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PROGRAMA EDUCATIVO:
INGENIERA AMBIENTAL
TESIS
Presenta
SUSANA RODRGUEZ AGUILAR
Director
Dr. Oswaldo Guzmn Lpez
Codirector
Dr. Csar Espinoza Ramrez
A Dios
Por permitirme vivir y darme la dicha de alcanzar una de mis ms grandes ilusiones.
A mis padres
Por la confianza que tuvieron en mi para desarrollar esta investigacin, por toda su ayuda y
por la paciencia que me tuvieron durante todo este tiempo.
A mi familia
Que ha estado a mi lado en todo momento, pero en especial a Lisbet por escucharme todos
estos meses y siempre tener la palabra correcta para darme nimos.
A mis amigos
M.A Mara Ariadna Escalante Rebolledo y Dr. Guillermo Mendoza Cervantes. Por el
tiempo brindado en la realizacin de esta tesis.
Por el apoyo brindado, por compartirme sus conocimientos, amenizar los das de trabajo y su
preocupacin durante la realizacin de este proyecto. Gracias a todos y cada uno de
ustedes.
A todos y cada uno de ustedes por las aventuras que compartimos este tiempo. Les deseo
todo el xito del mundo.
RESUMEN
I
1.4.1 Fundamentos bioqumicos .................................................................... 23
1.4.2 Factores que condicionan la biorremediacin ....................................... 24
1.4.3 Microorganismo para la biorremediacin .............................................. 27
CAPTULO II MATERIALES Y MTODOS ...................................................... 33
2.1 Anlisis fsicos y qumicos del suelo....................................................... 34
2.1.1 Determinacin de textura (Mtodo de Bouyoucus) ............................... 34
2.1.2 Determinacin de humedad (Mtodo gravimtrico)............................... 34
2.1.3 Determinacin de pH (Mtodo potenciomtrico) ................................... 35
2.1.4 Determinacin de la materia orgnica (Mtodo de Walkey-Black) ....... 35
2.1.5 Determinacin de nitrgeno orgnico (Mtodo matemtico) ................. 35
2.1.6 Determinacin de nitratos (Mtodo colorimtrico) ................................. 35
2.1.7 Determinacin de fosforo (Mtodo de Olsen) ........................................ 36
2.1.8 Determinacin de hidrocarburos totales del petrleo (HTPs). (Mtodo de
extraccin agitacin centrifugacin) ............................................................ 36
2.2 Anlisis Microbiolgicos........................................................................... 37
2.2.1 Fase I: Bacterias totales del suelo contaminado por la tcnica de dilucin
en placa para conteo de unidades formadoras de colonias (UFC). ............... 37
2.2.2 Fase II: Conteo, aislamiento y purificacin de bacterias
hidrocarburoclastas por la tcnica de dilucin en placa ................................. 37
2.2.3 Fase III: Pruebas para la identificacin de gnero de bacterias
hidrocarburoclastas. ....................................................................................... 38
CAPTULO III RESULTADOS Y DISCUSIN.................................................. 43
3.1 Anlisis fsicos y qumicos ....................................................................... 44
3.1.1 Textura .................................................................................................. 44
3.1.2 Humedad ............................................................................................... 45
3.1.3 pH.......................................................................................................... 46
3.1.4 Materia orgnica y nitrgeno orgnico .................................................. 47
3.1.5 Nitratos .................................................................................................. 48
3.1.6 Fsforo .................................................................................................. 48
3.1.7 Cuantificacin de hidrocarburos totales del petrleo. (HTPs) ............... 49
3.2 Anlisis microbiolgicos .......................................................................... 49
II
3.2.1 Fase I: Conteo de bacterias totales del suelo contaminado .................. 49
3.2.2 Fase II: Bacterias hidrocarburoclastas .................................................. 52
3.2.3 Fase III: Identificacin de gnero. ........................................................ 58
4. CONCLUSIONES. ............................................................................................ 67
5. RECOMENDACIONES. .................................................................................... 68
REFERENCIAS..................................................................................................... 69
ANEXOS .............................................................................................................. 74
ANEXO I. METODOLOGA ANLISIS FSICOS Y QUMICOS DEL SUELO ...... 75
A1.1 Determinacin de textura (Mtodo de Bouyoucus) ................................... 75
A1.2 Determinacin de humedad (Mtodo gravimtrico) .................................. 77
A1.3 Determinacin de pH (Mtodo potenciomtrico) ....................................... 77
A1.4 Determinacin de la materia orgnica (Mtodo de Walkey-Black) ........... 78
A1.5 Determinacin de nitrgeno orgnico (Mtodo matemtico) ..................... 79
A1.6 Determinacin de nitratos (Mtodo colorimtrico) ..................................... 79
A1.7 Determinacin de fsforo (Mtodo de Olsen)............................................ 80
A1.8 Determinacin de hidrocarburos totales del petrleo (HTPs). (Mtodo de
extraccin agitacin centrifugacin) ................................................................ 80
ANEXO II. METODOLOGA ANLISIS MICROBIOLGICOS ............................. 82
A2.1 Fase I: Bacterias totales del suelo contaminado por la tcnica de dilucin
en placa para conteo de unidades formadoras de colonias (UFC) .................... 82
A2.2 Fase II: Conteo, aislamiento y purificacin de bacterias hidrocarburoclastas
por la tcnica de dilucin en placa ..................................................................... 84
A2.3 Fase III: Pruebas para la identificacin de gnero de bacterias
hidrocarburoclastas. .......................................................................................... 85
ANEXO III. PREPARACIN DE SOLUCIONES Y MEDIOS DE CULTIVO .......... 88
A3.1 Preparacin de soluciones ........................................................................ 88
A3.2 Preparacin de medios de cultivo ............................................................ 90
III
NDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructuras qumicas de algunos hidrocarburos del petrleo. ................ 13
Figura 2. Diagrama de la biodegradacin de hidrocarburos de petrleo. .............. 24
Figura 3. Morfologa general de las bacterias ....................................................... 28
Figura 4. Morfologa general de colonias bacterianas. .......................................... 30
Figura 5. Diferenciacin de gneros comnmente aislados .................................. 39
Figura 6. FASE I. Bacterias totales por dilucin en placa incubadas por 24 horas a
350.2C ............................................................................................................... 51
Figura 7. Conteo de Unidades Formadoras de Colonias (UFCs) ......................... 52
Figura 8. FASE II. Bacterias hidrocarburoclastas por dilucin en placa incubadas
por 24 horas a 350.2C ....................................................................................... 54
Figura 9. Vistas macro y microscpicas de algunas cepas de la resiembra 6 ...... 56
Figura 10. Cepas de la resiembra 7 seleccionadas para pruebas de identificacin
.............................................................................................................................. 57
Figura 11. Preparaciones de las tinciones de Gram ............................................. 58
Figura 12. Resultados crecimiento anaerobio (Hugh y Leifson) ............................ 59
Figura 13. Revisin en luz UV (366nm) de cultivos en medio KB ......................... 60
Figura 14. Resultados del crecimiento en medio YDC .......................................... 61
Figura 15. Resultados prueba de ureasa .............................................................. 62
Figura 16. Resultado crecimiento en agar D1M .................................................... 63
Figura 17. Resultados prueba de catalasa ............................................................ 63
Figura 18. Resultados prueba de oxidasa ............................................................. 64
Figura 19. Tringulo de texturas del suelo ............................................................ 76
Figura 20. Preparacin de diluciones .................................................................... 82
Figura 21. Siembra por mtodo de placa vaciada ................................................. 83
Figura 22. Siembra de bacterias hidrocarburoclastas ........................................... 84
Figura 23. Tcnicas de estriado ............................................................................ 85
IV
NDICE DE TABLAS
Tabla 1. Tipos de petrleo ..................................................................................... 14
Tabla 2. Hidrocarburos que debern analizarse en funcin del producto
contaminante ......................................................................................................... 18
Tabla 3. Lmites mximos permisibles para fracciones de hidrocarburos en suelo.
.............................................................................................................................. 18
Tabla 4. Lmites mximos permisibles para hidrocarburos especficos en suelo. . 19
Tabla 5. Gneros bacterianos conocidos como degradadores de hidrocarburos . 31
Tabla 6. Clasificacin de gneros bacterianos conocidos como degradadores de
hidrocarburos ........................................................................................................ 32
Tabla 7. Resultados del clculo de porcentajes de arena, arcilla y limo ............... 44
Tabla 8. Porcentajes de humedad......................................................................... 45
Tabla 9. Medicin de pH ....................................................................................... 46
Tabla 10. Clasificacin del suelo en cuanto a su valor de pH .............................. 46
Tabla 11. Porcentajes de carbono, materia y nitrgeno orgnicos........................ 47
Tabla 12. Interpretacin de resultados de materia orgnica ................................. 47
Tabla 13. Cantidad de nitratos en ppm ................................................................. 48
Tabla 14. Contenido de fosforo en forma de fosfatos ............................................ 49
Tabla 15. Interpretacin de resultados Fsforo - Olsen ....................................... 49
Tabla 16. Total de Hidrocarburos Totales de petrleo (mg Kg-1)........................... 49
Tabla 17. Resultado de clculos de UFCs totales ................................................ 52
Tabla 18. Resultado de clculos de UFCs hidrocarburoclastas. .......................... 55
Tabla 19. Resultados pruebas bioqumicas .......................................................... 65
Tabla 20. Resultado de identificacin de generos de bacterias hidrocarburoclastas
.............................................................................................................................. 65
Tabla 21. Correccin de temperatura para las lecturas del hidrmetro. ................ 77
Tabla 22. Equivalencia de diluciones .................................................................... 83
V
INTRODUCCIN
En Mxico, los hidrocarburos fsiles afectan de manera constante a los suelos
como resultado de las actividades humanas durante la combustin y su transporte.
Estos hidrocarburos estn presentes de tres formas en la naturaleza: gas natural,
petrleo crudo y arenas asflticas. Van desde sustancias simples altamente
voltiles hasta ceras complejas y compuestos asflticos que no pueden destilarse
(Silos, 2008).
La regin sur del Estado de Veracruz es uno de los lugares con mayores eventos
de derrames de hidrocarburos en suelos (Vela, 2007), y en este trabajo se busca
aislar e identificar cepas de bacterias nativas que tengan la capacidad de crecer y
de degradar estos hidrocarburos utilizando una muestra de suelo de esta Regin y
as poder ser utilizados en posteriores estudios de biorremediacin y
bioaumentacin.
1
ANTECEDENTES
En la segunda mitad del siglo XX y el principio de este XXI, la industria del
petrleo y del gas se ha consolidado como la principal abastecedora de energa
para la humanidad. La exploracin, produccin y procesamiento de hidrocarburos
en territorio nacional, que Petrleos Mexicanos (PEMEX) ha podido llevar a cabo
desde hace prcticamente 75 aos, le ha permitido a Mxico mantener una
posicin independiente y de soberana (Comisin Nacional de Hidrocarburos,
2011). En el pas 17 entidades reportaron para el periodo de 1997 al 2001, 73
derrames, principalmente de hidrocarburos, 16 explosiones, 26 fugas y 9 incendios
(COFEPRIS, 2002).
El estado de Veracruz posee una riqueza natural nica. Entre los recursos
naturales ms explotados en la entidad, el petrleo figura en primer lugar: las
zonas productoras se localizan principalmente en el litoral del Golfo de Mxico, por
ejemplo en Coatzacoalcos, al sureste, donde se localizan instalaciones de
refinacin y petroqumica como los Complejos de Pajaritos, Cangrejera, Pemex
Refinacin, Pemex Petroqumica. Debido a la presencia de toda esta
infraestructura y por la dimensin de algunos eventos de riesgo, la ciudadana
veracruzana percibe que se est ocasionando un dao al medio ambiente, sin
embargo no se tiene el conocimiento pleno de la gravedad y frecuencia de los
daos, y mucho menos las acciones que se toman para reparar el dao
ocasionado al entorno. Los Hidrocarburos Totales de Petrleo, TPH por sus siglas
en ingls, son un grupo extenso de varios cientos de sustancias qumicas
derivadas originalmente del petrleo crudo que ocasionan este tipo de dao. Se
les llama hidrocarburos porque casi todos los componentes estn formados por
hidrgeno y carbono (ATSDR, 1999).
2
de color oscuro o semislidos que no se evaporan. Muchos de estos productos
tienen un olor caracterstico a gasolina, kerosn o aceite (ATSDR, 1999).
3
En la bsqueda de mtodos para mitigar las afectaciones provocadas por los
desastres con hidrocarburos, en especifico los suelos contaminados por stos, se
han desarrollado algunas investigaciones a nivel internacional y nacional en donde
se buscan y analizan microorganismos con capacidad hidrocarburoclasta para
mejorar la eficiencia en tiempo de la biorremediacin del sitio contaminado. Militon
y colaboradores (2010), evaluaron la respuesta de los microorganismos presentes
en suelo contaminado con petrleo al ser bioestimulado con aire en reactores de
lecho fijo, monitoreando la actividad microbiana por dos aos, encontrndose
varios filotipos raros, adems de que la comunidad bacteriana cambi de
Grammaproteobacteria a Actinobacteria durante el tratamiento, pudiendo este
ltimo filotipo estar involucrado en la restauracin de los ecosistemas estudiados.
4
Alphaproteobacteria (Rhodobacteracea) tienen la capacidad de degradar petrleo
(Kostka et al, 2011).
5
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Los problemas de contaminacin de suelos son un hecho que no podemos dejar
de lado, es preocupante como se han ido deteriorando los ecosistemas de nuestro
planeta a causa de esto, y la corteza terrestre no ha sido la excepcin. La industria
petroqumica ha ocasionado uno de los problemas ms serios en contaminacin
de suelos donde, por ejemplo el derrame de hidrocarburos ocupa uno de los
primeros lugares.
JUSTIFICACIN
En la regin sur del estado de Veracruz, la industria petrolera es sumamente
intensa. Existen instalaciones de explotacin y refinacin de cientos de kilmetros
adems de ductos que cruzan reas urbanas y rurales. Toda esta infraestructura
muchas veces no recibe el mantenimiento adecuado que garantice la seguridad
del proceso de obtencin y transporte de hidrocarburos, por lo que el riesgo de
que ocurra un derrame es bastante alto, y usualmente se aplican tcnicas
mecnicas para retirar fsicamente el contaminante del suelo.
Por todo lo anterior, en este trabajo se busca identificar bacterias que tengan la
capacidad de degradar hidrocarburos, mismas que sern aisladas y purificadas a
partir de muestras de suelo contaminado y se comprobar la capacidad de
adaptacin para degradacin de los hidrocarburos totales de petrleo, conocidos
como HTPs.
6
OBJETIVOS
Objetivo General
Aislar e identificar bacterias con capacidad de degradacin de hidrocarburos de
suelos contaminados de la zona sur del estado de Veracruz.
Objetivos Especficos
Caracterizar fsica y qumicamente el suelo contaminado con
hidrocarburos.
HIPTESIS
Si se han aislado cepas bacterianas en suelos contaminados con hidrocarburos,
es posible aislar cepas nativas con actividad hidrocarburoclasta en suelos
contaminados por hidrocarburos de la regin sur del Estado de Veracruz.
7
ESQUEMA DE TRABAJO.
Muestreo de Suelo Contaminado
Determinacin de Nitratos
(Mtodo Colorimtrico) FASE III.
Identificacin de las cepas
Determinacin de Nitrgeno bacterianas puras obtenidas en la
Orgnico (Mtodo Matemtico) fase anterior.
Determinacin de HTPs
(Mtodo de extraccin
Agitacin - Centrifugacin)
.
8
CAPTULO I
MARCO TERICO
1.1 Situacin actual de contaminacin por hidrocarburos en
Mxico
Como consecuencia de varios siglos de actividad minera en Mxico y
posteriormente, debido a la industria de la qumica bsica, petroqumica y de
refinacin del petrleo, se han producido cantidades muy grandes, pero muy
difciles de cuantificar, de residuos peligrosos. Aunado a lo anterior, la intensa
actividad de otras industrias, que conlleva a accidentes durante el
almacenamiento, transporte o trasvase de sustancias (fugas, derrames, incendios)
y la disposicin clandestina e incontrolada de residuos, contribuyen en gran
medida a la contaminacin de suelos (SEMARNAT, 1996).
10
Para el ao 2013 PEMEX report en el total de fugas y derrames una disminucin
de 39%, en comparacin con el cierre del ao de 2012, que en su mayora se dan
por el mal estado de los ductos. En cuanto a su pasivo ambiental al inicio de 2013
el inventario de sitios contaminados fue de 1,023.35 hectreas. Durante el ao se
incorporaron al inventario 50.70 hectreas, (21.88 hectreas de PEMEX-
Refinacin y 28.82 hectreas de PEMEX-Exploracin y Produccin). Asimismo, se
desincorporaron 53.81 hectreas de las cuales 18.89 corresponden a PEMEX-
Refinacin, 30.09 hectreas a PEMEX-Exploracin y Produccin, 3.63 hectreas a
PEMEX-Gas y Petroqumica Bsica y 1.20 a PEMEX-Petroqumica. Estas
acciones tuvieron como resultado un inventario total de 1,020.24 hectreas al
cierre de 2013, que representa una disminucin del 0.3 por ciento con relacin a
2012 (PEMEX, 2013).
11
oleoducto de 16 de dimetro, localizado en el municipio de Cunduacan en
Tabasco, debido a la ruptura del ducto. El segundo incidente, en el municipio de
Guaymas en el estado de Sonora, cuyo impacto fue de 6,272 barriles destilados
(PEMEX, 2014).
1.2 Hidrocarburos
12
molculas polares. En la Figura 1, se observan estructuras de algunas molculas
que componen el petrleo (Prince, 2002).
13
textura de ceras. En cualquier caso, el petrleo, de por s, es un lquido y se
encuentra mezclado con gases y con agua.
Operacin ssmica:
Es una de las ms utilizadas en la etapa de exploracin, y consiste en la medicin
de las ondas de resonancia que produce la detonacin de cargas de dinamita.
14
Esto significa que la zona explorada queda completamente llena de agujeros
dinamitados. Al encontrarse el lugar donde probablemente se puede dar la
explotacin del mineral, se procede a abrir los pozos exploratorios.
Exploracin:
Durante este proceso son utilizados lodos qumicos, los cuales son altamente
contaminantes, para la mayor penetracin en el terreno de los taladros que deben
ser enfriados constantemente con agua. Tambin se construyen piscinas para
depositar las aguas cidas y los lodos contaminados que salen junto con el
petrleo. Esta fase altera el equilibrio natural, ya que requiere de grandes
cantidades de agua del lugar y aumenta los niveles de contaminacin.
Fase de extraccin:
Comienza cuando alguno de los pozos exploratorios toca un yacimiento. En tierra
o en mar las operaciones a realizarse en esta etapa alteran el ambiente natural y
lo contaminan. Esta etapa presente riesgos adicionales de accidentes,
relacionados con gases txicos, aguas acidas y los depsitos de crudo.
Transporte:
Se da despus de la extraccin del crudo. El transporte del crudo es una de las
etapas ms riesgosas y costosas en trminos de destruccin ambiental. Desde
que se transporta el crudo masivamente, son millones de barriles que se han
derramado en zonas selvticas, ros, lagos y mares.
Exploracin y explotacin:
Tambin se da una compactacin de los suelos por la maquinaria pesada donde
se produce una contaminacin de los suelos de la zona por la prdida de
vegetacin. Los microorganismos del suelo son alterados por la contaminacin
con hidrocarburos, desapareciendo o disminuyendo las especies menos
resistentes sin dejar atrs las altas tasas de mutaciones. Las alteraciones al suelo
15
producen cambios en el pH de este y del agua, que pueden causar un deterioro
crnico de los ecosistemas.
16
1.2.6 Toxicologa de los HTPs
Los HTPs son liberados al ambiente por accidentes desde industrias o como
productos secundarios debido a su uso comercial o privado. Cuando hay escapes
o derrames de HTPs directamente al agua, algunas fracciones de los HTPs
flotan en el agua y forman una capa delgada en la superficie. Otras fracciones ms
pesadas se acumularn en el sedimento del fondo, lo que puede afectar a peces y
a otros organismos que se alimentan en el fondo.
Los HTPs que son liberados al suelo pueden movilizarse hacia el agua
subterrnea a travs del suelo. All, los componentes individuales pueden
separarse de la mezcla original dependiendo de las propiedades qumicas de cada
componente. Algunos de estos componentes se evaporan al aire y otros se
disolvern en el agua subterrnea y se alejarn del rea donde fueron liberados.
Otros compuestos se adherirn a partculas en el suelo y pueden permanecer en
el suelo durante mucho tiempo, mientras que otros sern degradados por
microorganismos en el suelo (ATSDR, 1999).
1.2.7 Normatividad
En septiembre de 2013 fue publicada la Norma Oficial Mexicana NOM-138-
SEMARNAT/SSA1-2012, que establece los lmites mximos permisibles de
hidrocarburos en suelo y lineamientos para muestreo, caracterizacin y
remediacin. Donde son establecidos los lmites en funcin de las fracciones
ligeras, medias y pesadas (DOF, 2014). Los productos asociados a los derrames
de hidrocarburos para los que se establecen lmites mximos permisibles de
contaminacin en suelos se enlistan en la Tabla 2.
17
Tabla 2. Hidrocarburos que debern analizarse en funcin del producto
contaminante
HIDROCARBUROS
PRODUCTO
FRACCIN FRACCIN FRACCIN
CONTAMINANTE HAPs HAPs BTEX
PESADA MEDIA LIGERA
Mezclas
Petrleo crudo
Combustleo
Parafinas
Petrolatos
Aceites
Gasleo
Diesel
Turbosina
Keroseno
Creosota
Gas avin
Gasolvente
Gasolinas
Gasnafta
BTEX: B, benceno; T, tolueno; E, etilbenceno; X, xilenos (suma de ismeros); HAPs:
Hidrocarburos aromticos polinucleares. FUENTE: NOM-138-SEMARNAT/SSA1-2012
18
Tabla 4. Lmites mximos permisibles para hidrocarburos especficos en suelo.
Uso de suelo predominante
Hidrocarburos especficos (mg Kg-1 base seca)
Agrcola Residencial Industrial
Benceno 6 6 15
Tolueno 40 40 100
Etilbenceno 10 10 25
Xilenos (suma de ismeros) 40 40 100
Benzo [a] pireno 2 2 10
Benzo [a] antraceno 2 2 10
Benzo [a,h] antraceno 2 2 10
Benzo [b] fluoranteno 2 2 10
Benzo [k] fluoranteno 8 8 80
Indeno (1,2,2-cd) pireno 2 2 10
FUENTE: NOM-138-SEMARNAT/SSA1-2012
1.3 Suelo
El suelo constituye un recurso natural que desempea diversas funciones en la
superficie de la Tierra, proporcionando un soporte mecnico as como nutrientes
para el crecimiento de plantas y microorganismos. La matriz del suelo est
formada por cuatro componentes principales: minerales, materia orgnica, aire y
agua.
Todos estos factores definen el tipo de suelo, que junto con las condiciones
particulares de un sitio frecuentemente pueden limitar la seleccin de un proceso
de tratamiento en particular. Por otra parte, la posibilidad de usar una tecnologa
de tratamiento, puede eliminarse con base en la clasificacin del suelo u otras
caractersticas propias de este (Van Deuren et al. 1997).
1.3.1 Composicin
De acuerdo a Eweis y colaboradores (1998), la matriz de un suelo est compuesta
por:
Minerales: son los principales componentes estructurales y constituyen ms
del 50% del volumen total del suelo.
19
Materia Orgnica: La fraccin orgnica del suelo est compuesta por:
o Residuos de plantas y animales.
o Productos resultantes del metabolismo microbiano, comnmente
llamado humus. El humus es materia orgnica que ha sufrido varias
degradaciones y transformaciones. Est compuesto en su mayor
parte por sustancias polimerizadas: compuestos aromticos,
polisacridos aminocidos, polmeros del cido urnico y
compuestos que contienen fsforo (Alexander, 1991).
Aire y Agua: Juntos ocupan el volumen de los espacios, y usualmente
conforman de 25% a 50% del volumen total. La proporcin relativa de
aire/agua flucta considerablemente con el contenido de humedad del
suelo.
20
por una masa esponjosa y ligera en la que an se aprecian los
componentes vegetales que la originaron. Se emplea como combustible y
en la obtencin de abonos orgnicos.
El suelo tiene una capacidad de depuracin que alcanza su lmite cuando deja de
ser eficaz y funciona como fuente de sustancias peligrosas para los organismos
que viven en l o no se pueden degradar al acumularse en l sustancias como los
HTPs a niveles tales que repercuten negativamente en el comportamiento de los
suelos. Dichas sustancias, a esos niveles de concentracin, se vuelven txicas
para los organismos del suelo. Se trata pues de una degradacin qumica que
provoca la prdida parcial o total de la productividad del suelo.
21
1.3.4 Hidrocarburos en el suelo
Los hidrocarburos contaminantes llegan por la actividad humana (antrpicos), se
caracterizan por la presencia de molculas aromticas policclicas, agrupadas bajo
los nombres de HPAs, y se pueden encontrar en el suelo en forma lquida si son
hidroflicos, adsorbidos en las partculas del suelo, si son hidrofbicas, o en la
atmsfera edfica, si son voltiles (Sols y Lpez, 2003).
1.4 Biorremediacin
La biorremediacin hace referencia a todos los procesos biolgicos que se pueden
usar para minimizar un impacto negativo en el ambiente; usualmente, es la
remocin de un contaminante presente en el suelo, el agua o el aire. Algunos
microorganismos, especialmente ciertas bacterias, tienen la habilidad de convertir
las molculas de un contaminante orgnico en dixido de carbono, agua e iones
inorgnicos fundamentales para los ciclos biogeoqumicos, como tambin oxidar o
reducir los agentes inorgnicos que contaminan un ambiente, esto permite que se
regeneren los ecosistemas que han sido afectados por el vertimiento de
sustancias orgnicas como el petrleo y sus derivados (hidrocarburos),
plaguicidas (compuestos alifticos y aromticos halogenados); sustancias
22
inorgnicas (compuestos nitrogenados), y tambin algunos contaminantes
metlicos (Prince, 2002).
Degradacin Aerobia:
Degradacin Anaerobia:
23
La siguiente frmula representa el modelo tpico de la biodegradacin de
hidrocarburo en condiciones aerbicas (OMI, 2005):
24
pH
El pH ptimo del suelo para que se desarrolle la biorremediacin debe ser
superior a 6.5, aadiendo cal por si fuera necesario para conseguirlo.
Tambin pueden aadirse fertilizantes como urea, fosfato amnico, etc.,
para acelerar la velocidad de degradacin de los hidrocarburos (Silos,
2008).
Materia Orgnica:
Se ha correlacionado positivamente con la adsorcin de compuestos
orgnicos en numerosos estudios. Un efecto inmediato del aumento de este
parmetro es el incremento de los sitios de adsorcin, disminuyendo la
concentracin en la fase acuosa y gaseosa del contaminante orgnico
como tambin su transporte y su biodisponibilidad. La adsorcin es
afectada por dos factores: la hidrofobicidad del contaminante (es la
dificultad para disolverse en agua) y la fraccin de la materia orgnica en el
suelo (contenido de carbono orgnico). Muchos de los compuestos
hidrofbicos pueden ser altamente adsorbidos, de acuerdo a varios estudios
de campo (Mackay et al., 1985).
25
Humedad:
Las bacterias requieren condiciones mnimas de humedad para su
crecimiento; el agua es importante para su desarrollo porque acta como
medio de transporte de nutrientes y oxgeno a la clula ya que forma parte
de su protoplasma bacteriano. Es conveniente mantener una humedad del
25-75% de la capacidad de campo, se refiere a la cantidad relativamente
constante de agua que contiene un suelo saturado despus de 48 horas de
drenaje (Shaxson y Barber, 2005)
Temperatura:
La biorremediacion llevada a cabo entre 20 y 40C muestra que este
intervalo de temperatura es ptimo para la actividad microbiana, sin
embargo, en climas tropicales es mejor una temperatura aproximadamente
de 30 a 35C. La velocidad de degradacin aumenta con la temperatura,
por lo que un incremento de la misma es til. Cuando la temperatura se
incrementa en 10C la biorremediacion se duplica, pero se elevan los
costos. Para mantener constante este factor es necesario cubrir la zona con
paja, vegetacin o plstico para conservar la radiacin solar, o la utilizacin
de electrodos enterrados en el suelo o la circulacin constante de agua
caliente (Bossert y Bartha, 1984)
26
derrames de petrleo en regiones cuyas temperaturas son entre 1 a 15C
se suelen usar microorganismos psicrfilos (Kerry, 1990).
Bacterias
Es importante notar la presencia de microorganismos nativos del suelo que tienen
un papel fundamental en la ausencia y/o permanencia de compuestos orgnicos,
siendo considerado como una va de prdida de los compuestos orgnicos
voltiles, llamada biodegradacin; los compuestos qumicos que poseen otras
estructuras que los azcares, aminocidos y cidos grasos, no pueden entrar
inmediatamente dentro del metabolismo microbiano; esos compuestos requieren
de una aclimatacin definida en horas o meses, durante el cual poco o nada se
degrada. El periodo de retraso generalmente es causado por (EPA, 1983):
a) La transferencia de la informacin gentica responsable de la degradacin
para una poblacin.
b) La fase inicial de crecimiento exponencial de organismos capaces de
degradar el compuesto, la alta solubilidad al agua que puede favorecer una
rpida degradacin
27
Por su diversidad, las bacterias se encuentran regularmente en comunidades
heterogneas; algunas especies son degradadores primarios, es decir, ellas
inician la degradacin de la materia orgnica en el suelo; otras crecen en
compuestos resultantes de la degradacin parcial de complejos orgnicos o
productos residuales de degradadores primarios.
28
Y se clasifican usando sus caractersticas fsicas, qumicas, genticas y
metablicas. El uso y tolerancia al oxgeno que es uno de los mtodos ms
generales de clasificacin. Los aerobios estrictos son bacterias que requieren
oxgeno como aceptor final de electrones y crecen solamente en presencia del
mismo. Las aerobias facultativas son bacterias que pueden utilizar aceptores de
electrones terminales alternativos y crecer en presencia o ausencia de oxgeno.
Algunas anaerobias son tolerantes al oxgeno, pero ste es txico a muchas
anaerobias estrictas (CULTIMED, 2012) .
Las colonias bacterianas tienen una medida, forma, textura y en algunos casos
color caractersticos, que aunque puede variar de acuerdo al medio en que se
encuentren, es constante bajo condiciones controladas y depende de la especie
bacteriana que la forme. Debido a que las caractersticas de las colonias ocurren
en varios grados y combinaciones dependiendo de las bacterias y son a menudo
muy uniformes, sirven para identificar bacterias en cultivos mezclados (Figura 4).
29
Figura 4. Morfologa general de colonias bacterianas.
Bacterias hidrocarburoclastas
Las bacterias hidrocarburoclastas son aquellas capaces de crecer en presencia de
hidrocarburos como nica fuente de carbono y energa. La presencia de petrleo
en el suelo enriquece selectivamente la comunidad microbiana capaz de
adaptarse y utilizar el nuevo sustrato, y crea una situacin selectiva. Sin embargo,
los componentes txicos del petrleo pueden inhibir a algunos miembros de la
comunidad microbiana, produciendo tanto una disminucin en el tamao de la
poblacin, como en la diversidad de especies (Fernndez et al, 2006). En la Tabla
5 se muestran algunas de los gneros reportados con capacidad
hidrocarburoclastas.
30
Tabla 5. Gneros bacterianos conocidos como degradadores de hidrocarburos
GNEROS
Achromobacter Acidovorax Acinetobacter Actinomyces
31
En la Tabla 6 se muestra la clasificacin de algunos de los gneros incluidos en la
Tabla 5
32
CAPTULO II
MATERIALES Y MTODOS
Este trabajo de investigacin se llev a cabo en el Laboratorio de Alta Tecnologa
de Xalapa (LATEX), S.C. de la Universidad Veracruzana a partir de una muestra
de suelo donada por la Empresa Soluciones Ambientales, S.A. de C.V. (CEISA, de
C.V), la cual se dedica a brindar servicios ambientales industriales, como
tratamiento fsico-qumico-biolgico a lado del sitio contaminado y/o fuera del sitio,
lavado de suelos con proceso fluidizante, extraccin de vapores y biorremediacin
por bioventeo y por biolabranza.
34
2.1.3 Determinacin de pH (Mtodo potenciomtrico)
El pH del suelo condiciona de forma decisiva no slo la vida de los
microorganismos y los importantes procesos que en ellos intervienen, sino
tambin la mayor o menor asimilabilidad de muchos elementos qumicos que para
los seres vivos son esenciales, y la de otros que a determinadas concentraciones
pueden resultar txicos y producir en ella graves alteraciones (Navarro, 2003). La
metodologa se describe en la seccin A1.3 del ANEXO I.
35
2.1.7 Determinacin de fosforo (Mtodo de Olsen)
En trminos generales, el fsforo del suelo se clasifica en fsforo orgnico e
inorgnico, dependiendo de la naturaleza de los compuestos que forme. La forma
orgnica se encuentra en el humus y la materia orgnica, y sus niveles en el suelo
pueden variar desde 0 hasta mayores que 0.2%. La fraccin inorgnica est
constituida por compuestos de hierro, aluminio, calcio y flor, entre otros, y
normalmente son ms abundantes que los compuestos orgnicos. Solo una
pequea parte del P aparece en solucin en suelo (< 0.01-1 mg L-1). Para suelos
neutros y alcalinos a medicin de P soluble se utiliza el mtodo Olsen, siendo una
determinacin por colorimetra (Fernndez et al., 2006). En suelos neutros,
calcreos o alcalinos, conteniendo fosfatos de calcio, el extractante disminuye la
concentracin de Ca en solucin a travs de una precipitacin del CaCO 3, por
tanto la concentracin de P en solucin se incrementa (Contreras, 2014). La
metodologa se describe en la seccin A1.7 del ANEXO I.
36
2.2 Anlisis Microbiolgicos
Las metodologas de este apartado se describen en el ANEXO II.
37
especfico, y es usado como indicador del potencial de biodegradacin de un suelo
en particular (Bossert y Bartha, 1984).
38
Figura 5. Diferenciacin de gneros comnmente aislados
39
Tincin de Gram
Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse
en dos grupos, Gram positivas y Gram negativas; en este caso, los trminos
positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrico, sino simplemente
designan dos grupos morfolgicos distintos de bacterias (Santambrosio, 2009).
Para establecer esta diferencia se aplica un disolvente del cristal violeta que no
tiene efecto sobre el grupo de microorganismos que lo retienen firmemente, pero
lo elimina de aquellos que no son capaces de retenerlo, quedando completamente
decolorados. En este caso sera difcil poder observarlos por lo que son tratados
con otro colorante, como la safranina. Este color no modifica el color de los
microorganismos que haban retenido el cristal violeta, pero tie a los que se
haban decolorado. Siendo consideradas Gram positivas aquellas que retienen el
Cristal Violeta y como Gram negativas aquellas teidas por las Safranina. Vase
seccin A2.3.1.
Crecimiento anaerobio
Esta prueba se hace cuando las bacterias son Gram Negativas. Es una tcnica de
desarrollada por Hugh y Leifson para evidenciar la importancia del significado
taxonmico del metabolismo oxidativo-fermentativo (O.F.), de los hidratos de
carbono por las bacterias Gram negativas. Vase seccin A2.3.2.
Pigmento fluorescente en KB
Para el caso de una respuesta negativa al crecimiento anaerobio se hace la
prueba de fluorescencia en medio KB para identificar Pseudomonas, algunas
elaboran Fluorescena sin Piocianina, otras elaboran slo Piocianina y otras que
elaboran las dos. El Medio KB potencia la produccin de Fluorescena e inhibe la
de Piocianina. Ambos colorantes se difunden en el medio dando una coloracin
amarilla fluorescente (Fluorescena) y azul (Piocianina). Si se obtienen colores
intermedios ms o menos verdosos indica que se han producido ambos pigmentos
y que por lo tanto la Fluorescena o la Piocianina no han quedado completamente
40
inhibidas. Aqu la temperatura puede ser un factor determinante ya que la mayora
de cepas fluorescente no crecern a 35-37C, crecern a 25-30C (CULTIMED,
2012). Vase seccin A2.3.3.
Prueba de ureasa
La urea es una diamida del cido carbnico y sta es fcilmente hidrolizada con la
liberacin de amonaco y dixido de carbono. La enzima ureasa que posee un
microorganismo puede hidrolizar a la urea que esta presente en el medio de
cultivo de acuerdo con la siguiente reaccin: El amonaco reaccionan en solucin
para formar carbonato de amonio, producindose una alcalinizacin y un aumento
del pH del medio, provocando el vire del medio. Esta prueba se realizo a las cinco
cepas de estudio como una manera de identificacin y no solo por seguir el
esquema propuesto por Schaad et al (2001). Vase seccin A2.3.5.
Pruebas complementarias
De manera complementaria a las pruebas bioqumicas establecidas en el
diagrama de Schaad et al (2001), se hicieron las pruebas de CATALASA y
41
OXIDASA como apoyo para la identificacin de las cepas 1A(A), 2C(A), 2C(B),
5D(A) y 5D(B). Vase seccin A2.3.7.
Catalasa
Pone de manifiesto la presencia de la enzima catalasa en una bacteria. Esta
enzima es capaz de descomponer el perxido de hidrogeno (agua oxigenada en
agua y oxgeno, con la consiguiente aparicin de burbujas. La mayora de las
bacterias Gram negativas son catalasa positiva.
Oxidasa
Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reaccin
de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la
oxidacin del citocromo que es reducido por el oxgeno molecular que produce
agua o perxido de hidrogeno segn la especie bacteriana. Por lo general, el
sistema citocromooxidasa slo se encuentra en los organismos aerobios, algunos
anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algn microaerfilo, pero los
anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa.
42
CAPTULO III
RESULTADOS Y DISCUSIN
3.1 Anlisis fsicos y qumicos
3.1.1 Textura
El mtodo de Bouyoucos consiste en la determinacin de los porcentajes de
arena, limo y arcilla presentes en la fraccin mineral del suelo. Estos porcentajes
se obtienen mediante la separacin de las partculas en grados clasificados de
acuerdo su dimetro. En la suspensin de suelo colocada en una probeta de
sedimentacin, la densidad a una profundidad determinada va disminuyendo a
medida que se sedimentan las partculas. Como stas sedimentan a velocidades
proporcionales a su tamao, seleccionando los tiempos, una lectura de la
densidad puede servir de medida del contenido limo ms arcilla o de arcilla
(Chicaiza, 2001).
44
apretarlo entre el pulgar y el resto de los dedos no formarn una cinta continua
(SIAR Limari, 2006).
3.1.2 Humedad
Aunque es recomendable determinar la humedad a la capacidad de campo de los
suelos, es decir, la cantidad de humedad que un suelo retiene contra gravedad,
cuando se deja drenar libremente; en algunas ocasiones, cuando se trata de
suelos contaminados, por ejemplo con hidrocarburos del petrleo, es difcil llevar a
cabo esta medicin por la dificultad de rehidratar suelos secos con estas
caractersticas. Por lo que la medicin de humedad se realiza solo en funcin del
porcentaje de agua que retiene este tipo de suelos. La humedad del suelo se
calcula utilizando un mtodo gravimtrico, por la diferencia de peso entre una
misma muestra hmeda, y despus de haberse secado en la estufa hasta obtener
un peso constante. (Fernndez et al., 2006).
S2Cc 1 9.7085
S2Cc - 2 9.4326
45
3.1.3 pH
El mtodo potenciomtrico o electroqumico para medir pH de un suelo es el ms
utilizado. Debido a que el pH del suelo es medido en una matriz acuosa como
agua o una solucin de sales diluidas, es dependiente del grado de dilucin
(relacin suelo-dilucin). En suelos contaminados con hidrocarburos la
interferencia va a depender de la concentracin y tipo de hidrocarburo, se puede
producir desde una simple iridiscencia sin afectar la determinacin, hasta un
impedimento de la determinacin por la alta concentracin y viscosidad del
contaminante (Fernndez et al., 2006).
Tabla 9. Medicin de pH
MUESTRA pH Temperatura (C)
46
3.1.4 Materia orgnica y nitrgeno orgnico
La materia orgnica del suelo es la fraccin orgnica que incluye residuos
vegetales y animales en diferentes estados de descomposicin; tejidos y clulas
de organismos que viven en el suelo; y sustancias producidas y vertidas por esos
organismos. Esta definicin es muy amplia pues incluye tanto a los materiales
poco alterados como a aquellos que s han experimentado cambios de
descomposicin, transformacin y resntesis dentro del suelo. Adems se pueden
incluir compuestos orgnicos txicos, provenientes de las actividades industriales
del hombre, como la contaminacin de suelos por hidrocarburos del petrleo, que
tambin constituye parte de la materia orgnica del suelo (Fernndez et al., 2006)
En la Tabla 11 se muestran los porcentajes de carbono orgnico, materia orgnica
y nitrgeno orgnico. El nitrgeno orgnico es un valor obtenido matemticamente
por la relacin entre el porcentaje de materia orgnica y el porcentaje de nitrgeno
(5 %) contenido en ella.
Tabla 11. Porcentajes de carbono, materia y nitrgeno orgnicos.
% Carbono % Materia % Nitrgeno
MUESTRA
Orgnico Orgnica Orgnico
S2Cc 15.6 26.89 1.34
47
3.1.5 Nitratos
El nitrgeno, en forma de nitrato, es fcilmente soluble en agua y es utilizado con
rapidez por la mayora de los cultivos. Tambin el nitrato es lixiviado del suelo por
las lluvias debido a su alta solubilidad y a que no es retenido en el suelo en grado
apreciable. Aunque la forma amoniacal del nitrgeno es soluble en agua, no es
lixiviado con tanta facilidad como el nitrato, debido a que grandes cantidades de
amonaco. Si el amoniaco no es absorbido por las races o los microorganismos o
fijado en arcilla, por lo general, es oxidado a nitrato. En la Tabla 13 se pueden ver
los resultados obtenidos.
Tabla 13. Cantidad de nitratos en ppm
MUESTRA ppm de Nitratos
S2Cc 1 2.73
S2Cc - 2 3.68
3.1.6 Fsforo
El fsforo (P) en forma de fosfatos es un indicador de la fertilidad de suelo, de esta
manera, interviene en la formacin de compuestos energticos dentro de las
clulas y es requerido para la sntesis de cidos nuclecos y fosfolpidos en los
procesos de reproduccin y degradacin en el suelo.
48
Tabla 14. Contenido de fosforo en forma de fosfatos
Muestra ppm de Fosforo (P)
S2Cc A 9.28
S2Cc B 9.28
49
-2
Dilucin 10
-3
Dilucin 10
-4
Dilucin 10
Figura 6. FASE I. Bacterias totales por dilucin en placa incubadas por 24 horas a
350.2C
50
-5
Dilucin 10
-6
Dilucin 10
Figura 7. FASE I. Bacterias totales por dilucin en placa incubadas por 24 horas a
350.2C
Para realizar el conteo se seleccion una caja de la dilucin 10-3 para la tcnica de
sectores y una de la dilucin 10 4 para la tcnica de punteo (Figura 8), dando
los resultados mostrados en la Tabla 17.
51
Figura 8. Conteo de Unidades Formadoras de Colonias (UFCs)
52
CONTROL
Con Atmosfera de petrleo
-2
Dilucin 10
-3
Dilucin 10
53
-4
Dilucin 10
-5
Dilucin 10
-6
Dilucin 10
Figura 10. FASE II. Bacterias hidrocarburoclastas por dilucin en placa incubadas
por 24 horas a 350.2C
54
Conteo:
Para el conteo de UFCs se tom una caja de las mismas diluciones que en el
conteo para bacterias totales (10-3 y 10-4), y los resultados se pueden ver en la
Tabla 18.
Tabla 18. Resultado de clculos de UFCs hidrocarburoclastas.
Mtodo
Dilucin Total de UFCs
empleado
10-3 Punteo 1460
10-4 Punteo 1955
Aislamiento y Purificacin:
Se hiceron 6 resiembras con estriado por dilucin, considerando que en la sexta
resiembra ya se tenan bacterias puras en las cajas Petri. Finalmente se obtuvo un
total de 24 cajas con siembra visiblemente pura. Para las pruebas de identificacin
se hizo una resiembra 7 de la cual se toman las muestras de bacterias
consideradas morfologicamente puras.
55
Figura 11. Vistas macro y microscpicas de algunas cepas de la resiembra 6
56
Se tomaron cinco cajas que se consideraron con diferentes entre s, siendo
seleccionadas las cepas 1A(A), 2C(A), 2C(B), 5D(A) y 5D(B), de las cuales se
tomaron asadas para las pruebas bioqumicas (Figura 12).
57
3.2.3 Fase III: Identificacin de gnero.
Tincin de Gram
Despus de realizar los frotis y el procedimiento de coloracin en cada uno, se
pudo observar que las 5 cepas son GRAM NEGATIVAS, en formas de bacilos.
(Figura 13)
58
Microorganismos fermentadores del hidrato de carbono: producen una
reaccin cida en ambos tipos de tubos.
Microorganismos que no utilizan el hidrato de carbono: no producen cambio
ninguno de los dos tubos, los cuales permanecen verdes.
Fluorescencia en medio KB
Considerando que en el cultivo de crecimiento anaerobio se haba obtenido como
positiva la cepa 2C(B) no fue tomada en cuenta para esta prueba, ya que se est
siguiendo el esquema de la Figura 5. Se estriaron por dilucin dos cajas Petri
59
para cada cepa, despus de 24 horas de incubacin a 270.2C se hizo una
revisin de las cajas para verificar el crecimiento de las colonias y la ausencia de
contaminacin, a las 48 horas se hizo la visualizacin en la lmpara de luz UV, a
longitud de onda larga, comparndolas con una siembra positiva y una negativa,
previamente identificadas como tal, adems de un blanco, que consiste en una
caja Petri con medio estril (Figura 15).
Como se puede ver en la Figura 15 las cepas 2C(A) y 5D(A) dan una fluorescencia
mayor que las otras dos, por lo que se les considera positivas y a las cepas 1A(A)
y 5D(B) negativas a fluorescencia en medio KB.
60
Crecimiento de colonias amarillas en agar YDC
El medio YDC no es semi-selectivo pero ayuda a diferenciar por el color de las
colonias que crecen en l. Siguiendo lo propuesto por Schaad, et al (2001), al
obtener resultados negativos para la fluorescencia en medio KB [1A(A); 5D(B)], y
al tener un resultado positivo en crecimiento anaerobio [2C(B)] se procedi a
sembrar mediante estriado por dilucin.
Teniendo un control a las 24 horas para ver que hubiera crecimiento y ausencia de
contaminacin, se incubaron a 35C durante 48 horas. En la Figura 16 se pueden
ver que en la cepa 1A(A) hay crecimiento de color amarillo, y en los cultivos 2C(B)
y 5D(B) se puede ver crecimiento de otros colores. Para la cepa 2C(B) de color
blanco-cremoso y para la 5D(B) de una tonalidad caf claro-beige. Concluyendo
para esta prueba que los cultivos 2C(B) y 5D(B) es un resultado negativo y que
para la cepa 1A(A) es un resultado positivo ya que hay un crecimiento de color
amarillo y textura butirosa.
61
Prueba de ureasa
Despus de 24 horas de incubacin no hubo ningn cambio en la coloracin del
medio en comparacin con el blanco (medio caldo urea sin inocular, ubicado en
medio de los dos tubos inoculados por cepa), as que todas dieron resultado
negativo. En la Figura 17 se muestra un control positivo para verificar que en
ninguno de los tubos inoculados hubo un cambio de coloracin.
62
Figura 18. Resultado crecimiento en agar D1M
Pruebas complementarias
Catalasa
Para poder observar la efervescencia fue necesario hacer la prueba en el
microscopio estereoscpico.
Al observar la Figura 19 se puede ver que las cinco cepas analizadas dan como
resultado positivo a esta prueba.
63
Oxidasa
En condiciones de esterilidad se tom una pequea porcin de masa de bacterias
para despus ponerla en el papel filtro ya hmedo por la solucin de N,N dimetil-
para-fenilen-diamina, recin preparada.
64
Resultados de las pruebas bioqumicas
En la Tabla 19 se puede observar un resumen de los resultados obtenidos en las
pruebas bioqumicas que permitieron encontrar la familia bacteriana de las cepas:
Tabla 19. Resultados pruebas bioqumicas
PRUEBAS BIOQUMICAS
CEPA Hugh y
Gram Forma Ureasa Catalasa Oxidasa KB YDC D1M
Leifson
1A(A) - B - - + + - + N.A
retardado
2C(A) - B - - + + + N.A N.A
2C(B) - B + - + - - - N.A
5D(A) - B - - + + + N.A N.A
5D(B) - B - - + + - + +
Gram: tincin de Gram; Hugh y Leifson: Crecimiento anaerobio; KB: Crecimiento fluorescente;
YDC: Colonias amarillas; D1M: Crecimiento en agar D1M; B: Bacilos; N.A: No Aplicada
65
Las cepas 1A(A), 2C(A), 5D(A) y 5D(B) pertenecen a la familia
Pseudomonadaceae, donde hay tres gneros: Pseudomonas,
Xanthomonas y Agrobacterium.
Las cepas 2C(A) y 5D(A) pertenecen al gnero Pseudomonas:
Las clulas del gnero son varillas rectas o curvas que miden 0.5 a 1.0 x 1.5 a 4.0
micras. Son Gram negativas y aerobias, catalasa y oxidasa positivas, y presentan
uno o ms flagelos polares. En agar simple forman colonias brillantes,
confluentes, de borde continuo y a veces ondulado con un centro opaco. El
pigmento (piocianina) se difunde en el medio dndole una tonalidad azul verdosa
(Krieg, 1984).
La cepa 1A(A) pertenece al gnero Xanthomonas:
Son bacilos, usualmente de entre 0.4-0.6 x 0.8-2.0 m, predominantemente
individuales pocas veces en pares, ocasionalmente en cadenas cortas y
raramente en filamentos. Circulares, enteras y butirosas cuando son jvenes, pero
muchas pueden mostrar superficies estriadas legando a ser lobuladas cuando
envejecen; inicialmente las colonias son transparentes a amarillo plido; Gram
negativo, mviles por un flagelo polar, aerbicas estrictas, catalasa positivas y
oxidasa negativas o positivas tardas. Las colonias son usualmente amarillas,
hmedas y butirosas, mucoides o viscosas. (Schaad et al, 2001; Hernandez y
Trujillo, 2000; Sosa et al, 1997).
La cepa 5D(B) pertenece al gnero Agrobacterium:
Los miembros de este grupo son aerobias obligadas, Gram negativo, tienen forma
de varilla y miden de 0.6 a 1.0 x 1.5 a 3.0 micras y son mtiles con 1 a 6 flagelos
pertricos (cuando tienen uno solo ste es ms lateral que polar). Las colonias son
blancas, lisas y mucosas. En medios que contienen carbohidratos, producen gran
cantidad de polisacridos extracelulares mucilaginosos (Fierro y Mena, 2009).
Los resultados obtenidos sugieren que las bacterias de los gneros Erwinia,
Pseudomonas, Xanthomonas y Agrobacterium seran excelentes candidatas para
el saneamiento de suelos contaminados con hidrocarburos, ya que inicialmente su
nica fuente de carbono fueron los compuestos voltiles del petrleo crudo.
66
4. CONCLUSIONES.
El suelo utilizado tena hasta 10 veces ms HTPs (62 589.83 mg Kg-1) que
el lmite permisible por la normatividad mexicana y los microorganismos
encontrados puede ser que tengan la capacidad metablica para tolerar esa
concentracin y adems de que pueden consumirlos.
67
Comparando los resultados en este trabajo con el de Prez (2012), que es
un trabajo donde tambin se aslan bacterias hidrocarburoclastas de suelo
contaminado por hidrocarburos, se puede apreciar que a pesar de ser
muestras de suelos de la misma regin tienen caractersticas fisicoqumicas
diferentes y aun as se reportan dos gneros iguales en ambas
investigaciones, Agrobacterium spp y Xanthomonas spp. Por lo tanto se
puede concluir que existe la posibilidad de que las bacterias nativas del
suelo contaminado puedan degradar los hidrocarburos presentes en el
suelo.
5. RECOMENDACIONES.
Realizar tcnicas de purificacin empleando las diluciones seriadas de las
colonias morfolgicamente unnimes, para garantizar mejor la pureza de
stas.
1
Adicionar bacterias altamente especializadas para incrementar y mejorar la capacidad de
biodegradacin total de la poblacin bacteriana natural.
2
Circulacin de soluciones acuosas (que contengan nutrientes y/u oxgeno) a travs del suelo
contaminado, para estimular la actividad de los microorganismos autctonos, y mejorar as la
biodegradacin de contaminantes orgnicos.
68
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73
ANEXOS
ANEXO I. METODOLOGA ANLISIS FSICOS Y QUMICOS DEL
SUELO
Una vez que la muestra estaba seca, se pas a la estufa de 100C y se dej secar
durante varios das. Despus se sac de la estufa para que se enfriara a temperatura
ambiente y se continu con la determinacin. De la muestra ya digerida y seca se pesaron
50 g de suelo, saturndola con agua destilada y 10 mL de solucin de calgn al 10% y se
homogeneiz, dejndola reposar por 15 minutos, la suspensin fue mezclada en una
batidora y despus se vaci en una probeta de 1000 mL. Finalmente, la suspensin fue
bien mezclada mediante la agitacin de la probeta tapada con un trozo de papel adhesivo,
despus se introdujo el hidrmetro dentro de la probeta, y 40 segundos despus se tom
una lectura del hidrmetro y la temperatura; se dej en reposo la suspensin por dos
horas y se tom una segunda lectura del hidrmetro y de la temperatura.
Clculos:
% de arena
Para calcular la cantidad de arena presente en 1 litro de la suspensin, restar este
valor del peso original de la muestra. Por ejemplo, si la lectura del hidrmetro
despus de los 40 segundos a temperatura corregida es de 18.0 g L-1, entonces
limo + arcilla pesan 18.0 en 1 litro de suspensin de suelo. Entonces la arena pesa
50.0-18.0 = 32 g en 1 litro de suspensin (50.0 g es el peso original de la muestra
de suelo secado al aire).
El porcentaje de arena es calculado dividiendo el contenido de arena (32 g) entre
el total (50 g) y multiplicndolo por 100 de la manera siguiente:
% de arena = 32 / 50 x 100 = 64%
75
% de arcilla
Despus de 2 horas, el limo se ha sedimentado.
La lectura del hidrmetro refleja ahora el contenido de arcilla de la suspensin
original. Por ejemplo, si la lectura del hidrmetro despus de corregir la
temperatura es de 4.7 g L-1, entonces el porcentaje de arcilla en el suelo es:
% de arcilla = 4.7 / 50 x 100 = 9.4% = 9%
% de limo
76
Tabla 21. Correccin de temperatura para las lecturas del hidrmetro.
Temperatura Correccin del Temperatura Correccin del
(C) hidrmetro (g L-1) (C) hidrmetro (g L-1)
15 -1.62 22.0 +0.90
15.5 -1.44 22.5 +1.08
16 -1.26 23.0 +1.26
16.5 -1.08 23.5 +1.44
17 -0.90 24.0 +1.62
17.5 -0.72 24.5 +1.80
18.0 -0.54 25.0 +1.98
18.5 -0.36 25.5 +2.15
19.0 -0.18 26.0 +2.34
19.5 0 26.5 +2.52
20.0 +0.18 27.0 +2.70
20.5 +0.36 27.5 +2.858
21.0 +0.54 28.0 +3.06
77
A1.4 Determinacin de la materia orgnica (Mtodo de Walkey-Black)
Se pesaron 0.05 g de suelo de tamiz No.0.5 en un matraz de 500 mL al que, para oxidar
la materia orgnica, se le aadi 10 mL de dicromato de potasio 1 N mezclando con
movimiento rotatorios y 20 mL de cido sulfrico concentrado dejndolo caer suavemente
por la pared del matraz, ya que se genera una reaccin violenta y exotrmica. Se dej
reposar por 30 minutos y simultneamente se realiz de la misma forma un ensayo en
blanco, es decir sin muestra de suelo. Para hacer la valoracin por retroceso se le
agregaron 200 mL de agua destilada, 5 mL de cido fosfrico y de 5 a 8 gotas de
indicador difenilaminasulfonato de bario, valorando con la solucin de sulfato ferroso
amnico 1 N.
El color verde obscuro debido a los iones cromo en un precipitado, se desplaza hacia el
azul turbio a medida que avanza la valoracin. En el punto final este color cambia
bruscamente a verde brillante, dando el viraje con una gota. Si se han gastado 8 de los 10
mL de cido crmico se repite el ensayo tomando una muestra de suelo ms pequea.
Clculos:
Donde:
B = valoracin del blanco, mL de la solucin ferrosa
M = valoracin de la muestra, mL de la solucin ferrosa
N = normalidad del sulfato ferroso amoniacal
0.0039 = (12/4000) x (1/0.77)
12/4000 = miliequivalente del carbono
1/0.77 = es un factor de correccin debido a que se supone que el mtodo solo
oxida 77% del carbono
1.724 = factor resultante de considerar que un 58% de la materia
orgnica del suelo es carbono (1/0.58) (factor de Van Benmelen)
W = peso del suelo en g.
78
A1.5 Determinacin de nitrgeno orgnico (Mtodo matemtico)
El porcentaje de nitrgeno orgnico se obtiene a partir del clculo de porcentaje de
materia orgnica, mediante el uso de la siguiente expresin:
Donde:
20 = 5% del nitrgeno contenido en la materia orgnica lo que equivale a 100/5 =
20
Clculos:
La cantidad de N - NO3, expresada en ppm o mg Kg-1 se calcula de la siguiente forma:
Donde:
C= lectura en ppm
V= volumen del extractante (20 mL)
f.d. = factor de dilucin
W= peso de la muestra (g)
Corregir el valor final por el contenido de agua en el suelo:
Donde:
A= ppm o mg Kg-1 de N-NO3
79
A1.7 Determinacin de fsforo (Mtodo de Olsen)
Para determinar el fsforo de la muestra se pesaron, por duplicado, 2.5 g de suelo en
tamiz No. 2 y se colocaron en tubos de polietileno, se adicionaron 50 mL de solucin
extractora y agit la suspensin en agitador de accin recproca durante 30 minutos, a
180 oscilaciones por minuto para posteriormente filtrarlas a travs de papel filtro Whatman
No. 42. Despus de esto se tom 5 mL ( 10 si la concentracin de P es muy baja) del
filtrado y se coloc en un matraz aforado de 50 mL. Finalmente, se agregaron 5 mL de la
solucin reductora, se agit y afor, al mismo tiempo se preparaba un blanco de la misma
manera. Las preparaciones se dejaron reposar por una hora para que el color se revelara
y despus se hizo la lectura en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 882 nm.
Para preparar la curva de calibracin se usaron de 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 mg L-1 de
P.
Clculos:
Donde:
CC= mg L-1 de P en la solucin. Se obtiene graficando la curva de calibracin
(absorbancia contra mg L-1) e interpolando en la misma los valores de absorbancia
de las muestras analizadas.
Vi = volumen de la solucin extractora adicionada.
P = peso de la muestra de suelo seca al aire.
Vf = volumen final de la solucin colorimtrica a leer.
a = alcuota de la muestra empleada para la cuantificacin.
80
hasta que el sobrenadante era de un color caf claro amarillento, tres veces en total.
Finalmente, en un rotaevaporador, se evapor el diclorometano hasta la sequedad, el
residuo obtenido contena todos los hidrocarburos solubles en diclorometano. Los
extractos orgnicos fueron puestos en recipientes (viales) a peso constante. La diferencia
de dichos pesos corresponda al contenido total de HTPs.
Clculos:
Para hacer el clculo de concentracin de hidrocarburos totales del petrleo provenientes
de la muestra, se debe considerar la cantidad de suelo que se pes para la extraccin, as
como la humedad de la muestra. El resultado debe expresarse en mg de HTP Kg -1 de
suelo seco, y se calcula de la siguiente manera:
Donde:
HTPs (mg Kg-1 de s.s.) = hidrocarburos totales del petrleo en mg Kg-1 de suelo
seco.
RA = peso (mg) del recipiente vaco a peso constante.
RB = peso (mg) del recipiente con el extracto orgnico concentrado.
P = cantidad de suelo extrado (g).
81
ANEXO II. METODOLOGA ANLISIS MICROBIOLGICOS
Para el conteo de bacterias totales del suelo contaminado se realiz esta tcnica usando
agar nutritivo (AN), tubos con tapn de rosca con 9 mL y frascos con 90 mL de solucin
salina isotnica al 0.85% as como cajas Petri y puntas para pipeta automtica,
esterilizados por 20 minutos a 15 lb de presin. Para la preparacin de la muestra se
pesaron, en condiciones de esterilidad, 10 g de suelo que fueron agregados al frasco que
contenia 90 mL de solucion isotnica estril, dejndose en incubacin a 35C para la
activacin de los microorganismos. Despues de 24 horas de incubacin se procedi a la
preparacin de diluciones tomando 1 mL de la muestra incubada y transfirindolo a uno
de los tubos (dilucin 10-2), previamente se dispers el suelo y homogeneiz la muestra.
Se repiti este paso preparando diluciones sucesivas hasta la dilucin 10-6, asegurndose
de utilizar una punta estril diferente en cada paso. Se debe agitar de forma constante en
cada paso (Figura 22)
82
la derecha y a la izquierda, y moviendo la caja horizontal y verticalmente. Despus se dej
que el medio se solidificara y se pusieron a incubar por 24 horas a 35C (Figura 23).
Pasadas las 24 horas de incubacin, se procedi al conteo de UFC en las cajas por
medio de tcnicas empleadas en el rea de Inocuidad Alimentaria de LATEX; la tcnica
de sectores y por punteo.
Clculos:
Por Sectores:
83
Donde:
C1,2,3= Total de colonias contadas en cada uno de los tres cuadrantes dibujados en
cada caja
65= Total de centmetros cuadrados que hay en una caja Petri
E.D = Equivalente de la dilucin en la que se realiz el conteo
Por Punteo:
Donde:
C1,2,= Total de colonias contadas en cada caja Petri
E.D = Equivalente de la dilucin en la que se realiz el conteo
Conteo:
Para el conteo de las UFCs, se emplearon los mismos clculos presentados en la seccin
2.1 del ANEXO 2.
84
Aislamiento y purificacion:
A partir del crecimiento de colonias en atmsfera de petrleo se procedi a identificar, con
ayuda de un microscopio estereoscpico, las diferentes colonias por su morfologia, a
partir de la cual se identificaron cinco tipos diferentes. Una vez diferenciadas, se marc la
ubicacin en la caja Petri para posteriormente sembrar cada cepa en agar nutritivo (AN) y
en agar tripteina soya (TSA) por agotamiento (Figura 25), siendo esta la Resiembra 1.
Las resiembras posteriores se hicieron usando el estriado por dilucin (Figura 25),
haciendo tres secciones y quemando el asa de platino antes de hacer el estriado 2 y 3.
Hasta la Resiembra 3 se mantena el medio de cultivo inicial (AN o TSA), pero para la
Resiembra 4 todas las cepas se estriaron en AN, para poder diferenciar mas fcilmente
las colonias. Todas las resiembras se cultivaron a 35C por 24 horas. Se hicieron
resiembras hasta obtener cultivos donde las colonias aisladas fueron observadas
morfologicamente puras.
85
minutos, se lava con agua destilada y se seca, para despus observar el
porta objetos en un microscopio compuesto.
86
A2.3.5 Prueba de ureasa
Se inocularon dos tubos que contenan 5 mL de caldo urea con una asada
de la suspensin microbiana a estudiar y se incubaron a 35C durante 24
horas. En este caso el caldo urea no se esteriliza ya que la urea se
descompone al someterse al calor.
87
ANEXO III. PREPARACIN DE SOLUCIONES Y MEDIOS DE
CULTIVO
88
Solucin stock de NO3-N de 1000 ppm
Secar aproximadamente 10 g de nitrato de potasio a 105C durante 2 horas. Enfriar en
desecador. Pesar 7.223 g. Disolver en un poco de agua destilada y aforar a un litro.
Hidrxido de sodio 1 M.
Disolver 4 g de NaOH en 100 mL de agua.
89
Solucin patrn de fsforo (200 mg L-1)
Pesar exactamente 0.8786 g de fosfato de potasio monobsico (KH2PO4) seco al horno a
105C, disolver en agua y aforar a un litro. Guardar en envase de plstico o vidrio y
conservar en refrigeracin.
90
Mezclar hasta obtener una sujecin homognea. Calentar y hervir por 1 minuto con
agitacin frecuente. Esterilizar a 121C durante 20 minutos. Enfriar de 45 a 50C
aproximadamente. Agregar 1 mL de la solucin mineral para bacterias
hidrocarburoclastas estril y mezclar hasta homogeneizar.
91
filtros se puede esterilizar a 100-110C durante 10 minutos. Si este medio se prepara y se
inocula de inmediato se obtienen buenos resultados sin esterilizar.
Agar D1M
Pesar y disolver los siguientes reactivos en 100mL de agua destilada: 0.5 g de celubiosa;
0.1 g de NH4Cl; 0.1 g de NaH2PO4; 0.1 g de K2HPO4; 0.3 g de MgSO4*7H2O; 1 mg de
verde de malaquita y 1.5 g de agar. Ajustar el pH a 7, calentar hasta ebullicin. Esterilizar
a 15 psi, a 121C por 20 minutos, dejar enfriar a 45-50C y vaciar a cajas Petri estriles.
A3.3 Equipos
Agitador orbital LAB-LINE
Autoclave FELISA, modelo FE-399.
Balanza analtica Denver AA-200
Balanza digital AND, modelo GF-2000.
Bao de Agua APSA GB822
Bao isotrmico FISHER-Scientific, modelo ISOTEM 210.
Batidora de fuente de sodas
Cabina Cromato-Uve UVP Upland CA, modelo CC-10
Campana de extraccin
Campana de flujo laminar VECO, modelo GVFL-B09.
Centrfuga Eppendorf 5416
Centrifuga Universal HETTICH, modelo D788532
Estufa de secado FELISA
Incubadora FELISA, modelo FE-134.
Microscopio Estereoscpico CARL ZEISS, modelo STEMI 1000
Microscopio Compuesto CARL ZEISS, modelo K F2
Potencimetro ORION, modelo 420A.
Parrilla elctrica FELISA, modelo FE-311.
Tamizador elctrico
Vortex Thermolyne M16715.
92