UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS- ESPE

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y AGRICULTURA

CARRERA DE INGENIERA AGROPECUARIA IASA-1

Tema: Evaluacin in vitro de Micorriza sp. sobre Botrytis

cinerea.

Autores: LORENA LOAIZA (MICROBIOLOGIA 3-B)

JAIME CEDEO (MICROBIOLOGIA 3-B)

SEMESTRE ABRIL - AGOSTO 2017

 INDICE

1. Captulo I
Introduccin
1.1. Introduccin.2
1.2. Formulacin del problema...3
1.3. Justificacin.4
1.4. Objetivos..5
1.4.1. Objetivo general...5
1.4.2. Objetivos especficos...5
1.5. Fundamento terico .6
1.6. Hiptesis9
2. Captulo II
Material y mtodos
2.1. Ubicacin de la investigacin. ..10
2.2. Materiales...10
2.3. Mtodos.....10

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 Captulo I
1.1. Introduccin
La cebolla es de las hortalizas ms cultivadas en el Ecuador, cuya produccin est
valorada en ms de 1 000 millones de dlares anuales. En trminos de produccin y
consumo nacional, o como producto de exportacin, Allium sepa es un producto
importante (Yumbay, 2011).
El cultivo de cebolla es afectado por algunas plagas y enfermedades que comprometen la
calidad del bulbo, afectando su comercializacin; una de ella es la pudricin caf o botritis
producida por el hongo fitopatgeno Botrytis cinerea, el mismo que produce una
disminucin en la productividad de un 5 a 10%. A este mismo se lo controla eficazmente
con fungicidas qumicos (Quinche, 2009).
La aplicacin de microrganismos para controlar plagas llega con la necesidad de producir
alimentos libres de elementos qumicos o txicos para la salud. De esta manera el gnero
de microrganismos Micorrizas sp. Tiene resultados favorables en control biolgico de
ciertos patgenos como Fusarium, Phytophthora etc. igualmente en nematodos y
bacterias (Carreon et al., 2008).
Sin embargo, la mayora de estos estudios han sido realizados bajo condiciones ex vitro,
en invernadero o campo. Hasta el momento no se han realizado estudios de la respuesta
de la cebolla (Allium cepa) al control biolgico de fitopatgenos in vitro (Quinche, 2009).

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 1.2.Formulacin del problema
La cebolla (Allium cepa) es un cultivo que se presenta dentro de las operaciones agrcolas
de pequea y gran escala en tiempo real, pues hay gran nmero de variedades con distinta
adaptacin a los diferentes medios en donde son producidas. La superficie total plantada
de cebolla en el mundo asciende a ms de 2 millones de hectreas, producindose 32.5
millones de toneladas anuales. Es por esto que a la cebolla se le da un extenso cuidado
durante su desarrollo ya que esta es vulnerable a varias enfermedades, entre ellas est la
ms comn que es la Botrytis o pudricin caf producida por el hongo llamado Botrytis
cinerea (Herbario virtual, 2013).

Las enfermedades causadas por Botrytis cinerea quiz sean las ms comunes y ms
ampliamente distribuidas de hortalizas, plantas ornamentales, frutales, etc. Las cuales
aparecen principalmente en forma de tizones de inflorescencias y pudriciones del fruto,
pero tambin como pudriciones del tubrculo, como el bulbo y races. Esta enfermedad,
es uno de los problemas ms graves de los cultivos que aqueja a pequeos, medianos y
grandes productores hoy en da. (Museo Nacional de Historia Natural, 2015)
Los productores cada ao invierten mucho dinero para controlar y evitar la enfermedad
con productos qumicos que pueden contaminar al planeta y ser perjudiciales en la salud
del hombre. Para ello se platea nuevas alternativas de control biolgico como el empleo
de micorrizas ya que estas pueden inhibir en el desarrollo de la Botrytis cinerea,
generando as un tratamiento amigable con el bolsillo y el medio ambiente (Museo
Nacional de Historia Natural, 2015).

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 1.3.Justificacin
El presente proyecto de investigacin pretende evitar el uso de agroqumicos y fungicidas
ya que estos suelen filtrase mediante el suelo o el aire, y crean una cierta contaminacin
en medio ambiente mientras se estn aplicando, tienen alta toxicidad para los seres
humanos as perjudican la salud a largo plazo, por este motivo lo remplazaremos por el
mtodo de control biolgico in vitro siendo este sustentable para el ecosistema y as
producir alimentos libres de qumicos y sin agotar los recursos naturales. (Perez , 2011)

La ubicacin geogrfica del pas es una ventaja para la produccin de cebolla. Por lo
general, esta hortaliza est presente en todas las comidas diarias de los ecuatorianos, y
por ese motivo es que un buen nmero de ecuatorianos estamos expuestos a los residuos
de los agroqumicos utilizados para, ya sea tratamiento o prevencin de plagas y
enfermedades, y con ello vienen problemas de salud para el consumidor. Por tal motivo
se busca nuevos mtodos de control de plagas como el planteado en este proyecto, ya que
en l se investigar un mtodo, poco aplicado a nivel regional, de tratamiento para una de
las enfermedades ms comunes que afecta este popular alimento, la cual es el botritis,
utilizando el control biolgico de esta por medio de micorrizas para as generar un
tratamiento ms amigable con el medio ambiente y con la salud del consumidor. (Vera,
2009)

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1.4.Objetivos

1.4.1. Objetivo general

Evaluacin in vitro de Micorriza sp. sobre Botrytis cinrea en cultivo de cebollas

1.4.2. Objetivos especficos

Obtener cepas puras de Micorriza sp. y de Botrytis cinrea.

Realizar un control biolgico de Botrytis cinrea con cepas de Micorriza sp. como
agente inhibidor.

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 1.5. Fundamento Terico

I) Botrytis cinrea
El moho gris (Botrytis cinerea) y sus cepas causan la necrosis de las flores, las hojas, las
yemas, los brotes, las plntulas y las frutas de las plantas. Tanto las plantas herbceas
como las leosas son susceptibles a esta enfermedad. Esta enfermedad no tiene
hospederos especficos. El moho gris puede infectar a cientos o miles de plantas. La
infeccin ocurre en condiciones de humedad. Cuanto ms hmeda est la planta, ms
riesgo correr de infectarse de moho gris. La cantidad de zonas infectadas ha aumentado
como as tambin la cantidad de plantas atacadas y el grado de gravedad de las infecciones
(desarrollo ms rpido de la enfermedad y necrosis del tejido). (Enriquez , 2012)
El botritis a veces se confunde con los daos que se manifiestan cuando las plantas
envejecen o con el dao que causan los trips. Revise los ptalos atentamente para
diferenciar la marchitez causada por el envejecimiento de la que causa la enfermedad. La
marchitez causada por el envejecimiento debe ocurrir primero en los ptalos externos y
en los bordes o en la punta. Cuando los ptalos internos o el centro de los ptalos
desarrollan lesiones marrones primero, la causa probablemente sea el moho gris. En las
hojas delgadas como las del rbol de Judea, las lesiones son irregulares de color marrn
claro a marrn. En las hojas ms carnosas como las del rododendro se ven anillos
concntricos de distintos tonos del marrn. (Enriquez , 2012)
Los sntomas varan segn el tipo de planta atacada, la parte de la planta atacada y las
condiciones de crecimiento. Cuando hay mucha humedad se puede ver un entretejido fino
gris (micelio). Generalmente, en ese tejido se forma una estructura denominada
conidiforo que contiene esporas. Las plantas infectadas liberan las esporas de la
enfermedad en forma de nubes cuando por alguna razn se mueven. La humedad tambin
acelera la liberacin de las esporas. La mala circulacin de aire tambin contribuye a la
supervivencia y al desarrollo de la enfermedad. Cuando la temperatura oscila entre los 68
y 76 F y la humedad es elevada, la enfermedad demora aproximadamente 20 horas para
comenzar a infectar. El clima clido a muy caluroso y seco contribuye a reducir o detener
el desarrollo y la diseminacin de la enfermedad. (Gonzlez, 2006)

Imagen1: Micrografa electrnica de una cepa de Botrytis cinrea. Imagen obtenida de Google imgenes

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 II) Micorrizas
La palabra micorriza, de origen griego, define la simbiosis entre un hongo (mycos) y
las races (rhizos) de una planta. Como en muchas relaciones simbiticas, ambos
participantes obtienen beneficios. En este caso la planta recibe del hongo principalmente
nutrientes minerales y agua, y el hongo obtiene de la planta hidratos de carbono
y vitaminas que l por s mismo es incapaz de sintetizar mientras que ella lo puede hacer
gracias a la fotosntesis y otras reacciones internas. Se estima que entre el 90 y el 95% de
las plantas terrestres presentan micorrizas de forma habitual. (Carren, Gmez, &
Martnez, 2008)
La asociacin simbitica se establece entre las races de plantas leosas de las
familias Pinaceae, Fagaceae, Nothofagaceae, Myrtaceae y Dipterocarpaceae, las hifas de
hongos de los filos Glomeromycota, Basidiomycota y Ascomycota. Al inicio de la
colonizacin el hongo forma un manto constituido de hifas fngicas que rodean el pice
de la raz; luego otras hifas penetran el espacio intercelular entre las clulas radiculares,
formando lo que se conoce como la red de Hartig. Es aqu en la red de Hartig donde se
lleva a cabo el intercambio de nutrientes, minerales y agua: el hongo absorbe agua y
minerales que luego transloca hacia la planta y en retorno la planta le provee azcares y
otros productos de la fotosntesis al hongo. Dentro de varios de los efectos positivos que
le brindan los hongos ectomicorrcicos a su hospedero, el ms importante se le atribuye
al micelio extra radical que aumenta la cantidad de toma de minerales disueltos. (Herbario
virtual, 2013)
La movilizacin de nutrientes se puede dar por una va enzimtica que le permite al hongo
utilizar nitrgeno orgnico y fsforo, o por la liberacin de cidos orgnicos
movilizando calcio, magnesio y potasio, entre otros. Las hifas excretan
principalmente cido oxlico que ayuda a desgastar las superficies rocosas; adems el
dimetro que presenta el pice de una hifa comparado con el pice de una raz, le confiere
una gran ventaja a la planta pues le permite explorar sustratos a los cuales no podra
alcanzar sin la asociacin con su hongo ectomicorrcico. (Perez , 2011)
Es posible que un hongo forme micorrizas con ms de una planta a la vez, establecindose
de este modo una conexin entre plantas distintas; esto facilita la existencia de
plantas parsitas (algunas de las cuales ni siquiera realizan la fotosntesis, como las
del gnero Monotropa), que extraen todo lo que necesitan del hongo micobionte y las
otras plantas con las que ste tambin establece simbiosis. As mismo, varios hongos (en
ocasiones de especies diferentes) pueden micorrizar una misma planta al mismo tiempo.
(S.N, 2015)

Imagen2: imagen de una asociacin simbitica entre un hongo y la raz de una planta de papa. Imagen obtenida de http://agriculturers.com

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III) Cebolla (Allium cepa)
Es una planta herbcea bienal perteneciente a la familia de las amarilidceas. Es la
especie ms ampliamente cultivada del gnero Allium, el cual contiene varias especies
ms que se denominan cebollas y que se cultivan como alimento. Ejemplos de las
mismas son la cebolla de verdeo (Allium fistulosum), la cebolla escalonia (Allium
ascalonicum) y la cebolla de hoja o ciboulette (Allium schoenoprasum). (Vera, 2009)
La cebolla es el bulbo subterrneo y comestible que crece en la planta del mismo nombre.
Se trata de una hortaliza de origen asitico cultivada desde 6.000 a.C. Desde Asia se
extendi por Europa, de donde pas a Amrica. Actualmente existe una amplia gama de
variedades, que pueden clasificarse en funcin del color del bulbo, forma, tamao, usos,
origen y precocidad. Tiene muchos usos culinarios, pudiendo usarse de distintas maneras,
ya sea cruda o cocinada. Adems, se le conocen distintas propiedades medicinales. (Perez
, 2011)

Imagen3. Imagen de una Cebolla (Allium cepa) comn obtenida de Google imgenes.

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1.6. Hiptesis
El control biolgico de Botritis cinerea en el cultivo de cebolla (Allium cepa)
utilizando micorrizas, genera un mtodo ms sustentable para tratamiento de la
enfermedad en la planta, dejando de lado el uso de agroqumicos.

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 Captulo II
3. Materiales y mtodos

3.1. Ubicacin de la Investigacin

3.1.1. Provincia: Pichincha
3.1.2. Cantn: Rumiahui
3.1.3. Lugar: Hacienda el Prado IASA-1
3.1.4. Latitud: 02320 S
3.1.5. Longitud: 782444 E
3.1.6. Altitud: 2748 m.s.n.m.
3.1.7. Piso altitudinal: Montano Bajo
3.1.8. Regin latitudinal: Templado
3.1.9. Zona de vida: Bosque Hmedo
3.1.10. Provincia de humedad: Hmedo
3.1.11. Clasificacin bioclimtica: Hmedo Temperado
3.1.12. Formacin vegetacional: Bosque hmedo montano
3.1.13. Piso zoo geogrfico: Temperado- Alto andino.

3.2. Materiales

Equipo Microorganismos Reactivo

Cepas de:
Autoclave Trichoderma spp. PDA (Agar papa
dextrosa)
Cmara de flujo laminar Micorriza sp.
Cajas petri
Parafilm
Incubadora
Mechero
Asa de inoculacin
Matraz graduado
Balanza

3.3. Mtodos

3.3.1. Recoleccin hongos patgenos:

Se colecto diferentes muestras de la cebolla que estn infectadas con Botrytis cinerea.
Posteriormente se coloc las muestras en bolsas con cierre Ziploc, roseando con agua
para que el hongo esporule durante una semana.
3.3.2. Preparacin de medios de cultivo:
Se realiz un medio de cultivo; pesando 40 gramos de PDA y se disolvi en 500 cc de
agua destilada que est caliente, luego se esper que todo el sustrato est completamente
disuelto.

- 10 -
Se esterilizo el medio de cultivo en la autoclave en una temperatura de 121 C durante
15 minutos.
Se sac el agar de la autoclave y se dej que se enfre por 7 minutos para posteriormente
se coloc cierta cantidad en las cajas Petri.
Se puso las cajas Petri listas en el refrigerador para luego ser utilizadas en el cultivo de la
muestra.
3.3.3. Cultivo del hongo patgeno:
Se encendi el mechero para proceder con el cultivo de la muestra.
Se desinfecto y flameo el asa de inoculacin.
Con el asa de inoculacin estril se tom una pequea muestra de la bolsa Ziploc que
contiene al hongo esporulado (Botrytis cinerea), recordando que todo este proceso se
realiz detrs de la llama del mechero de Bunsen para evitar que el cultivo se contamine.
Se coloc la muestra de Botrytis cinerea en el medio de cultivo de agar papa dextrosa.
Proceder a flamear los bordes de la caja Petri.
Luego se sell la caja Petri con papel para film.
Se coloc nuestro cultivo a la incubadora de laboratorio, la cual se encontro a 23 C,
procurando que la tapa de la caja Petri est boca abajo para proporcionar una adecuada
humedad al medio de cultivo.
3.3.4. Cultivo del hongo benfico:
Se encendi el mechero para proceder con el cultivo de la muestra.
Se desinfecto y flameo el asa de inoculacin.
Con el asa de inoculacin estril se tom una pequea muestra de un medio de cultivo
adulto de Micorriza sp, recordando que todo este proceso se debe realizar detrs de la
llama del mechero de Bunsen para evitar que el cultivo se contamine.
Se coloc la muestra de Micorriza sp en el medio de cultivo de agar papa dextrosa.
Se procedi a flamear los bordes de la caja Petri.
Luego se sell la caja Petri con papel para film.
Se llev a nuestro cultivo a la incubadora de laboratorio, la cual se encontraba a 23 C,
procurando que la tapa de la caja Petri est boca abajo para proporcionar una adecuada
humedad al medio de cultivo.
Evaluacin del antagonismo
La evaluacin de la capacidad antagnica in vitro se efectu en PDA por medio de la
tcnica de cultivos duales, la cual consiste en colocar en un extremo de la caja Petri los
microorganismos a estudiar, y medir el halo de crecimiento de cada microorganismo;

- 11 -
 El que el biocontrolador (Micorriza sp.) crezca significa que acta de manera
antagnica e inhibe el crecimiento de Botrytis cinrea
El que Botrytis cinrea crezca ms que Micorriza sp. Significa que Micorriza
sp. No es un hongo antagnico.

Caja Petri 1: Colocar en un extremo de la caja Petri 1 un disco de 5 mm de diametro, del

medio de cultivo que contenia el antagonista (Botrytis cinrea) y en el otro extremo de la
caja un disco del medio que contena el biocontrolador (Micorriza sp )

- 12 -
Bibliografa
Carren, Y., Gmez, N., & Martnez, M. (2008). Las micorrizas arbusculares en la proteccin
vegetal. Morelia-Michoacn-Mxico.

Enriquez , P. (17 de Febrero de 2012). Universidad de Chile . Obtenido de

http://extension.illinois.edu/focus_sp/graymold.cfm

Gonzlez, M. (5 de abril de 2006). EcuRed. Obtenido de EcuRed:

https://www.ecured.cu/Fumagina

Herbario virtual. (2013). Obtenido de Fumagina en ctricos:

http://herbariofitopatologia.agro.uba.ar/?page_id=298

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FUMAGINA: http://www.mnhn.cl/613/w3-article-52856.html

Perez , A. (14 de Enero de 2011). Tipos de contaminacin . Obtenido de

https://tiposdecontaminacion.net/ventajas-y-desventajas-de-los-fungicidas/

S.N. (20 de MAYO de 2015). GREENPEACE. Obtenido de GREENPEACE:

http://www.greenpeace.org/espana/Global/espana/2015/Report/agricultura/Plaguici
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Vera, V. (4 de Julio de 2009). EL COMERCIO. Obtenido de EL COMERCIO :

http://www.elcomercio.com/actualidad/limon-tahiti-mas-productivo.html

- 13 -
 Captulo III

4. Resultados
- En el antagonismo entre Botrytis cinrea y Micorriza spp. se observ que el hongo
predominante es Botrytis cinrea con un amplio crecimiento en casi toda la caja
Petri dejando a la micorriza sin espacio para desarrollarse y crecer se aproxima un
crecimiento de 2 y 0,5 cm por da respectivamente.

- En la caja Petri con Thricoderma spp. y Botrytis cinrea ubicados en los extremos
de estas se logr observar que la Trichoderma spp. se desarroll de manera ms

- 14 -
 amplia de manera que la Botrytis spp. tuvo que de manera inmediata inhibir su
crecimiento se aproxima un crecimiento de 2 cm y 1cm por da respectivamente.

- En la competencia de crecimiento entre Trichoderma spp. y Micorriza spp.

predomin el hongo Trichoderma spp. el cual invadi por completo la caja Petri
dejndolo en un lugar sumamente aislado a la micorriza impidiendo totalmente
desarrollo de este, se aproximan medidas de crecimiento de 3cm y 3mm diarios
respectivamente.

- Finalmente se coloc en una caja Petri los tres hongos netamente como prueba
de observacin y el resultado obtenido fue predominio de Trichoderma sp.
aislando a los otros dos hongos.

Captulo IV
5. Discusin

- La capacidad antagonista de Trichoderma spp. frente a otros hongos ha sido

estudiado incontables veces y diferentes maneras. Este hongo presenta una
alta agresividad ante presencia de otros microorganismos. En nuestra
investigacin el estudio de tres hongos diferentes dio datos sobre la naturaleza
de Tricoderma, pues este tuvo un efecto abrasivo en nuestros medios los
mismos que colonizo en una buena parte.

- 15 -
 - Otros estudios de Trichoderma spp. obtuvieron los mismos resultados
antagnicos utilizando mtodos diferentes de aplicacin y siembra de los
mismos, como lo cita Martnez (2013), en su estudio de Trichoderma y su
funcin en el control de plagas en los cultivos, con la diferencia de la
extensiva aplicacin y siembra del mismo en diferentes medios.

- Por otra parte queda demostrado la eficacia de Trichoderma spp. como bio
controlador de plagas como el caso de Botrytis cinrea que afecta a varios
tipos de cultivos y en caso de esta investigacin, en cultivo de rosas, el mismos
que pudre los tallos y petalos de la flor.

Captulo V

1.1. Conclusiones

1.- Al efectuar el proyecto se observ que los hongos colocados Trichoderma sp y

Micorriza spp. sobre Botrytis cinrea (hongo patgeno de las rosas) el hongo que inhibio
completamente el crecimiento y desarrollo de Botrytis cinrea es el hongo Trichoderma
sp. actuando como un notorio antibitico sobre Botrytis cinrea y siendo un hongo con
efectos beneficiosos no solo en el suelo sino tambin frente a otro hongo.

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2.- Al aislar Micorriza spp. en una caja Petri se identific colonias helicoidales de color
blanco brillante- cristalino creciendo a medida de 1cm diario con gran cantidad de esporas
(observadas en microscopio) y con hifas largas y abundantes.

3.- Trichoderma sp. aislada en caja Petri present un color verde-gris-cenizo con una
apariencia similar a arena con grumos gruesos y un tanto brillantes con pequeos crculos
(colonias) de dimetro y altura considerable los cuales son observables a simple vista,
este hongo tuvo un crecimiento de 1.5 2 cm diarios.

4.- Se observ que al aislar el hongo Botrytis cinrea este present un color verde fuerte
con pequeas colonias en toda la caja Petri y gran cantidad de esporas; se consider un
desarrollo de 0.5 a 0.8 cm por da.

Captulo VI
6.1. Recomendaciones
- Los estudios realizados son exclusivamente pruebas in vitro, las mismas que
pueden tener otros resultados en campo variando en los efectos que pudimos
obtener.

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 - Los factores climticos pueden afectar el resultado de nuestro experimento, por lo
que se recomiendo realizar estudios en diferentes pisos climticos.

- Aplicar antagonismo de los microorganismos estudiados, con otros organismos, y

comparar la eficacia que se podra obtener con los hongos que no lograron
desarrollarse por efecto del ser con caractersticas ms agresivas de colonizacin.

- Realizar un seguimiento de cultivos de rosas y de su incidencia en la

contaminacin con Botrytis cinrea, y determinar causas o patrones de su
aparicin.

Bibliografa
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vegetal. Morelia-Michoacn-Mxico.
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CONTROL DE SIGATOKA NEGRA (Paracercospora fijiensis M.) EN EL CULTIVO DE
BANANO (Musa paradisiaca) EN FASE DE LABORATORIO. Santo Domingo-Ecuador.
Yumbay, R. M. (2011). EVALUACIN DE CEPAS DE Trichoderma spp. EN EL CONTROL DE
Botrytis cinerea EN EL CULTIVO DE ROSAS. Sangolqu-Quito-Ecuador.

- 18 -
AGRIOS, G., 1995. Fitopatologa. Mxico. Editorial. Limusa. 281, 419-423 pp.
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ECUAQUIMICA, C. A., 2003. Manejo integrado de los principales problemas fitosanitarios en
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MUOZ, L., 1997. Plantas medicinales y aromticas. Espaa. Editorial. MundiPrensa. 282-
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Camargo-Ricalde S.L. 1999. Hongos micorizgenos arbusculares. ContactoS, 31: 62-67.
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Smith S.E. y Read D.J. 1998. Micorrhizal symbiosis, San diego USA, Academic. Press.
Capitulo VIII
8.1. Anexos

- 19 -
Antagonismo Figura N.2 Antagonismo Botrytis
spp. y Botrytis cinerea y Micorriza spp.
erea

Figura N.3 Antagonismo

Trichoderma spp. y Micorriza spp.

ELABORACIN DE UN BIOPREPARADO A PARTIR DE TRICHODERMA PARA EL

CONTROL DE BOTRYTIS CINEREA

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