2005). Production of poly(3-
hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) by Ralstonia eutropha.
Biochemical Engineering Journal 23 169174.
- Lee, S. (1996). Plastic bacteria. Progress and prospects for polyhydroxy-
alkanoates production in bacteria. Trends in Biotechnology. 14: 431-438.
- Duarte. A. (1995). Introduccin a la ingeniera bioqumica. Facultad de
ingeniera de la Universidad Nacional de Colombia, Bogota.
IX. ANEXOS
DISEO DE MEDIO DE FERMENTACION
1. CALCULO DE LA MASA DE GLUCOSA Y SULFATO DE AMONIO A UTILIZAR:
Condiciones o exigencias:
(g/L) 6.0
55
(g/L) 0.8
Volumen del medio 200 ml
Datos:
ELEMENTO Peso NUTRIENTE Peso % EN

atmico molecular NUTRIENTE
(g) (g/mol)
Carbono 12.011 Glucosa 180.06 40.02
Nitrgeno 14.007 (NH4 )2 SO4 132.075 21.21
Entonces: para 200 ml de medio para la fermentacin se necesitaran

= = .

= . = .

En nutrientes serian:
.
= = .

.

.
= = .

.

2. CALCULOS DEL DISEO DEL MEDIO DE FERMENTACION: OTRAS FUENTES NO

LIMITANTES
Datos:
Elemento Peso atmico g Nutriente Peso molecular g

C 12.011 . 246.471
N 14.007 136.084
H 1.008 . 278.011
S 32.065 56
O 15.999
P 30.974
Mg 24.305
Fe 55.845
K 39.098
Entonces: para 120ml de medio
% en % en Y x/s
ELEMENTO NUTRIENTE So (g/L) So (g)
Clulas Nutriente (g/g)
Mg MgSO4 . 7H2 0.5 9.8612 19.7224 0.1141 0.02282
K K 2 HPO4 4.5 28.7307 6.3846 0.3524 0.07048*
P K 2 HPO4 3.0 22.7609 7.5870 0.2966 0.05932*
Fe FeSO4 . 7H2 O 0.2 20.0873 100.4365 0.0224 0.00448

*Se considerara el So=0.07048g debido a que por ser mayor incluye la racin de
fosforo que se requiere.
Frmulas utilizadas:
% . /
/ = ( ) =
% /
Donde n=1.5 por no ser nutriente limitante

() = ( )

CURVA DE CALIBRACION DNS (FRUCTUOSA):
N Vol. Sol. Vol. Agua FRUCTOSA ABS

Std. (ml) (ml) (1g/l) 540 nm
1 0,500 0,000 1 1.538
2 0,400 0,100 0.8 1.258
3 0,300 0,200 0.6 0.891
4 0,200 0,300 0.4 0.602
5 0,100 0,400 0.2 0.268 57
6 0,050 0,450 0.1 0.166
7 0,000 0,500 0 0
Curva de Calibrado DNS

1.8
1.6
1.4
1.2 y = 1.551x - 0.0121

ABSORBANCIA (nm)
R = 0.9984
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
-0.2
FRUCTOSA (g/L)
CURVA DE CALIBRACION DNS (GLUCOSA):
Vol. Sol. Vol. Agua

N GLUCOSA ABSORBANCIA
Std. (ml) (ml)
1 0,500 0,000 1 1.588
2 0,400 0,100 0.8 1.306
3 0,300 0,200 0.6 0.972
4 0,200 0,300 0.4 0.602
5 0,100 0,400 0.2 0.297
58
6 0,050 0,450 0.1 0.135
7 0,000 0,500 0 0
Curva de calibrado de DNS

1.8
1.6
1.4
y = 1.6242 x - 0.0193
1.2 R = 0.9988
ABSORBANCIA
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
-0.2
concentracion de glucosa (g/l)
CURVA DE CALIBRACION DE BIOMASA:
GRUPO A:
A-1:
Para la dilucin 1:1 se realiz 3 repeticiones, obtenindose:
NUMERO DE PESO PESO PESO CONCENTRACION

ABSORBANCIA
CAPACHO INICIAL(g) FINAL(g) SECO(g) (g/L)
A1-1 0.039 0.1914 0.1957 0.0043 1.075
A1-2 0.041 0.1517 0.1572 0.0055 1.375
A1-3 0.04 0.1689 0.1744 0.0055 1.375
ABS PROMEDO 0.04 0.0051 1.275
Datos obtenidos por regla de tres:
IDEAL
NUMERO DE PESO PESO FINAL PESO SECO
ABSORBANCIA CONCENTRACION (g/L)
CAPACHO INICIAL(g) (g) (g)
PROMEDIO 0.04 1.275
A1-4 0.028 0.8925
A1-5 0.022 0.70125
A1-6 0.018 0.57375
A1-7 0.012 0.3825
BLANCO 0 0
(IDEAL)
0.045
0.04
ABSORBANCIA A 640 nm 0.035 y = 0.0314 x - 1E-17 60
0.03 R = 1
0.025
0.02
0.015
0.01
0.005
0
-0.005 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
CONCENTRACION (g/L)
Datos obtenidos de la experiencia en laboratorio:
REAL
NUMERO DE PESO PESO PESO CONCENTRACION
DILUCION DILUCION ABSORBANCIA
CAPACHO INICIAL(g) FINAL (g) SECO (g) (g/L)
PROMEDIO 1 - 1. 4 inoculo+ 0 agua 0.04 0.0051 1.275
A1-4 1 - 2. 2.5 inoculo+2.5 agua 0.028 0.1568 0.1626 0.0058 1.16
A1-5 1 - 3. 2 inoculo+4 agua 0.022 0.1842 0.1904 0.0062 1.033333333
A1-6 1 - 4. 1 inoculo+3 agua 0.018 0.2156 0.2188 0.0032 0.8
A1-7 1 - 5. 1 inoculo + 4 agua 0.012 0.1667 0.1705 0.0038 0.76
BLANCO 0 0
REAL
0.045
61
0.04
0.035
0.03 y = 0.028x - 0.0034
R = 0.8717
ABSORBANCIA
0.025
0.02
0.015
0.01
0.005
0
-0.005 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
-0.01 CONCENTRACION (g/L)

62

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DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO

CELULAR POR LOTES DE Ralstonia

LAZARO CAJUSOL Jeniffer

Ing. Augusto Castillo Caldern

4.6 Preparacin Del Medio De Fermentacin para la Cintica. ...................................... 26

En el presente trabajo aborda todo lo referente al desarrollo del inculo y cultivo

Este trabajo se inicio realizando su manipulacin desde su estado en forma de cepa

La experiencia consisti en obtener la cintica de crecimiento de Ralstonia

Para el caso de las conclusiones se evalu tanto el crecimiento de biomasa y

El objetivo general en la prctica fue disear y realizar una experiencia de

En la actualidad muchos de los alimentos son obtenidos gracias al manejo y

La bacteria Ralstonia eutropha NRRL B-14690 es la ms utilizada en la

Concentracin de biomasa permanece constante presentndose acumulacin

Es as que para esta prctica hemos centrado nuestra atencin en el

La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de fermentacin es

Los componentes de los medios constituyen los efectores externos de

Disear y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en matraces,

Disear y preparar los medios de cultivo para Ralstonia eutropha NRRL B-

IV. MATERIALES Y METODOS

3.1 MATERIALES INSTRUMENTOS Y REACTIVOS

Material Biolgico: Ralstonia eutropha NRRL B-14690

3.2 METODOLOGIA EXPERIMENTAL

3.2.1 DISEO DE MEDIOS DE CULTIVO:

Para la formulacin del diseo de cultivo se tiene en cuenta los siguientes

A. Formula estimada del m.o.:

- Fuente de Carbono : Glucosa

- Fuente de Nitrgeno : Sulfato de amonio

- Fuente de Potasio : Fosfato bicido de Potasio

- Fuente de Magnesio : Sulfato de Magnesio Heptahidratado

- Estado del medio : liquido

- Velocidad de agitacin : 200 rpm

D. REFERENCIAS DE COMPOSICIN DE MEDIOS DE MANTENCIN,

Ajustar pH: 7.0

Ajustar pH: 7.0

Ajustar pH: 7.0

*Las concentraciones de los componentes del medio de cultivo para la

E. COMPSICION DE LOS MEDIOS A UTILIZAR EN ESTA PRCTICA:

- TABLA N01: Medio solido de mantencin PGY-Agar para 50 ml

Ajustar pH: 7.0

- TABLA N02: Medio Liquido de Activacin para 20 ml

Ajustar pH: 7.0

- TABLA N03: Medio de Fermentacin de Ralstonia eutropha NRRL B-14690

Ajustar pH: 7.0

**Los clculos de estas concentraciones y pesos se detallan en ANEXO 1 y

Nutriente Concentracin (g/l)

Fuente: Wang y Yu, (2001)

3.2.2 PREPARACION DE MEDIOS Y PROGRAMA DE MUESTREO:

La precisin y concentracin durante la preparacin de los medios son factores

A. PREPARACION DEL Medio solido de mantencin PGY-Agar (50 ml)

PESAR <Nutrientes Tabla N01>

<Ebullicin por 1 minuto>

DIVIDIR <7 ml en 6 tubos de ensayo c/t>

<Autoclave 121C-20 minutos>

ENFRIAR <Tubos inclinados/ T ambiente>

B. SIEMBRA EN MEDIO DE MANTENCION:

C. PREPARACION DEL Medio liquido de activacin (30 ml)

Para la preparacin de este medio lquido, previamente se deben esterilizar

- TUBO 01: Extracto de levadura enrasado a 5ml con agua destilada.

Los pesos de cada nutriente se extraen de la TABLA N02:

ENFRIAR <Temperatura ambiente>

AGITAR <Varilla de vidrio>

ESTERILIZAR <121C por 15 minutos >