Publikacja wspfinansowana przez Uni Europejsk w ramach Europejskiego Funduszu Spoecznego

TECHNIKI SEPARACYJNE

Piotr Stepnowski

Elbieta Synak
Beata Szafranek
1
Wydawnictwo Uniwersytetu Gdaskiego Zbigniew Kaczyski
 Publikacja wspfinansowana przez Uni Europejsk w ramach Europejskiego Funduszu Spoecznego

Copyright by:

Piotr Stepnowski, Elbieta Synak, Beata Szafranek, Zbigniew Kaczyski

Skad komputerowy: Zbigniew Kaczyski & Piotr Stepnowski

Okadk i stron tytuow zaprojektowali: Anna Biak-Bieliska, Jolanta Kumirska, Piotr Stepnowski

Recenzent: Prof. dr hab. in. Waldemar Wardencki

ISBN 978-83-7326-712-1

All rights reserved

Uniwersytet Gdaski
Wydzia Chemii
80-952 Gdask, ul. Sobieskiego 18/19

2
Techniki separacyjne

Piotr Stepnowski

Elbieta Synak

Beata Szafranek

Zbigniew Kaczyski

Uniwersytet Gdaski, Gdask 2010

Spis treci
Od autorw .................................................................................................................................. 9
I. Wstp do technik separacyjnych ................................................................................................. 9
1. Wstp ................................................................................................................................... 9
2. Teoria separacji ....................................................................................................................12
2.1. Termodynamiczny opis separacji .....................................................................................13
2.2. Adsorpcja i podzia .........................................................................................................17
2.3. Oddziaywania midzyczsteczkowe................................................................................21
2.3.1. Oddziaywania dyspersyjne ......................................................................................21
2.3.2. Oddziaywania polarne.............................................................................................22
2.3.3. Oddziaywanie jonowe .............................................................................................23
2.4. Lipofilowo w opisie potencjau oddziaywa molekularnych ..........................................24
3. Literatura.................................................................................................................................29
II. Ekstrakcja ................................................................................................................................30
1. Wstp ..................................................................................................................................30
2. Podzia technik ekstrakcyjnych ..............................................................................................31
3. Ekstrakcja prbek gazowych..................................................................................................35
3.1. Ekstrakcja w ukadzie gaz ciecz .....................................................................................35
3.1.1. Ekstrakcja membranowa przez bony pprzepuszczalne ............................................35
3.2. Ekstrakcja w ukadzie gaz ciao stae .............................................................................37
3.2.1. Ekstrakcja gazw przez membrany porowate ............................................................39
3.2.2. Mikroekstrakcja do fazy staej ..................................................................................42
4. Ekstrakcja prbek ciekych ....................................................................................................50
4.1. Ekstrakcja w ukadzie ciecz gaz .....................................................................................50
4.1.1. Ekstrakcja do gazowej fazy nadpowierzchniowej .......................................................50
4.1.2. Ekstrakcja strumieniem gazu przepywajcym przez prbk .......................................53
4.2. Ekstrakcja w ukadzie ciecz-ciecz .....................................................................................56
4.2.1. Ekstrakcja zwizkw organicznych ............................................................................59
4.2.2. Ekstrakcja zwizkw nieorganicznych........................................................................61
4.2.2.1. Ekstrakcja kompleksw chelatowych ..................................................................61
4.2.2.2. Ekstrakcja jonw metali w postaci kompleksw jonowo-asocjacyjnych.................62
4.2.2.3. Ekstrakcja specjacyjna .......................................................................................65
4.2.3. Klasyczna technika ekstrakcji ciecz ciecz .................................................................67
4.2.4. Ekstrakcja ciga ......................................................................................................67

4
 4.2.5. Mikroekstrakcja .......................................................................................................69
4.2.5.1 Mikroekstrakcja do rozpuszczalnika.....................................................................69
4.2.5.2. Mikroekstrakcja do kropli ..................................................................................69
4.2.5.3. Mikroekstrakcja poprzez membran do fazy ciekej .............................................72
4.2.6. Ekstrakcja cieczami jonowymi...................................................................................73
4.3. Ekstrakcja w ukadzie ciecz ciao stae ...........................................................................79
4.3.1. Ekstrakcja do fazy staej ...........................................................................................79
4.3.2. Mikroekstrakcja do fazy staej ..................................................................................84
4.3.3. Ekstrakcja za pomoc ruchomego elementu sorpcyjnego ...........................................84
4.3.4. Ekstrakcja z ograniczonym dostpem do fazy stacjonarnej .........................................90
4.3.5. Ekstrakcja przez wykluczanie na sorbentach immunologicznych .................................91
4.3.6. Ekstrakcji za pomoc polimerw z nadrukiem molekularnym .....................................92
4.3.7. Mikroekstrakcja do upakowanego sorbentu w strzykawce .........................................95
5. Ekstrakcja prbek staych ......................................................................................................97
5.1. Ekstrakcja prbek staych faz gazow.............................................................................98
5.1.1 Ekstrakcja do gazowej fazy nadpowierzchniowej ........................................................98
5.1.2. Ekstrakcja dynamiczna technik wymywania i wychwytywania...................................99
5.1.3. Ekstrakcja strumieniem gazu z desorpcj termiczn ...................................................99
5.2. Ekstrakcja w ukadzie ciao stae ciecz ......................................................................... 100
5.2.1. Ekstrakcja rozpuszczalnikiem przez wytrzsanie....................................................... 100
5.2.2. Ekstrakcja przez homogenizacj prbki z rozpuszczalnikiem ..................................... 100
5.2.3. Ekstrakcja przez zmydlanie (saponifikacja)............................................................... 100
5.2.4. Ekstrakcja za pomoc strumienia rozpuszczalnika .................................................... 101
5.2.5. Ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika z prbki zmieszanej z wypeniaczem............... 102
5.2.6. Ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika w aparacie Soxhleta ...................................... 103
5.2.7. Ekstrakcja wspomagana ultradwikami ................................................................. 107
5.2.8. Ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika wspomagana promieniowaniem mikrofalowym
...................................................................................................................................... 108
5.2.9 Ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika pod zwikszonym cinieniem.......................... 111
5.2.10. Przyspieszona ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika ............................................. 112
5.2.11. Ekstrakcja pynem w stanie nadkrytycznym ........................................................... 115
5.2.12. Ekstrakcja poprzez mineralizacj........................................................................... 119
6. Literatura ........................................................................................................................... 121
III. Techniki chromatograficzne ................................................................................................... 123

5
1. Wprowadzenie do chromatografii ....................................................................................... 123
1.1. Wstp.......................................................................................................................... 123
1.2. Podstawowe definicje chromatograficzne...................................................................... 125
1.3. Chromatogram............................................................................................................. 127
1.4. Podstawowe parametry retencyjne............................................................................... 129
1.5. Podstawy teoretyczne procesu chromatograficznego ..................................................... 130
1.5.1. Teoria pek .......................................................................................................... 132
1.5.2. Teoria kinetyczna................................................................................................... 135
1.6. Sprawno kolumn chromatograficznych ....................................................................... 139
1.7. Analiza jakociowa ....................................................................................................... 141
1.8. Analiza ilociowa .......................................................................................................... 144
1.8.1. Metoda krzywej kalibracyjnej ................................................................................. 145
1.8.2. Metoda wzorca wewntrznego............................................................................... 146
1.8.3. Metoda dodatku wzorca ........................................................................................ 149
1.8.4. Metoda normalizacji wewntrznej .......................................................................... 150
2. Chromatografia cieczowa .................................................................................................... 152
2.1. Wstp.......................................................................................................................... 152
2.2. Chromatografia cienkowarstwowa ................................................................................ 153
2.2.1. Wstp ................................................................................................................... 153
2.2.2. Proces chromatograficzny ...................................................................................... 154
2.2.3. Zasady dobrej praktyki laboratoryjnej w TLC............................................................ 157
2.3. Chromatografia kolumnowa niskocinieniowa ............................................................... 159
2.3.1. Wstp ................................................................................................................... 159
2.3.2. Proces chromatograficzny ...................................................................................... 160
2.3.3. el krzemionkowy jako faza stacjonarna.................................................................. 161
2.3.4. Klasyfikacja rozpuszczalnikw w normalnym ukadzie faz ......................................... 162
2.3.5. Dobr warunkw rozdziele w chromatografii kolumnowej na elu krzemionkowym za
pomoc analizy TLC......................................................................................................... 165
2.4. Wysokosprawna chromatografia cieczowa .................................................................... 169
2.4.1. Wstp ................................................................................................................... 169
2.4.2. Aparatura.............................................................................................................. 170
2.4.3. Chromatografia adsorpcyjna .................................................................................. 175
2.4.4. Chromatografia podziaowa ................................................................................... 175
2.4.5. Chromatografia jonowa ......................................................................................... 177

6
 2.4.6. Chromatografia wykluczania .................................................................................. 182
2.4.7. Chromatografia powinowactwa.............................................................................. 183
3. Chromatografia gazowa ..................................................................................................... 184
3.1. Wstp.......................................................................................................................... 184
3.2. Aparatura .................................................................................................................... 184
3.3. Wybr parametrw analizy GC...................................................................................... 190
4. Poczenie chromatografii gazowej ze spektrometri mas..................................................... 192
5. Chromatografia z faza ruchom w stanie nadkrytycznym ...................................................... 198
5.1. Wstp.......................................................................................................................... 198
5.2. Fazy ruchome .............................................................................................................. 199
5.3. Proces rozdzielania chromatograficznego ...................................................................... 199
5.4. Aparatura .................................................................................................................... 200
5.5. Zastosowanie chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym............................ 203
6. Literatura ........................................................................................................................... 204
IV. Techniki elektromigracyjne .................................................................................................... 206
1. Wstp ................................................................................................................................ 206
2. Podzia technik elektroforetycznych..................................................................................... 210
2.1. Elektroforeza kapilarna................................................................................................. 211
Zalety elektroforezy kapilarnej......................................................................................... 217
2.1.1. Strefowa elektroforeza kapilarna ............................................................................ 218
2.1.2. Micelarna elektrokinetyczna chromatografia kapilarna ............................................ 218
2.1.3. Kapilarna elektroforeza elowa............................................................................... 219
2.1.4. Ogniskowanie izoelektryczne.................................................................................. 219
2.1.5. Izotachoforeza kapilarna ........................................................................................ 220
2.1.6. Elektrochromatografia kapilarna............................................................................. 221
2.2. Elektroforeza elowa na paszczynie ............................................................................ 222
2.2.1. ele stosowane w elektroforezie ............................................................................ 223
2.2.2. Przygotowanie prbek ........................................................................................... 225
2.2.3. Rozdzielenie .......................................................................................................... 225
2.2.4. Wizualizacja .......................................................................................................... 225
2.2.5. Dokumentacja rozdziele ....................................................................................... 226
3. Wykorzystanie technik elektromigracyjnych......................................................................... 226
4. Literatura ........................................................................................................................... 227

7
Od autorw
Techniki separacyjne, a szczeglnie techniki chromatograficzne s dzisiaj najczciej stosowanymi
technikami laboratoryjnymi adne wspczesne laboratorium chemiczne czy biochemiczne nie
moe si bez nich obej. Nabywanie umiejtnoci posugiwania si nowoczesnymi technikami
separacyjnymi staje si wic zasadniczym obszarem ksztacenia praktycznego na kierunkach
chemicznych i pokrewnych w szkolnictwie wyszym.

Od wielu lat Wydzia Chemii Uniwersytetu Gdaskiego wprowadza do programw studiw na

kierunkach CHEMIA oraz OCHRONA RODOWISKA zagadnienia zwizane z zastosowaniem technik
separacyjnych w zaawansowanej analityce chemicznej i biochemicznej, fizykochemii organicznej czy
monitoringu rodowiska. Dodatkowo, na jednej ze specjalnoci kierunku chemia (analityka i
diagnostyka chemiczna) realizowany jest przedmiot pod nazw Techniki separacyjne.

Niniejszy skrypt przygotowany zosta z myl o studentach wszystkich kierunkw i specjalnoci

Wydziau Chemii UG, ktrzy z elementami technik separacyjnych stykaj si ju na pierwszym roku
studiw, by w kolejnych latach poznawa coraz to bardziej zaawansowane metody rozdzielncze
zarwno w obrbie kursw podstawowych jak i specjalnociowych.

Skrypt podzielony jest na trzy samoistne czci: techniki izolacji analitw, techniki chromatograficzne
oraz techniki elektormigracyjne. Takie podejcie umoliwio zawarcie wikszoci zagadnie
teoretycznych i praktycznych towarzyszcych technikom separacyjnym ukazujc je, jako integralny
obszar wiedzy.

Mamy nadziej, e skrypt Techniki separacyjne stanie si wan pozycj wspomagajc ksztacenie
studentw na Wydziale Chemii Uniwersytetu Gdaskiego oraz innych uczelni w Polsce.

Autorzy

8
I. Wprowadzenie do technik separacyjnych
1. Wstp
Techniki separacyjne we wspczesnej analityce chemicznej s podstaw wikszoci procesw izolacji
i identyfikacji zwizkw chemicznych. Ich zadaniem jest selektywne rozdzielenie pierwiastkw czy
substancji chemicznych ze skomplikowanych mieszanin, przy jednoczesnym okreleniu ich rodzaju i
iloci. Stosujc techniki separacyjne, w trakcie jednej operacji analitycznej mona uzyska bardzo
wiele informacji. Jest to najprawdopodobniej najwiksza ich zaleta w porwnaniu z klasycznymi
metodami analitycznymi.
Oprcz zastosowania analitycznego, techniki separacyjne wykorzystywane s obecnie rwnie w
procesach preparatywnych, tzn. do wydzielania wikszych iloci pojedynczych substancji lub frakcji
wybranych zwizkw o okrelonym dalszym zastosowaniu. W duej mierze procesy te s bardzo
podobne do zastosowa analitycznych ze wzgldu na mechanizm rozdzielania jak i stosowanej
aparatury, rni si natomiast skal.
Zastosowanie technik separacyjnych w analityce chemicznej zwizkw organicznych rozpoczo si
ponad sto lat temu, wraz z odkryciem zjawiska chromatografii przez Michaia Cwieta, ktry po raz
pierwszy zastosowa t metod do rozdziele wyekstrahowanych barwnikw rolin. Rozwj tej
dziedziny nauki nie byby jednak moliwy bez wkadu takich uczonych jak Irving Langmuir (Nagroda
Nobla w 1932) czy Archer Martin i Richard Synge (Nagroda Nobla w 1952), ktrych badania nad
fizykochemi powierzchni czy zjawiskami midzyfazowego podziau day faktyczne podstawy
nowoczesnym technikom separacyjnym.
Wspczenie, techniki separacyjne stosowane w chemii analitycznej obejmuj trzy zasadnicze grupy:

techniki izolacji analitw z matryc,

techniki chromatograficzne,
techniki elektromigracyjne.

Techniki izolacji analitw reprezentowane s przede wszystkim przez rnorodne metody

ekstrakcyjne, takie jak ekstrakcja rozpuszczalnikiem czy ciecz w stanie nadkrytycznym, ekstrakcja i
mikroekstrakcja do fazy staej czy ekstrakcja do kropli. Dodatkowo, procesy te mog by
wspomagane energi ultradwikw, mikrofal lub podwyszaniem cinienia.
Najobszerniejsz grup technik separacyjnych, stosowanych w analityce chemicznej, jest
chromatografia. Obejmuje ona chromatografi planarn, gazow i cieczow wraz z ich odmianami,
jak chromatografia adsorpcyjna, podziaowa, powinowactwa, wykluczenia, jonowymienna i in. oraz
techniki czone, wykorzystujce np. poczenie procesu ekstrakcji z dozowaniem prbki do ukadu
pomiarowego czy separacji analitw wraz z okreleniem ich iloci i identyfikacji struktury.
Trzecia grupa obejmuje techniki elektromigracyjne, takie jak: elektroforeza planarna i kapilarna,
micelarna chromatografia elektrokinetyczna, kapilarne ogniskowanie izoelektryczne oraz
izotachoforeza kapilarna.
Podstawowy podzia technik separacyjnych wykorzystywanych w analityce chemicznej
przedstawiono na rysunku 1. Dodatkowo, podziau metod mona dokona na podstawie cech
charakterystycznych dla konkretnego procesu. S to: typ fazy ruchomej (gaz lub ciecz), profil ukadu

9
(strefowy lub czoowy), rodzaj izotermy (liniowy lub nieliniowy), rozmieszczenie wypenienia
(planarne lub kolumnowe), skad fazy ruchomej (izokratyczny lub w gradiencie), wymiarowo ukadu
(jednowymiarowy, dwu- lub wielowymiarowy), skala (analityczna lub preparatywna) oraz rodzaj
mechanizmu.

Techniki separacyjne w analityce chemicznej

Techniki Techniki Techniki

ekstrakcyjne chromatograficzne elektromigracyjne

Ekstrakcja gazem Chromatografia Elektroforeza

gazowa elowa na
paszczynie
Ekstrakcja ciecz Chromatografia
kolumnowa
Elektroforeza
Ekstrakcja do fazy kapilarna
staej
Chromatografia
ciecz w stanie
nadkrytycznym

Chromatografia
kolumnowa

Chromatografia
cieczowa

Chromatografia
kolumnowa

Chromatografia
planarna

Rysunek 1. Techniki separacyjne w analityce chemicznej

10
Procesom separacyjnym towarzysz okrelone mechanizmy fizyczne i chemiczne, w konsekwencji
umoliwiajce rozdzielenie substancji z mieszaniny (rysunek 2). Istniej trzy podstawowe grupy
mechanizmw wykorzystywanych w separacji analitycznej, s to: podzia, adsorpcja oraz filtracja.
Ostatni z nich ma charakter wycznie fizyczny i ma zastosowanie gwnie w procesach zatania i
wydzielania analitw z matryc. Z kolei zarwno sorpcja jak i podzia oparte s na oddziaywaniach
fizykochemicznych pomidzy analitem a medium separacyjnym.

Mechanizmy towarzyszce procesom separacyjnym

Adsorpcja Podzia Filtracja

Adsorpcja Podzia ciecz- Ultrafiltracja

chemiczna ciecz
Nanofiltracja
Adsorpcja Podzia ciecz-
fizyczna ciecz na
noniku Odwrcona
osmoza
Oddziaywania: Podzia ciecz-
- jonowe gaz Sczenie
- dipol-dipol molekularne
- wizania
wodorowe
Podzia
- - gaz-ciecz na
noniku

Oddziaywania
dyspersyjne

Oddziaywania:
- dyspersyjne
- jonowe
- jon-dipol
- dipol-dipol
- dipol-dipol
indukowany
- wizania
wodorowe
- -

Rysunek 2. Mechanizmy towarzyszce procesom separacyjnym

11
Intensywno oraz selektywno tych oddziaywa odgrywa zasadnicz rol w procesie rozdzielenia
substancji. Kluczow rol w doborze procesu separacyjnego ma budowa chemiczna analitu, od ktrej
zaley potencja oddziaywa molekularnych jego czsteczki. Zdolno oddziaywa molekularnych
czsteczki analitu nie jest mierzona jednym parametrem, lecz jest wypadkow przynajmniej kilku
deskryptorw molekularnych, okrelajcych zachowanie si czsteczki w ukadzie separacyjnym.

2. Teoria separacji
Tak w analityce jak i preparatyce, separacja (rozdzielenie) substancji moe mie charakter peny bd
czstkowy.
W pierwszym przypadku dochodzi do penego rozdzielenia mieszaniny na jej poszczeglne skadniki,
zgodnie z poniszym schematem:

(a + b + c + d + .)
(a) + (b) + (c) + (d) + (1)

gdzie:
nawiasy to okrelony obszar w przestrzeni,
poszczeglne litery a, b, c, d to komponenty (anality), zajmujce te obszary.
Zgodnie z tym schematem, po zastosowaniu techniki separacyjnej, komponenty stanowice
mieszanin (zmieszane), zostaj rozdzielone, czyli formalnie zajmuj rne obszary w przestrzeni. Jest
to wynik najbardziej korzystny, umoliwiajcy dalsz, dokadn analiz poszczeglnych skadnikw,
zarwno pod ktem ilociowym jak i jakociowym.
W drugim przypadku, w ktrym dochodzi do separacji czstkowej, schemat ten moe przyj
nastpujce postaci:

(a + b + c + d + .)
(a) + (b + c + d + ) (2)
lub
(a + b + c + d + .)
(a + b) + (b + a) + (3)
Schemat (2) opisuje przypadek wydzielenia z wieloskadnikowej mieszaniny jednej, czystej substancji
(analitu). Jest to sytuacja czsto towarzyszca zastosowaniu technik separacyjnych do wydzielania i
oznaczania jednego skadnika, z pominiciem pozostaych komponentw mieszaniny, bdcych np.
skadnikami matrycy analizowanej prbki. Niestety, stosowane techniki separacyjne nie zawsze s w
stanie doprowadzi do jednoznacznego wyodrbnienia czystego analitu. Tak sytuacj opisuje
schemat (3), z ktrego wynika, i w wyniku procesu separacyjnego rozdzielane s wieloskadnikowe
frakcje, bogate w skadnik a (1 frakcja) lub skadnik b (2 frakcja). Otrzymane frakcje, o ile zachodzi
taka potrzeba, mona poddawa dalszym procesom rozdzielczym, uywajc tej samej lub innej
techniki separacyjnej.
Przedstawione schematy separacji, niezalenie od tego, na jakim etapie rozdzielania czy wzbogacania
prbki zachodz, opisuj zasadnicz cech wszystkich technik separacyjnych.

Gwn cech wszystkich technik separacyjnych jest fakt, i w trakcie procesu dochodzi do
przeniesienia (transportu) i redystrybucji analitw w przestrzeni w taki sposb, aby byo moliwe
ich pojedyncze i/lub grupowe oznaczenie jakociowe i ilociowe.

12
Transport analitw zachodzi w medium separacyjnym, w ktrym kluczow rol odgrywaj
nastpujce czynniki:

budowa molekularna medium separacyjnego, okrelajca rodzaj oddziaywa

midzyczsteczkowych, decydujcych o selektywnoci wobec konkretnych analitw,
rwnowaga (dynamiczna) zachodzca pomidzy analitem a medium, bdca si napdow
procesu separacji,
budowa mikro- i makroskopowa medium, okrelajca mechaniczne parametry separacji, tj.
przepyw, opory, wymian masy i in.
Oglny schemat procesu separacji przedstawiono na rysunku 3. Najwaniejsz czci ukadu jest
medium separacyjne, od ktrego rodzaju zaley nie tylko typ (budowa chemiczna) analitw
poddawanych rozdzielaniu, ale rwnie ich liczba i stenie.

Rysunek 3. Oglny schemat rozdziele analitw w technikach separacyjnych

Medium separacyjne stanowi najczciej ukad dwufazowy. Wprowadzone do takiego ukadu anality,
w trakcie procesu separacyjnego, ulegaj przeniesieniu z jednej fazy do drugiej. Wielokrotno tego
procesu wraz z odpowiedni selektywnoci faz doprowadza do stopniowego rozdzielania (bd
wydzielania) skadnikw mieszaniny. Ukad ten najczciej ma charakter dynamiczny, tzn. fazy
przemieszczaj si wzgldem siebie w trakcie procesu separacyjnego, wielokrotnie zwikszajc
moliwo oddziaywa na granicy faz. Wyduony w ten sposb kontakt midzy fazami umoliwia
wielokrotne zajcie stanu rwnowagi, w ktrym zachodzi selektywne przeniesienie analitu, co
prowadzi do jego rozdzielenia od innych skadnikw mieszaniny.

2.1. Termodynamiczny opis separacji

Przeniesieniu masy analitu z jednej fazy do drugiej w ukadzie otwartym towarzyszy stan staej lub
chwilowej rwnowagi. Na gruncie termodynamiki mona przewidywa waciwoci ukadu
znajdujcego si w stanie rwnowagi. Do tego celu suy funkcja termodynamiczna nazywana
entalpi swobodn, G (energi Gibbsa). Funkcja ta nie tylko opisuje stany rwnowagowe, ale
rwnie dostarcza informacji o tym, czy okrelone procesy osign stan rwnowagi w danych
warunkach. Z procesami przebiegajcymi samorzutnie w kierunku rwnowagi zwizana jest ujemna
zmiana entalpii swobodnej G (w warunkach staego cinienia i temperatury), wic, obliczajc G dla

13
przemiany fizycznej czy te chemicznej, mona przewidzie czy w danych warunkach temperatury i
cinienia bdzie ona samorzutna.
Zgodnie z I i II zasad termodynamiki zmiana entalpii swobodnej takiego ukadu opisana jest funkcj
temperatury i objtoci, co pokazuje nastpujce rwnanie:

dG = SdT + Vdp (4)

gdzie:
dG zmiana entalpii swobodnej,
S warto entropii,
dT zmiana temperatury,
V objto ukadu,
dp zmiana cinienia.
Jeeli w czasie procesu separacji, w warunkach staej temperatury i staego cinienia, zostanie
wprowadzona do mieszaniny skadnikw pewna, bardzo maa ilo moli analitu i (dni) przy
niezmienionej iloci pozostaych skadnikw (analitw), to spowoduje to zmian entalpii swobodnej
G caej mieszaniny:
G (5)
dG =
dni
ni T , p ,n j

W tym przypadku entalpia swobodna ukadu G zmienia si nieznacznie, proporcjonalnie do dni. Ten
wkad wasnej entalpii swobodnej danego skadnika i do cakowitej entalpii swobodnej ukadu
definiuje si jako potencja chemiczny substancji i:

G (6)
i =

ni T , p ,n j

Innymi sowy, potencja chemiczny to cz entalpii G wniesiona do ukadu przez n moli substancji i
przy staej temperaturze i cinieniu. Wymiarem potencjau chemicznego jest jednostka energii na
mol. Po podstawieniu pochodnej czstkowej
G/
n do rwnania (5), zmiana entalpii ukadu
przyjmuje nastpujc posta:
(7)
dG = i dni

Podobnie, zmiana iloci kadego z pozostaych skadnikw rozdzielanej mieszaniny (np. analitu j) ma
wpyw na cakowit entalpi swobodn mieszaniny:
(8)
dG = j dn j
Std, przeniesienie dowolnej liczby skadnikw w ukadzie jest sum wkadw czstkowych,
(9)
dG = i dni
przy czym suma dotyczy wszystkich skadnikw wchodzcych i opuszczajcych system (potencjay
chemiczne opuszczajcych skadnikw stanowi ujemny wkad do dG). Jeeli w trakcie procesu
separacyjnego zmienia si take temperatura i cinienie, naley dodatkowo uwzgldni ich udzia:

14
 dG = SdT + Vdp + dni i
(10)

Jak powiedziano wczeniej, rozdzielenie analitw w wikszoci technik separacyjnych odbywa si

najczciej w ukadzie dwufazowym (przedstawionym w uproszczeniu na rys. 4), zawierajcym dwie
niemieszajce si (lub mieszajce si w bardzo ograniczonym stopniu) fazy i , pomidzy ktrymi
moe doj do wymiany skadnikw. Fazy i rozpatrywane razem, stanowi ukad zamknity, ktry
po upywie dostatecznie dugiego czasu osiga stan rwnowagi termodynamicznej. Do rwnowagi tej
dochodzi za spraw przemieszczania si skadnikw pomidzy fazami. W rwnowadze skadniki
przemieszczaj si rwnomiernie pomidzy fazami zachowujc okrelone, rwnowagowe, stenia w
tych fazach. Wwczas zmiany entalpii swobodnych faz maj tak sam warto. Std wypadkowa
zmiana entalpii swobodnej wynosi zero, dG = 0, zgodnie z rwnaniem:

dG = dG + dG = ( i + i ) dni = 0 (11)

Potencja chemiczny wyraa status energetyczny skadnika i w kadej z tych faz. Przy staej
temperaturze i cinieniu rwnowaga na granicy faz oznacza zrwnanie potencjaw chemicznych
substancji i w fazie i fazie :
= (12)
i i

Rysunek 4. Schemat ukadu dwufazowego skadajcego si z fazy , zawierajcej n moli analitu (ni) i z
fazy , do ktrej migruj czsteczki analitu

Rwno ta zachodzi we wszystkich procesach separacyjnych. Wielko potencjau chemicznego

zaley od dwch zasadniczych czynnikw:

termodynamicznego powinowactwa zwizku do danej fazy,

stopnia rozcieczenia (stenia zwizku).
Powinowactwo (intensywno oddziaywa analitu z faz) opisuje tzw. standardowy potencja
chemiczny i0, natomiast stopie rozcieczenia - stenie substancji w ukadzie. Obie te wielkoci s
zwizane z potencjaem chemicznym w nastpujcy sposb:

i = i 0 + RT ln ci (13)
gdzie:
R staa gazowa,
ci stenie analitu i (mol/L lub mol/kg).

15
Standardowy potencja chemiczny i0 zaley przede wszystkim od energii (w mniejszym stopniu
entropii) oddziaywa pomidzy analitem a jego otoczeniem (faz), std zmienia si w czasie
przemieszczania analitu z fazy do fazy. Wielko i0 przyjmuje najmniejsze wartoci w ukadach, gdzie
oddziaywania analit faza s najsilniejsze. Czon RTln ci opisuje stopie rozcieczenia analitu w fazie.
Na stopie rozcieczenia wpywa przede wszystkim warto entropii (entropii rozcieczenia). Wpyw
ten jest niebagatelny, zwaywszy na fakt, i w ukadach separacyjnych (dwch faz) wystpuje zwykle
duy stopie rozcieczenia analitu. Biorc powysze pod uwag moemy powiedzie, i w ukadzie
dwufazowym bodcem do przejcia analitu z fazy do fazy jest obnianie potencjau chemicznego.
W ukadzie takim osignicie stanu rwnowagi oznacza, e potencja chemiczny analitu jest taki sam
w obu fazach, czyli i = i, co prowadzi do nastpujcego rwnania:

c 0 (14)
i = exp i
c RT
i eq
gdzie:
i0 = i0 - i0,
(ci / ci)eq - iloraz ste analitu w fazach.
Iloraz ste analitu w fazach jest rwnowagowym wspczynnikiem podziau K, std:

i0 (15)
K = exp
RT

W rwnowadze zachodzi rwno i = i, wic w fazie z mniejsz wartoci i0 rwno kompensuje
wysza warto skadowej RT lnci, a wic wysze stenie analitu. Dodatkowo, jeeli i0 przyjmuje
warto dodatni, oznacza to, e i0 w fazie jest mniejsze ni w fazie . Rnica ta spowodowana
jest zarwno rn si (energi) oddziaywa chemicznych analitw z fazami jak i rnym stopniem
rozcieczenia (entropi) w fazach. W konsekwencji to wanie ta rnica umoliwia separacj rnych
analitw w ukadzie dwufazowym. Przyjmujc, e cakowit zmian entalpii ukadu reprezentuje
rnica standardowych potencjaw chemicznych w ukadzie, to:

G 0 (16)

K = exp
RT

gdzie:
G0 - cakowita zmiana entalpii ukadu
std:
RT ln K = G 0 (17)

Z II zasady termodynamiki wiadomo, i na entalpi swobodn ukadu G skada si zarwno zmiana

entalpii, H0, stanowica wkad energetyczny do entalpii swobodnej, jak i zmiana entropii (S0), czyli:

G 0 = H 0 T S 0 (18)
gdzie:
H0 zmiana entalpii ukadu,
S0 zmiana entropii ukadu.

16
Po podstawieniu do rwnania (17) otrzymuje si oglne rwnanie wice rwnowagowy
wspczynnik podziau, z entalpi i entropi danego procesu:

H 0
S 0 (19)
ln K =
RT R

Rwnowagowy wspczynnik podziau K, bdcy miar wszystkich procesw separacyjnych, jest
wypadkow dwu udziaw: entalpowego i entropowego, przy czym w zalenoci od zastosowanej
techniki, dominujcy moe by udzia jednej albo drugiej skadowej. Ilustruj to przykadowe wykresy
Vant Hoffa, przedstawione na rysunku 5, opisujce temperaturow zmienno staej rwnowagi w
dwu rnych procesach separacyjnych.

Rysunek 5. Wykresy Vant Hoffa, opisujce temperaturow zmienno staej rwnowagi w dwu (a i b)
rnych procesach separacyjnych

W pierwszym procesie (wykres A), przy maym udziale czynnika entropowego (S/R), nastpuje
wyrana zmiana entalpii ukadu wraz ze zmian temperatury (duy kt nachylenia krzywej). Taki
przypadek ma miejsce w przypadku technik opartych o podzia do fazy (chromatografia podziaowa,
ekstrakcja), gdzie energia oddziaywa fizykochemicznych analitu z faz odgrywa decydujc rol w
separacji. W drugim procesie (wykres B), udzia czynnika entropowego (S/R) jest zdecydowanie
wikszy, natomiast wpyw zmian temperatury na czynnik entalpowy jest mniej wyrany (mniejsze
nachylenie krzywej). Jest to przypadek opisujcy techniki oparte o zjawisko adsorpcji (chromatografia
adsorpcyjna lub jonowymienna), gdzie dochodzi do gwatownych zmian w strukturze
uporzdkowania ukadu w trakcie separacji.

2.2. Adsorpcja i podzia

Z punktu widzenia procesu separacyjnego rnica pomidzy adsorpcj a podziaem tkwi w miejscu, w
ktrym dochodzi do zmiany stenia rozdzielanego analitu; podczas adsorpcji zmiana ta zachodzi na
powierzchni graniczcych ze sob faz, natomiast w trakcie podziau dotyczy ona caej objtoci faz
ukadu. Na rysunku 6 przedstawiono schematyczne ujcie obu procesw.

17
 Rysunek 6. Schematyczne ujcie adsorpcji (a) i podziau (b)

Na granicy faz dochodzi do nierwnomiernego rozoenia (asymetrii) oddziaywa molekularnych na

powierzchni (rysunek 7a). W efekcie czsteczki powierzchniowe s silniej wcigane do wntrza fazy
objtociowej, co jest przyczyn powstania napicia powierzchniowego na granicy faz, na ktrej dochodzi do
adsorpcji. Natomiast w przypadku podziau, oddziaywania w obrbie fazy objtociowej s jednakowe,
niezalene od miejsca w przestrzeni (rysunek 7b).
Zarwno mechanizm adsorpcji (i desorpcji) jak i podziau, zachodzcy w technikach separacji
analitw, jest zwykle sum kilku typw oddziaywa. Ich poszczeglny udzia decyduje o
intensywnoci i trwaoci interakcji analitu z medium separacyjnym. Po zajciu adsorpcji anality trac
swobod ruchu, co oznacza obnienie entropii ukadu. Anality po zwizaniu z sorbentem trac
rwnie energi, czyli maleje ich entalpia swobodna. Skoro zachodzi rwno opisana zalenoci
(18), oznacza to, e wszystkie procesy adsorpcji s egzotermiczne.

Rys. 7. Schematyczna reprezentacja oddziaywa midzyczsteczkowych w fazie powierzchniowej (a)

i objtociowej (b)

Aby okreli, w jakim stopniu zwizek chemiczny gromadzi si na granicy faz w stanie rwnowagi w
danym ukadzie, naley zna stosunek cakowitej iloci zwizku na sorbencie do iloci pozostaej w
drugiej fazie. Stosunek ten odpowiada staej podziau zdefiniowanej wyraeniem (15), przy czym w
opisie zjawiska adsorpcji staa ta nazywana jest rwnowagowym wspczynnikiem sorpcji, Kd:

18
 Cs
Kd = (20)
Cw
gdzie:
Cs - cakowita ilo zaadsorbowanego analitu na jednostk sorbentu (np.: mol kg-1),
Cw - ilo zwizku pozostajca w drugiej fazie (gazie lub roztworze) w stanie rwnowagi (np.:
mol l-1).
W rwnowagowym podziale substancji chemicznej midzy gaz lub ciecz a ciao stae na stenie
analitu w gazie lub roztworze wpywa cakowita pojemno sorbentu i zwizany z tym stopie
nasycenia powierzchni sorbentu. W najprostszym przypadku, dla niskich cinie lub bardzo maych
ste (powierzchnia sorbentu jest prawie pusta) zaleno (20) jest speniona w postaci:
Cs = Kd Cw (21)
i jest zwana rwnaniem izotermy Henryego (zaleno liniowa, potwierdzona eksperymentalnie).
Powizanie midzy steniami analitu w fazie wolnej i zwizanej duo lepiej oddaje izoterma sorpcji
wg modelu Freundlicha:
Cs = KF. Cw 1/n (22)
gdzie:
KF - staa Freundlicha lub wspczynnik pojemnociowy,
1/n - wykadnik potgowy Freundlicha.
Zaleno ta zakada, e rwnoczenie oddziauj rne typy miejsc aktywnych, zrnicowanych
zarwno pod wzgldem iloci, jak i entalpii swobodnych. Dodatkowo, model ten zakada, e moe
wystpowa wielowarstwowa sorpcja. Wykadnik potgowy jest wskanikiem zrnicowania entalpii
swobodnych, powizanych z sorpcj z roztworu przez rne skadniki heterogenicznego sorbentu:

gdy 1/n =1, mona wnioskowa, e entalpia swobodna procesu jest staa w caym zakresie
ste;
kiedy 1/n < 1, izoterma wskazuje, i dodawany sorbat jest wizany z centrami o coraz
mniejszej entalpii swobodnej;
gdy 1/n > 1, izoterma ma przebieg rosncy, z czego mona wnioskowa, e wiksza ilo
czsteczek na powierzchni zwiksza entalpi swobod, a tym samym potguje dalsz sorpcj.
Parametry KF oraz 1/n mog zosta wyznaczone z danych eksperymentalnych, poprzez przeksztacenie
rwnania (22) do postaci logarytmicznej (23):
1
log C s = log C n + log K F (23)
n
Jeli na sorbencie istnieje ograniczona liczba miejsc aktywnych, ktre zostan wysycone, Cs nie moe
rosn w nieskoczono wraz ze wzrostem Cw i izoterma nie moe by opisana przez rwnanie (23).
W takim przypadku lepiej sprawdza si model izotermy Langmuira. Zakada on, e na powierzchni
sorbentu istnieje okrelona liczba jednakowych centrw sorpcji (adsorpcji), z ktrych kade jest
zdolne do zaadsorbowania tylko jednej czsteczki adsorbatu (proces ten nazywany te jest adsorpcj
zlokalizowan). Stan maksymalnej adsorpcji odpowiada obsadzeniu wszystkich centrw, tj.
wytworzeniu na powierzchni monomolekularnej warstwy. Izoterm Langmuira opisuje nastpujce
rwnanie:
Cmax K L CW
Cs = (24)
1 + K L CW

19
gdzie:
Cmax - maksymalna liczba centrw aktywnych na jednostk masy sorbentu,
KL - staa Langmuira.
W idealnym przypadku, Cmax bdzie takie samo dla wszystkich sorbentw, w rzeczywistoci Cmax moe
mie rne wartoci, w zalenoci od rodzaju analitu (np: rnica w wielkoci czsteczki
oddziaywujcej). Dlatego te, Cmax zwykle wyraa maksymaln powierzchni dostpn dla danego
zwizku. Staa KL jest okrelana, jako staa rwnowagi reakcji sorpcji:

centrum powierzchniowe + analit w roztworze lub w gazie analit na powierzchni

Przy zaoeniu, e KL jest staa, nastpuje cige powinowactwo analitu do wszystkich centrw
powierzchniowych. Aby wyznaczy KL i Cmax z danych eksperymentalnych, naley graficznie
przedstawi zaleno 1/Cs od 1/Cw:

1 1 1
= + (25)
C s K L C max C s C max

i z parametrw prostej wyznaczy stae izotermy.

Model Freundlicha jest zwykle stosowany do opisu zachowa czsteczek chemicznych na
zrnicowanych powierzchniach porowatych, natomiast model Langmuira bardzo dobrze ilustruje
koncepcj tworzenia monowarstwy adsorpcyjnej na powierzchni porowatej, a take procesy
chemisorpcji.
W przypadku zjawiska podziau take dochodzi do rwnowagi, w ktrej, zgodnie z rwnaniem (14)
stosunek ste analitu w dwch niemieszajcych si fazach jest stay, opisany sta podziau K:

c
i = K = const (26)
c
i eq

Stan ten opisuje prawo Nernsta, ktre jest spenione w staej temperaturze i przy staym cinieniu.
Prawo Nernsta jest spenione dla ukadu dwu cieczy niemieszajcych lub mieszajcych si w sposb
ograniczony. Warunkiem koniecznym jest take (jak w przypadku izotermy Henryego) niskie stenie
substancji rozpuszczonej w obu fazach oraz brak jakichkolwiek reakcji analitw, w kontakcie z jedn
lub obu fazami ukadu (dysocjacja, asocjacja, polimeryzacja i in.).

Wszystkie wymienione stae opisujce rwnowag ukadu, zarwno podczas procesu adsorpcji
(Kd, KF i KL) czy podziau (K) s jedn z miar efektywnoci procesu separacyjnego. Im wysza
warto dowolnej z nich, opisujcej dany proces, tym intensywniejsze oddziaywanie analitu z
medium separacyjnym, powodujce duszy czas przebywania analitu w ukadzie. Poniewa
wynik procesu separacyjnego najczciej okrela si czasem przebywania (retencji, retardacji,
mobilnoci) analitu w ukadzie, czas ten jest wprost proporcjonalny do staej rwnowagi
opisujcej dany proces.

20
2.3. Oddziaywania midzyczsteczkowe
Wielkoci charakteryzujc termodynamiczne powinowactwo analitu do danej fazy jest
standardowy potencja chemiczny i0 (13). Na to powinowactwo skada si szereg oddziaywa
fizykochemicznych o charakterze odwracalnym, powodujcych przemieszczanie si analitu w
ukadzie. W procesach rozdzielczych najczciej wykorzystywane s nastpujce oddziaywania:
dyspersyjne, jonowe, dipol dipol, dipol dipol indukowany oraz wizanie wodorowe. Trwalsze
oddziaywania (wizania chemiczne), ze wzgldu na ich nieodwracalno, praktycznie nie s
wykorzystywane w procesach separacji. W tabeli 1 zgrupowano typowe oddziaywania towarzyszce
procesom rozdzielania wraz z zakresami ich energii oraz ilustrujcymi je przykadami.

Wszystkie oddziaywania midzyczsteczkowe maj natur elektrostatyczn. Generalnie

mona wyodrbni trzy grupy oddziaywa, ktrych natura uzaleniona jest od budowy
chemicznej biorcych w nich udzia czsteczek. S to: oddziaywania dyspersyjne,
oddziaywania polarne oraz oddziaywania jonowe.

Tabela 1. Typowe oddziaywania zachodzce w ukadach separacyjnych

Zaleno
Energia
Rodzaj oddziaywania energii od Przykad
(kJ/mol)
odlegoci

R C O H
Silne oddziaywanie jonowe 200 1/r O
N
+
N

Cl
Oddziaywanie jonowe 40 1/r +N R
4
R3 N:
Odziaywanie jon- dipol 25 1/r2 +
N4R
Wizanie wodorowe 20 1/r3 OH O

Oddziaywanie dipol- dipol 4 1/r3 C + :NR3

R
Oddziaywania dyspersyjne 2 1/r6
R

2.3.1. Oddziaywania dyspersyjne

Oddziaywania dyspersyjne (zwane inaczej siami Londona) wywoywane s przede wszystkim
pomidzy substancjami obojtnymi, nieposiadajcymi trwaych adunkw elektrycznych czy
momentw dipolowych. Mimo to, wzajemne ssiedztwo dwch obojtnych czsteczek z czasem
prowadzi do nieznacznych fluktuacji elektronw w ich strukturze, co z kolei wywouje powstanie
chwilowych dipoli. Dipole te, cho trwaj dosownie uamki sekund, zaczynaj na siebie oddziaywa
przycigajc si i odpychajc elektrostatycznie. Sia tego typu oddziaywa zaley od
polaryzowalnoci czsteczek, zarwno tych, w ktrych rozpoczynaj si fluktuacje elektronw, jak i

21
tych, ktre ulega bd temu wpywowi. Fluktuacje te bd tym intensywniejsze im sabszy bdzie
wpyw jdra na wzbudzane (walencyjne) elektrony. Dua polaryzowalno wiadczy o
uprzywilejowanej skonnoci czsteczek do ulegania takim oddziaywaniom. W uproszczeniu energi
oddziaywa dyspersyjnych mona przybliy wzorem Londona:

C II
V = C 1 2 1 2
r 6
I1 + I 2 (27)
gdzie:
V energia potencjalna oddziaywania,
r odlego midzy czsteczkami,
1 i 2 polaryzowalno czsteczek biorcych udzia w oddziaywaniu,
I1 i I2 energie jonizacji obu czsteczek.

Oddziaywania dyspersyjne maj kluczowe znaczenie w jednym z najwaniejszych obecnie rodzajw

chromatografii cieczowej - w ukadzie faz odwrconych. Ten typ chromatografii cieczowej pozwala na
precyzyjne projektowanie selektywnoci ukadu, dziki niewielkim energiom oddziaywa (odlegym
o a r6), towarzyszcym procesowi separacji. Jest to obecnie jedna z najpopularniejszych metod
rozdzielania analitw.

2.3.2. Oddziaywania polarne

Oddziaywania polarne zachodz pomidzy czsteczkami polarnymi, ktre posiadaj trway lub
indukowany moment dipolowy. Trway moment dipolowy wynika z obecnoci konkretnych grup
funkcyjnych w czsteczce, ktrych budowa zapewnia powstanie czstkowych adunkw w obrbie
struktury. Z kolei indukowanie dipolu moe zaj w czsteczce obojtnej (jak to ma miejsce w
oddziaywaniach dyspersyjnych), przy czym zjawisko to dotyczy duo silniejszych pl elektrycznych,
pochodzcych od czsteczek polarnych. Energia oddziaywa polarnych zaley przede wszystkim od
momentu dipolowego czsteczki polarnej oddziaujcej z inn czsteczk polarn bd indukujc
dipol w innej czsteczce obojtnej. Moment dipolowy wyraany jest w debajach (D), przy czym 1D =
3,3 10-30 C m.
Sama warto momentu dipolowego nie zawsze odzwierciedla faktyczn polarno czsteczki. Np.
zmierzony moment dipolowy wody, substancji z natury wysoce polarnej, wynosi zaledwie 1,8 D lub
polarnego metanolu, tylko 2,8 D. W obu przypadkach jest to wynik dodatkowych oddziaywa, jakie
zachodz w tych rozpuszczalnikach, prowadzcych do wzajemnych asocjacji czsteczek poprzez
wizania wodorowe, w konsekwencji kompensujcych potencjalnie znaczne momenty dipolowe. W
oddziaywaniach polarnych wan rol odgrywa take wzajemne uoenie dipoli w przestrzeni.
Oglnie, energia potencjalna takiego oddziaywania zaley od momentw dipolowych obu dipoli,
odlegych od siebie o r3 w przypadku uoenia rwnolegego lub o r6 w przypadku innej orientacji:

1 2 (28)
V f
r3
gdzie:
czynnik f uwzgldnia zmian energii wywoan zblianiem si do siebie jednakich lub
przeciwnych adunkw dipoli (zmian kta pomidzy wektorami reprezentujcymi
oddziaujce na siebie dipole).

22
Gdy oddziaywanie dotyczy dipola indukowanego, energia potencjalna oddziaywania, opisana
rwnaniem (27), jest zdecydowanie nisza, a staa C zaley od momentu dipolowego substancji
indukujcej 1 i polaryzowalno substancji indukowanej 1:

C 121 (29)

Szczeglnym przypadkiem oddziaywa polarnych jest wizanie wodorowe. W oddziaywaniu tym

atom wodoru jest usytuowany pomidzy dwoma silnie elektroujemnymi atomami (np. atomem
azotu, tlenu lub fluoru) wic je nawzajem. W najprostszym ujciu, pomijajc teori orbitali
molekularnych, oddziaywanie to powstaje w wyniku pojawienia si na atomie wodoru czstkowego
adunku dodatniego (w zwizku ze spolaryzowaniem ukadu), ktry elektrostatycznie oddziauje z
woln par elektronow na drugim atomie elektroujemnym, wg nastpujcego schematu:

X H + L: Y
gdzie:
X i Y to atomy wysoce elektroujemne biorce udzia w oddziaywaniu.
Oddziaywanie takie jest stosunkowo trwae (20kJ/mol) i peni istotn rol w strukturze krysztaw
molekularnych czy drugorzdowej strukturze biaek. Z punktu widzenia technik separacyjnych, jest to
zasadnicze oddziaywanie zachodzce podczas procesu sorpcji zwizkw polarnych na
powierzchniach takich jak krzemionka czy tlenki glinu. Ponadto, podobnie jak pozostae
oddziaywania polarne, wspwystpuje ono z oddziaywaniami dyspersyjnymi i jonowymi w trakcie
procesw rozdzielania.
Do oddziaywa polarnych naley take zaliczy oddziaywania donorowo-akceptorowe par
elektronowych (nazywanych take oddziaywaniem przeniesienia adunku). Zachodzi ono pomidzy
donorem pary elektronowej - czsteczk posiadajc wysokoenergetyczny orbital molekularny a
akceptorem pary elektronowej czsteczk posiadajc niskoenergetyczny orbital molekularny.
Najwyszymi energiami charakteryzuj si orbitale zajte przez wolne pary elektronw n (np. w
aminach, eterach, fosfinach i in.) lub elektronw (nienasycone zwizki organiczne). Orbitale
akceptorowe to nieobsadzone orbitale walencyjne metali, orbitale antywice (np. chlorowce) lub
zwizki zawierajce ukad -elektronowy. W technikach separacyjnych, w celu podniesienia
selektywnoci rozdziele czsto wykorzystuje si te oddziaywania pomidzy ukadami
nienasyconymi (oddziaywania -*).

2.3.3. Oddziaywanie jonowe

Oddziaywania jonowe zachodz midzy dwiema rnoimiennie naadowanymi czsteczkami. W
odrnieniu od wizania jonowego, w oddziaywaniu jonowym adunek jest zdelokalizowany
pomidzy atomami tworzcych je czsteczek. Energi tego oddziaywania opisuje kulombowska
energia potencjalna pomidzy dwoma adunkami odlegymi o r, wg wzoru:

z i e2 (30)
V=
4 0 r
gdzie:
zi wartociowo jonu,
e - adunek elementarny,
0 przenikalno elektryczna w prni (8,85 10-12 J-1C2m-1).

23
W przypadku orodka zawierajcego inne adunki, np. roztworu elektrolitu, efekt oddziaywania jest
duo sabszy. Oddziaywanie jonowe jest wykorzystywane w technikach separacyjnych przede
wszystkim w chromatografii jonowej, gdzie naadowane anality rozdzielane s na fazach
stacjonarnych (jonitach) obdarzonych przeciwnym adunkiem.

2.4. Lipofilowo w opisie potencjau oddziaywa molekularnych

Rnorodny zakres energetyczny oddziaywa umoliwia taki dobr ukadu separacyjnego, ktry jest
w stanie selektywnie rozdzieli anality o rnej budowie chemicznej, czyli rnice si potencjaem
oddziaywa molekularnych. Std, przed przystpieniem do procesu separacyjnego, warto jest
scharakteryzowa badane anality pod tym ktem, aby mc dobra jak najkorzystniejszy ukad. Nie
jest to zadanie atwe, gdy opisu substancji chemicznej pod ktem jej oddziaywania z otoczeniem
dokonuje si przy pomocy kilkunastu parametrw (deskryptorw molekularnych), ktrych
wyznaczenie wymaga zastosowania zoonego aparatu chemometrycznego oraz niejednokrotnie
dodatkowych eksperymentw. W praktyce jednak, wprowadza si parametry grupowe (zbiorcze),
znacznie uatwiajce prognoz efektywnej separacji. Parametry grupowe opieraj si o zasad
liniowoci energii swobodnych, ktra zakada, e podobne poczenia chemiczne reaguj podobnie, i
e podobne zmiany w strukturze podobnie wpywaj na reaktywno. W myl tej zasady mona z
duym przyblieniem obliczy, na podstawie udziau poszczeglnych fragmentw molekularnych w
czsteczce, jaka np. bdzie rozpuszczalno badanej substancji w wodzie, jaka bdzie jej prno
pary lub, co jest wykorzystywane w technikach separacyjnych, w jakim stopniu badana substancja
ulegnie podziaowi pomidzy faz organiczn a faz wodn. Wielkoci charakteryzujc t skonno
nazywa si zwyczajowo lipofilowoci (powinowactwo zwizku chemicznego do fazy lipidowej, tzn.
niemieszajcej si z wod), ktr oczywicie charakteryzowaa bdzie staa podziau. Przyjto, e
rozpuszczalnikami najlepiej odwzorowujcymi ukad faz polarnych i niepolarnych s n-oktanol i woda.
Rozpuszczalniki te po zmieszaniu tworz dwie odseparowane fazy, przy czym ze wzgldu na
wzajemn czciow rozpuszczalno jest to ukad zawierajcy oktanol nasycony wod (2,3 mol/L)
oraz wod nasycon oktanolem (4,5 x10-3 mol/L). Staa podziau pomidzy tymi fazami, opisywana
jako KOW lub wspczynnik podziau P, jest wyraana ilorazem dwch ste substancji rozpuszczonej:

C okt (31)
P = K OW =
Cw
gdzie:
Cokt (mol/L) - stenie molowe substancji w oktanolu,
Cw (mol/L) - stenie molowe substancji w wodzie.
Eksperymentalnie, wspczynnik taki wyznacza si w 25oC, przy steniu substancji badanej nie
wyszym ni 0.01 mol/L. W takim ukadzie, jeeli wiksza ilo czsteczek badanego zwizku
chemicznego znajdzie si w fazie oktanolowej, to mamy do czynienia ze zwizkiem lipofilowym
(hydrofobowym). Jeeli za wikszo pozostanie w fazie wodnej, bdzie to zwizek lipofobowy
(hydrofilowy). W fazie oktanolowej, dominujcymi s oddziaywania dyspersyjne pomidzy
hydrofobowymi fragmentami czsteczki rozpuszczonego zwizku a acuchem alkilowym n-oktanolu.
Poniewa n-oktanol posiada zarwno waciwoci lipo- jak i hydrofilowe, wystpuj tam rwnie
oddziaywania dipol-dipol czy wizania wodorowe z grup hydroksylow alkoholu, s one jednak o
nieco mniejszym znaczeniu. Cecha zwizku, polegajca na wykazywaniu zarwno waciwoci
lipofilowych jak i hydrofilowych nazywa si amfifilowoci. T cech n-oktanolu przedstawiono

24
schematycznie na rysunku 8, na ktrym uwidoczniono wszystkie oddziaywania zachodzce pomidzy
oboma rozpuszczalnikami.

OH
H
O
HO H

OH
OH

H O

H OH

HO HO
H
O
H
OH

Rysunek 8. Oddziaywania midzyczsteczkowe ukadzie n-oktanol : woda

W fazie n-oktanolu analit moe oddziaywa z rozpuszczalnikiem poprzez oddziaywania dyspersyjne,

ale rwnie na zasadzie oddziaywa dipol-dipol oraz wiza wodorowych. W fazie wodnej z kolei,
wystpowa bd niemal wycznie wizania wodorowe oraz oddziaywania dipol-dipol pomidzy
polarnymi fragmentami czsteczki zwizku rozpuszczonego a wod. Warto wspczynnika podziau
oktanol woda zaley zarwno od budowy chemicznej czsteczki rozpuszczonego zwizku (liczba i
rodzaj rnych grup funkcyjnych, udzia miejsc nienasyconych, fragmentw alkilowych, warto
momentu dipolowego i in.) jak i, w duej mierze, od jej wielkoci. W trakcie mieszania obu
rozpuszczalnikw (proces spontaniczny) cakowita entropia takiego ukadu gwatownie wzrasta,
jednak jej uprzywilejowany wzrost jest ograniczany spadkiem entropii w fazie wodnej, zwizanym ze
stopniowym uporzdkowywaniem czsteczek wody w otoczce hydratacyjnej solwatowanego
zwizku. Poniewa wiksze rozmiary czsteczki wymaga bd coraz wikszej wnki w
rozpuszczalniku (wikszej otoczki hydratacyjnej), powodowa to bdzie nieuprzywilejowany spadek
entropii caego ukadu. W takiej sytuacji korzystniejsze termodynamicznie staje si obnienie
rozpuszczalnoci czsteczek o duych rozmiarach w fazie wodnej, co wpywa na zwikszenie
wspczynnika podziau. Std te czsteczki, nawet stosunkowo due, ale zawierajce w swojej
strukturze ukady nienasycone, rozgazione i in., uatwiajce zmniejszenie rozmiaru molekularnego,
charakteryzuj si duo niszymi staymi podziau od swoich analogw pozbawionych tych cech.
Staa podziau n-oktanol woda mieci si w bardzo szerokim zakresie, od 0,01 dla zwizkw o
wysokiej polarnoci do 1010 dla substancji wysoce hydrofobowych. Na rysunku 9 przedstawiono
zakres wartoci wspczynnika podziau P dla wybranych grup zwizkw chemicznych. Tak rozpity
zakres wartoci wspczynnika spowodowa, e przyjto wyraa go w formie logarytmicznej:

log P = log Cokt log c w (32)

25
Przyjmuje si, i zwizki, ktrych log P jest mniejszy od jednoci, mog by charakteryzowane jako
hydrofilowe (liofobowe), zwizki dla ktrych 1 < log P < 3, charakteryzuj si redni lipofilowoci
(liofilowoci), natomiast zwizki, ktrych log P > 3, charakteryzuj si wysok lipofilowoci
(liofilowoci). Wartoci wybranych wspczynnikw podziau P (log P) przedstawiono w tabeli 2.
Halogenki
alkilw C1- C2

Alkilowe pochodne
benzenu

Chlorobenzeny

Polichlorowane bifenyle
(PCB)

Estry kwasu
ftalowego
Wielopiercieniowe
wglowodory
aromatyczne WWA

Wglowodory alifatyczne
C5 C18

1 102 104 106 108 1010

Wspczynnik podziau P

Rysunek 9. Wartoci wspczynnika podziau P wybranych grup zwizkw chemicznych

W pionierskich badaniach Hansha i Leo nad wyznaczeniem staej podziau oktanol-woda dla szerokiej
gamy zwizkw zauwaono, e okrelone fragmenty strukturalne badanych substancji, wnosz
kadorazowo do cakowitej wielkoci log P stay wkad, niezaleny od tego, w jakiej czsteczce
wystpuj. I tak np. rnica w zlogarytmizowanych wartociach staych podziau pomidzy benzenem
a toluenem (strukturalnie rnice si obecnoci grupy metylowej) wyniosa 0,55. Podobn rnic
zaobserwowano pomidzy lipofilowoci aniliny i metyloaniliny, w ktrych przypadku rnic
strukturaln rwnie stanowi ugrupowanie metylowe.

Tabela 2. Wartoci logarytmu wspczynnika podziau P dla wybranych substancji chemicznych

Zwizek log P
Acetamid -1,16
Metanol -0,82
Kwas mrwkowy -0,41
Eter di etylowy 0,83
Chlorek metylenu 3,37
Heksametylobenzen 4,61
2,2',4,4',5-Pentachlorobifenyl 6,41

26
W myl zasady liniowoci energii swobodnych przyjto wic, e niezalenie od miejsca przyczenia
grupa metylowa wnosi do cakowitej wartoci log KOW substancji stay udzia w wysokoci ok. 0,55. Z
czasem baza danych czstkowych udziaw lipofilowoci zostaa rozszerzona o dziesitki ugrupowa
funkcyjnych, grup czy pojedynczych atomw, oraz uzupeniona szeregiem poprawek,
uwzgldniajcych miejsca przyczenia danej grupy czy atomu, czynniki steryczne, zjawiska
elektronowe, geometryczne i in. W tabeli 3 przedstawiono przykadowe wspczynniki czstkowe
wnoszone przez konkretne fragmenty do cakowitej lipofilowoci analitu. Korzystanie z bazy danych
pozwala bardzo szybko policzy cakowit lipofilowo substancji chemicznej wycznie na podstawie
jej struktury. Obliczona w ten sposb lipofilowo, wyraona logarytmem ze staej podziau,
umoliwia prognoz zachowania si analitu w ukadzie separacyjnym. Wspczenie korzysta si z
kilku metod obliczenia log P zgodnie z powysz zasad. Obliczenia dokonuje si wykorzystujc
nastpujc zaleno:
log P = ai fi + b j F j (33)
gdzie:
fi - czstkowy udzia fragmentu i,
ai - ilo fragmentw i,
Fj - czstkowy udzia czynnika strukturalnego j,
bj - ilo czynnikw strukturalnych j.

Tabela 3. Wybrane wspczynniki czstkowe fragmentw i czci struktury molekuy

Fragment fi
Alifatyczny CH3 0,5473
Alifatyczny CH2 0,4911
Alifatyczny C 0,2000
Aromatyczny C lub CH 0,2940
Wodr 0,2300
Cl poczony z alifatycznym fragmentem 0,0600
Cl poczony z aromatycznym fragmentem 0,6445
OH poczony z aromatycznym fragmentem -0,4802
Br poczony z aromatycznym fragmentem 0,8900
Aromatyczny NH2 -0,8540
Czynnik strukturalny Fj
Wizanie podwjne -0,09
Wizanie potrjne -0,50
Elastyczny acuch alkilowy
o n atomach wgla (n-1)(-0,12)
2 chlorowce na tym samym atomie wgla 0,60
3 chlorowce na tym samym atomie wgla 1,59

Ograniczeniem tych metod jest dzi wielko analizowanej czsteczki. Metoda obliczeniowa sprawdza
si bardzo dobrze dla maych czsteczek, natomiast w przypadku zwizkw wielkoczsteczkowych
dochodzi do dodatkowych efektw zwizanych z objtoci molekuy, co wprowadza dodatkowe
oddziaywania w ukadzie, niemoliwe do przewidzenia tym prostym modelem.

27
Metody obliczeniowe lipofilowoci koreluj bardzo dobrze z wielkociami retencji (czasem
przebywania w rozdzielajcym ukadzie chromatograficznym) zwizkw o redniej i wysokiej
hydrofobowoci.
Poniej podano przykad obliczenia teoretycznej wartoci logarytmu ze staej podziau KOW
trichloroetanu (CCl3-CH3). Do rwnania (33) naley wprowadzi:

sum udziaw fragmentw: 2 x (wgiel alifatyczny) + 3 x (wodr) + 3 x (chlor),

oraz sum udziaw czynnikw strukturalnych: 1 x (elastyczny acuch alkilowy o 2 atomach
wgla) + 1 x (3 chlorowce na jednym atomie wgla).
log P = 2 (0,20) + 3 (0,23) + 3 (0,06) + 1 (-0,12) + 1 (1,59) = 2,50
Warto staej podziau wyznaczona eksperymentalnie dla trichloroetanu (CCl3-CH3) wynosi dla 2,49.
Na rysunku 10 przedstawiono korelacj lipofilowoci wybranych wglowodorw alifatycznych i
aromatycznych z ich wartociami retencji, otrzymanymi przy uyciu chromatografii cieczowej w
odwrconym ukadzie faz. Dla przedstawionej na rysunku wybranej grupy zwizkw zaleno ta jest
niemal idealnie liniowa, co wskazuje, i dominujcym parametrem decydujcym o zatrzymywaniu
tych analitw w danym ukadzie chromatograficznym jest lipofilowo. Istotnie, w chromatografii w
odwrconym ukadzie faz parametr ten jest najlepszym deskryptorem retencji (zatrzymywania w
ukadzie).

Rysunek 10. Zaleno lipofilowoci wybranych substancji od chromatograficznego czasu retencji

28
3. Literatura
1. Boethling, R. S.; Mackay, D. Handbook of Property Estimation Methods for Chemicals;
Environmental and Health Sciences; Lewis Publishers: Boca Rota, 2000.
2. Dutkiewicz, E. Fizykochemia powierzchni; Wydawnictwo Naukowo-Techniczne: Warszawa, 1998.
3. Giddings, J. C. Unified separation science; John Wiley & Sons Inc.: New York, 1991.
4. Hammett, L. P. Fizyczna chemia organiczna; Wydawnictwo Naukowe PWN: Warszawa, 1970.
5. Kaliszan, R. Structure and retention in chromatography. A chemometric approach; Harwood
Academic Publisher: Amsterdam, 1997.
6. Schwarzenbach, R. P.; Gschwend, P. M.; Imboden, D.M. Environmental organic chemistry; John
Wiley & Sons Inc.: New York, 1993.
7. Witkiewicz, Z. Podstawy chromatografii; Wydawnictwo Naukowo-Techniczne: Warszawa, 2000.

29
II. Ekstrakcja
1. Wstp

Klasyczna ekstrakcja jest sposobem wyodrbniania poszczeglnych substancji lub grup zwizkw
chemicznych poprzez rozpuszczanie ich w rozpuszczalniku i oddzielenie ich w postaci roztworu od
pozostaych skadnikw prbki.

W przypadku prbek ciekych ekstrakcja jest przenoszeniem wybranych skadnikw z roztworu

prbki (matrycy pierwotnej) do roztworu w innej cieczy (matrycy wtrnej zwanej te matryc
odbierajc). Gdy prbka jest ciaem staym, ekstrakcja polega na rozpuszczeniu wybranych
skadnikw w cieczy i oddzieleniu roztworu od pozostaych, nierozpuszczalnych skadnikw
matrycy.

Przenoszenie skadnikw z fazy staej do ciekej nazywa si ugowaniem lub roztwarzaniem, ale te
terminy uywa si zwykle do wydzielania (powizanego czsto z rozkadem prbki) zwizkw
nieorganicznych z prbek staych (np. gleby czy stopu metali) za pomoc roztworw kwasw, zasad,
soli oraz zwizkw chelatujcych i innych.

We wspczesnych technikach ekstrakcji, jako matryc odbierajc stosuje si rwnie gaz, pyn
w stanie nadkrytycznym lub ciao stae.

Ekstrakcj stosuje si z dwch zasadniczych powodw:

dla wyodrbnienia grupy lub poszczeglnych zwizkw chemicznych z ich pierwotnej matrycy,
dla uzyskania odpowiedniego stenia wyodrbnianych zwizkw (zatenia),
umoliwiajcego zastosowanie odpowiedniej techniki instrumentalnej w analizie ilociowej,
szczeglnie w analizie zwizkw wystpujcych w ilociach ladowych.
Wyodrbnianie moe dotyczy substancji podstawowej, np. produktu reakcji, biologicznie czynnych
zwizkw zawartych w surowcach rolinnych albo substancji zanieczyszczajcych dany roztwr czy
inn prbk.

Ekstrakty to anality i zwizki ekstrahujce si razem z nimi, w nowej matrycy, ktr jest zwykle
rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalnikw o znanym skadzie. Skad chemiczny ekstraktu
jest zdecydowanie prostszy od skadu matrycy pierwotnej.

Rozpuszczalniki organiczne, bdce matryc odbierajc, mona atwo odparowa, bez straty
ekstraktu oraz s zwykle odpowiednie do zastosowania w technikach analizy kocowej, np. w
chromatografii. Substancje obecne w ekstrakcie obok analitu mog powodowa zakcenia
(interferencje) w oznaczaniu, jednak jest ich, w stosunku do analitu, zdecydowanie mniej ni w
prbce pierwotnej.

30
 Proces lub operacja zwikszajca stosunek ste lub iloci analitw (mikroskadnikw)
wzgldem matrycy (makroskadnikw) w badanej prbce nazywa si wzbogacaniem (definicja
przyjta przez IUPAC). Ekstrakcja jest jedn z metod wzbogacania analitw.

Do oceny ilociowej procesu ekstrakcji suy wielko nazwana procentem ekstrakcji (%E). Jest to
stosunek masy substancji ekstrahowanej, znajdujcej si w matrycy odbierajcej po ekstrakcji (A) do
masy substancji ekstrahowanej, znajdujcej si w matrycy pierwotnej przed ekstrakcj (A):
( A)
%E = 100% (1)
( A)
Jeli substancja ekstrahowana nie znajduje si w takiej samej postaci w obu matrycach ( bo ulega np.
dysocjacji, hydratacji lub hydrolizie) naley uwzgldni masy wszystkich form substancji
ekstrahowanej, wystpujce w matrycy odbierajcej [(A)] oraz masy wszystkich form substancji
ekstrahowanej, wystpujce w matrycy pierwotnej [(A) ]:

%E =
( A) 100% (2)
( A)

2. Podzia technik ekstrakcyjnych

Kryterium podziau technik ekstrakcyjnych s stany skupienia prbki oraz medium ekstrahujcego
(ekstrahenta). Technika ekstrakcji ciaa staego rni si od techniki ekstrakcji cieczy czy gazu. W
tradycyjnej ekstrakcji matryc odbierajc jest ciecz natomiast nowoczesne techniki ekstrakcyjne s
czsto bezrozpuszczalnikowe, gdzie matryc odbierajc jest gaz lub ciao stae. Nazywajc technik
ekstrakcji naley przyj sta kolejno wymieniania faz, tak by mwic o ekstrakcji typu ciao stae -
ciecz i ciecz - ciao stae byo oczywiste, ktra faza jest ekstrahentem. Logicznym wydaje si
wymienia w pierwszej kolejnoci stan skupienia fazy zawierajcej substancj przed ekstrakcj, czyli
prbki, natomiast stan skupienia fazy zawierajcej substancj po ekstrakcji (ekstrahenta), jako drug i
taki sposb przyjto w niniejszym opracowaniu. Na rysunkach 1, 2 i 3 przedstawiono podzia technik
ekstrakcyjnych stosowanych do prbek o rnym stanie skupienia.

Wybr techniki ekstrakcji zaley od waciwoci fizyko-chemicznych substancji ekstrahowanych i

matrycy, a take kocowego celu stosowanego procesu.

Waciwoci analitu o podstawowym znaczeniu jest jego rozpuszczalno w ekstrahencie. Poza tym
naley bra pod uwag posta fizyczn analitu, jego lotno, zdolno do sublimacji, odporno
termiczn, odporno na dziaanie promieniowania UV czy zdolno do sorpcji na powierzchni.
Waciwoci analitu i matrycy warunkuj te dobr parametrw wybranej techniki ekstrakcji, takich
jak: temperatura, rodzaj i moc oddziaywa fizycznych (cinienia, ultradwikw czy promieniowania
mikrofalowego), intensywnoci mieszania, itp. Wybr techniki ekstrakcji zaley od tego czy celem ma

31
by wyodrbnienie pojedynczej substancji czy okrelonej grupy zwizkw chemicznych, czy
wyodrbnianie przeprowadza si na skal preparatywn czy analityczn. Sposb ekstrakcji zaley od
poziomu ste analitu w matrycy, jak rwnie od tego, czy kocowa analiza jest identyfikacj
skadnikw ekstraktu i/lub oznaczeniem ilociowym jego skadu. Sposb ekstrakcji musi by
dostosowany do wymogw techniki analizy kocowej.

Ekstrakcja do fazy ciekej

Ekstrakcja
gaz ciecz
Ekstrakcja przez bony pprzepuszczalne
Ekstrakcja
prbek
gazowych

Ekstrakcja do fazy stacjonarnej

Ekstracja
gaz ciao Mikroekstrakcja do fazy staej
stae

Ekstrakcja przez membrany porowate

Rysunek 1. Sposoby ekstrakcji prbek gazowych

Kierunkiem rozwoju wspczesnych technik ekstrakcyjnych s zasady zielonej chemii, w tym chemii
analitycznej. Podstawowymi cechami zielonej chemii analitycznej s:

ograniczenie zuycia odczynnikw chemicznych, zwaszcza rozpuszczalnikw organicznych, lub

ich eliminacja,
niestosowanie odczynnikw toksycznych dla czowieka i rodowiska naturalnego,
ograniczenie emisji par i gazw, ciekw i odpadw staych, powstajcych w wyniku procesu
analitycznego,
zmniejszenie nakadu pracy i zuycia energii w procesie analitycznym.
Powysze wymogi spenia wiele wspczesnych technik ekstrakcji, jak ekstrakcja do fazy staej lub
gazowej. W ekstrakcji ciecz znalazy zastosowanie nowe ekstrahenty, takie jak: pyn w stanie
nadkrytycznym, woda w stanie podkrytycznym czy ciecze jonowe.
Techniki ekstrakcyjne umoliwiajce automatyzacj procesu lub oznaczanie kilku substancji w
jednej prbce zmniejszaj zuycie energii i pracy w przeliczeniu na analit.

32
 Statyczna analiza fazy nadpowierzchniowej

Dynamiczna analiza fazy nadpowierzchniowej

Ekstrakcja
ciecz - gaz Dynamiczna analiza fazy gazowej nad filmem

Wymywanie i wychwytywanie

Klasyczna ciecz - ciecz

Techniki Ekstracja ciga

ekstrakcji Ekstrakcja
prbek ciecz - ciecz Mikroekstracja
ciekych Mikroekstracja do pojedynczej kropli

Mikroekstracja poprzez membran

Ekstrakcja do fazy staej

Mikroekstrakcja do fazy staej

Ekstrakcja poprzez sorbent pokrywajcy

powierzchni mieszadeka magnetycznego
Ekstrakcja
ciecz ciao Mikroekstrakcja poprzez membran do fazy
stae stacjonarnej

Metoda ograniczonego dostpu do fazy staej

Ekstrakcja wykluczenia na sorbentach o

powinowadztwie immunologicznym

Ekstrakcja do sorbentw z nadrukiem

molekularnym

Ekstrakcja do fazy staej w strzykawce

Rysunek 2. Sposoby ekstrakcji prbek ciekych

33
 Ekstrakcja do fazy staej w ukadzie statycznym
Ekstrakcja
ciao stae - Ekstrakcja do fazy staej w ukadzie dynamicznym
gaz
Ekstrakcja strumieniem gazu z desorpcj termiczn

Ektrakcja rozpuszczalnikiem przez wytrzsanie

Ekstrakcja strumieniem rozpuszczalnika

Techniki
ekstrakcji Ekstrakcja w aparacie Soxhleta Metody
prbek klasyczne
staych Homogenizacja prbki z rozpuszczalnikiem

Ekstrakcja wieloetapowa (sekwencyjna)

Zmydlanie (saponifikacja)

Ekstrakcja
Metody Ultradwikami, sonikacja
ciao stae -
klasyczne
ciecz
wspomagane Promienowaniem mikrofalowym

Przyspieszona ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika

Ekstrakcja rozpuszczalnikiem pod zwikszonym

cinieniem Nowoczesne
metody
Ekstrakcja rozpuszczalnikiem wspomagana ekstrakcji
promieniowaniem mikrofalowym

Ekstrakcja pynem w stanie nadkrytycznym

Rysunek 3. Sposoby ekstrakcji prbek staych

34
3. Ekstrakcja prbek gazowych
3.1. Ekstrakcja w ukadzie gaz ciecz
Ekstrakcja prbek gazowych ciecz (ang. gas liquid extraction, GLE) polega na podziale izolowanych z prbki
analitw gazowych do cieczy, pod warunkiem, e s one w niej cakowicie rozpuszczalne lub rozpuszczalne
czciowo, ale w wikszym stopniu ni pozostae skadniki prbki. Mieszanin gazow (prbk) przepuszcza
si przez okrelony rozpuszczalnik. W trakcie tego procesu rozpuszczalne skadniki prbki s absorbowane i
skad mieszaniny gazowej opuszczajcej ciecz jest inny ni skad mieszaniny wejciowej. Proces podziau
zachodzi w caej objtoci cieczy. Przenoszenie mas polega na dyfuzji czsteczek substancji w obu fazach
(gazowej i ciekej) poprzez warstw graniczn, wywoanej rnic stenia substancji w obu fazach.

Rnica ste skadnika absorbowanego jest si napdow dyfuzji, im wiksza rnica ste
tym wiksza szybko dyfuzji.

W pynie nieruchomym jest to dyfuzja czsteczkowa, przy przepywie cieczy - dyfuzja burzliwa.

Przenikanie (podzia) czsteczek substancji przez warstw graniczn, czyli stref przyleg do
powierzchni midzyfazowej i poprzez powierzchni midzyfazow (granic faz) zaley od
szybkoci przenikania i jest tym wiksze im wiksza jest powierzchnia midzyfazowa.

Zwikszenie powierzchni midzyfazowej uzyskuje si przez mieszanie, zastosowanie bekotki lub

rozpylanie, a take przez rozpraszanie na wypenieniach o rnych ksztatach. Etap dyfuzji mona
wyduy, stosujc odpowiedni czas ekstrakcji.
T metod ekstrakcji gazu stosuje si do prbek o steniu analitu rzdu kilku procent lub niszych,
pod warunkiem, e ekstrahowany gaz bardzo dobrze rozpuszcza si w cieczy ekstrahujcej. Ciecz
(medium ekstrahujce) nazywa si absorbentem, skadnik gazowy ekstrahowany z prbki gazowej
absorbatem, urzdzenie, w ktrym zachodzi absorpcja nazywa si za absorberem.
Proces podziau skada si tu z trzech etapw: przenoszenia masy z fazy gazowej do powierzchni
cieczy, rozpuszczenia w warstwie granicznej i przenoszenia masy z warstwy granicznej w gb cieczy.
Szybko przenoszenia masy do granicy faz po obu stronach zaley od szybkoci dyfuzji czsteczkowej
i burzliwej. Rozpuszczanie w warstwie granicznej wie si z oporami wnikania mas po obu stronach
granicy. Przyczyn oporw jest bariera fizyczna i hydrodynamiczna. Barier fizyczn stwarzaj
czsteczki, ktre blokuj dostpno powierzchni midzyfazowej do wnikania gazu. Z kolei barier
hydrodynamiczn stwarza napicie powierzchniowe cieczy, ktre utrudnia ruch w strefie przylegej
do powierzchni midzyfazowej. W nieruchomej warstwie cieczy o przenoszeniu masy decyduje
dyfuzja czsteczkowa.

Gazy sabo rozpuszczaj si w cieczach w warunkach normalnych w porwnaniu z innymi

substancjami, a ich rozpuszczalno maleje wraz ze wzrostem temperatury. Oddziaywania
midzyczsteczkowe gaz ciecz (solwatacja) s sabe z powodu niewielkiej polarnoci gazw, a
niewielki wzrost temperatury powoduje ich ulatnianie si (zwikszenie entropii lotnych
zwizkw nie wymaga duych nakadw energii).

35
 W ukadach rozcieczonych gaz - ciecz w stanie rwnowagi, matematyczn zaleno stenia gazu
pochanianego w cieczy i jego cinienia podaje prawo Henryego (prawo Henryego nie obowizuje,
gdy gazy wchodz w reakcje chemiczne lub ulegaj dysocjacji):

p A = H cA (3)
gdzie:

pA- rwnowagowe cinienie gazu pochanianego (cinienie czstkowe tego gazu nad
roztworem nasyconym),
cA- rwnowagowe stenie gazu w cieczy (roztwr nasycony),
H- staa Henryego.
Z rwnania Henryego wynika, e rozpuszczalno gazu w cieczy bdzie tym wysza im wysze
cinienie w ukadzie. Warto staej Henryego zaley od temperatury, i wzrasta wraz z jej wzrostem,
zatem wzrost temperatury zmniejsza rozpuszczalno gazu. W stanie rwnowagi szybko absorpcji
skadnika gazowego w cieczy rwna jest szybkoci jego desorpcji z cieczy. Czas osigania rwnowagi
jest dugi i w praktyce, podczas ekstrakcji, nieosigany.

3.1.1. Ekstrakcja membranowa przez bony pprzepuszczalne

Do oczyszczania lub rozdzielania gazw stosuje si rwnie membrany pprzepuszczalne zwane
zwartymi. Materia, z ktrego wykonana jest bona pprzepuszczalna zachowuje si jak ciecz, w ktrej
rozpuszczaj si i dyfunduj skadniki gazu. Motorem separacji skadnikw gazu jest rnica ich cinie
czstkowych po obu stronach membrany. Efekt rozdzielania zaley od selektywnoci materiau membrany
oraz rozpuszczalnoci skadnikw gazu w membranie i od wartoci ich wspczynnikw dyfuzji, ktre
mona modyfikowa warunkami przeprowadzania ekstrakcji, jak temperatur i cinieniem. Schemat
procesu separacji przez membran pprzepuszczaln przedstawiono na rysunku 8.

Mieszanina gazw do rozdzielenia Membrana o gruboci L i Analit (po przejciu przez membran
o steniu analitu(c1), tzw. strefa przekroju poprzecznym A zw. permeatem) o steniu c2 w
zasilania strefie permeatu

Kierunek dyfuzji

Rysunek 8. Schemat separacji przez membran pprzepuszczaln

36
Przenoszenie masy przez membran pprzepuszczaln opisywane jest rwnaniem dyfuzji Ficka i
rwnaniem Henryego. Pierwsze dotyczy transportu masy podczas dyfuzji skadnika, wywoanej
rnic jego ste po obu stronach membrany:

c
J = AD (4)
L
gdzie:
 szybko dyfuzji wyraana strumieniem molowym (objtociowym) skadnika,
[cm3/cm2 s],
 - rnica ste skadnika midzy stron zasilania a stron permeatu (c1 c2),
 - grubo membrany [cm],
A poprzeczny przekrj strefy dyfuzji,
D wspczynnik dyfuzji analitu w materiale membrany.
W poczeniu z rwnaniem Henryego, zaleno przyjmuje posta:

QA( p1 p 2 )
J= (5)
L
z ktrej wynika, e dla okrelonego analitu i materiau membrany, o wymiarach membrany decyduje
rnica cinie 
  po obu jej stronach, a szczeglnie cinienie permeatu. Membrany zwarte
s wykonywane z polimerw, ze szka kwarcowego, materiaw ceramicznych i metali. Polimery nie
maj duej selektywnoci i nie s wytrzymae na wysokie temperatury, s za to zdecydowanie tasze
od pozostaych. Wrd polimerw najwikszym zastosowaniem ciesz si membrany wykonane z
gumy silikonowej. Membrany zwarte ceramiczne lub metalowe mog by jednofazowe lub
dwufazowe, jak spieki ceramiczno-metalowe, tzw. cermety.
Ekstrakcj membranow przez bony pprzepuszczalne stosuje si w przemyle i w laboratoriach
analitycznych. W przemyle membrany stosowane s do rozdzielania takich mieszanin, jak: tlen
azot, wodr wglowodory, wodr tlenek wgla, wodr azot, ditlenek wgla wglowodory,
para wodna wglowodory, siarkowodr wglowodory, hel wglowodory, hel azot,
wglowodory powietrze w procesach wzbogacania, osuszania, oczyszczania, wydzielania i
odzyskiwania. W analityce gazw stosowane s urzdzenia wykorzystujce ekstrakcj
membranow. S to permeacyjne osuszalniki strumienia gazw, dozymetry permeacyjne,
denudery permeacyjne, dozowniki w spektrometrach mas, umoliwiajce wprowadzenie prbki
gazowej do komory jonizacyjnej, separatory membranowe do przenonych spektrometrw mas.

3.2. Ekstrakcja w ukadzie gaz ciao stae

Rozdzielanie na sorbentach staych moe odbywa si wg rnych mechanizmw: poprzez adsorpcj
fizyczn, adsorpcj chemiczn, kondensacj kapilarn i in. (por. rozdz. II.3.1.2).
Adsorpcja fizyczna polega na zatrzymywaniu skadnikw gazu na powierzchni zewntrznej i
wewntrznej (w porach) adsorbentu, w wyniku oddziaywa midzyczsteczkowych bliskiego
zasigu, jak siy Van der Waalsa czy wizania wodorowe. W wyniku tych oddziaywa najatwiej
adsorbuj si czsteczki gazw o duej masie czsteczkowej i niskiej temperaturze wrzenia.
Podczas gdy mae czsteczki gazu maj mniejsz energi wizania z adsorbentem. Wtrakcie
procesu adsorpcji czsteczki silniej wice si z adsorbentem wypieraj te, sabiej zwizane.
Poniewa adsorpcja nastpuje na skutek oddziaywa bliskiego zasigu miedzy czsteczkami

37
skadnikw gazu a czsteczkami powierzchni adsorbentu, ilo zaadsorbowanych czsteczek jest
ograniczona i adsorpcja fizyczna zachodzi do momentu cakowitego wykorzystania przez analit
powierzchni zewntrznej i wewntrznej sorbentu.

Dlatego wan cech adsorbentu jest jego powierzchnia waciwa. Rozrnia si dwa rodzaje
powierzchni waciwej: powierzchnia waciwa ziaren adsorbentu i powierzchnia waciwa
zoa adsorbentu.

Powierzchnia waciwa ziaren adsorbentu, zwana te powierzchni adsorpcyjn, jest to stosunek

cakowitej powierzchni zewntrznej ziaren (granulek) i powierzchni porw do masy ziarna.
Powierzchnia waciwa wyraana jest zwykle w m2/g. Na wielko i kinetyk adsorpcji ma rwnie
wpyw struktura porw adsorbentu, okrelana cakowit objtoci porw i struktur porw.
Cakowita objto porw skada si z objtoci waciwej wszystkich rozmiarw porw
(makroporw, mezoporw i mikroporw, patrz rozdzia: Ekstrakcja membranowa przez membrany
porowate) i wyraana jest w cm3/g adsorbentu.
Struktur porw okrela: ksztat powierzchni bocznej porw, ksztat przekroju poprzecznego
porw (jest zmienny wzdu jego dugoci), profil porw w przekroju podunym, krto porw,
rodzaje pocze porw (obustronnie i jednostronnie otwarte), uporzdkowanie lub
nieuporzdkowanie porw (pooenie), poczenie elementw zoa adsorbentu (sztywny
szkielet lub oddzielne, przylegajce do siebie elementy). Od struktury porw zaley droga
migracji czstek analitu, tym samym szybko adsorpcji.
Powierzchnia waciwa zoa adsorbentu jest potrzebna do obliczania transportu masy substancji z
gazu do powierzchni adsorbentu. Powierzchni waciw zoa adsorbentu oblicza si na podstawie
masy pojedynczego ziarna i gstoci nasypowej zoa, po uwzgldnieniu ksztatu ziarna.
Charakterystyk najczciej stosowanych adsorbentw przedstawiono w tabeli 1.
W przypadku adsorpcji chemicznej, oddziaywanie czsteczek adsorbatu z czsteczkami
powierzchni adsorbentu zwizane jest z przejciem elektronw, w wyniku tego energia wizania
czsteczek na powierzchni jest tak dua, e zaadsorbowana substancja moe by desorbowana
tylko w postaci zwizku chemicznego lub usunita jak substancja staa.

Przy doborze adsorbentu do rozdzielania mieszanin gazowych naley uwzgldni:

charakter chemiczny izolowanych substancji,

charakter chemiczny adsorbentu odpowiadajcy waciwociom rozdzielanych gazw,
pojemno sorpcyjn adsorbentu (odpowiednia powierzchnia waciwa, wielko porw),
metod desorpcji analitu z sorbentu,
czysto adsorbentu,
trwao analitu na wybranym sorbencie (moliwo zmian chemicznych analitu).
Proces adsorpcji skada si z trzech gwnych etapw (por. rozdz. II.3.2.1.)

wdrwka adsorbatu do zewntrznej powierzchni adsorbentu, polegajca na dyfuzji czstek

gazu w fazie gazowej dyfuzja zewntrzna,

38
 dyfuzja adsorbatu w porach w kierunku powierzchni wewntrznej porw dyfuzja
wewntrzna,
kondensacja czsteczek adsorbatu na powierzchni porw waciwy proces adsorpcji.

Proces adsorpcji moe przebiega w rnych warunkach: gaz poddawany adsorpcji moe by
jedno- lub wieloskadnikowy, adsorpcji ma ulega jeden lub kilka skadnikw gazu, adsorpcja
moe by prowadzona statycznie lub dynamicznie, zoe adsorbentu moe by nieruchome lub
ruchome itd. Warunki adsorpcji maj zdecydowany wpyw na jej cakowit szybko oraz
szybko poszczeglnych jej etapach. Cakowit szybko adsorpcji wyraa si przyrostem iloci
adsorbujcej si substancji [jednostka masy] w jednostce czasu.
Adsorpcja moe by prowadzona w sposb statyczny lub dynamiczny. W sposobie statycznym,
ruch czsteczek gazu w kierunku fazy stacjonarnej jest swobodny (dyfuzja molekularna).
Statyczna adsorpcja stosowana jest w analityce, do pobierania prbek gazowych (dozymetry
pasywne). Stosowanie metody statycznej nie wymaga urzdze do zasysania gazu ani pomiaru jego
objtoci.
Adsorpcja dynamiczna polega na przepuszczaniu strumienia gazu przez adsorbent. Jest czsto
stosowana w analityce do oznaczanie organicznych skadnikw gazowych. Wymaga zasysania gazu
przez sorbent (np. przez rurk sorpcyjn wypenion zoem sorbentu staego lub kilku warstw
rnych sorbentw) oraz pomiaru objtoci zasysanego gazu. W przemyle procesy adsorpcyjne
przeprowadza si metodami dynamicznymi, najczciej na zou nieruchomym, rzadziej ruchomym
czy fluidalnym. Zatrzymane na adsorbencie skadniki musza by uwalniane desorbowane. Przy
rozdzielaniu mieszanin gazowych, proces desorpcji jest zwizany z procesem adsorpcji. Rozdzielanie
adsorpcyjne mieszanin gazowych mona przeprowadza dwoma sposobami:

metod adsorpcji zmienno-temperaturowej, polegajcej na adsorpcji w niskiej temperaturze

(adsorpcja jest procesem egzotermicznym, odprowadzanie ciepa zwiksza wydajno),
desorpcji i regeneracji adsorbentu w podwyszonej temperaturze,
metod adsorpcji zmienno-cinieniowej (metoda bezgrzewcza), polegajcej na adsorpcji w
podwyszonym cinieniu, a desorpcji i regeneracji przy obnionym cinieniu.
W skali laboratoryjnej stosowana jest rwnie desorpcja przez pukanie zoa gazem obojtnym,
wypieranie zaadsorbowanego gazu innym, nieadsorbujcym si na sorbencie oraz desorpcja
rozpuszczalnikiem (ekstrakcja).

3.2.1. Ekstrakcja gazw przez membrany porowate

Do selektywnego rozdzielania skadnikw mieszanin gazowych (gazw i par) stosuje si rwnie
klasyczne membrany porowate. Ze wzgldu na rednic porw membrany dzieli si na:

mikroporowate, o rednicy porw mniejszej ni 2 nm,

mezoporowate (membrany o porach przejciowych), o rednicy od 2 nm do 50 nm,
makroporowate, o rednicy porw wikszej ni 50 nm.
Podstaw separacji na membranach porowatych jest proces selektywnej adsorpcji skadnikw
mieszanin gazowych na powierzchni i wewntrz porw oraz na mechanizmie wykluczania.

39
 Tabela. 1. Charakterystyka najczciej stosowanych adsorbentw

wg
Adsorbent Waciwoci fizyczne Skad chemiczny i Zastosowanie klasyfikacji
waciwoci chemiczne Kisielewa*

ele Wskoporowe (red. SiO2 (99,71%) + Fe2O3, Osuszanie gazw, usuwanie specyficzny
krzemionkowe 1,5 nm), pow. w. Al2O3,TiO2, Na2O, CaO, polarnych zanieczyszcze dodatni
550700 m2/g ZrO2 polarny, kwany, o organicznych, np. alkoholi,
duej pojemnoci fenolu, chlorofenoli,
szerokoporowe sorpcyjnej chlorobenzenw, amin
(red.6 nm), pow. w. aromatycznych i alifatycznych
400530 m2/g
Tlenek glinu Powierzchnia Al2O3 (92%) + H2O, Usuwanie zwizkw specyficzny
(aluminoel) waciwa 200250 Na2O, SiO2, Fe2O3,TiO2, polarnych: alkoholi, glikoli, dodatni
m2/g polarny, kwany aldehydw , ketonw itp.,
osuszania powietrza,
oczyszczanie z lotnych
zwizkw fluoru

Wgle Dua porowato, Nazwy handlowe: Usuwanie z powietrza par niespecyfic

aktywne posiadaja makro-, Wgiel N, Wgiel A, zwizkw organicznych, zny
mezo-, mikropory, Carbosorbit, Carbopol Z- usuwanie SO2 z gazw niepolarny
pow. w. 7001200 O-4, spalinowych
m2/g
Sorbent Dua porowato, Glinokrzemiany metali Osuszanie wodoru, powietrza, specyficzny
czsteczkowy pory jednorodne o jedno- i gazw szlachetnych, usuwanie dodatni
(zeolit) redn.0,31,1nm, dwuwartociowych, sita NH3,H2S,SO2,CO2,
pow. w. 7001100 molekularne, typ A, X, Y,
m2/g polarne, n-alkany, dieny, etyloamina,
benzen, naftalen, proste
zwizki heterocykliczne,
chlorowcowglowodory
Polimery Dua porowato, Niepolarne, Usuwanie zanieczyszcze specyficzny
porowate wskoporowate, pow. niespecyficzne: organicznych, kwasw i zasad ujemny
w. kilkaset m2/g XAD-2, XAD-4, organicznych, fenoli,
Porapak(P,Q), zwizkw organicznych z
Chromosorb (101, 102) wieloma grupami funkcyjnymi
Polarne, Chromosorb
104,Vinylosorb N, XAD-
11, Amberlite IRC-50
Polimery Dua porowato, XAD-2, XAD-4, Usuwanie zanieczyszcze Niepolarny
porowate wskoporowate, pow. Porapak(P,Q), organicznych, kwasw i zasad nie-
w. kilkaset m2/g Chromosorb (101, 102) organicznych, fenoli, specyficzny
Chromosorb zwizkw organicznych z lub
104,Vinylosorb N, XAD- wieloma grupami funkcyjnymi specyficzny
11, Amberlite IRC-50 ujemny

*klasyfikacja chemicznego charakteru powierzchni wg Kisielewa: niespecyficzne (niepolarne, neutralne i hydrofobowe, na

powierzchni nie znajduj si jony ani grupy funkcyjne), specyficzne dodatnie (polarne, na powierzchni znajduj si skupione
adunki dodatnie), specyficzne ujemne (polarne, na powierzchni znajduj si rozoone adunki ujemne).

40
Adsorpcj nazywa si zjawisko zmian stenia substancji na powierzchni styku fazy staej z faz
gazow lub ciek (por. roz. I.2.2.). Zmiany stenia (sorpcja) nastpuj w wyniku reakcji zachodzcej
na powierzchni ciaa staego (adsorpcja chemiczna) lub w wyniku oddziaywa
midzyczsteczkowych (si Van der Waalsa), wystpujcych w gbi fazy staej oraz si adhezji,
skierowanych prostopadle do powierzchni styku faz (adsorpcja fizyczna). Wydajno adsorpcji
wzrasta ze wzrostem powierzchni waciwej sorbentu. Adsorpcja jest procesem egzotermicznym,
wic wydajno ekstrakcji na membranie porowatej wzrasta wraz z obnieniem temperatury.
Natomiast proces odwrotny, czyli desorpcja wymaga doprowadzenia energii.
Mechanizm wykluczania polega na dyfuzji przez membran tych moleku, ktrych rozmiary
odpowiadaj rednicy porw.
Udzia poszczeglnych procesw zaley od wielkoci porw. W makroporach membran adsorpcja
zachodzi w niewielkim stopniu, su one gwnie do transportu adsorbowanych substancji na
powierzchni membrany do porw o mniejszych rednicach. Na powierzchni porw przejciowych
zachodzi adsorpcja, a zaadsorbowane molekuy maj du mobilno, gdy siy adsorpcyjne
wystpuj w niewielkiej odlegoci od cian porw. Adsorpcja na powierzchni mezoporw moe by
mono- lub polimolekularna. Wewntrz porw przejciowych moliwa jest rwnie kondensacja
kapilarna. Wykroplenie si skadnika w kapilarze jest etapem separacji od trwaych skadnikw
gazowych.
Membrany o mikroporach, porwnywalnych z rozmiarami czsteczek maj najwiksz selektywno,
wynikajc z moliwoci doboru rozmiarw porw i doboru ich charakteru chemicznego. Poza tym, w
mikroporach zachodzi wiele zjawisk, jak: dyfuzja molekularna, dyfuzja Knudsena, dyfuzja
powierzchniowa, kondensacja kapilarna, oddziaywania miedzy dyfundujcymi molekuami oraz
wykluczanie moleku, dziki ktrym membrany mikroporowate osigaj wysok selektywno.
Oglny schemat dziaania membrany porowatej przedstawiono na rysunek 9. Rozdzielanie na
membranie porowatej skada si z trzech etapw:

wdrwka adsorbatu do zewntrznej powierzchni adsorbentu, polegajcy na dyfuzji czstek

gazu w fazie gazowej dyfuzja zewntrzna,
dyfuzja adsorbatu w porach w kierunku powierzchni wewntrznej porw dyfuzja
wewntrzna (prdko dyfuzji w porach zaley w duej mierze od stosunku redniej rednicy
porw (r) do redniej drogi swobodnej czsteczek adsorbatu () i rwnie decyduje o
szybkoci caego procesu; gdy r >> , to transport wewntrz porw w fazie gazowej odbywa
si w wyniku dyfuzji molekularnej, czyli swobodnych ruchw czsteczek, gdy >> r, szybko
dyfuzji zaley o ciaru czsteczkowego gazu i rednicy porw i nosi nazw dyfuzji
knudsenowskiej),
kondensacja czsteczek adsorbatu na powierzchni porw waciwy proces adsorpcji.

Czsteczki o odpowiednich rozmiarach, nieulegajce adsorpcji dyfunduj przez pory membrany w

kierunku mniejszego stenia.

Membrany porowate wykonuje si z polimerw organicznych, materiaw ceramicznych, metali,

szka kwarcowego i rzadziej z wgla. Nowe technologie produkcji membran pozwalaj
otrzymywa membrany w postaci cienkiej warstwy zeolitw, krzemionki, tlenku tytanu, wglika

41
 krzemu i wgla, naniesionej na nieorganiczne membrany makro- i mezoporowate. Membrany
mog mie ksztat paskiej folii, kapilary lub wydronego, porowatego wkna kapilarnego.

Prdko dyfuzji

Zasilanie, p1 Permeat, p2

Rozmiar
porw

Grubo membrany

Rysunek 9. Zasada dziaania membrany porowatej

Ekstrakcja za pomoc adsorpcji na membranach porowatych umoliwia usuwanie z gazu wielu

substancji jednoczenie, szczeglnie organicznych oraz oczyszczanie duych strumieni gazw o
maym steniu zanieczyszcze.

3.2.2. Mikroekstrakcja do fazy staej

Mikroekstrakcja do fazy staej (ang. solid phase microextraction, SPME) polega na sorpcji mikroiloci
zwizkw organicznych w cienkiej, cylindrycznej warstwie fazy stacjonarnej, pokrywajcej wkno
szklane lub kwarcowe. SPME zostaa zastosowana po raz pierwszy w Kanadzie w 1989 roku przez
naszego rodaka Janusza Pawliszyna z Uniwersytetu w Waterloo. Mikroekstrakcja do fazy staej
znalaza szybko szerokie zastosowanie w analityce zwizkw organicznych z prbek gazowych,
ciekych lub ekstraktw z prbek staych. Cztery lata pniej firma Supelco wprowadzia na rynek
strzykawki do mikroekstrakcji do fazy staej. Wkno z sorbentem znajduje si w rurce ze stali
nierdzewnej, a cao mieci si w igle umocowanej w uchwycie, przypominajcym strzykawk do
chromatografii gazowej (rysunek 10a). Uchwyt umoliwia dwa pooenia wkna: wewntrz i na
zewntrz rurki. W trakcie ekstrakcji wkno moe by umieszczone (zanurzone) bezporednio w
ciekej prbce (ang. direct immersion, DI-SPME), lub w gazowej fazie nadpowierzchniowej nad ciek
lub sta prbk (ang. head space, HS-SPME), rysunek 10b i c.

Po okrelonym czasie ekstrakcji, wkno chowane jest do igy. Ekstrakt, po zamkniciu koca igy np.
uszczelk chromatograficzn, moe by przechowywany na wknie do czasu analizy. Analiza
chromatograficzna ekstraktu polega na wprowadzeniu igy przyrzdu do dozownika chromatografu
gazowego i wysuniciu wkna z sorbentem do przestrzeni dozownika, gdzie nastpuje desorpcja
analitw do fazy gazowej. Gaz nony przenosi je nastpnie do kolumny chromatograficznej, gdzie

42
nastpuje proces rozdzielania. Technika SPME nie wymaga specjalnych desorberw termicznych i
mona j stosowa w poczeniu z kadym chromatografem gazowym.

Prowadnica wkna

ruba blokujca
pooenie wkna

Otwr do
obserwacji
wkna

Ruch
analitw
Iga

Wkno z Prbka
sorbentem

a) b) c)

Rysunek 10. Schemat przyrzdu do mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej, SPME (a) oraz sposoby
ekstrakcji: bezporednio w prbce, DI-SPME (b) i w fazie nadpowierzchniowej, HS-SPME (c)

Dla celw chromatografii cieczowej stosuje si ekstrakcj poprzez przepuszczanie prbki przez
kapilar, pokryt od wewntrz sorbentem. Zatrzymane na sorbencie w kapilarze anality wymywa si
bezporednio przez faz ruchom do kolumny HPLC lub rozpuszczalnikiem do naczynka
chromatograficznego.
Fazy stacjonarne stosowane w technice SPME maj rne waciwoci chemiczne. Sorpcja zwizkw
organicznych zaley od ich powinowactwa do zastosowanego rodzaju fazy stacjonarnej.
Najpowszechniej stosowan grup faz s fazy silikonowe. S to polisiloksany, ktre dziki swym
waciwociom fizykochemicznym, bardzo dobrze speniaj wymogi faz stacjonarnych. Polisiloksany
s stabilnymi termicznie i chemicznie cieczami, posiadajcymi odpowiedni lepko, nieznacznie
zmieniajc si ze zmian temperatury. Fazy te mona modyfikowa chemicznie, poprzez dodatek
rnych grup funkcyjnych, uzyskujc w ten sposb rn selektywno. Struktura polisiloksanw
umoliwia szybk sorpcj analitw. Przykadem faz silikonowych jest np. polidimetylosiloksan (ang.
polydimethylsiloxane, PDMS) lub mieszanina polidimetylosiloksanu i diwinylobenzenu PDMS/DVB
(ang. divinylbenzene, DVB). Jako faz sta w SPME stosuje si rwnie poliakrylany (PA) oraz
kopolimery np. carbowax/DVB, DVB/carboxenTM-PDMS i inne.

43
Podstawy metody

Zaleno stenia analitu w fazie stacjonarnej od czasu ekstrakcji jest funkcj wykadnicz, ktr
przedstawia rwnanie:
k (6)
c s (t) = c w,0 1 ( 1 - e -k2t )
k2

gdzie:
k1 i k2 - stae sorpcji i desorpcji analitu w fazie stacjonarnej,
 , - pocztkowe stenie analitu w wodzie,
  - stenie analitu w fazie stacjonarnej w czasie t.
Mechanizm ekstrakcji polega na podziale analitu midzy dwie fazy: matryc (woda) i
sorbent(polimer, ciecz). W zwizku z tym ilo analitu w sorbencie (ms) zaley w gwnej mierze od
wartoci staej podziau analitu midzy dwie fazy: sorbent i wod - / . Staa podziau jest ilorazem
ste analitu w stanie rwnowagi w fazie sorpcyjnej(cs) i fazie wodnej (cw):

cs m Vw
K s/w= = s (7)
cw m w Vs
gdzie:
 - objto fazy wodnej,
 - objto fazy ekstrahujcej,
 - masa analitu w fazie ekstrahujcej,
 - masa analitu w fazie wodnej.
Po osigniciu stanu rwnowagi, bilans mas mona zapisa:

mw,0 = ms+mw (8)

gdzie:
 , - pocztkowa masa analitu w fazie wodnej.

Przeksztacajc wzory (7) i (8), otrzymuje si wzr na mas analitu w fazie ekstrahujcej,
m w, 0 K s / wVs
ms = (9)
K s / w + Vw

ktry po uwzgldnieniu pocztkowej masy analitu w fazie wodnej przyjmuje ostateczn posta
zalenoci masy analitu w fazie ekstrahujcej:

c w, 0Vw K s / wVs
ms = (10)
K s / w + Vw

Mikroekstrakcja do fazy staej jest technik rwnowagow, co oznacza, e zawsze masa analitu
znajdujca si w sorbencie ekstrahujcym jest zalena od jego stenia pocztkowego w prbce. To,
jaka pocztkowa cz analitu znajdzie si w sorbencie, zaley od staej podziau oraz od objtoci

44
 
fazy stacjonarnej i prbki. Przy bardzo duej objtoci prbek, stosunek  jest bliski jednoci,
/ 

wic rwnanie mona zapisa:

m s = K s / w c w, 0V s (11)

co oznacza, e w takim przypadku ilo analitu ekstrahowana do fazy stacjonarnej jest niezalena od
objtoci prbki. Umoliwia to pomiar stenia analitw w wysoce objtociowych prbkach, np.
rzece czy w jeziorze, poprzez bezporednie zanurzenie wkna do wody.
Dla prbek gazowych, zaleno iloci analitu zaabsorbowana przez faz stacjonarn od stenia jego
w prbce jest identyczna jak w przypadku prbek ciekych, przy czym stenie, objto oraz staa
podziau analitu dotyczy gazu:
m s = K s / g c g , 0Vs (12)

gdzie:
, - pocztkowe stenie analitu w prbce gazowej,
 - objto fazy gazowej (prbki),
/ - staa podziau analitu midzy dwie fazy: sorbent i prbk gazow.

Jeli wkno znajduje si w fazie nadpowierzchniowej nad prbk, w stanie rwnowagi midzy fazami,
ilo analitu w fazie stacjonarnej zaley od staej podziau miedzy faz stacjonarn a gazow faz
nadpowierzchniow, Ks/g oraz midzy gazow faz nadpowierzchniow a prbk, Kg/w. Zaleno t mona
wyprowadzi jak poprzednio z bilansu mas w stanie rwnowagi, uwzgldniajc przejcie analitu z fazy
gazowej do fazy staej:
cs ms V g
K s/g= = (13)
cg mg Vs

oraz przejcie analitu z fazy wodnej do fazy gazowej:

cg m g Vw
Kg/w = = (14)
cw mw V g
gdzie:
 - objto fazy nadpowierzchniowej,
 - masa analitu w gazowej fazie nadpowierzchniowej.

Bilans mas obejmuje wszystkie trzy fazy:

m w, 0 = ms + m w + m g (15)

std masa analitu w fazie stacjonarnej wynosi:

K s / g K g / wV sVw c0
ms = (16)
K s / g K g / wVs + K g / wV g + Vs

45
Ponadto, w przypadku prbek ciekych, stosunek staej podziau ciao stae/gaz i staej podziau
gaz/woda jest rwny staej podziau ciao stae/woda:

ms V g m g V w m s Vw (17)
K s/ g K g / w = = = Ks / w
m g Vs m w V g m w Vs

Jeli ekstrahuje si anality, ktrych staa podziau faza nadpowierzchniowa/prbka, / jest
niska, to zmniejszajc objto fazy gazowej, zmniejsza si warto czynnika / , co
oznacza, e ilo analitu w fazie stacjonarnej bdzie prawie taka sama, jakby zanurzy sorbent w
prbce. Jest to bardzo cenna cecha tej techniki, gdy transport analitw przez faz
nadpowierzchniow jest znacznie szybszy ni w ciekej fazie (w prbce zawsze tworzy si cienka
warstwa wody wok wkna, co spowalnia przenoszenie masy analitu). Ponadto, w fazie
nadpowierzchniowej, jest znacznie mniejszy wpyw matrycy, co z kolei jest istotne w przypadku
bardzo zoonych prbek.

Czas ekstrakcji zaley od czasu ustalania si rwnowagi midzy prbk a faz stacjonarn. Dyfuzj
analitw z prbki do fazy stacjonarnej przyspiesza mieszanie. Idealne mieszanie umoliwia
zastosowanie ultradwikw, w innych przypadkach zawsze wok wkna znajduje si cienka
warstwa wody ograniczajca dyfuzj do warstwy sorbentu i wyduajca czas ustalania rwnowagi.
Poniewa warstwa sorbentu na wknie ma ma grubo (7 100 m), stan rwnowagi ustala si
szybko i w praktyce czas ekstrakcji wynosi zwykle od 2 do 30 min. Poza tym pojemno wkna jest
ograniczona i przeduanie czasu kontaktu z prbk (zwaszcza w gazow) moe prowadzi do
desorpcji i zmniejszenia wydajno ekstrakcji.
Dobr wkna z sorbentem opiera si najczciej na zasadzie stosowanej w chromatografii -
podobne rozpuszcza podobne, charakter sorbentu (polarno) dobierany jest do polarnoci analitu.
Czuo metody zatania technik SPME zalena jest od wartoci staej podziau analitu midzy
substancj sorpcyjn (faz stacjonarn) a prbk.
Jeli dobr wkna jest utrudniony ze wzgldu na waciwoci analitu (obecno w matrycy znacznych
iloci substancji o podobnej strukturze chemicznej), mona zastosowa jego derywatyzacj. Dobrym
sposobem, jeli to jest moliwe, jest przeprowadzenie analitw w pochodne o innej strukturze
chemicznej od pozostaych skadnikw matrycy. Pochodne analitw powinny mie inne waciwoci
fizykochemiczne, np. nisz temperatur wrzenia lub inn polarno. Nisza temperatura wrzenia
zwiksza ich lotno, a mniejsza polarno zwikszy sta podziau na niepolarnej fazie stacjonarnej,
co w rezultacie zwiksza wydajno ekstrakcji lub wrcz j umoliwia. Derywatyzacj prbki mona
wykona przed ekstrakcj lub w trakcie. Jednym ze sposobw jednoczesnej ekstrakcji i derywatyzacji
jest zanurzenie wkna do odczynnika -reagenta a nastpnie zanurzenie do prbki lub umieszczenie
w fazie gazowej nad prbk. Reakcja zachodzi na wknie, co znacznie skraca czas analizy. Niestety,
nie kad reakcj mona w ten sposb wykona.
Masa analitu w fazie stacjonarnej zaley rwnie od jej iloci. Dostpne s wkna o nastpujcej
gruboci warstwy sorbentu: 7, 10, 30, 50, 65, 70, 85 i 100 m. Grube warstwy fazy odpowiednie s do

46
wikszych iloci analitw, ciesze stosowane s do mniejszych ste. Czas dyfuzji w fazie
stacjonarnej zaley od jej gruboci i wielkoci molekuy analitu. Wkna o wikszej gruboci warstwy,
np. 100 m, stosuje si do ekstrakcji niskomolekularnych i lotnych zwizkw. Z kolei wkna o
gruboci warstwy mniejszej, np. 30, 10 lub 7 m stosuj si do ekstrakcji zwizkw o wyszych masach
molekularnych i mniej lotnych. Grubo warstwy sorbentu naley rwnie wybiera biorc pod
uwag proces desorpcji analitu. Substancje o wyszych temperaturach wrzenia szybciej desorbuj si
z wkna o cieszej warstwie fazy stacjonarnej.

Na wydajno ekstrakcji maj wpyw objtoci fazy gazowej i prbki.

Wydajno wzrasta przy minimalizacji objtoci fazy gazowej nadpowierzchniowej. Zwykle prbka
cieka zajmuje poow objtoci naczynka do ekstrakcji. Poza tym stan rwnowagi midzy faz
gazow a ciek osiga si szybciej w naczynku o mniejszej pojemnoci. Np. 3 razy szybciej osiga si
stan rwnowagi w naczynku o pojemnoci 5 mL, z zawartoci prbki rwn 1 mL ni w naczynku o
pojemnoci 50 mL, z zawartoci prbki rwn 10 mL.
Staa podziau substancji midzy faz gazow a prbk, Kg/w ronie ze wzrostem temperatury, wzrasta
wic ilo analitu w fazie gazowej. Im wysze stenie analitu w fazie gazowej, tym szybsza jego
sorpcja na wknie. Ale zbyt wysoka temperatura jest przyczyn desorpcji ich z wkna, ktra nie
powinna zachodzi w trakcie ekstrakcji. Optymaln temperatur naley wic dobra w zalenoci od
skadu prbki i uytej fazy stacjonarnej. Temperatura i czas ekstrakcji s cile ze sob zwizane,
wzrost temperatury pociga za sob skrcenie czasu ekstrakcji.
Dla zwikszenia wydajnoci ekstrakcji czsto stosuje si proces wysalania. Wysalanie zwiksza si
jonow roztworu i zmniejsza rozpuszczalno organicznych analitw w prbce, tym samym
zwikszajc ich ilo w fazie gazowej, co uatwia sorpcj na wknie. Wysalanie czsto stosuje si przy
oznaczaniu pestycydw i zwizkw aromatycznych. Efekt wysalania zaley od rodzaju analitu i
stenia soli w prbce.
Zastosowanie selektywnych membran wok wkna (rysunek 11) zwiksza selektywno ekstrakcji i
moe przeduy ywotno wkna. Szczeglne zainteresowanie wzbudzaj membrany wglowe.

Membrana
Prbka
Ruch analitu

Rysunek 11. Schemat mikroekstrakcji do fazy staej przez membran

47
Warunki desorpcji s rwnie wane jak warunki ekstrakcji. Zwykle stosowana jest desorpcja
termiczna i odbywa si w dozowniku chromatografu gazowego. SPME nie daje piku rozpuszczalnika w
GC ale desorpcja analitu z wkna zachodzi wolniej ni odparowanie rozpuszczalnika, czego
rezultatem jest ogonowanie pikw, dlatego czas desorpcji powinien by moliwie najkrtszy.
Temperatura dozownika powinna by wysza ni temperatura wrzenia najwyej wrzcego skadnika,
ale z drugiej strony musi by dopasowana do termicznej wytrzymaoci wkna. W oznaczaniu
nielotnych lub nietrwaych zwizkw, technik SPME lepiej poczy z technik HPLC lub LC/MS.
Technika SPME jest bezrozpuszczalnikow ekstrakcj. Rnorodno wkien dostpnych
komercyjnie umoliwia wiele zastosowa (tabela 2). SPME jest metod przygotowania prbek
analizowanych technik chromatografii gazowej, wysokosprawnej chromatografii cieczowej lub
elektroforezy. Mona j stosowa do lotnych i nielotnych substancji. Ekstrakcja do fazy staej moe
si odbywa na bardzo selektywnych sorbentach, jakimi s przeciwciaa lub polimery z molekularnym
nadrukiem.

Tabela 2. Przykady zastosowa mikroekstrakcji do fazy staej w analityce rodowiska (na podstawie
Trends in solventless sample preparation techniques for environmental analysis, W. Wardencki, J.
Curyo, J. Namienik, J. Biochem. Biophys. Methods 70 (2007))

Prbka Analit Typ sorbentu, Typ Analiza

grubo warstwy ekstrakcji waciwa
fazy stacjonarnej
[m]
Woda Pochodne benzenu PDMS, 100 DI GC/IT/MS
Woda Pestycydy PDMS, 7 DI GC/NPD,
PDMS/DVB, 65 GC/ECD

Woda Lotne i redniolotne zwizki PDMS HS GC/FID, GC/MS

organiczne
Gleba Chlorowcoorganiczne pestycydy PDMS, 100 DI GC/ECD, GC/MS
Gleba Fungicydy PA, 85 DI GC/MS
Gleba Fosforoorganiczne pestycydy PA, 85 HS GC/MS
Ryby, woda Metylort PDMS, 100 HS GC/MS
rzeczna
Woda Fosforoorganiczne pestycydy PA, 85 DI SFE/HPLC
Woda Substancje wybuchowe CW/TPR, 50 DI HPLC/UV
PDMS/DVB, 60
PA, 85
Grunt i BTEX, naftalen, chlorowane PDMS, 100 HS MCC/UV/IMS
woda alkany, chlorowane benzeny PA, 85
powierzchn.

48
Tabela 2. c.d.

Prbka Analit Typ sorbentu, Typ Analiza

grubo warstwy ekstrakcji waciwa
fazy stacjonarnej
[m]
Woda BTEX PDMS/DVB, 65 HS GC/FID
Woda N-nitrozoaminy CAR/PDMS HS GC/NCD
GC/NPD
GC/MS
cieki Zwizki siarkowe PDMS/DVB HS GC/MS
przemysowe PDMS/Carboxen
Woda Chlorek benzylu, dichlorek Wkno z wglem HS GC/MS
benzylu, trichlorek benzylu aktywowanym
(ACF)
Powietrze Chlorobenzeny Carbowax/PDMS HS GC/MS
PDMS/DVD GC/ECD
Carbowax /DVB

49
4. Ekstrakcja prbek ciekych
4.1. Ekstrakcja w ukadzie ciecz gaz

Metoda ekstrakcji do fazy gazowej wykorzystywana jest gwnie do oznaczania lotnych skadnikw
organicznych w prbkach wodnych oraz staych. Metod t stosuje si w przypadku prbek
szczeglnie trudnych do analizy, wymagajcych uciliwego i skomplikowanego oczyszczania oraz
zagszczania. Ekstrakcja do fazy gazowej polega na przenoszeniu analitw do fazy gazowej nad
powierzchni prbki (nadpowierzchniowej, ang. head space, HS) w ukadzie zamknitym lub do
strumienia gazu przepywajcego przez prbk. W obu technikach istotn rol odgrywa podwyszona
temperatura, dziki ktrej wspomagane s procesy desorpcji analitu z fazy ciekej lub staej do
gazowej.

4.1.1. Ekstrakcja do gazowej fazy nadpowierzchniowej

Podstaw statycznej metody ekstrakcji do gazowej fazy nadpowierzchniowej jest zmienno cinienia
czstkowego substancji w fazie gazowej wraz ze zmian jej stenia w fazie ciekej. W ukadzie
zamknitym, w stanie rwnowagi termodynamicznej zaleno cinienia czstkowego pi skadnika i w
fazie gazowej nad prbk od jego stenia w ciekej mieszaninie, ktr jest prbka, wyraa prawo
Raoulta:

p i = xi p i0 (18)
gdzie:
 - uamek molowy skadnika i w prbce ciekej,
 - prno pary nad czystym skadnikiem i.

Z prawa Raoulta wynika, e na podstawie stenia analitu w fazie gazowej mona okreli pierwotne
jego stenie w prbce ciekej. W stanie rwnowagi termodynamicznej midzy faz gazow i ciek,
przy danym cinieniu i temperaturze, stosunek ste skadnika i w obu fazach jest wielkoci sta,
ktrej warto wyraa staa podziau substancji i
 :

ciL
Ki = (19)
c iG

gdzie:
 - stenie substancji i w fazie ciekej,
 - stenie substancji i w fazie gazowej.


Stenie pocztkowe skadnika i w prbce ( ) mona obliczy z bilansu mas. W stanie rwnowagi
termodynamicznej ilo skadnika i w fazie ciekej wynosi   a w fazie gazowej -   . Suma iloci

skadnika w obu fazach jest jego iloci w fazie ciekej (prbce) przed ekstrakcj -  :

0 (20)
c iLV L = ciG VG + c iLV L

Po uwzgldnieniu staej podziau otrzymuje si rwnanie wyraajce zwizek midzy steniem

badanej substancji w prbce ciekej a jej steniem w fazie gazowej:

0 V
c iL = c iG G + K i
VL 50
 (21)

Rwnanie (21) jest podstawow zalenoci stosowan w oznaczeniach ilociowych technik HS

w poczeniu z chromatografi gazow. Stenie badanej substancji w prbce ciekej jest
proporcjonalne do jej stenia w fazie gazowej, bdcej w stanie rwnowagi termodynamicznej z

faz ciek. Wyraenie " # % & ' jest wspczynnikiem proporcjonalnoci, ktry naley
$

wyznaczy dowiadczalnie metod krzywej kalibracyjnej.

Przy wykonywaniu pomiarw do krzywej kalibracyjnej naley nastrzykiwa na kolumn

chromatograficzn, identyczn objto fazy gazowej jak w przypadku prbki badanej. Prbki do
wyznaczenia krzywej kalibracyjnej musz mie te same objtoci fazy ciekej  i fazy gazowej  ,
oraz niezmienn warto staej podziau  . Szczeglnie trudny do zachowania jest warunek ostatni,
tj. zachowanie tej samej wartoci staej podziau w prbkach wzorcowych i badanych, co si wie z
zachowaniem takiego skadu jakociowego prbek wzorcowych jak prbek badanych.
Innym sposobem wyznaczenia wartoci stenia skadnika w prbce jest eliminacja z oblicze staej
podziau: rzeczywista i rachunkowa. Rzeczywist eliminacj mona osign przez ekstrakcj w
temperaturze podwyszonej (takiej, by cay analit znajdowa si w stanie gazowym), wwczas  = 0,
wic i  = 0, a zawarto w prbce oblicza si stosujc metod chromatograficzn. Nie jest to jednak
metoda uniwersalna, mona j wykorzystywa do substancji lotnych i dobrze rozpuszczalnych w
wodzie o maych staych podziau.

Rachunkowo sta podziau eliminuje si z oblicze w metodzie dodatku wzorca

Najdogodniejszym sposobem tej metody jest wykonanie dwch analiz rwnolegych, jednej bez
dodatku, drugiej z dodatkiem znanej iloci analitu. Zalet jest rwnie to, e mona go stosowa w
automatycznych dozownikach chromatografw gazowych.
Bilans mas substancji oznaczanej w pierwszym naczynku HS (bez dodatku wzorca, indeks dolny 1)
mona zapisa nastpujco:
VL c0 = VG c1G + V L c1L (22)

Bilans mas substancji oznaczanej w drugim naczynku HS (z dodatkiem wzorca, indeks dolny 2) mona
zapisa nastpujco:
V L c0 + m w = V G c2 G + V L c 2 L (23)

Do obu rwna mona wprowadzi sta podziau  , ktra jest identyczna w obu przypadkach,
poniewa skad jakociowy obu prbek jest taki sam:

c c
K i = 1L = 2L (24)
ciG c 2G
Po odpowiednim podstawieniu otrzymuje si wzr na obliczenie nieznanego stenia pocztkowego
w fazie ciekej (prbce) na podstawie ste analitu w fazie gazowej:
mW c1G
c0 = (25)
V L c2G c1G
51
Poniewa wielko sygnaw chromatograficznych(A) jest wprost proporcjonalna do stenia analitu
w gazie gazowej ( ), rwnanie mona zapisa w postaci praktycznej, a mianowicie:
)* -.
 ( (26)
+, -/ 0 -.

Mnoc obie strony rwnania przez warto  otrzymuje si wzr na mas analitu w badanej
prbce:
-.
 (  (27)
-/ 0 -.

Technik headspace mona wykonywa w dwch ukadach ekstrakcyjnych: statycznym i

dynamicznym. Statyczna metoda ekstrakcji do fazy nadpowierzchniowej (ang. static headspace, SHS)
naley do metod rwnowagowych. W zamknitym naczyniu, zawierajcym prbk ciek i gaz
obojtny, w okrelonej temperaturze ustala si midzy fazami stan rwnowagi termodynamicznej, w
ktrym stosunek ste analitw w obu fazach jest zgodny z ich sta podziau. Po pobraniu
okrelonej objtoci fazy gazowej i oznaczeniu jej skadu, uzyskuje si informacj o skadzie prbki.
Ekstrakcj mona przeprowadza przy uyciu powietrza, pod warunkiem, e nie ma w nim analitw, a
skadniki powietrza nie oddziauj z substancjami oznaczanymi. Schemat postpowania w przypadku
metody statycznej przedstawiony jest na rysunku 12. Po napenieniu naczynka HS prbk (1) i faz
gazow (2) naley je zamkn szczelnie za pomoc uszczelki (3) i kapsla metalowego (4) uywajc
kapslownicy. Zamknite naczynko wstawia si do termostatu (5), gdzie w czasie t i temperaturze T
ustala si stan rwnowagi. Optymalny czas i temperatur termostatowania naley ustali
eksperymentalnie dla kadego analitu. Po ustaleniu si stanu rwnowagi ekstrakt gazowy (6) pobiera
si gazoszczeln strzykawk (7), ktra bya termostatowana w tej samej temperaturze, co prbka.
Ogrzanie strzykawki do tej samej temperatury, co prbka zapobiega wykraplaniu si analitw
podczas pobierania ekstraktu gazowego oraz oczyszcza j przez odparowanie ewentualnych
pozostaoci po poprzednim uyciu. W automatycznych urzdzeniach (przystawkach do
chromatografu gazowego) oglny schemat postpowania jest podobny do schematu
przedstawionego na rysunku 12.

Termostat Strzykawka
gazoszczelna
Kapsel
metalowy

Uszczelka
Faza
Ekstrakt
gazowa
gazowy
Prbka

Rysunek 12. Schemat postpowania w statycznej ekstrakcji do fazy gazowej

52
Dynamiczna metoda ekstrakcji do gazowej fazy nadpowierzchniowej (ang. dynamic headspace, DHS)
naley do technik nierwnowagowych i polega na przepywie strumienia gazu ekstrahujcego nad
powierzchni ogrzanej prbki. Ekstrakcja dynamiczna jest bardziej wydajna ni statyczna, gdy
kolejne porcje gazu porywaj wydzielajce si do fazy nadpowierzchniowej anality. Stosuje si j w
przypadku niskiego stenia oznaczanych zwizkw w matrycy lub z powodu maych wartoci staej
podziau. Poza tym jest to dogodna metoda izolacji substancji z silnie pienicych si cieczy. Wad jest
natomiast due zuycie gazu i konieczno izolowania analitw z fazy gazowej, gdy duej objtoci
gazu nie da si wprowadzi do dozownika chromatografu gazowego.
Sposobem na zwikszenie powierzchni kontaktu przepywajcego gazu z prbk jest ekstrakcja do
fazy gazowej przepywajcej nad cienk warstw (filmem) ciekej prbki. Metoda ta nosi nazw
angielsk thin layer headspace, TLHS. Due rozwinicie powierzchni kontaktu wystpuje w przypadku
rozprysku prbki ciekej w fazie gazowej.

4.1.2. Ekstrakcja strumieniem gazu przepywajcym przez prbk

Odrbn nierwnowagow metod izolacji analitw jest technika wymywania i wychwytywania

(purge and trap, PT), ktra moe by wykonywana w ukadzie zamknitym i otwartym. Polega ona na
wymywaniu analitu przez gaz ekstrahujcy, przepuszczany przez warstw prbki ciekej a nastpnie
usuwaniu analitu z gazu. W czasie przechodzenia kolejnych objtoci gazu przez prbk nastpuje
zmniejszanie si w niej zawartoci analitu. Stenie analitu w prbce zmienia si wraz ze zmiennoci
objtoci gazu (w danej temperaturze) wg funkcji wykadniczej:

H VG
(28)
0 RT V L
c iL = c iL e
gdzie:
H - staa Henryego,
R staa gazowa,
 - stenie analitu i w prbce ciekej o objtoci  po przepuszczeniu przez ni objtoci
gazu  ,

 - pocztkowe stenie analitu w prbce.

W technice PT wymywanie i wychwytywanie analitw jest prowadzone w tym samym czasie, przy
otwartym obiegu gazu ekstrahujcego, ktrym najczciej jest hel. Schemat i zasad dziaania takiego
zestawu przedstawiono na rysunku 13. Prbk umieszcza si w specjalnym, szczelnym naczynku (1),
do ktrego doprowadzany jest gaz obojtny (2) przewodem (3), zakoczonym bekotk (4). Przepyw
gazu ekstrahujcego przez prbk i puapk wymuszany jest cinieniem gazu w butli (2). Ekstrahent
nie moe wprowadza zanieczyszcze do prbki, dlatego gaz przepuszczany jest przez filtr (5), dla
usunicia ewentualnych niepodanych substancji. Gaz, przepywajc przez prbk w postaci
rozproszonych pcherzykw, zabiera ze sob lotne substancje, ktre nastpnie s zatrzymywane
przez sorbent znajdujcy si w puapce (6). Objto badanej prbki zaley od stenia oznaczanych
w niej zwizkw chemicznych, zwykle wynosi kilka lub kilkanacie mL. Czas i objto
przepuszczanego gazu naley dostosowa do wartoci staej podziau analitu. Najczciej gaz
przepuszczany jest przez prbk przez kilka do kilkudziesiciu minut z prdkoci od 10 do 40

53
mL/min. Dla zwizkw lotnych, o duej wartoci staej podziau, wystarczajce stenie analitu w
fazie gazowej mona osign ju w temperaturze pokojowej. Dla zwizkw redniolotnych lub
trudnolotnych naley stosowa podwyszon temperatur ekstrakcji, by zwikszy ich lotno.
Zwizki polarne ulegaj solwatacji w roztworach prbek, co zmniejsza ich lotno (nastpuje
przesunicie rwnowagi w kierunku fazy ciekej). Na wydajno ekstrakcji ma rwnie wpyw sia
jonowa roztworu prbki. Im wiksza sia jonowa prbki, tym mniejsza rozpuszczalno w niej
skadnikw organicznych, std wysalanie prbki zwiksza wydajno ekstrakcji. Wydajno ekstrakcji
do fazy gazowej jest to stosunek iloci analitu, jaka przesza do fazy gazowej do iloci pocztkowej w
prbce, wyraony w % (patrz (1) i (2), rozdz. II.1):

0
c iL c iL
E= 100% (32)
0
c iL

W zestawie do ekstrakcji w ukadzie zamknitym gaz doprowadzany jest do prbki i puapki za

pomoc pompy. Oczyszczony z analitu gaz po wyjciu z puapki zawracany jest do ekstrakcji.

Filtr (5)
Przewody
Butla ze spronym
gazem
Wylot

Zoe sorbenta staego do

wychwytywania analitw (6)
Termostat (7)
Naczynko z prbk (1)
Bekotka

Rysunek 13. Schemat zestawu do ekstrakcji przez wymywanie i wychwytywanie (PT) w ukadzie
otwartym

W dynamicznych metodach ekstrahowane zwizki trzeba izolowa z fazy gazowej, poniewa znajduj
si w duej jej objtoci. Puapki powinny zapewnia ilociowe wychwycenie skadnikw oraz
ilociowe i atwe uwolnienie analitw. W zalenoci od waciwoci fizyko-chemicznych analitw,
wychwytywanie mona stosowa poprzez adsorpcj na sorbentach staych, absorpcj w roztworach
lub fazach ciekych osadzonych na noniku lub przez wymraanie.
Sorbenty stae powinny si charakteryzowa okrelon wytrzymaoci termiczn i powierzchni
waciw. Najczciej stosowanymi sorbentami staymi s sorbenty wglowe, takie jak: grafityzowana
sadza wglowa (Carbotrap B lub C), wglowe sita molekularne (Carboxen, Carbosieve S-II i S-III) oraz
polimery syntetyczne, jak politlenek 2,6-difenylo-p-fenylenowy znany pod nazw Tenax GC, Tenax TA
czy czony z grafitem Tenax GR. Stosowane s rwnie ele krzemionkowe i wgiel aktywny.
Najwiksz wytrzymao termiczn posiada wgiel aktywny - pow. 700C, najnisz el
krzemionkowy - 300C. Syntetyczne sorbenty wytrzymuj temperatur 400 C. Najwiksz

54
powierzchni waciw posiadaj: wgiel aktywny, Carbosieve S-III i S-II, Carboxen i el krzemionkowy
(od 300 do 1000 m2/g), mniejsz Tenax (18 m2/g) i Carbotrap C i B - odpowiednio 10 i 90 m2/g.
Wymienione sorbenty stae, poza elem krzemionkowym, maj charakter hydrofobowy. Zakres
zastosowania sorbentw staych uywanych w technice wymywania i wychwytywania przedstawiono
w tabeli 3.

Tabela 3. Sorbenty stae stosowane w technice wymywania i wychwytywania(PT) (na podstawie

Namienik J., Jamrgiewicz Z., red., Fizykochemiczne metody kontroli zanieczyszcze rodowiska,
Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, Warszawa, 1998)

L.p. Typ sorbentu Zastosowanie

1. Carbotrap B Wglowodory C4 C8
2. Carbotrap C Wglowodory od C4 do bifenyli
3. Carbosieve S-II Bardzo lotne zwizki organiczne
4. Carbosieve S- Bardzo lotne zwizki typu chlorometan, chlorek winylu
III
5. Carboxen Lotne zwizki organiczne
6. Tenax GC, Wglowodory alifatyczne od C6, wglowodory aromatyczne,
Tenax TA policykliczne, aldehydy, fenole, aminy aromatyczne,
nitrozwizki i in.
7. Tenax GR Waciwoci lepsze ni Tenax TA
8. Wgiel Bardzo lotne zwizki organiczne
aktywny
9. el Zwizki wysokowrzce
krzemionkowy

Puapka kriogeniczna (wymraajca) jest to niewielki odcinek kapilary ze spiekanej krzemionki, pusty
lub pokryty faz ciek, umieszczony w termostacie. Termostat mona schodzi do temperatury -
196C a nastpnie gwatownie ogrza do temperatury 300C z szybkoci 1200C/min.

Ekstrakty gazowe, ktre maj by przepuszczane przez puapki kriogeniczne nie mog zawiera
wody.

Dynamiczn form ekstrakcji do fazy gazowej jest mikroekstrakcja przez porowate wkno
polimerowe, ktra moe by realizowana w dwch wersjach, przedstawionych na rysunku 14a i b.
Pierwszy sposb polega na omywaniu prbk porowatego wkna, przez ktre pynie w
przeciwprdzie gaz ekstrahujcy, w drugim sposobie gaz ekstrahujcy omywa porowate wkno,
przez ktre przepywa prbka. Jak w kadej metodzie dynamicznej, analit musi by z fazy gazowej
izolowany.
Ekstrakcj do fazy gazowej stosuje si powszechnie do izolacji i oznaczania lotnych skadnikw
organicznych w prbkach o zoonej matrycy, mogcej interferowa z oznaczanymi zwizkami. Takimi

55
prbkami s: produkty spoywcze(owoce, mid, wino, moszcz) materia biologiczny (np. krew, pyny
ustrojowe, mleko ludzkie), materia rolinny (olejki eteryczne, zioa, roliny lecznicze), wody
naturalne, cieki, osady i gleba. Headspace stosuje si do izolacji pozostaoci rozpuszczalnikw w
rnych produktach, np. olejach, rodkach farmaceutycznych oraz monomerw rozpuszczonych w
polimerach.
Wylot Wylot
gazu prbki

Wlot Wlot
prbki gazu

a) b)

Wylot Wylot
prbki gazu

Wlot gazu Wlot prbki

Rysunek 14. Mikroekstrakcja do fazy gazowej przez porowate wkno

4.2. Ekstrakcja w ukadzie ciecz-ciecz

Proces przenoszenia substancji rozpuszczonej w jednej fazie ciekej do drugiej fazy ciekej,
niemieszajcej si z pierwsz, nazywa si ekstrakcj w ukadzie ciecz ciecz (ang. liquid liquid
extraction, LLE). Ruch materii przez granic faz opisuje regua faz Gibbsa:

f + s = + 2 (33)
gdzie:
f liczba faz,
s zmienno lub liczba stopni swobody,
- ilo skadnikw.
W ukadzie dwch niemieszajcych si cieczy oraz jednego skadnika, rozpuszczonego i ulegajcego
podziaowi miedzy nie, liczba stopni swobody wynosi:

s = + 2 f = 3+ 2 2= 3 (34)

56
W ekstrakcji, pod staym cinieniem i w staej temperaturze, pozostaje jeden stopie swobody
stenie skadnika, co oznacza, e stenie skadnika w jednej fazie ciekej odpowiada cile
okrelonemu jego steniu w drugiej fazie ciekej, niezalenie od cakowitej jego zawartoci.
Zaleno stenia substancji w jednej fazie od jej stenia w drugiej fazie, w stanie rwnowagi i w
staej temperaturze i cinieniu jest stay co ilociowo opisuje prawo podziau Nernsta definiujce
sta podziau K (por. rozdz. I.2.2, (26))
Jeli substancja ekstrahowana ulega rnym procesom chemicznym w jednej z faz, podzia substancji
ekstrahowanej midzy dwie fazy okrela wspczynnik ekstrakcji - D, uwzgldniajcy stenia
wszystkich form substancji wystpujcych w matrycy odbierajcej [(cA)] i w matrycy pierwotnej
[(cA)]:

D=

(c A )
(35)

(c A )

Znajomo wartoci staej podziau K czy wspczynnika ekstrakcji D substancji izolowanej lub jej
homologu, umoliwia ustalenie warunkw ekstrakcji, jak objto fazy ekstrahujcej oraz krotno
ekstrakcji, aby zapewni wystarczajc wydajno procesu.

Dla wartoci K>>1 wystarczajc jest jednostopniowa ekstrakcja, wielostopniow ekstrakcj

naley stosowa, jeli warto K jest znacznie mniejsza, gdy K jest rwne jednoci rozdzielenie
jest niemoliwe.

Zaleno midzy wydajnoci ekstrakcji a wspczynnikiem ekstrakcji przedstawia rwnanie:

v
%E = D 100 (36)
gdzie: v
v, v objtoci odpowiednio matrycy odbierajcej i matrycy pierwotnej.

Z rwnania wynika, e wydajno ekstrakcji jest tym wiksza, im wiksza jest warto wspczynnika
ekstrakcji D i wiksza warto stosunku v/v, czyli im wiksza objto matrycy odbierajcej.
Zwikszenie objtoci matrycy odbierajcej powoduje rozcieczenie analitu, co kci si z
podstawowym celem ekstrakcji, jakim jest zatanie, dlatego aby osign podan wydajno,
naley stosowa kilkakrotn ekstrakcj mniejszymi porcjami rozpuszczalnika. Zmiany stenia
substancji ekstrahowanej w dwch fazach, podczas osigania stanu rwnowagi w kolejnych
ekstrakcjach tak sam porcj rozpuszczalnika 12 , mona zapisa, korzystajc ze wspczynnika
ekstrakcji. Po pierwszej ekstrakcji wspczynnik ten wynosi:

D=
[ ( A) 0 ( A) ]/ v1 (37)
( A) 1 / v

Po przeksztaceniu, masa substancji pozostaa w matrycy pierwotnej (3456  wynosi:

57


v
( A) 1 = ( A) 0
Dv + v (38)

gdzie:
73458
3456 9/12
stenie substancji w matrycy odbierajcej po pierwszej ekstrakcji,
3458 - masa pocztkowa substancji w matrycy pierwotnej,
3456 /15 - stenie substancji pozostaej w matrycy pierwotnej po pierwszej ekstrakcji.

Jeli matryca pierwotna bdzie ekstrahowana kolejn porcj 12 matrycy odbierajcej, pozostanie w
niej masa 345: substancji ekstrahowanej:
2

( A) =
v v
( A) 1 = ( A) 0 (39)
2 Dv + v Dv + v

Po wielu (n) ekstrakcjach tak sam porcj matrycy odbierajcej ;<, w matrycy pierwotnej pozostanie
masa substancji ekstrahowanej 345= rwna:
n

( A) =
v
( A) 0 (40)
n Dv + v

Aby wyekstrahowa substancj ilociowo naley zastosowa n-krotn ekstrakcj, moliwie

maymi porcjami matrycy odbierajcej.

Powysze rwnanie jest spenione dla dwu niemieszajcych si cieczy, natomiast jeli ekstrahent
miesza si w niewielkim stopniu z roztworem prbki, zaleno ta jest przybliona. Warto
wspczynnika ekstrakcji substancji midzy dwie niemieszajce si ciecze mona oszacowa na
podstawie jej rozpuszczalnoci w tych cieczach. Naley rwnie podkreli, e powysze zalenoci
speniane s dla niskich ste.
Ekstrakcja ciecz ciecz jest procesem dwufazowym, w ktrym w celu przyspieszenia osignicia stanu
rwnowagi wymagane jest rozwinicie powierzchni zetknicia faz. Po osigniciu stanu rwnowagi, fazy
(warstwy cieczy) naley rozdzieli w moliwie krtkim czasie. Szybkie rozdzielanie si warstw uatwia
zastosowanie waciwego rozpuszczalnika do ekstrakcji, ktry poza zdolnoci rozpuszczania analitu, ma
odpowiedni gsto, lepko i napicie powierzchniowe. Inne waciwoci odpowiednio dobranego
rozpuszczalnika to: bardzo saba rozpuszczalno w matrycy pierwotnej, odpowiednia lotno, umoliwiajca
atwe odparowanie z ekstraktu bez strat analitw oraz dua czysto. Rozpuszczajc si w matrycy
pierwotnej, ekstrahent zwiksza w niej rozpuszczalno substancji wyodrbnianej, przez co zmniejsza si
warto staej podziau i wydajno ekstrakcji.
Zatony rozpuszczalnik moe by rdem zanieczyszcze prbki kocowej - minimalna obecno
substancji zanieczyszczajcej w rozpuszczalniku (a istnieje niewiele substancji nierozpuszczalnych w
rozpuszczalnikach organicznych na poziomie ppb) powoduje po jego zateniu (np. stukrotnym)
pojawienie si sygnau mogcego zdecydowanie zmieni interpretacj wynikw oznacze.

58
 Ekstrakcja w ukadzie ciecz-ciecz moe by stosowana w temperaturze pokojowej lub niszej,
dlatego nadaje si do izolacji substancji nietrwaych. Ze wzgldu na konieczno i sposb usuwania
rozpuszczalnika (odparowanie), ekstrakcj w ukadzie ciecz ciecz mona stosowa do izolacji
rednio- i trudnolotnych substancji.

4.2.1. Ekstrakcja zwizkw organicznych

Ekstrakcja w ukadzie ciecz ciecz jest najstarszym typem ekstrakcji i nadal jest stosowana, zwaszcza do
wyodrbniania zwizkw organicznych z prbek wodnych. Zwizki organiczne hydrofobowe, ktrych
czsteczki zbudowane s gwnie z acuchw czy piercieni wglowodorowych, (nasyconych,
nienasyconych, aromatycznych), rozpuszczaj si lepiej w rozpuszczalnikach o maej staej dielektrycznej
(niepolarnych). Zwizki organiczne hydrofilowe, zawierajce w swej budowie ugrupowania polarne takie jak
grupy hydroksylowe, aminowe, karboksylowe lepiej rozpuszczaj si w rozpuszczalnikach o duej staej
dielektrycznej (polarnych). W skrcie, podstaw doboru rozpuszczalnika do ekstrakcji okrela zasada
podobne rozpuszcza podobne. Jeli nie ma przesanek, jakiego rozpuszczalnika naley uy do ekstrakcji
(np. brak danych o rozpuszczalnoci analitu w rozpuszczalnikach matrycy pierwotnej i odbierajcej), wyboru
dokonuje si na podstawie wynikw kilku ekstrakcji wykonywanych na ma skal rnymi
rozpuszczalnikami. Do naczynia (np. probwki) wlewa si jednakowe, kilkumililitrowe, objtoci prbki i
testowanego rozpuszczalnika, po wytrzniciu i odstaniu warstw rozpuszczalnika przenosi na szkieko
zegarkowe i pozostawia do odparowania, by stwierdzi obecno substancji. W tabeli 4 podano waciwoci
fizyczne niektrych, czsto stosowanych do ekstrakcji, rozpuszczalnikw.
Do ekstrakcji stosuje si rwnie mieszaniny rozpuszczalnikw, ktrych waciwoci ekstrakcyjne mog by
lepsze ni dla kadego rozpuszczalnika osobno.
W przypadku bardzo zoonych prbek stosuje si ekstrakcj sekwencyjn, polegajc na traktowaniu
kolejno, tej samej prbki rozpuszczalnikami o coraz wikszej polarnoci. Mona uzyska wtedy rne
frakcje ekstraktu, z ktrych kada bdzie wzbogacona o inny analit lub grup analitw.
Gsto rozpuszczalnika ma due znaczenie na etapie rozwarstwiania cieczy, im wiksza rnica w
gstoci midzy rozpuszczalnikiem a prbk, tym szybsze i dokadniejsze rozdzielenie warstw.
Niestety w praktyce niejednokrotnie otrzymuje si ekstrakty mtne, co jest spowodowane
tworzeniem si emulsji na granicy faz. Emulsje tworz si atwo, gdy prbka ma odczyn zasadowy.
Niektre rozpuszczalniki, np. chloroform, atwo tworz emulsje z roztworami wodnymi.
Stosujc wielostopniow ekstrakcj w rozdzielaczu, korzystnie jest uywa rozpuszczalnika o wikszej
gstoci ni prbka. W taki przypadku ekstrakt bdzie tworzy doln warstw, ktr mona bezporednio
przela do zbiornika ekstraktu. Gdy do ekstrakcji uywany jest rozpuszczalnik o mniejszej gstoci ni
prbka, mona doda do niego takiego rozpuszczalnika, by ich mieszanina bya cisza od prbki, co
bardzo uatwia wykonywanie czynnoci przy wielostopniowej ekstrakcji. Mieszanin rozpuszczalnikw
stosuje si te by zwikszy waciwoci ekstrakcyjne, ktre mog by dla mieszaniny lepsze ni dla
kadego rozpuszczalnika oddzielnie.
Jeli prbka jest roztworem wodnym, dla uatwienia ekstrakcji mona zastosowa dodatek soli, np.
chlorku sodu, chlorku wapnia. Zwikszenie siy jonowej roztworu zmniejszy rozpuszczalno w nim
zwizku organicznego i uatwi jego ekstrakcj. Proces taki nazywa si wysalaniem. Wysalanie jest rwnie
korzystne w przypadku stosowania rozpuszczalnika czciowo mieszajcego si z wod, gdy zmniejsza

59
jego rozpuszczalno w wodzie. Dla zwizkw organicznych o wysokiej lotnoci, wzrost iloci soli w prbce
zwykle zwiksza wydajno ekstrakcji do rozpuszczalnika organicznego. Z kolei mniej lotne substancje
mog wykazywa optimum wydajnoci ekstrakcji przy okrelonej zawartoci soli w prbce. Ilo
dodawanej soli do prbki naley wyznaczy eksperymentalnie.

Tabela 4. Waciwoci fizyczne wybranych rozpuszczalnikw organicznych

Rozpuszczalnik Gsto Temperatura Wzgldna Rozpuszczalno w

[g ml-1] wrzenia[C] przenikalno wodzie [%]
dielektryczna

Aceton 0,891 56,5 20,7 nieograniczona

Alkohol n-pentylowy 0,814 138,1 13,8 2,2

Alkohol n-butylowy 0,813 117,7 17,1 7,9

Alkohol etylowy 0,789 78,3 24,3 nieograniczona

Alkohol metylowy 0,796 64,7 32,6 nieograniczona

Chloroform 1,498 61,3 4,8 1

Cykloheksan 0,783 80,7 2,0 0,01

Dichlorometan 1,326 40,2 8,93 1,6

Dioksan 1,034 101,3 2,2 nieograniczona

Disiarczek wgla 1,263 46,3 2,6 0,22

Eter dietylowy 0,719 34,5 4,3 7,4

Eter diizopropylowy 0,728 67,2 3,9 0,7

Heksan 0,660 69,0 1,9 0,02

Nitrobenzen 1,198 211 34,8

Octan etylu 0,901 77,2 6,0 8,6

Pirydyna 0,988 115,3 12,3 nieograniczona

Toluen 0,866 110,8 2,4 0,05

Trichloroetylen 1,456 87 3,4 0,1

Rozpuszczalniki, ktre maj nisk temperatur wrzenia s korzystne na etapie usuwania ich z
ekstraktu, ale nie w trakcie ekstrakcji. Lotne rozpuszczalniki atwo przechodz w stan pary, wdychane
lub w kontakcie ze skr stanowi zagroenie dla zdrowia czowieka. Z kolei palne rozpuszczalniki
stwarzaj niebezpieczestwo zaponu. Rozpuszczalnikami organicznymi mona te ekstrahowa
niektre elektrolity organiczne. Ekstrakcj umoliwia waciwy dobr pH prbki, co wykorzystuje si
np. do izolacji lub oczyszczania alkaloidw za pomoc chloroformu.

60
 Jest kilka sposobw, ktre mona zastosowa dla przyspieszenia rozwarstwienia cieczy:

delikatny ruch wirowy zawartoci rozdzielacza,

przesczenie przez cis warstw waty szklanej,
jeli ekstrakt jest mtny z powodu emulsji rozpuszczalnika z wod, mona go przesczy
przez suchy sczek; woda z emulsji zatrzyma si na sczku,
mona doda niewielk ilo innego rozpuszczalnika (w przypadku prbek wodnych, np.
alkoholu etylowego),
dodatek soli, np. chlorku czy siarczanu sodu, wglanu potasu,
w przypadku ekstrakcji roztworw alkalicznych mona zmniejszy pH przez dodanie
rozcieczonego kwasu, pod warunkiem, e roztwr pozostanie nadal alkaliczny a
skadniki prbki nie zmieni swoich waciwoci,
wstawienie na chwil naczynia z ekstraktem do ciepej wody,
pozostawienie do odstania.

4.2.2. Ekstrakcja zwizkw nieorganicznych

Ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi jest czsto stosowana w analizie nieorganicznej. Wykorzystuje si
j do oczyszczania odczynnikw do analiz ladowych, wydzielania substancji, usuwania skadnikw
przeszkadzajcych oraz zatania. Bardzo czsto jest stosowana w analizie jakociowej i ilociowej do
wydzielania lub rozdzielania maych i ladowych iloci kationw metali. Kationy metali w roztworach
wodnych wystpuj w postaci kompleksw z wod i takiej postaci nie bd si rozpuszczay w
rozpuszczalnikach organicznych. Aby umoliwi przejcie kationu do warstwy organicznej i uzyska
selektywno rozdzielania, naley zastosowa odpowiedni odczynnik, ktry zastpi czsteczki wody w
kompleksie kationu innym ligandem i wyeliminuje adunek elektryczny.
Wybr sposobu ekstrakcji pierwiastka lub zwizku zaley od tego, w jakiej postaci ma lub moe by
ekstrahowany.

Dla zwizkw niejonowych, stosuje si ekstrakcj niepolarnymi rozpuszczalnikami

organicznymi. W ten sposb mona ekstrahowa np. AsCl3 czy HgCl2 benzenem, toluenem czy
chloroformem i jest to ekstrakcja niejonowych czsteczek kowalencyjnych.

4.2.2.1. Ekstrakcja kompleksw chelatowych

Innym sposobem wyodrbniania kationw jest ekstrakcja kompleksw chelatowych. Niektre

ligandy tworz z kationem metalu struktur piercieniow, a uzyskane poczenie nazywa si
kompleksem chelatowym (chelatem) i jest czsto wykorzystywane w analizie chemicznej, poniewa
jest znacznie trwalsze od pocze kompleksw prostych. Najczciej stosowanymi zwizkami
chelatujcymi s: diketony, dioksymy, ditiokarbaminiany, 8-hydroksychinolina, kwasy alkilo- i
arylofosforowe, kwasy alkilo- i arylotiofosforowe. Kompleksy chelatowe trudno rozpuszczaj si w
wodzie, natomiast rozpuszczaj si w organicznych rozpuszczalnikach niepolarnych. Ekstrakcj
przeprowadza si roztworem wybranego zwizku chelatujcego w rozpuszczalniku organicznym. W
czasie ekstrakcji zachodzi reakcja:

61
 >?@ % @AB8 C >?B @ 8 % @A 
gdzie:
MeF - jon metalu,
HA - odczynnik kompleksujcy w fazie organicznej,
MeAF  - kompleks w fazie organicznej.

Wydajno ekstrakcji zaley od stenia odczynnika kompleksujcego w fazie organicznej i stenia

jonw wodorowych w fazie wodnej. Im wysze pH fazy wodnej, tym wydajno jest wysza, a
zaleno ta jest rna dla rnych wartociowoci kationu. Wydajno ekstrakcji zaley od
waciwoci uytego odczynnika chelatujcego, czyli od waciwoci kompleksu (trwao czy
rozpuszczalno w rozpuszczalniku organicznym) i wzrasta wraz ze wzrostem jego stenia w fazie
organicznej. Wybr rozpuszczalnika organicznego zaley od waciwoci chelatu. Jeli kompleks ma
wolne miejsca koordynacyjne, zostaj one obsadzone czsteczkami wody, w takim przypadku wiksz
wydajno ekstrakcji uzyska si stosujc bardziej polarny rozpuszczalnik. Ekstrakcj kationw w
postaci chelatw prowadzi si w temperaturze pokojowej, a trwao kompleksu zmniejsza si ze ze
wzrostem temperatury.

4.2.2.2. Ekstrakcja jonw metali w postaci kompleksw jonowo-asocjacyjnych

W stonych roztworach elektrolitw jony maj mniejszy dostp do czsteczek wody gdy warstwa
hydratacyjna poszczeglnego kationu zostaje zmniejszona. Mog pojawi si wic oddziaywania
bezporednie midzy jonami. W wyniku elektrostatycznego oddziaywania przeciwnie naadowanych jonw
tworz si asocjaty pary lub tryplety jonw, zachowujce si jak pojedynczy jon. Kompleksy jonowo-
asocjacyjne powstaj zwaszcza wtedy, gdy przynajmniej jeden z jonw ma du mas. Na tworzenie si
asocjatw ma take wpyw uyty rozpuszczalnik organiczny, ktry czciowo rozpuszczajc si w wodzie,
ogranicza dostp jonw do jej czsteczek.
Ekstrakcj jonw metali w postaci kompleksw jonowo-asocjacyjnych dzieli si na kilka grup, ze wzgldu na
rodzaj stosowanego odczynnika kompleksujcego. Jedn z grup zwizkw tworzcych asocjaty z jonami
metali wielowartociowych s halogenkowe kwasy: chlorowodorowy, bromowodorowy, jodowodorowy i
tiocyjanowodorowy. Kompleks powstaje poprzez solwatacj protonu czsteczkami rozpuszczalnika.
Schemat ekstrakcji jonw metalu trjwartociowego eterem dietylowym w obecnoci duych iloci kwasu
chlorowodorowego przedstawiono na rysunku 15.
Inn grup pozwalajc ekstrahowa jony metali oraz kwasy organiczne i nieorganiczne s aminy o
duych masach czsteczkowych, np. tributyloamina (TBA), tri-n-oktyloamina (TOA) czy metylo-di-n-
oktyloamina (MDOA). Ich roztwory w benzenie, ksylenie, chloroformie czy alkoholu amylowym
umoliwiaj ekstrakcj z kwasowych roztworw jonw metali, kwasw (np. HNO3, HClO4) oraz
heteropolikwasw (np. kwasu molibdenokrzemowego

62
 ETAP I (powstawanie uwodnionego anionu)

>?A: TV 0
U % WXY Z 7[?A: T: XYW 9
0 % WA T
:

ETAP II (wymiana czsteczek wody, solwatujcych anion i kation

wodorowy, na czsteczki eteru dietylowego)

7[?A: T: XYW 9 0 % :\ : T Z 7[?\ : T: XYW 9 0 % :A: T

AV T % :\ : T Z \ : TA  % A: T

ETAP III (tworzenie i polimeryzacja asocjatu)

\ : TA % 7[?\ : T: XYW 9 0 Z ]7\ : TA9 7[?\ :T: XYW 90^

xn

]7\ : TA9 7[?\ : T: XYW 90^@

Rysunek 15. Schemat ekstrakcji jonw metalu trjwartociowego eterem dietylowym w obecnoci
duych iloci kwasu chlorowodorowego

Azotany wielowartociowych metali mona ekstrahowa ze rodowiska kwanego jako asocjaty z eterem
dietylowym, ketonem metylowo-izobutylowym, fosforanem tri-n-butylowym (TBP), fosforanem tri-n-
oktyloaminy (TOPO) i in. w obecnoci jonw azotanowych w duym steniu, pochodzcych od takich soli,
jak: Al(NO3)3, Ca(NO3)2 czy NH4NO3. Asocjaty te, jak np. Ce(NO3)4 4TBP czy Zr(NO3)4 2TOPO, mona
ekstrahowa rozpuszczalnikami organicznymi. Due kationy organiczne, jak jon tetrafenyloarsoniowy
[As(C6H5)4]+ czy jon tetrafenylofosfoniowy [P(C6H5)4]+ nie wymagaj solwatacji aby utworzy asocjaty z
anionami (np. z SCN 0 , FeSCN0 0
P , SbClS . Asocjaty te ekstrahuje si niepolarnymi rozpuszczalnikami.
W tabeli 5 podano przykady ekstrakcji jonw metali za pomoc odczynnikw kompleksujcych.
Podstawowym celem analizy specjacyjnej jest okrelenie toksycznego i ekotoksycznego dziaania
poszczeglnych pierwiastkw. Sposb oddziaywania pierwiastkw na wod, gleb, osady oraz na
ludzi, zwierzta i roliny jest bardzo zaleny od ich formy chemicznej. Dziaanie toksyczne np. metali
jest silniej zwizane z ich form chemiczn ni z cakowitym steniem. Na bioprzyswajalno rnych
form pierwiastkw wpywa rwnie ich rozmieszczenie w poszczeglnych elementach rodowiska
naturalnego. Analiz specjacyjn wykonuje si w kontroli produktw ywnociowych, badaniu lekw i
innych produktw farmaceutycznych, w kontroli procesw technologicznych, kontroli stanowisk
pracy i in. Badania specjacji s wykonywane rwnie dla poznania penych cykli biogeochemicznych
poszczeglnych pierwiastkw.

63
 Tabela 5. Zastosowanie odczynnikw kompleksujcych do ekstrakcji jonw niektrych pierwiastkw

Pierwiastek Odczynnik Rozpuszczalnik Warunki Uwagi

kompleksujcy ekstrakcji
Nikiel Dimetyloglioksym Chloroform Zasadowe lub Oddziela si jony niklu od
obojtne jonw miedzi, elaza,
kobaltu, chromu,
manganu i in.
elazo(III) Kwas solny Eter dietylowy, Kwas solny Usuwanie elaza
wysze ketony, -1 przeszkadzajcego w
6 mol L
etery i estry oznaczaniu innych
pierwiastkw
Kobalt Izotiocyjanian Keton metylowo- Sabo kwane Oddziela si jony kobaltu
izobutylowy od jonw elaza(III),
miedzi(II) i innych
Kobalt Tri-n-oktyloamina Tetrachlorek Kwas solny 1:1 Do oznaczania domieszek
wgla (tylko do kobaltu w niklu
rozcieczenia)
Krzem Molibdenian(VI) amonu Alkohol Kwane Przeszkadzaj fosfor(V),
izopentylowy arsen(V) i german(IV)
Uran(VI) Kompleks azotanowy Toluen (tylko do Kwas azotowy Przy wyszej kwasowoci
sol watowany tri-n- rozcieczenia) 0,1-1 mol L-1 ekstrahuj si jony
butylofosoranem oraz due ceru(IV), toru i cyrkonu
stenie
azotanu(V)
Rne 8-Hydroksychinolina, Chloroform Zmienne pH Stosowane do analizy
metale dietyloditiokarbaminian ladowej wody
i ditizon

W oznaczaniu cakowitej zawartoci metali skadniki prbki s przewanie niszczone, a mierzone s

tylko oznaczane pierwiastki, natomiast analiza specjacyjna nastrcza znacznie wicej trudnoci.
Pierwszym problemem jest stenie metali. Ju cakowite bywa czsto bliskie progu detekcji, a
analiza specjacyjna pwoduje dodatkowe jego zmniejszane poprzez podzia na frakcje. Poza tym
niektre formy pierwiastkw pozostaj w rwnowadze z innymi, obecnymi w prbce, dlatego
warunki ekstrakcji musz by takie, aby nie naruszy oglnej rwnowagi lub naruszy j przynajmniej
w nieznacznym stopniu. W zalenoci od celu przeprowadzania, metody analizy specjacyjnej s
dzielone w rny sposb. Wg najbardziej podstawowego podziau, specjacj dzieli si na
funkcjonaln, uytkow lub chemiczn.
Analiza specjacyjna funkcjonalna suy do oznaczania analitw wg roli, jak peni w elemencie
rodowiska, z ktrego zostay pobrane. Przykadem moe by oznaczanie rtci, ktra moe by
pobierana przez roliny lub elaza, ktre moe by przyswajane z farmaceutykw.

64
Analiza specjacyjna uytkowa (operacyjna) okrela rodzaj analitw ekstrahowanych dana metod,
np. metale ekstrahowane z gleby buforem octanowym lub ow obecny w pyle o rednicy niszej ni
10 m, frakcje rozpuszczalne lub nierozpuszczalne i in.
Analiza specjacyjna chemiczna suy do oznaczania poszczeglnych analitw lub grup analitw, np.
stopie utlenienia chromu wystpujcego w danej prbce lub zawarto monometylo- lub
dimetylopochodnych. W analizie specjacyjnej chemicznej wyrnia si nastpujce typy:

analiza specjacyjna przesiewowa, w celu wykrycia i oznaczenia tylko jednej formy analitu,
analiza specjacyjna grupowa,w celu oznaczenia okrelonej grupy zwizkw w prbce,
analiza specjacyjna dystrybucyjna (dotyczy gwnie prbek biologicznych), w celu oznaczenia
zawartoci analitu w poszczeglnych czciach badanego obiektu (roliny, tkankach
zwierzcych),
analiza specjacyjna indywidualna (najtrudniejsza), w celu rozrnienia i oznaczenia wszystkich
indywiduw chemicznych, zawierajcych w swoim skadzie dany pierwiastek.

W analizie specjacyjnej wykorzystuje si wszystkie dostpne techniki rozdzielania, w tym techniki

ekstrakcyjne. Do izolacji rnych form pierwiastkw stosuje si ekstrakcj chemiczn, polegajc na
traktowaniu prbki odczynnikiem lub odczynnikami symulujcymi warunki rodowiskowe naturalne
lub zmienione antropogenicznie Ekstrakcja moe by jednoetapowa lub wieloetapowa.

Ekstrakcj jednoetapow przeprowadza si odczynnikiem, ktry podobnie jak w naturze,

umoliwia przechodzenie metali do gleby, wd czy rolin. S to najczciej roztwory o
odczynie obojtnym, o duej sile jonowej lub kompleksujce, powodujce uwalnianie
zaadsorbowanych skadnikw:

niezbuforowane roztwory soli (CaCl2, NaNO3, NH4NO3, BaCl2),

roztwory buforowe (NH4OAc/AcOH),
roztwory zwizkw kompleksujcych (kwas etylenodiaminotetraoctowy EDTA, kwas
dietylenotriaminopentaoctowy DTPA, EDTA-AcOH/NH4OAc, DTPA + trietanoloamina TEA).

Ekstrakcja wieloetapowa polega na kolejnych ekstrakcjach roztworami o wzrastajcej sile ugowania i

moe by prowadzona rwnolegle oraz sekwencyjnie. Ekstrakcje rwnolege prowadzi si, aby
wyeliminowa wpyw innych odczynnikw.

Ekstrakcja sekwencyjna polega na roztwarzaniu i ugowaniu tej samej prbki kolejno rnymi
odczynnikami, ktrymi najczciej s, stosowane w kolejnoci:
niezbuforowane roztwory soli,
roztwory buforowe lub roztwory sabych kwasw,
roztwory zwizkw redukujcych,
roztwory zwizkw utleniajcych,
mocne kwasy.

65
Ekstrakcje wieloetapowe przeprowadzane s wg rnorodnych procedur i z zastosowaniem rnych
odczynnikw. Najczciej, za podstawow metod przyjmuje si procedur opracowan w 1979 r.
przez A. Tessiera, P. Campbella i M. Bisona, ktra umoliwia oznaczanie piciu frakcji. Schemat tej
ekstrakcji przedstawiono na rysunku 16.

1 mol/dm3 MgCl2, pH Prbka

7,0 lub 1 mol/dm3
NaOAc, pH 8,2
1 mol/dm3 NaOAc, pH
Frakcja jonowymienna,
metale zaadsorbowane na
powierzchni cia staych
Pozostao

0,04 mol/dm3 Frakcja wglanowa, metale

NH2OHHCl/25%AcOH
lub0,3 mol/dm3 Na2S2O4/
0,175 mol/dm3 cytrynian
trisodu/ 0,025 mol/dm3
kwas cytrynowy
a)0,02 mol/dm3
HNO3+30%H2O2pH 2
b)30%H2O2pH 2 (HNO3)
c)3,2 mol/dm3
NH4AcOH /20%HNO3
HF + HClO4
zwizane z wglanami
Pozostao
Frakcja tlenkowa, metale
zwizane z uwodnionymi
tlenkami elaza i manganu
Pozostao
Frakcja organiczna i
siarczkowa, metale
zwizane lub
zaadsorbowane na
Pozostao powierzchni materii
Frakcja pozostaa, metale
trwale zwizane z
mineraami, wbudowane w
sie krystaliczn

Rysunek 16. Schemat ekstrakcji sekwencyjnej wg A. Tessiera i wsp.

Dla umoliwienia porwnywania wynikw w Krajach Unii Europejskiej w ramach Programu Pomiarw
i Testowania (Standard Measurement and Testing Programme, SM&T) przyjto wsplne procedury
ekstrakcji metali cikich z gleb mineralnych, zarwno dla metody jednoetapowej jak i sekwencyjnej.
Do izolacji Cd, Pb, Cr, Ni, Cu, i Zn zatwierdzono 0,43 M kwas octowy i 0,005 M EDTA. Zatwierdzone
przez SM&T warunki ekstrakcji sekwencyjnej przedstawiono w tabeli 6.

66
Tabela 6. Schemat procedury analizy sekwencyjnej wg europejskiego programu standaryzacji SM&T

Etap Frakcja metali (ladw) Skad wodnego roztworu ekstrahujcego c[mol L-1]
1 Jonowymienna i wglanowa CH3COOH (0,11 )
2 Tlenkowa NH2OHHCl (0,1) przy pH 2 (HNO3)
3 Organiczna i siarczkowa H2O2 (8,8) przy pH 2(HNO3); CH3COONH4 (1.0), pH 2

4.2.3. Klasyczna technika ekstrakcji ciecz ciecz

Najprostszym sposobem ekstrakcji ciecz ciecz jest ekstrakcja w rozdzielaczu zwana periodyczn.
Prbk ciek umieszcza si w rozdzielaczu (rysunek 17a), dodaje rozpuszczalnika ekstrahujcego i
wytrzsa rcznie lub mechanicznie. Nastpnie pozostawia do rozdzielenia warstw. Ekstrakcj
powtarza si wielokrotnie a poczone ekstrakty przemywa czyst ciecz, w ktrej bya rozpuszczona
prbka. W przypadku prbek wodnych, ekstrakty przemywa si wod lub roztworem wodnym
zawierajcym odczynniki, jeli byy one dodane do prbki przed ekstrakcj. Odmyty z domieszek
ekstrakt naley wysuszy rodkiem suszcym, np. bezwodnym siarczanem(VI) sodu i odparowa.

chodnica
wodna

naczynie
ekstrakcyjne

rozpuszczalnik prbka

ekstrakt ekstrakt
bekotka

prbka rozpuszczalnik
grzanie

grzanie

a) b) c)

Rysunek 17. Rozdzielacz gruszkowy (a) i zestawy do ekstrakcji cigej (b i c)

4.2.4. Ekstrakcja ciga

Nie zawsze mona dobra rozpuszczalnik, dla ktrego staa podziau ekstrahowanej substancji bdzie
miaa du warto. W takich przypadkach, by ograniczy iloci zuywanego do ekstrakcji
rozpuszczalnika, stosuje si ekstrakcj cig (ang. liquid-liquid extraction, CLLE). Budowa aparatw

67
do ekstrakcji cigej ciecz ciecz prbek wodnych zaley od tego, czy rozpuszczalnik jest lejszy czy
ciszy od wody. Budow ich przedstawiono na rysunkach 17b i 17c. Ekstrakcja prowadzona jest
cigle wie porcj rozpuszczalnika. Na rys. 17b przedstawiono schemat ekstrakcji rozpuszczalnikiem
lejszym od wody. Rozpuszczalnik spywa z chodnicy rurk na dno i przez bekotk zatopion na
kocu rurki przenosi si w postaci drobnych kropelek przez prbk, ekstrahujc j. Bekotka
umoliwia rozwiniecie powierzchni styku faz i zwikszenie wydajnoci ekstrakcji. Ekstrakt zbiera si
nad wod, nastpnie przelewa rurk boczn do odbieralnika ogrzewanego, skd rozpuszczalnik
odparowuje i skrapla si w chodnicy a w odbieralniku zagszcza si ekstrakt. Na rysunku 17c
przedstawiono schemat ekstrakcji rozpuszczalnikiem ciszym od wody. Ekstrakcja przebiega
podobnie, a substancja ekstrahowana gromadzi si w odbieralniku.

Poniej podano kilka warunkw ekstrakcji, uatwiajcych jej wykonanie:

rozdzielacz powinien mie szczelne zamknicia, szlifw nie mona smarowa smarami,
poniewa rozpuszczaj si w wikszoci rozpuszczalnikw,
rozdzielacze w ksztacie gruszki (rysunek 17a) uatwiaj rozdzielenie warstw,
pojemno rozdzielacza powinna by dwukrotnie wiksza od objtoci ekstrahowanej
prbki,
ilo rozpuszczalnika ekstrahujcego nie powinna by zbyt maa, zwykle stosuje si ilo
stanowic ok. 1/3 objtoci roztworu prbki,
na pocztku ekstrakcji wytrzsanie naley przeprowadza bardzo delikatnie, by nie
doprowadzi do gwatownego wzrostu cinienia i czsto otwiera kran dla wyrwnania
cinienia,
po ustaleniu si cinienia w rozdzielaczu, wytrzsanie mona wykonywa energicznie przez
kilka minut,
gdy rozpuszczalnik jest lejszy od roztworu prbki, ekstrakt stanowi grn warstw; w takim
ukadzie, by unikn zanieczyszczenia ekstraktu roztworem prbki, doln warstw spuszcza
si przez kran a ekstrakt (grna warstwa) wylewa si z rozdzielacza grnym otworem,
najczciej wykonuje si trzykrotn ekstrakcj, dla sprawdzenia czy substancja zostaa
wyekstrahowana, pobiera si ma objto ostatniej porcji ekstraktu, odparowuje
rozpuszczalnik i sprawdza ilo suchej pozostaoci,
ekstrahowanej prbki nie wylewa si dopki nie zostanie wyizolowany czysty produkt
(mona wtedy naprawi ewentualne bdy).

Do rozdzielania mieszaniny substancji o zblionych wartociach staych podziau stosuje si ekstrakcj

przeciwprdow, ktr przeprowadza si w specjalnych aparatach, np. aparacie Craiga. Aparat taki
skada si z wielu elementw (np. 120). Do jednego lub kilku elementw wprowadza si prbk,
pozostae napenia faz ekstrahujc. Na ekstrakcj skada si kilka etapw:

68
 wytrzsanie (wszystkie elementy poruszaj si i w elementach z prbk nastpuje
wymieszanie faz),
stan spoczynku, w ktrym nastpuje rozdzielenie si warstw,
etap przenoszenia fazy; aparat jest tak zbudowany, e umoliwia przelewanie si fazy grnej
do kolejnego elementu (daje to efekt poruszania si faz w przeciwprdzie),
etapy jednostkowe przeprowadzane s wielokrotnie.
Czas mieszania i odstawania oraz ilo pojedynczych procesw ustala si dowiadczalnie w zalenoci
od skadu prbki i waciwoci ekstrahenta. Ekstrakcja przeciwprdowa umoliwia rozdzielanie
skomplikowanych mieszanin nawet, gdy rnice w zawartoci poszczeglnych skadnikw s due.
Pozwala take na wydzielanie skadnikw w bardzo czystym stanie i okrelanie ich stosunku
ilociowego w mieszaninie. Ekstrakcja przeciwprdowa stosowana jest do celw analitycznych i
preparatywnych.

4.2.5. Mikroekstrakcja
Techniki mikroekstrakcji w ukadzie ciecz ciecz (ang. liquid-liquid microextraction, LLME)
charakteryzuj si maym zuyciem rozpuszczalnikw, co jest korzystne dla rodowiska naturalnego i
zdrowia. Stosowanie niewielkich iloci rozpuszczalnikw ogranicza te zdecydowanie liczb operacji
wykonywanych podczas ekstrakcji.

4.2.5.1 Mikroekstrakcja do rozpuszczalnika

Mikroekstrakcja do rozpuszczalnika (ang. microscale solvent extraction, MSE) zostaa zastosowana

we wstrzykowej analizie przepywowej. Metoda ta polega na wstrzykiwaniu pynnej prbki do
strumienia cieczy nonej, przepywajcej przez rurk o maej, staej rednicy, w ktrej znajduje si
odczynnik reagujcy z analitem. Rozmiary rurki i prdko przepywu cieczy nonej jest dostosowana
do szybkoci zachodzenia reakcji chemicznej (ta cz rurki, w ktrej zachodzi reakcja jest w postaci
spirali). Wstrzyknita prbka tworzy w strumieniu nonym odpowiedni stref przemieszczajc si do
detetektora. Jeli do strumienia cieczy nonej, w miejscu, w ktrym prbka jest ju spochodniona,
doprowadzi si rozpuszczalnik, cao wymiesza si i nastpi ekstrakcja analitu do fazy organicznej (w spirali
ekstrakcyjnej). Mieszanina wpywa nastpnie do separatora grawitacyjnego lub membranowego, gdzie faza
organiczna jest oddzielona i kierowana do detektora. W metodzie tej zuycie rozpuszczalnikw jest
zdecydowanie mniejsze w porwnaniu do iloci zuywanych w metodach tradycyjnych (np. 1 mL na 1L
prbki), poza tym ekstrakcja zachodzi w ukadzie zamknitym i rozpuszczalnik nie odparowuje do atmosfery.

4.2.5.2. Mikroekstrakcja do kropli

Mikroekstrakcja do kropli (ang. single-drop microextraction, SDME) jest kolejn technik

zmniejszajc w sposb radykalny zuycie rozpuszczalnikw. Ekstrakcja nastpuje przez
rozpuszczanie si skadnikw prbki w kropli cieczy zawieszonej na kocu igy strzykawki i zanurzonej
w prbce. Warunkiem przeprowadzenia ekstrakcji jest wiksza rozpuszczalno analitu w
rozpuszczalniku ekstrahujcym ni w prbce.
W mikroekstrakcji do kropli wystpuje ukad trjfazowy, gdzie analit ulega podziaowi midzy prbk
a faz gazow nad prbk oraz miedzy prbk a ciek faz organiczn, ktr jest kropla. Po
osigniciu stanu rwnowagi, ilo wyekstrahowanego do kropli analitu (m) opisuje rwnanie:

69
 K odwVd C 0V s
m= (42)
K odwVd + K hsVh + Vs
gdzie:
Kodw - staa podziau analitu midzy faz organiczn (kropl) a faz ciek prbki,
Khs - staa podziau analitu midzy faz gazow nad powierzchni prbki a faz ciek prbki,
Co - steniem pocztkowym analitu w prbce,
Vs, Vh i Vd - objtoci odpowiednio prbki, fazy gazowej nad prbk i kropli.

Ilo wyekstrahowanego analitu nie zaley od lokalizacji kropli w ukadzie ekstrakcyjnym

(bezporednio w roztworze prbki czy w fazie gazowej nadpowierzchniowej nad prbk) pod
warunkiem, e objtoci prbki, kropli i fazy gazowej nie zmieniaj si.
Metod SDME mona stosowa do prbek ciekych i gazowych. W przypadku prbek ciekych
rozpuszczalnik ekstrahujcy nie moe miesza si z prbk lub miesza si w bardzo ograniczonym
stosunku. Zestawy do mikroekstrakcji do kropli z prbek ciekych pokazano na rysunku 18. Jeli kropla
rozpuszczalnika jest bezporednio zanurzona w prbce (ang. direct immersion single drop microextraction,
DI-SDME), (rysunek 18a), ekstrakcja nastpuje przez podzia analitu midzy dwie cieke fazy. W drugim
przypadku (rysunek 18b), lotne anality z prbki ciekej znajdujce si w fazie gazowej rozpuszczaj si w
kropli rozpuszczalnika umieszczonej nad powierzchni prbki (ang. headspace single drop
microextraction, HS-SDME). Po odpowiednim czasie ekstrakcji, kropla rozpuszczalnika ekstrahujcego
wcigana jest do strzykawki i przenoszona np. do dozownika chromatografu. Do ekstrakcji mona
stosowa pojedynczy rozpuszczalnik lub mieszanin rozpuszczalnikw w celu uzyskania wikszej
selektywnoci. Do ekstrakcji jonw metali stosuje si odczynniki chelatujce, rozpuszczone w
organicznym rozpuszczalniku.

mikrostrzykawka

kropla ekstrahujcej
b
cieczy

prbka

a) b)

Rysunek 18. Mikroekstrakcji do kropli, a kropla zanurzona bezporednio w prbce(DI-SDME), b-

kropla w fazie gazowej nad powierzchni prbki (HS-SDME)

70
W ekstrakcji do kropli znalazy rwnie zastosowanie ciecze jonowe (por roz II. 4.2.6). Przy wyborze
rozpuszczalnika do ekstrakcji naley rwnie uwzgldni rodzaj techniki stosowanej do oznaczania
analitu. W przypadku stosowania chromatografii gazowej w kocowym oznaczaniu, rozpuszczalnik do
ekstrakcji musi by tak dobrany, by jego sygna chromatograficzny nie nakada si na sygna analitu.

Wydajno estrakcji zaley gwnie od wartoci staej podziau K analitu midzy prbk a
ekstrahentem oraz od warunkw ekstrakcji, takich jak: czas ekstrakcji, intensywno mieszania
prbki, wielko kropli oraz pH prbki, zwaszcza, gdy ekstrahentem jest odczynnik chelatujcy.

Wyduanie czasu ekstrakcji zwiksza jej wydajno, ale tylko do pewnego momentu. Szybki wzrost stenia
analitu w kropli obserwuje si w pocztkowej fazie ekstrakcji, dalsze wyduanie czasu daje minimalne
przyrosty stenia. Poza tym dugi czas ekstrakcji moe powodowa niestabilno kropli (rozpuszczanie lub
zerwanie). Zwykle ekstrakcja trwa kilka do kilkanacie minut. Poniewa powierzchnia styku dwch faz jest
bardzo maa, prbk naley miesza mieszadekiem magnetycznym, umoliwiajc kontakt kropli z kolejn
warstw prbki. Mieszanie prbki skraca czas i zwiksza wydajno ekstrakcji. Zwikszanie szybkoci
mieszania daje pocztkowo duy wzrost wydajnoci, po czym dalszy wzrost szybkoci mieszania nie daje ju
wyranej poprawy, za to staje si niekorzystne dla stabilnoci kropli i powtarzalnoci oznaczania. Objto
kropli zaley od gstoci i napicia powierzchniowego rozpuszczalnika ekstrahujcego oraz rozmiarw igy i
moe wynosi 110 L, najczciej jednak nie przekracza objtoci 5 L. Wielko kropli rwnie wpywa na
wydajno ekstrakcji. Optymalne warunki ekstrakcji naley dobra eksperymentalnie dla kadego
oznaczenia.
Opisana powyej metoda ekstrakcji do kropli jest wersj statyczn. W wersji dynamicznej kropl
stanowi niewielki sup cieczy ekstrahujcej, znajdujcy si w czasie ekstrakcji przez cay czas w
mikrostrzykawce. Prbk wprowadza si do mikrostrzykawki i pozostawia na kilka sekund, w tym
czasie anality z prbki rozpuszczaj si w supie rozpuszczalnika i jego warstwie przylegajcej do
wewntrznej ciany korpusu strzykawki. Tak operacj powtarza si wielokrotnie, uzyskujc kontakt
ekstrahenta z kolejnymi, wieymi porcjami prbki. Wzbogacony w analit rozpuszczalnik ze
strzykawki wykorzystuje si bezporednio do oznaczenia stosowan technik analityczn.
W technice SDME zastosowanie powszechnie stosowanych sposobw wspomagania ekstrakcji jest
ograniczone trwaoci kropli. Wspomaganie energi ultradwikw czy intensywne mieszanie
niszczy kropl. Przy ekstrakcji zwizkw organicznych z roztworw wodnych skuteczne jest wysalanie.
Metod mikroekstrakcji do kropli po raz pierwszy zastosowano w 1996 roku do ekstrakcji z prbek
wodnych rozpuszczalnikami niemieszajcymi si z wod. Przykady zastosowania SDME podano w
tabeli 7.
Najczciej stosowanymi rozpuszczalnikami do ekstrakcji prbek wodnych s proste wglowodory,
oktanol oraz alkohol benzylowy. Zastosowanie do ekstrakcji znalazy rwnie ciecze jonowe, np. do
ekstrakcji podstawionych fenoli wykorzystano krople heksafluorofosforanu 1-oktylo-3-
metyloimidazoliowego. Jony metali mona ekstrahowa rozpuszczalnikami organicznymi z roztworw
wodnych, stosujc odczynniki kompleksujce. Do wydzielania jonw oowiu z prbek biologicznych
(wosw ludzkich, lici herbaty, mki ryowej) zastosowano odczynnik chelatujcy - 1-fenylo-3-

71
metylo-4-benzoilo-5-pirazolon (PMBP), rozpuszczony w benzenie, nastpnie kropl z chelatem
oowiu umieszczano w kuwecie grafitowej i oznaczano metod elektrotermicznej atomowej
spektroskopii absorpcyjnej (ET-ASA). Kompleksowanie z O,O-dietyloditiofosforanem oraz technik
SDME, z zastosowaniem chloroformu, wykorzystano do oznaczania jonw oowiu metod ET-ASA.

Tabela 7. Niektre przykady zastosowania mikroekstrakcji do kropli

Analit Prbka Rozpuszczalnik Sposb

ekstrahujcy ekstrakcji
Lotne zwizki organiczne
Chloroorganiczne pestycydy Woda Heksan DI SDME

Chlorobenzeny Woda Izooktan DI SDME

Fosforoorganiczne pestycydy Woda, soki Toluen DI SDME
owocowe
Fosforoorganiczne insektycydy Woda Toluen DI SDME
Herbicydy sulfonamidowe Ekstrakty wodne z Octan etylu, DI SDME
gleby chlorek metylenu
BTEX Woda 1-Oktanol, HS SDME
n-heksadekan
Zwizki aktywne biologicznie Ekstrakty wodne z 1-Oktanol HS-SDME
rolin
BTEX Zuyty olej n-Heksadekan HS SDME
silnikowy
Zwizki terpenowe aktywne Olejki eteryczne p-Ksylen HS-SDME
biologicznie
Pozostaoci rozpuszczalnikw Olej rolinny Alkohol benzylowy HS-SDME

Przeprowadzanie analitu w odpowiedni do analizy kocowej pochodn moe si odbywa podczas

jednej operacji, rwnoczenie z ekstrakcj i zataniem, jeli kropla rozpuszczalnika ekstrahujcego
bdzie zawiera odpowiedni reagent. Ten sposb mona wykorzysta w technice HS-SDME, w ktrej
kropla ekstrahenta umieszczona jest w fazie gazowej nad powierzchni prbki.

4.2.5.3. Mikroekstrakcja poprzez membran do fazy ciekej

Mikroekstrakcja do kropli obarczona jest ryzykiem jej zniszczenia. Ciecz ekstrahujc mona
unieruchomi w porowatym wknie (drenie), co zostao wykorzystane w mikroekstrakcji poprzez
membran do fazy ciekej (ang. hollow fibre liquid phase microextraction, HF-LPME). Jest to
ekstrakcja w ukadzie ciecz ciecz, gdzie ciecz ekstrahujca znajduje si w przestrzeniach porowatego
wkna zamocowanego na kocach igie dwch mikrostrzykawek (rys.19a) lub na kocu igy jednej
mikrostrzykawki (rysunek 19b) i zanurzonego w roztworze prbki. Po skoczonej ekstrakcji ekstrakt z

72
drenu zasysany jest do strzykawki. Technika ta umoliwia du selektywno procesu poprzez due
moliwoci doboru odpowiedniej cieczy ekstrahujcej oraz rodzaju porowatego wkna. Due
zastosowanie w tej technice znalaz porowaty polipropylen. Poza zabezpieczeniem cieczy
ekstrahujcej, mae pory wkna uniemoliwiaj przedostanie sie do niej duych moleku, co jest
podane zwaszcza w analityce pynw biologicznych. Na wydajno ekstrakcji, podobnie jak w
technice SDME, wpyw maj takie warunki ekstrakcji, jak: objto prbki i ekstrahenta,
intensywno mieszania, czas ekstrakcji, wysalanie oraz pH prbki. Technik t zastosowano do
ekstrakcji z roztworw wodnych takich analitw jak np.: aminy aromatyczne, leki o charakterze
kwanym lub zasadowym oraz estrogeny.

igy strzykawek

prbka
a) b)
wkno polipropylenowe

z ekstrahentem

Rysunek 19. Zestawy do mikroekstrakcji przez membran do fazy ciekej, HF-LPME

4.2.6. Ekstrakcja cieczami jonowymi

Zastosowanie do mikroekstrakcji, zwaszcza do mikroekstrakcji do kropli (SDME) znalazy ciecze jonowe.
W odrnieniu od konwencjonalnych rozpuszczalnikw, ciecze jonowe umoliwiaj tworzenie wikszych i
stabilniejszych kropli, ktre nie odparowuj i nie rozpuszczaj si w prbce wodnej. Te korzystne cechy
wynikaj ze struktury chemicznej cieczy jonowych, ktre s solami o niskiej temperaturze topnienia.

Wg oglnie przyjtej definicji ciecze jonowe s to sole organiczne o temperaturach topnienia

poniej 100C i stabilne w powietrzu w szerokim zakresie temperatur. Spord nich wyrniaj
si te, ktre maj temperatur topnienia rwn lub nisz od temperatury pokojowej (ang.
room temperature ionic liquids, RTIL).

S to nowe rozpuszczalniki o dobrych waciwociach rozpuszczajcych dla szerokiego zakresu substancji i

korzystnych fizycznych waciwociach. RTIL znajduj coraz szersze zastosowanie w technikach
separacyjnych. Ciecze jonowe cieke w temperaturze pokojowej s bardzo interesujcymi
rozpuszczalnikami ekstrahujcymi. Znanych jest ponad dwiecie RTIL a liczba dostpnych komercyjnie
zwizkw wci wzrasta. Gwnymi typami ciekych w temperaturze pokojowej cieczy s sole zawierajce
w swej strukturze kationy takie jak: alkiloimidazoliowe, alkiloamoniowe, alkilofosfoniowych,
alkilopirydyniowe oraz alkilopirolidyniowe. Z kolei najczeciej stosowane aniony to sabe nukleofile takie
jak: bis(trifluorometanosulfonylo)imidek, heksafluorofosforan, tetrafluoroboran, perfluoroalkilosulfonian i

73
in. Struktur chemiczn czsto stosowanych, ciekych w temperaturze pokojowej cieczy jonowych
przedstawiono w Tabeli 8. Niska temperatura topnienia cieczy jonowych tumaczona jest ma symetri
czsteczki i delokalizacj adunku, przesanianiem jednego lub obu jonw oraz sabym wizaniem
wodorowym midzy jonami. Maa symetria czsteczki i delokalizacja adunku daj du swobod drga,
ktre zwikszaj odlegoci midzyadunkowe i obniaj w ten sposb stabilno sieci krystalicznej i
temperatur topnienia. Temperatury parowania cieczy jonowych s wysokie, gdy przed przejciem do fazy
gazowej chroni, dziaajce na znaczne odlegoci, oddziaywania kulombowskie.

Tabela 8. Typowe ciecze jonowe

Kation Struktura Kation Struktura

R4

N+ X- + N R1
Alkiloamoniowy R3
Alkilopirydyniowy
R1
R2 X-

R4
R2
P+ X- + N
Alkilfosfoniowy R3
Alkilopirolidyniowy
R1 R1
R2 X-

R1 R2
R4
+
Alkilosulfoniowy S+ X- Alkilotioazoliowy S N
R1 R3
R3 X-
R4

R1 R2
N
+ +
Alkiloimidazoliowy N N Alkilotriazoliowy N N
R2 R1 R5
X- X-
R4

Anion X: BF4, PF6, AlCl4, SbF6, CF3SO3, (CF3SO2)2N i in. Rx: od -CH3 do -C9H19

Niska prno par cieczy jonowych wystpuje w szerokim zakresie temperatur. Termiczn trwao cieczy
jonowej najczciej okrela si przez temperatur pocztku rozpadu. Ciecze jonowe ze sabozasadowymi
anionami wykazuj wyjtkow termiczn stabilno w obojtnej atmosferze, pozwalajc na stosowanie w
temperaturze powyej 250C (np. w chromatografii gazowej). Gsto cieczy jonowych RTIL jest przewanie
wiksza od gstoci wody (dla najczciej stosowanych wynosi od 0,964 do 1,470 g/mL, w 25C) i zwykle
zmniejsza si wraz ze wzrostem rozmiaru jonw. Cieke w temperaturze pokojowej ciecze jonowe maj

74
relatywnie nisk lepko, relatywnie naley podkreli, bo wikszo z nich ma lepko powyej 30 cP
(lepko wody w temp. 25C wynosi 0,8937 cP). Lepko cieczy jonowych zwizana jest z rozmiarem anionu,
mae aniony z rozmytym adunkiem ujemnym i ograniczon zdolnoci do wizania wodoru obniaj
lepko. Ciecze jonowe s oglnie trudnopalne, a temperatury zaponu s przynajmniej o 100C wysze ni
temperatury zaponu konwencjonalnych rozpuszczalnikw organicznych.

Zdolno do solwatacji oraz waciwoci fizyczne ciekych w temperaturze pokojowej cieczy

jonowych, takie jak: niska prno par i wysoka gsto, s korzystne w procesie ekstrakcji.

Zdolno do solwatacji jest oglnie charakteryzowana przez polarno rozpuszczalnika, czyli zdolno
rozpuszczalnika do oddziaywa midzyczsteczkowych ze skadnikami rozpuszczonymi, ale nieskutkujca
reakcjami chemicznymi. Jest to wypadkowa wszystkich oddziaywa (o polarnoci rozpuszczalnika nie mona
mwi w kontekcie pojedynczych czsteczek). Np. azotany i tiocyjaniany alkiloamoniowe maj polarno
podobn do wody, z kolei sole alkiloimidazoliowe maj polarno mniejsz ni woda, porwnywaln z
rozpuszczalnikami polarnymi, jak: dimetylosulfotlenek, krtkoacuchowe alkohole alifatyczne i in.
Wszystkie ciecze jonowe s dipolarne/polaryzowalne i posiadaj waciwoci tworzenia wiza
wodorowych, co powoduje ich dobre waciwoci solwatacyjne i dobr rozpuszczalno szerokiego zakresu
zwizkw organicznych i nieorganicznych a take rnych biomoleku w tym enzymw i biopolimerw,
takich jak np. celuloza.

Poprzez odpowiedni dobr kationu i anionu cieczy jonowej mona z powodzeniem

manipulowa takimi cechami fizykochemicznymi jak lepko, gsto, rozpuszczalno z
odpowiednimi rozpuszczalnikami i In. Wikszo z dostpnych wspczenie cieczy jonowych
moe cakowicie lub czciowo miesza si z polarnymi rozpuszczalnikami organicznymi (np.
metanolem, acetonitrilem, tetrahydrofuranem, dichlorometanem, acetonem, i in.). Ciecze mog
te tworzy wydajne dwufazowe ukady z organicznymi rozpuszczalnikami o niskiej polarnoci
(np. heksanem, toluenem, eterami alkilowymi) lub z wod.

Rozpuszczalno w wodzie zaley bardziej od rodzaju anionu ni kationu. Sole alkiloimidazoliowe z anionami
halogenkowymi, etanolanowym, azotanowym i trifluorooctowym cakowicie mieszaj si z wod. Sole z
anionami heksafluorofosforanowymi oraz bis(trifluorometanosulfonylo)imidkowymi oglnie nie mieszaj si
z wod, natomiast sole anionw tetrafluoroboranowych i trifluorosulfonianowych mieszaj si cakowicie
lub wcale, w zalenoci od dugoci acucha alkilowego w strukturze kationu. Wszystkie tetrafluoroborany
alkiloimidazoliowe s oglnie rozpuszczalne w acetonie i dichlorometanie. Z kolei dicyjanoimidki 1-etylo-3-
metyloimidazoliowe, N,N-dialkilopirolidyniowe i tetralkiloamoniowe mieszaj si bez ogranicze z wod i
wikszoci rozpuszczalnikw organicznych, z wyjtkiem heksanu i toluenu; metanosulfonian i
etanosulfonian 1,3-dialkiloimidazoliowy mieszaj si z wod i z wikszoci zwykych, polarnych
rozpuszczalnikw organicznych.

W wikszoci zastosowa ciekych w temperaturze pokojowej cieczy jonowych w technikach

separacyjnych, dwie waciwoci odrniaj je na korzy od konwencjonalnych
rozpuszczalnikw: wysoka termiczna trwao i pomijalna prno par w szerokim zakresie
temperatur. 75
Gsto ciekych w temperaturze pokojowej cieczy jonowych, ktre tworz ukady dwufazowe z wod lub
rozpuszczalnikami organicznymi, umoliwia szybkie rozdzielenie faz, co jest korzystne w przypadku ich
stosowania w metodach ekstrakcyjnych. Niepodan cech w porwnaniu z konwencjonalnymi
rozpuszczalnikami jest wysoka lepko. Procedury przygotowania prbek, polegajce na pompowaniu cieczy
jonowej wymagaj dla normalnej pracy aparatu lepkoci poniej 5 cP. Lepko RTIL moe by obniana do
podanego zakresu przez podwyszenie temperatury lub przez rozcieczenie z mieszajcym si
rozpuszczalnikiem organicznym.
Pomijalna prno par minimalizuje zanieczyszczenie rodowiska naturalnego poprzez odparowanie,
co jest gwnym problemem w przypadku stosowania konwencjonalnych rozpuszczalnikw
organicznych oraz pozwala na stosowanie ukadw prniowych bez istotnych strat.
W technikach separacyjnych najwiksze zastosowanie cieke w temperaturze pokojowej ciecze jonowe
znalazy w ekstrakcji prbek wodnych, do izolacji zarwno zwizkw organicznych jak i nieorganicznych.
Jeli analiza waciwa analitu jest przeprowadzana technik uniemoliwiajc bezporednie zastosowanie
cieczy jonowej (np. za pomoc chromatografii gazowej) konieczna jest zamiana tego medium na inn
matryc. Odzyskanie ekstrahowanych substancji mona przeprowadzi przez destylacj, sublimacj lub
ekstrakcj rozpuszczalnikiem organicznym (ewentualnie po derywatyzacji). RTIL nie mona wprowadza
bezporednio do chromatografu gazowego z powodu ich niskiej lotnoci, co moe powodowa ich
kumulacj w dozowniku i na kolumnie chromatograficznej, obniajc sprawno separacji. Przykady
zastosowania ciekych w temperaturze pokojowej cieczy jonowych w ekstrakcji zwizkw organicznych i
nieorganicznych przedstawiono w Tabeli 9.
Cieczami jonowymi mona ekstrahowa zwizki wystpujce w formie obojtnej lub jonowej. Jeli
zwizek jest w formie jonowej, np. fenol - jako anion fenolanowy, ekstrakcja zachodzi wg
mechanizmu wymiany jonowej, czyli taka sama ilo anionw cieczy jonowej musi przej do fazy
wodnej, ile anionw fenolanowych przechodzi do cieczy jonowej.
Fenole mog by ekstrahowane w formie obojtnej i formie anionowej, a wydajno ekstrakcji zaley od
rodzaju cieczy jonowej. Dla niektrych fenoli ekstrakcja bya wydajniejsza w warunkach, gdy fenol by w
formie zjonizowanej. Wydajno ekstrakcji fenoli z wody za pomoc RTIL moe by 10 razy wiksza ni dla
dichlorometanu.
Zastosowanie cieczy ciekych w temperaturze pokojowej w technikach mikroekstrakcji, jak ekstrakcja
do pojedynczej kropli w fazie nadpowierzchniowej (HS-SDME) i ciekej (DI-SDME), mikroekstrakcja
poprzez membran do fazy ciekej (HF-LPME) oraz mikroekstrakcji do fazy staej (SPME), wynikaj
gwnie z ich waciwoci fizycznych. Stosowane w SDME ciecze jonowe daj wiksze i stabilniejsze
krople, co umoliwia szybsze mieszanie prbki i duszy czas ekstrakcji. RTIL z kationem 1,3-
dialkiloimidazoliowym daj wspczynnik wzbogacenia od 5 do 200 dla typowych niskomolekularnych
substancji. Technika SDME czy HF-LPME przy uyciu cieczy jonowych ciekych w temperaturze
pokojowej moe by bezporednio czona z chromatografi cieczow w ukadzie odwrconych faz z
wodnymi fazami ruchomymi. W przypadku analizy technik chromatografii gazowej, wymagany jest
dozownik z wyjmowan wkadk, z ktrej lotne skadniki s odparowywane w temperaturze
pokojowej, a usuwanie wkadki zapobiega kumulowaniu si cieczy jonowej w dozowniku i na
kolumnie. Przykady zastosowa cieczy jonowych w mikroekstrakcji przedstawiono w Tabeli 10.

76
 Tabela 9. Przykady zastosowania ciekych w temperaturze pokojowej cieczy jonowych (RTIL), jako
cieczy ekstrahujcych

Analit Prbka Cieka w temperaturze pokojowej Wspczynnik

ciecz jonowa (RTIL) podziau

Benzenowe lub naftalenowe Woda heksafluorofosforan 1-butylo -3- 1 97

pochodne z pojedyncz grup metyloimidazoliowy
fenolow

Fenol, tyrozol, kwas p- Woda tetrafluoroboran 1-alkilo-3- Porwnywalny z

hydroksybezoesowy, bisfenol A, metyloimidazoliowy n-oktanol/woda
pentachlorofenol, 4-oktylofenol,
4-nonylofenol

Benzen Woda heksafluorofosforan 1-butylo-3- Porwnywalny z

metyloimidazoliowy n-oktanol/woda

Biaka Komrki mrwczan 3-(dimetyloamino) -1- -

drody propyloamoniowy

Hemoglobina Krew heksafluorofosforan 1-butylo -3- -

ludzka trimetylosililoimidazoliowy

Ksyleny Heksan etylosulfonian 1-etylo-3- -

metylopirydyniowy
Jony metali cikich w postaci Woda heksafluorofosforan 1-butylo -3- -
kompleksu z ditizonem metyloimidazoliowy

Jony rtci (bez kompleksowania) Woda heksafluorofosforan 1-alkilo-3- -

metyloimidazoliowy
Toluen, cykloheksanon, nonanol- Woda Rne RTIL Wyszy ni
1, kwas octowy, kwas heksanowy n-oktanol/woda

Kwasy naftalenosulfonowe Woda bis(trifluorometano- ok. 2 (2 lub 3

(barwniki azowe) sulfonylo)imidek N-butylo-N- ekstrakcje
etylopirolidyniowy daway 95 %
wydajnoci)

Amoxicilina, ampicylina Woda heksafluorofosforan 1-butylo-3- 3 20

(antybiotyki) metyloimidazoliowy,
heksafluorofosforan i
tetrafluoroboran 1-heksylo-3-
metyloimidazoliowy,
tetrafluoroboran 1-oktylo-3-
metyloimidazoliowy

77
 Tabela 10. Zastosowanie cieczy jonowych RTIL w technice mikroekstrakcji

Analit Prbka Ciecz jonowa Technika

ekstrakcji
BTEX, halometany, Woda heksafluorofosforan 1 -oktylo-3- HS-SDME
chlorobenzeny, metyloimidazoliowy
chloroaniliny

Benzofenony Mocz heksafluorofosforan 1-butylo-3- DI-SDME

metyloimidazoliowy

WWA, alkilofenole Woda heksafluorofosforan 1-butylo-3- DI-SDME

metyloimidazoliowy

Chlorofenole alifatyczne, Woda heksafluorofosforan HF-LPME

wglowodory 1-butylo-3-metyloimidazoliowy
aromatyczne heksafluorofosforan 1-oktylo-3-
metyloimidazoliowy
Amfetamina, Mocz 1-winylo-3-alkiloimidazoliowa SPE
metamfetamina ciecz jonowa chemicznie
zwizana z wknem z krzemionki

Wodne ukady dwufazowe tworzone s zwykle przez dwie substancje o rnych wasnociach
(szczeglnie o rnym powinowactwie do wody) w mieszaninie z wod. Trjskadnikowa mieszanina
o okrelonym steniu w odpowiedniej temperaturze tworzy dwie wodne fazy o rnym skadzie.

Wodny ukad dwufazowy mona stosowa do ekstrakcji ciecz - ciecz, a rozpuszczone substancje
ulegaj podziaowi midzy dwie wodne fazy.

Ta technika jest szeroko stosowana do oczyszczania biopolimerw, poniewa jest selektywna, tania,
rozdzielenie faz nastpuje szybko i mona j zaadaptowa do procesw cigych, a ekstrahowane
substancje zachowuj aktywno biologiczn.
W technice dwufazowych roztworw wodnych podejmowano prby zastosowania
niskotemperaturowych cieczy jonowych. Mieszanin trjskadnikow tworz ciecz jonowa, sl
nieorganiczna i woda, w ktrej ciecz jonowa wspzawodniczy z sol nieorganiczn o czsteczki wody.
Sl nieorganiczna ma wiksze powinowactwo do wody, wic hydratacja cieczy jonowej bdzie si
zmniejszaa, bo czsteczki wody bd przemieszczay si od jonw cieczy jonowej do jonw soli
nieorganicznej. Zmniejszenie hydratacji cieczy jonowej powoduje zmniejszenie jej rozpuszczalnoci w
wodzie, co sprawia, e faza bogatsza w ciecz jonow oddziela si od reszty roztworu, dziki czemu
powstaje ukad dwufazowy.
Najkorzystniejsze cechy do zastosowania w technice dwufazowych ukadw wodnych maj sole
kationw 1,3-dialkiloimidazoliowych, ktrych zdolno do tworzenia dwch faz jest w przyblieniu

78
odwrotnie proporcjonalna do rozpuszczalnoci w wodzie. Stosowane w tych ukadach sole
nieorganiczne to: fosforany(V), siarczany(VI), wglany lub cytryniany amoniowe, potasowe lub
sodowe. Faz wodn wzbogacon w ciecz jonow mona bezporednio analizowa metod
chromatografii cieczowej.
Wodne ukady dwufazowe z RTIL stosowane s do ekstrakcji niskoczsteczkowych skadnikw, np.:
alkaloidw z rolin, tryptofanu, testosteronu i epitestosteronu w moczu, a najczciej stosowanym
dwufazowym ukadem ekstrakcyjnym jest mieszanina chlorku 1-butylo-3-metyloimidazoliowego lub
bromku z fosforanem(V) lub kwanym fosforanem(V) sodu.

4.3. Ekstrakcja w ukadzie ciecz ciao stae

4.3.1. Ekstrakcja do fazy staej
Klasyczna ekstrakcja ciecz-ciecz jest atwa, niewymagajca specjalistycznego sprztu, ale
czasochonna i wymagajca duej iloci czystych rozpuszczalnikw. Du redukcj czasu analizy i
objtoci uywanych rozpuszczalnikw i zwizanego z tym zmniejszenia szkodliwych odpadw i
zwikszenia bezpieczestwa pracy, daje ekstrakcja do fazy staej (ang, solid phase extraction, SPE).
Termin ten oznacza sposb izolowania analitu w ukadzie ciecz ciao stae, wykorzystujcy zjawisko
podziau analitu midzy ciek prbk a stay sorbent.
Rozwj technik ekstrakcji do fazy staej nastpi w latach siedemdziesitych ubiegego wieku, po
pojawieniu si atwo dostpnych i trwaych sorbentw o rnorodnych waciwociach chemicznych. Do
techniki SPE wykorzystano zmodyfikowane powierzchniowo materiay krzemionkowe czy polimerowe,
podobne do tych, ktre s szeroko stosowane w HPLC. S to adsorbenty, takie jak: el krzemionkowy,
florisil, tlenek glinu, krzemionka modyfikowana grupami alkilowym (np. C-18), fenylowymi, cyjanowymi,
propyloaminowymi i in. W technice SPE stosuje si rwnie rnego rodzaju modyfikacje polimeru
diwinylobenzenu (DVB), sorbenty wykluczania immunologicznego, polimery z nadrukiem molekularnym
lub fazy stacjonarne stosowane w chromatografii jonowymiennej (SCX, SAX).
Sorbentem o najwikszym znaczeniu w technice SPE jest krzemionka, gdy jest wygodnym nonikiem
rnych grup funkcyjnych. Czysta krzemionka, zawierajca na swej powierzchni wolne grupy silanolowe
(SiOH), ktra silnie adsorbuje polarne zwizki, przy czym jest to oddziaywanie na tyle silne, e odzysk
zaadsorbowanych substancji jest znacznie utrudniony. Zmodyfikowanie powierzchni elu
krzemionkowego poprzez zastpienie wolnych grup silanolowch grup cyjanow (CN), aminow (NH2) czy
diolow (COHCOH) powoduje zmniejszenie siy oddziaywa silnie polarnych zwizkw z krzemionk i
umoliwia ich ekstrakcj. Ten typ sorbentw nosi nazw zwizanych faz normalnych (NP). Z kolei
zastpienie grup silanolowch grupami oktylowymi (C-8), oktadecylowymi (C-18) czy alkilofenylowymi (R-
C6H5) sprawia, e krzemionka staje si sorbentem niepolarnym i nosi nazw faz odwrconych (RP). W tym
przypadku powstaj silne, ale odwracalne oddziaywania niepolarnych lub sabo polarnych substancji ze
zmodyfikowan powierzchni krzemionki, co umoliwia ich ekstrakcj z polarnego rozpuszczalnika.
Zasada rozdzielania metod SPE zaley gwnie od natury sorbentu. Siami warunkujcymi oddziaywania
midzy analitem a staym adsorbentem polarnym (np. el krzemionkowy, tlenek glinu) s wizania
wodorowe, oddziaywania dipol-dipol, dipol indukowany-dipol oraz siy dyspersyjne (van der Waalsa)
(por. roz. I.2.3). Ten typ ekstrakcji oparty jest na takich samych zasadach jak chromatografia adsorpcyjna.
Gdy zastosowanym sorbentem jest krzemionka z chemicznie zwizan grup polarn, np. aminow (ukad
faz normalnych) lub niepolarn, np. oktadecylow (ukad faz odwrconych) zasada rozdzielania jest taka,
jak w chromatografii podziaowej (por. roz. III.2.4). Naley pamita, e istnieje moliwo rnych

79
oddziaywa midzy grupami funkcyjnymi analitu a powierzchni sorbentu i mimo, e mechanizm
rozdzielania na fazach zwizanych jest podziaowy, w rzeczywistoci przebiega w duym stopniu przy
udziale procesw adsorpcyjnych.
Celem rozdzielania metod SPE jest przygotowanie prbki do analizy waciwej, czyli wyizolowanie
analitu z matrycy w maksymalnie czystej i skoncentrowanej postaci. Moe by to osignite na dwa
sposoby: mona wyeluowa analit, podczas gdy zanieczyszczenia s zatrzymywane lub odwrotnie,
dany analit jest zatrzymywany na kolumnie, podczas gdy zanieczyszczenia s usuwane z kolumny.
Ekstrakcja do fazy staej zachodzi tylko wwczas, gdy wizanie pomidzy sorbentem a analitem jest
silniejsze ni oddziaywanie wywierane przez rozpuszczalnik lub matryc prbki. Anality zatrzymane
na zou mona odzyskiwa przez mineralizacj zoa, ekstrakcj rozpuszczalnikami organicznymi czy
desorpcj termiczn. Do najczstszych metod naley jednak ekstrakcja rozpuszczalnikami
organicznymi. W procesie wymywania eluent musi posiada silniejsze powinowactwo do analitu ni
sorbent. Zwykle stosuje si: metanol, acetonitryl, aceton, izopropanol, dichlorometan, pentan oraz
mieszaniny tych rozpuszczalnikw.
Naley pamita, e stosowane w kolumienkach SPE fazy stacjonarne wykonane na bazie materiaw
krzemionkowych s stabilne w zakresie pH od 2 do 7,5; w odczynie alkalicznym el krzemionkowy
moe si rozpuci a w odczynie silnie kwanym mog ulec hydrolizie wizania midzy grupami
silanolowymi a podstawnikami modyfikujcymi el krzemionkowy.
Chemicznie zwizane fazy stacjonarne posiadaj znaczn (od 1 do 5% masy sorbentu) zdolno
umiarkowanie selektywnego wychwytu rnorodnych substancji, co umoliwia zminiaturyzowanie
procesu ekstrakcji. W praktyce uywa si najczciej komercyjnie przygotowane kolumienki szklane
lub polipropylenowe, zawierajce od 100 mg do 2 g sorbentu staego, zawartego midzy dwoma
porowatymi filtrami oraz system prniowy ze statywem na odbieralniki, manometrem kontrolnym i
zaworem regulujcym. Ponadto w skad systemu wchodz zcza i zawory umoliwiajce czenie
kilku kolumienek tej samej lub rnej wielkoci. Ziarna wypenienia w kolumienkach SPE maj
rednic 40 m (wiksz ni stosowane w HPLC) a take nieregularny ksztat, co umoliwia szybki
przepyw fazy ruchomej. Budowa pojedynczej kolumienki SPE oraz zestawu szeregu kolumienek
podczonych do prni przedstawiona jest na rysunku 20.
Elucja analitw wymaga rozpoznania pochodzenia prbki, potencjalnych substancji przeszkadzajcych
(interferentw) i waciwoci fizyko-chemicznych oznaczanych substancji. Dobr rozpuszczalnika do elucji
zaley od miejsca rozpuszczalnika w szeregu eluotropowym w stosunku do analitu, rodzaju fazy staej oraz
od wymaga kolejnych etapw procedury oznaczania (np. lotno, moliwo zastosowania detektora
spektrofotometrycznego UV/Vis). Ekstrakcj z wody zwizkw niepolarnych wykonuje si, stosujc
niepolarn faz, najczciej krzemionk zmodyfikowan grupami oktadecylowych (C-18) lub sorbenty
polimerowe o waciwociach odwrconych faz. Do elucji stosuje si takie rozpuszczalniki, jak:
dichlorometan, pentan, heksan, aceton, octan etylu, acetonitryl lub ich mieszanina. Mona te wymywa
substancje kolejno rnymi rozpuszczalnikami, rnicymi si si elucyjn - ekstrakcja sekwencyjna.
Efektywno zagszczania metod SPE wyraa si wspczynnikiem wzbogacenia analitu k, opisanego
wzorem:
V (43)
k= W
gdzie: V E
VW - objto wody przepuszczona przez sorbent,
VE - objto eluentu uyta do wymycia analitw.

80
 Wzrost wartoci wspczynnika mona osign przez zwikszenie objtoci wody przepuszczanej
przez sorbent lub przez zmniejszenie objtoci eluentu. Zmniejszenie objtoci eluentu wie si z
uyciem mniejszej iloci sorbentu. Uycie eluentu o wikszej sile wymywania te prowadzi do
zmniejszenia jego objtoci, ale moe si wiza z wymyciem interferentw. W warunkach
optymalnych warto odzysku moe wynosi ok. 90%, przy wspczynniku wzbogacenia 1000 dla
prbek o objtoci 0,5 do 1,0 dm3 wody.

toczek strzykawki

strzykawka

cznik

eluent

kolumienka filtr
zoe ekstrahujce
z naniesion prbk

naczynko -
odbieralnik
roztwr analitu
podcinienie

a) b)

Rysunek 20. Budowa pojedynczej kolumienki SPE (a) i zestawu kilku kolumienek (b)

Metoda ekstrakcji do fazy staej znalaza szerokie zastosowanie, zwaszcza do izolowania substancji
organicznych z roztworw wodnych, np. do ekstrakcji WWA z wody stosowane s z powodzeniem
niepolarne fazy oktadecylowe (C-18), same lub w poczeniu z grupami polarnymi, np.
aminopropylow.
Ekstrakcja do fazy staej obejmuje kilka niezbdnych etapw. Poniej podano sposb przygotowania
kolumienki wypenionej niepolarn faz oktadecylow (C-18). Pierwszy etap to przemycie kolumienki wraz
z wypenieniem rozpuszczalnikami majcymi warto eluotropow wiksz ni stosowane eluenty. Usuwa
si w ten sposb substancje (alkeny C16-C24, alkiloftalany, alkany, silanole, siloksany), ktre mog si
wyekstrahowa z gotowych kolumienek, a ilo ich zaley od producenta. Wymywanie zwizkw
silanolowych wynika z hydrolizy wizania midzy grupami silanolowymi a podstawnikami modyfikujcymi
krzemionk, dlatego naley bezwzgldnie unika stosowania eluentw mogcych j powodowa w dalszych
etapach ekstrakcji. Objto rozpuszczalnikw sucych do przemywania kolumienek naley ustali
dowiadczalnie, najczciej zaleca si wstpne przemywanie rozpuszczalnikami stosowanymi do elucji w
objtoci 5-10 razy wikszej od masy wypenienia.

81
Nastpnym etapem jest kondycjonowanie (solwatacja) wypenienia kolumienki (zoa sorbentu),
polegajce na przygotowaniu powierzchni sorbentu do efektywnej izolacji i wzbogacania analitw z
wody. el krzemionkowy modyfikowany faz oktadecylow ma wasnoci lipofilowe (fazy RP nie s
zwilane wod), dlatego zoe najpierw przemywa si metanolem lub 2-propanolem a nastpnie
mieszanin wody i 2-propanolu. Do kondycjonowania stosuje si zwykle 510 objtoci pustych
uywanej kolumienki (1 objto pusta = 1,01,2 l/mg sorbentu). W trakcie kondycjonowania
acuchy wglowodorowe ulegaj wyprostowaniu oddalajc si od powierzchni sorbentu, tworzc
tzw. szczotk o znacznie powikszonej powierzchni aktywnej. Wane jest uycie do
kondycjonowania rozpuszczalnika o waciwociach najbardziej zblionych do waciwoci matrycy
badanej prbki (wody dejonizowanej dla prbek wodnych) oraz utrzymywanie sorbentu w peni
pokrytego rozpuszczalnikiem do momentu naniesienia prbki (zawsze pierwsz porcj rozpuszczalnika
wprowadza si bez uycia podcinienia, pozwalajc jej wsikn w zoe).
Kolejnym etapem jest naniesienie na kolumienk prbki wody. Jeli prbka zawiera zawiesin, przed
naniesieniem naley j odwirowa lub przesczy, aby unikn zatkania filtru wlotowego kolumienki.
Badan wod nanosi si z dodatkiem 1-5% metanolu lub 515% 2-propanolu. Dodatek alkoholu do
wody badanej powoduje, e powierzchnia sorbentu jest aktywna (acuchy wglowodorowe
wyprostowane) podczas wszystkich etapw zagszczania (dynamiczna solwatacja), co umoliwia
przepuszczenie przez kolumn wikszej objtoci prbki bez przekroczenia pojemnoci sorpcyjnej
zoa (tzw. przebicia) oraz zmniejsza adsorpcj analitw na ciankach kolumienki. Roztwory wodne
zawierajce analit przepuszcza si przez kolumienk z szybkoci 125 cm3/min przy stosowaniu
odpowiedniego podcinienia (pompka wodna) lub nadcinienia (sprony gaz obojtny).
Nastpny etap obejmuje usunicie z przestrzeni midzy czstkami sorbentu oraz z wntrza jego
porw substancji niezwizanych przez przemycie czystym rozpuszczalnikiem, w ktrym znajdowa si
analit. Mona zastosowa inne rozpuszczalniki, o sile eluotropowej wikszej, jeli nie spowoduj
wymycia analitu. W ten sposb usuwa si ewentualne interferenty pochodzce z matrycy, co zwiksza
czysto frakcji analizowanej. Resztki rozpuszczalnika przemywajcego usuwa si przez suszenie
strumieniem powietrza (zasysanym przez pompk wodn). Czas suszenia zaley od lotnoci rozpuszczalnika
i masy sorbentu i wynosi od 120 minut. W przypadku rozpuszczalnikw wysokowrzcych (w tym wody),
suszenie przy uyciu podcinienia moe by niewystarczajce i powinno go poprzedzi wirowanie.
Odwirowanie rozpuszczalnika naley stosowa, gdy mamy do czynienia z analitami lotnymi lub atwo
ulegajcymi utlenieniu. Przy nielotnych analitach mona zastosowa rwnie liofilizacj.
Ostatnim etapem jest wymycie zatrzymanych na kolumience analitw ma porcj (zalena od
wielkoci zoa, zwykle 300 -500 L) odpowiedniego rozpuszczalnika. Na rysunku 21 przedstawiono
zestaw do ekstrakcji do fazy staej z zastosowaniem podcinienia z pompki wodnej.

82
 Zbiornik prbki

Kolumienka SPE (CHROMABOND C-18)

Warstwa fazy staej

cznik

Odbieralnik

Pompka wodna

Rysunek 21. Zestaw do ekstrakcji do fazy staej

Kolumienki SPE charakteryzuj si ma sprawnoci mierzonej iloci pek teoretycznych, maj za

to nastpujce zalety:

szybko ekstrakcji - kilkukrotnie wiksza ni w ukadzie ciecz -ciecz,

przy ladowych zanieczyszczeniach, jedna kolumienka moe ekstrahowa nawet 100 L prbki
wody,
mona je stosowa do analitw lotnych i nielotnych,
mona je stosowa do analitw organicznych i nieorganicznych,
mona przechowywa analit w warstwie sorbentu do czasu analizy, co pozwala na
wykonywanie ekstrakcji w warunkach polowych,
powoduj ominicie problemu pienienia si lub emulgowania prbek,
maj du odtwarzalno, dziki zmniejszeniu iloci manipulacji z prbk,
moliwo automatyzacji procesu,
dua selektywno ekstrakcji dziki duemu wyborowi staych sorbentw,
s bardziej ekonomiczne, przez zmniejszenie zuycia szka, odczynnikw i nakadu pracy
(moliwo wielokrotnego uycia sorbentu, prostota wyposaenia),
s zdecydowanie bezpieczniejsze od tradycyjnej ekstrakcji, na skutek mniejszego zuycia
atwopalnych rozpuszczalnikw,
daj moliwo izolacji od matrycy i zagszczania rnorodnych grup zwizkw chemicznych
w czasie jednej ekstrakcji,
dziki wysokiemu wspczynnikowi podziau i maej objtoci eluatu mona przeprowadzi
bezporedni jego analiz bez strat z powodu zagszczania, co jest bardzo wan zalet tej
metody, zwaszcza w analizach ladw,
moliwo zagszczania w warunkach polowych: moliwo ekstrakcji prb o duej objtoci
do maych, kilkumililitrowych kolumienek z materiaem sorpcyjnym umoliwia transport
duej ich iloci i zabezpiecza nietrwae anality przed rozkadem w czasie transportu i
oczekiwania na analiz.

83
Niestety metoda ta posiada te wady, a do najistotniejszym mona zaliczy:

to pozostawione przez uyty rozpuszczalnik,

konieczno regeneracji zoa przed kolejnym uyciem,
czasem mae wartoci odzysku analitu, spowodowane oddziaywaniami midzy sorbentem a
substancj analizowan,
zatykanie zoa poprzez zawiesiny obecne w prbce,
czasami saba odtwarzalno spowodowana rnicami midzy kolejnymi partiami sorbentu.

Przewaga zalet nad wadami jest zdecydowana i ekstrakcja do fazy staej znalaza szerokie
zastosowanie do wydzielania analitw bezporednio z prbek gazowych, wodnych jak i z
ekstraktw prbek staych. Ekstrakcja do fazy staej jest rutynow technik w kadym
laboratorium.

4.3.2. Mikroekstrakcja do fazy staej

Rozwj techniki SPE doprowadzi do miniaturyzacji procesu ekstrakcji oraz jego automatyzacji, czego
przykadem jest mikroekstrakcja do fazy staej (por. roz. II.3.2.2).

4.3.3. Ekstrakcja za pomoc ruchomego elementu sorpcyjnego

Jedn z wersji ekstrakcji do fazy staej jest mikroekstrakcja do warstwy sorbentu, pokrywajcego stay
element szklany lub kwarcowy. Do takiej nale mikroekstrakcja do fazy staej oraz ekstrakcja za
pomoc ruchomego elementu sorpcyjnego (ang. stir bar sorptive extraction, SBSE). Obie techniki
ekstrakcji s zgodne z ide "zielonej chemii analitycznej", gdy powoduj minimalizacj preparatyki
prbek: ograniczaj lub eliminuj zuycie rozpuszczalnikw, zmniejszaj objto prbki wymaganej do
analizy oraz minimalizuj straty analitw, poniewa nie wymagaj obrbki ekstraktw, ktre w caoci
mog by wprowadzane do systemu dozowania w chromatografie gazowym czy cieczowym.
Metod SBSE wprowadzi Baltussen i wsppracownicy w 1999 roku i nazwa j twisters. Od tamtej pory
metoda ta znajduje coraz szersze zastosowanie w oznaczaniu zanieczyszcze w prbkach rodowiskowych,
w ywnoci oraz w prbkach biomedycznych. Tak due zainteresowanie t metod wie si z
wykorzystaniem polidimetylosiloksanu jako fazy sorpcyjnej. Polidimetylosiloksan (PDMS), znany w
podziaowej chromatografii gazowej, jako cieka faza stacjonarna, jest termicznie stabiln ciecz o duej
lepkoci, niemieszajc si z matryc prbki (wod), ktra moe by stosowana w szerokim zakresie
temperatur (do 320C). Poza tym, PDMS wykazuje interesujce waciwoci dyfuzyjne, w ekstrakcji analitu
bierze udzia caa objto sorbentu a nie tylko jego powierzchnia.
Nieorganiczne sorbenty nie maj duego zastosowania w tej metodzie, poniewa oddziauj zbyt
silnie z wyapywanymi substancjami, co wie si z desorpcj w warunkach mogcych powodowa
degradacj analitu (np. wysoka temperatura). Organiczne adsorbenty, jak np. Tenax, czsto
powoduj termiczn dekompozycj skadu prbki.

84
Podstawy metody
W miar upywu czasu ekstrakcji, nastpuj zmiany stenia analitu w fazie sorpcyjnej PDMS. Jest to
zaleno wykadnicza, ktr przedstawia rwnanie:

k1
c PDMS (t ) = cW , 0 (1 e k2t ) (44)
k2
gdzie:
k1 i k2 - stae sorpcji i desorpcji analitu w fazie PDMS,
 , - pocztkowe stenie analitu w wodzie,
_`ab  - stenie analitu w fazie PDMS w czasie t.

Prbka i sorbent s cieczami, wic mechanizm ekstrakcji polega na podziale analitu midzy dwie fazy.
W zwizku z tym wydajno ekstrakcji zaley w gwnej mierze od wartoci staej podziau analitu
midzy dwie fazy: PDMS i wod (prbk) - _`ab/ . Staa podziau podziau jest ilorazem ste
analitu w stanie rwnowagi w fazie sorpcyjnej(cPDMS) i fazie wodnej (cw):

c PDMS m PDMS VW m
K PDMS = = = PDMS (45)
cW mW V PDMS mW

gdzie:
c - stosunek objtoci fazy wodnej  do fazy ekstrahujcej _`ab ,
_`ab - masa analitu w fazie ekstrahujcej,
 - masa analitu w fazie wodnej.
Po osigniciu stanu rwnowagi, bilans mas mona zapisa:

mW , 0 = m PDMS + mW (8)

gdzie:
 , - pocztkowa masa analitu w fazie wodnej.

czc obydwa rwnania mona wyliczy teoretyczny odzysk izolowanego analitu R:

m PDMS m PDMS K PDMS / w K /w

R= = = PDMS (47)
mW m PDMS ( K PDMS + ) K PDMS +

Ze wzoru wynika, e odzysk analitu (tym samym wydajno ekstrakcji) jest tym wyszy im mniejszy
jest stosunek objtoci faz wodnej do ekstrahujcej ().
Aby oceni, czy dla danego analitu technik SBSE z wykorzystaniem fazy PDMS osignie si
wystarczajc wydajno, mona posuy si sta podziau oktanol woda KOW, zwan te
wspczynnikiem podziau P (por. roz. I.2.4).
Jeli do wzoru na odzysk analitu w czasie ekstrakcji wprowadzi si warto staej podziau oktanol
woda, KOW dla badanej substancji, uzyska si przyblion warto jej odzysku w czasie ekstrakcji do
fazy polidimetylosiloksanowej.

85
 Staa podziau oktanol woda jest niezawodnym sposobem przewidywania zachowania si
analitu w ukadzie faz polarnej i niepolarnej. W literaturze chemicznej mona znale wartoci
staej KOW dla wielu substancji.

Staa podziau oktanolwoda jest niezawodnym sposobem przewidywania zachowania si analitu w

ukadzie faz polarnej i niepolarnej. W literaturze chemicznej mona znale wartoci wspczynnika
dla wielu substancji.

Przyjmuje si, e zwizki, ktrych log KOW jest mniejszy od jednoci, charakteryzowane s jako
hydrofilowe, wic nie bd si rozpuszczay w niepolarnej fazie PDMS. Zwizki, dla ktrych log KOW
mieci si midzy wartoci 1 a 3, charakteryzuj si rednim charakterem hydrofilowym (lub rednim
charakterem hydrofobowym) i mog w ograniczonym stopniu rozpuszcza si w fazie PDMS.
Natomiast zwizki, ktrych log KOW osiga warto powyej 3, charakteryzowane s, jako hydrofobowe
i bd dobrze rozpuszczay si w niepolarnej fazie PDMS.

Ekstrakcja SBSE skada si z kilku etapw:

Ekstrakcja (zestaw do ekstrakcji za pomoc ruchomego elementu sorpcyjnego przedstawiono

na rysunku 22).
Usuwanie resztek matrycy (soli, cukrw, biaek i innych skadnikw prbki) przez przemycie
wod i delikatne osuszenie.
Izolacja analitu z sorbentu poprzez desorpcj rozpuszczalnikiem lub termiczn.

Ekstrakcj wykonuje si mieszadekiem magnetycznym pokrytym warstw sorbentu. Jest to prt

magnetyczny umieszczony w szklanej osonie, ktr pokrywa sorbent. Komercyjnie, dostpne s
mieszadeka o dugoci 1 cm, pokryte warstw polidimetylosiloksanu, o gruboci 0,5 mm. Cakowita
objto sorbentu wynosi 24 L. SBSE wykonuje si w naczynkach HS o pojemnoi 30 mL, przy
objtoci prbek wodnych do 20 mL. Podczas ekstrakcji, mieszadeko jest zanurzone w roztworze
prbki lub umieszczone w gazowej fazie nadpowierzchniowej. Mieszadeka pokryte PDMS mona
stosowa wielokrotnie, nawet wicej ni 50 razy (oczywicie, po analizie, naley je rekondycjonowa).

Ustalenie warunkw ekstrakcji polega na:

doborze odpowiedniego czasu ekstrakcji,
doborze intensywnoci mieszania,
doborze odpowiedniej temperatury,
doborze odpowiedniego pH roztworu prbki,
doborze iloci dodawanej soli obojtnej do prbki,
wyborze modyfikatora organicznego i jego iloci,
doborze objtoci prbki i objtoci fazy ekstrahujcej.

86
Technika ekstrakcji za pomoc ruchomego elementu sorpcyjnego naley do metod rwnowagowych.
Czas osignicia rwnowagi (czas ekstrakcji) zaley od kinetyki procesu i przecitnie wynosi 30150
min. Zwikszenie kinetyki ekstrakcji mona uzyska przez mieszanie i podwyszenie temperatury.
Rozpito stosowanego czasu ekstrakcji w SBSE jest dua, od minut do doby.
W trakcje mieszania zmniejsza si grubo warstwy granicznej miedzy mieszadekiem a zawartoci
roztworu, co przyspiesza wymian mas. Ale bardzo szybkie mieszanie powoduje czstszy kontakt
mieszadeka ze ciank naczynka i moe by przyczyn uszkodze fizycznych fazy ekstrahujcej,
rwnie generowanie bbli przy wysokich obrotach nie wpywa dobrze na wydajno. Najczciej
wspczynnik ekstrakcji wzrasta ze wzrostem obrotw do 500-750 na min, potem wzrasta niewiele
lub wcale.

Naczynko HS

Prbka
Prt magnetyczny
(mieszadeko) pokryte
warstw sorbentu

Mieszado magnetyczne

Rysunek 22. Zestaw do ekstrakcji za pomoc ruchomego elementu sorpcyjnego, SBSE

Podwyszenie temperatury przyspiesza osignicie stanu rwnowagi. Ale wspczynnik podziau a

tym samym wspczynnik ekstrakcji staje si mniejszy. Poza tym skraca si czas ycia fazy PDMS, jeli
ekstrakcja prowadzona jest w temperaturze wyszej ni 40C.Wpyw temperatury na wspczynnik
ekstrakcji zaley od waciwoci analitu.
Takie parametry jak pH, dodatek soli obojtnej czy dodatek modyfikatora organicznego, wpywaj na
waciwoci analitw lub prbki i zmieniaj stan rwnowagi.
Dobr waciwego pH prbki ekstrahowanej za pomoc niepolarnej fazy PDMS, jest wany dla tych
prbek, ktrych waciwoci kwasowe lub zasadowe zale od odczynu roztworu. Odpowiedni
warto pH ustala si dla uzyskania czciowo lub cakiem niejonowej postaci analitu. Poza tym, zbyt
kwane lub zbyt zasadowe warunki nie s zalecane ze wzgldu na moliwo degradacji fazy PDMS,
co skraca jej czas ycia.
Dodatek soli obojtnej (np. NaCl, KCl) modyfikuje si jonow roztworu prbki, co wpywa na
rozpuszczalno organicznych analitw w matrycy prbki (wodzie). Dla polarnych analitw
obserwowany jest wzrost wydajnoci ekstrakcji wraz ze wzrostem dodatku soli obojtnej do roztworu
prbki. Dzieje si tak dlatego, e nastpuje hydratacja jonw soli nieorganicznej, przez co woda staje
si mniej dostpna dla organicznych zwizkw, zostaje utrudniony ruch ich czsteczek i zmniejsza si
rozpuszczalno.

87
Dla analitw hydrofobowych (o wartoci log KOW > 3,5), dodatek soli obojtnej nie jest ju tak
oczywisty. Dodatek soli nie zawsze poprawia odzysk niepolarnego analitu z wody, czasem nawet
zmniejsza. Dla wyjanienia spadku odzysku dla niepolarnych zwizkw zaproponowano kilka hipotez:

zmniejszenie rozpuszczalnoci niepolarnego zwizku powoduje jego zbieranie si na

powierzchni prbki (efekt oleju), przez co utrudniony jest jego kontakt z faz sorpcyjn na
mieszadeku,
wraz ze wzrostem stenia soli zwiksza si lepko roztworu, co zmniejsza kinetyk
ekstrakcji,
jony soli pokrywaj powierzchniow warstw polimeru PDMS i utrudniaj rozpuszczanie,
oddziaywania elektrostatyczne lub oddziaywania par jonowych midzy jonami soli i
roztworem, utrudniaj ruch analitu.

Analitycy czsto spotykaj si z przeciwnymi skutkami wysalania w przypadku tych samych

substancji, dlatego naley z wielk ostronoci podchodzi do doboru warunkw wysalania
podczas ekstrakcji.

Dodatek organicznego modyfikatora, jak metanolu czy acetonitrylu zmienia warunki ekstrakcji i stan
rwnowagi. Zmiany zalene s od waciwoci chemicznych i iloci dodanego rozpuszczalnika
organicznego i od waciwoci analitu. Podobnie jak w przypadku dodatku soli, dodatek modyfikatora
organicznego moe zwiksza lub zmniejsza wydajno ekstrakcji.
Ze wzoru (48) na odzysk R wynika, e wydajno ekstrakcji jest tym wysza im mniejszy jest stosunek faz
wodnej do ekstrahujcej, czyli im wiksza objto fazy ekstrahujcej, tym c mniejsze i odzysk wikszy.
Zaobserwowano, e wpyw stosunku faz na wydajno ekstrakcji jest wyraniejszy dla zwizkw bardziej
polarnych (o niskich wartociach KOW ni dla niepolarnych (o wyszych wartociach KOW). Z drugiej strony,
cho wiksze objtoci prbki nie zwikszaj odzysku (R), to wiksza objto prbki daje wiksz mas
analitu wprowadzan do detektora, co zwiksza jego wskazania. Przy standardowej objtoci badanych
prbek, wynoszcej 10 mL, stosunek c w przypadku SBSE wynosi 400 (10 mL/24L), za w przypadku
stosowania techniki SPME, gdzie objto fazy na wknie wynosi 5 L stosunek faz c wynosi 20000 (10
mL/5L). Jest to bezporedni przyczyn znacznie wyszego odzysku w SBSE w porwnaniu do SPME.
Odzysk analitw z mieszadeka moe odbywa si poprzez desorpcj termiczn (ang. thermal desorption,
TD), wtedy mona stosowa t ekstrakcj w poczeniu z chromatografi gazow. W desorpcji termicznej nie
ma rozpuszczalnika. Mieszadeko wprowadza si do termicznego desorbera, poczonego z chromatografem
gazowym. Desorpcja moe trwa wicej ni 15 min. Desorber termiczny jest grzany dwuetapowo, do
temperatury 150-300C. W pierwszym etapie nastpuje desorpcja termiczna analitw, po czym nastpuje
chodzenie do temperatury 150-40C (drugi etap), tzw. krioogniskowanie, pozwalajce zminimalizowa
szeroko piku na chromatogramie gazowym. Ograniczeniem termicznej desorpcji jest trwao analitu.
Anality labilne termicznie mog by desorbowane rozpuszczalnikiem (ang. liquid desorption, LD). Desorpcj
rozpuszczalnikiem stosuje si rwnie w poczeniu z chromatografi cieczow lub elektroforez.
Mieszadeko zanurzane jest w rozpuszczalniku lub mieszaninie rozpuszczalnikw, ktre musz by
dostosowane do waciwoci sorbentu. Zwykle stosowane s acetonitryl, metanol lub ich mieszanina oraz
mieszanina z wod lub wodnymi buforami. Minimalna objto rozpuszczalnika stosowanego do desorpcji

88
musi cakowicie pokrywa mieszadeko. Desorpcj rozpuszczalnikiem mona przyspieszy mieszaniem,
ogrzewaniem lub ultradwikami.
Handlowo dostpne mieszadeka pokryte s niepolarnym polidimetylosiloksanem, co ogranicza
zastosowanie ich do ekstrakcji zwizkw niepolarnych. Wydajno ekstrakcji do PDMS dla zwizkw
polarnych jest bardzo maa. Stosuje si wiele modyfikacji sorbentu PDMS, zwikszajcych
selektywno i oraz wydajno dla zwizkw hydrofilowych. Trwaj badania nad wykorzystaniem
polipirolu, pianki poliuretanowej czy alkoholu poliwinylowego.
Innym sposobem umoliwiajcym ekstrakcj polarnych zwizkw do fazy PDMS jest przeprowadzanie analitw
w mniej polarne pochodne. Derywatyzacj mona przeprowadzi bezporednio w naczynku ekstrakcyjnym. Po
dodaniu reagenta powstaje niepolarna pochodna analitu, ktra moe by ekstrahowana przez sorbent
polidimetylosiloksanowy. Reagent moe te pokrywa mieszadeko, wtedy pochodna powstaje na jego
powierzchni. Niestety, duym ograniczeniem jest niemoliwo przeprowadzenia reakcji zachodzcych w
bezwodnych warunkach. W tabeli 11 podano przykady zastosowania ekstrakcji do sorbentu na ruchomym
elemencie SBSE.

Tabela 11. Przykady zastosowa techniki SBSE (na podstawie A. Prieto A., Basauri O., R. Rodil R.
Usobiaga A., Fernndez L. A., Etxebarria N., Zuloaga O., Stir-bar sorptive extraction: A view on
method optimisation, novel applications,limitations and potential solutions, J. of Chromatography A,
1217, 26422666, 2010)

Analit Matryca, Technika Czas ekstrakcji Dodatek,

objto ekstrakcji, [min], rodzaj derywatyzacj
sorbent desorpcji a
17-Estradiol Woda SBSE, PDMS, 120, TD -
rzeczna, 10 mL 10mm/0,5mm
Chlorofenole Osady, 0,5 g SBSE, PDMS, 60, TD Ekstrakt
10mm/0,5mm MeOH, ACN,
acylowanie
Pestycydy Woda, 10 mL SBSE, PDMS, 30, LD NaCl, MeOH
10mm/0,5mm
WWA Woda, 10 mL SBSE, PDMS, 30, LD NaCl, MeOH
10mm/0,5mm
Estrogeny` Woda, 2 mL SBSE, PDMS, CD 15, LD 30% NaCl
10mm/0,5mm
Fosforoorganiczne Gleba, 10 g SBSE, MIP 60, LD Ekstrakt
pestycydy 10mm/0,5mm
Zwizki organiczne Woda, 50 mL SBSE, PPESK, 20, LD -
WWA Woda, 50 mL SBSE,PDMS CD- 90, TD -
DVB,
20mm/0,5mm
Triclocarban Woda, 10 mL SBSE, PDMS, CD 120, TD -
(3,4,4- 10mm/0,5mm
trichlorocarbanilid)

89
 Tabela 11 c.d.

Analit Matryca, Technika Czas ekstrakcji Dodatek,

objto ekstrakcji, [min], rodzaj derywatyzacj
sorbent desorpcji a
Lotne fenole i inne Wina, 30 mL SBSE, PDMS, 60, LD EtOH
polarne zwizki 10mm/0,5mm
Herbicydy Woda, 4 mL SBSE, PU, 30, LD 5% MeOH
triazynowe
TCA, fenole, Wina, 10 mL SBSE, PDMS 60, TD -
10mm/0,5mm
17-Estradiol Mocz, 1 mL SBSE, PDMS, 60 (40C), TD acylowanie
10mm/0,5mm
Kofeina i jej Pyny SBSE-RAM(alkil- 40, LD 10% MeOH
metabolity biologiczne, diol-silica),
1 mL
Lotne skadniki Mleko ludzkie, SBSE, PDMS 60, TD -
zapachowe 5 mL 20mm/0,5mm
Hormony pciowe Woda, mocz, SBSE, PDMS 120 lub 240, NaCl
30 mL 20mm/1mm LD
Antydepresanty Osocze, 1 mL SBSE, PDMS, 45, LD Bufor
10mm/0,5mm boranowy

CD - -cyklodekstryna, MIP - Nylon 6 imprintowany czsteczkami fosforoorganicznego pestycydu,

Alkil-diol-silica RAM (metoda ograniczonego dostpu do fazy staej), PPESK (polimer pochodnej
ftaloazyny, zawierajcej grup slufonow, eterow i ketonowe), DVB diwinylobenzen, Pu pianka
poliuretanowa, TCA kwas trichlorooctowy.
Istotnym problemem w ekstrakcji SBSE jest duy wpyw matrycy, ale mimo tego ograniczenia,
metoda ta znajduje coraz szersze zastosowanie w analityce prbek rodowiskowych, biologicznych,
medycznych, ywnoci oraz pasz zwierzcych i moe by rutynow technik ekstrakcji.

4.3.4. Ekstrakcja z ograniczonym dostpem do fazy stacjonarnej

Ekstrakcja do fazy staej moe odbywa si jednoczenie wg dwch rnych mechanizmw

rozdzielania. Tak si dzieje w przypadku stosowania kolumienek z wypenieniem typu RAM (ang.
restricted access material or restricted access media), a metod mona nazwa ekstrakcj z
ograniczonym dostpem do fazy stacjonarnej. Ograniczenie powoduje zewntrzna, stykajca si z
matryc, powierzchnia fazy stacjonarnej, ktrej waciwoci fizyczne lub chemiczne uniemoliwiaj
sorpcj czsteczek o duych rozmiarach, takich jak: biaka, kwasy nukleinowe czy polimery.
Substancje niskoczsteczkowe mog penetrowa mae pory sorbentu i ulega ekstrakcji przez podzia
do wntrza fazy stacjonarnej, ktra ma najczciej charakter faz odwrconych (niepolarny).

Technika RAM czy w sobie mechanizm wykluczania z mechanizmem podziaowym.

90
Fazy stae RAM, ze wzgldu na mechanizm wykluczania makromoleku, dzieli si na dwie grupy. W pierwszej
grupie wykluczanie odbywa si z powodu fizycznej bariery, jak jest wielko porw powierzchni fazy staej,
a ekstrakcja analitw zachodzi wewntrz porw. Sorbenty w tej grupie mog mie rny charakter, zaleny
od waciwoci analitu, np. fazy odwrcone, jak krzemionka modyfikowana gliceryn i zwizana z
acuchami wglowodorowymi C4, C8 lub C18, znana pod nazw ADS (ang. alkil-diol-silica) oraz fazy z
porowatej krzemionki z rnymi ligandami.
W drugiej grupie, wykluczanie odbywa si z powodu chemicznej bariery. Oprcz odpowiedniej wielkoci
porw, zewntrzna warstwa sorbentu stanowi pprzepuszczaln powierzchni - krzemionk pokryt
biakami albo fazy z mieszanymi funkcjami lub oson hydrofobow. W technice RAM s rwnie stosowane
fazy stae o specyficznych waciwociach, np. umoliwiajce rozdzieanie enancjomerw lub separacja
oparta na mechanizmie jonowymiennym. Struktura zewntrznej warstwy sorbentu umoliwia desorpcj
makromoleku i stosowanie sorbentu wielokrotnie. Wewntrzn warstw sorbentu take najczciej
stanowi sorbent o charakterze odwrconych faz, typu ADS, na ktrym sorpcja zachodzi gwnie na skutek
oddziaywa Van der Waalsa. Sorbent ten jest stosowany do szerokiego zakresu analitw.
Technika z zastosowaniem RAM wykorzystywana jest przede wszystkim w analizach biologicznych, co
pozwala wyeliminowa z preparatyki wstpne usuwanie biaek i innych duych polarnych skadnikw
(usuwanych dotd przez strcanie, wirowanie itp.). Technika ta stosowana jest do analizy wielu
substancji, w tym lekw i ich metabolitw, w pynach fizjologicznych, takich jak: osocze krwi, mocz
czy wydzielina z nosa, jak rwnie do oznaczania substancji w supernatantach przy hodowli kultur
komrkowych i in. Technika ekstrakcji z ograniczonym dostpem do fazy stacjonarnej ma
zastosowanie rwnie w analizach prbek rodowiskowych, np. do oznaczania herbicydw.

4.3.5. Ekstrakcja przez wykluczanie na sorbentach immunologicznych

W sytuacji, gdy analit wystpuje w prbkach w iloci ladowej, a substancje interferujce w duym
steniu, zastosowanie nieselektywnego sorbentu do ekstrakcji nie przyniesie oczekiwanych
rezultatw. W takim przypadku tej intensywne sygnay interferentw bd maskowa sygnay
analitw na chromatogramie.

Najbardziej selektywnymi sorbentami, stosowanymi do ekstrakcji do fazy stacjonarnej i

redukujcymi wpyw matrycy s sorbenty immunologiczne.

Sorbent immunologiczny umoliwia izolacj, oczyszczanie i zagszczanie analitu w jednej operacji.

Mechanizm ekstrakcji polega na rozpoznaniu molekuy analitu przez przeciwciao (na zasadzie oddziaywania
antygen-przeciwciao). Odpowiednie przeciwciaa (jednego rodzaju lub rne) unieruchamia si poprzez
wizania kowalencyjne z powierzchni nonika, np. krzemionki (rysunek 23). Taki sorbent nazywany jest
immunosorbentem (IS) i moe by przewidziany do ekstrakcji pojedynczego analitu, analitu i jego
metabolitw oraz klasy strukturalnie podobnych analitw. Szczeglnie wydajn, przy zastosowaniu
immonosorbentw, jest ekstrakcja analitw z prbek biologicznych i rodowiskowych.

91
 Powierzchnia
krzemionki

Przeciwciao

Analit

Miejsce
wice

Rysunek 23. Schemat budowy i dziaania immunosorbentu (IS)

W analizach zanieczyszcze rodowiska, immunosorbenty zastosowano do wykrywania np.

pochodnych triazyn (herbicydy), wielopiercieniowych wglowodorw aromatycznych (WWA),
pochodnych fenylomocznika (herbicydy), benzydyny, barwnikw azowych, aflatoksyn, ochratoksyn,
lekw weterynaryjnych, wglowodorw aromatycznych BTEX, kortykosteroidw i in.
Immunosorbenty stosowane s w postaci wypenienia kolumienek SPE lub w postaci wymiennego
naboju. Wysokie powinowactwo przeciwciaa do analitu zapewnia bardzo wysok selektywno, wic
nie ma problemu z substancjami interferujcymi z matrycy.

4.3.6. Ekstrakcji za pomoc polimerw z nadrukiem molekularnym

Zasada dziaania polimerw z nadrukiem molekularnym (ang. molecularly imprinted polymers, MIP)
jest porwnywana z rozpoznawaniem czsteczek przez naturalne biomolekuy (receptory, enzymy,
przeciwciaa). W tak przygotowanym polimerze znajduj si trjwymiarowe miejsca wychwytu
(wnki), odpowiadajce wymiarom i charakterowi chemicznemu czsteczki analitu. Mechanizm
ekstrakcji oparty jest na efekcie wykluczania, wynikajcego z rnic w wielkoci i ksztacie czsteczek
oraz charakteru zwizku i wynikajcych z niego sposobw oddziaywa z polimerem (wizania
wodorowe, oddziaywania dipol-dipol, tworzenie par jonowych itp.). Na rysunku 24 przedstawiono
sposb otrzymywania polimerw z nadrukiem molekularnym. Aby otrzyma polimer zdolny
wychwyci czsteczki analitu naley waciwie dobra monomer funkcyjny oraz poszczegln
substancj (analit) lub substancj, bdc analogiem strukturalnym analitu lub grupy analitw.
Monomer funkcyjny jest to substancja zdolna do polimeryzacji, najczciej posiadajca sprzone
podwjne wizania oraz posiadajca odpowiednie grupy funkcyjne, dobrane do grup obecnych w
czsteczce analitu tak, aby mogo zachodzi wizanie kowalencyjne lub inne oddziaywania midzy
monomerem a analitem, np. elektrostatyczne, wodorowe czy hydrofobowe( od ich rodzaju zale
techniki modelowania polimeru).

92
 Polimeryzacja waciwa Usuwanie
z odczynnikiem substancji
sieciujcym wzorcowej

Czasteczka
analitu (lub Waciwa struktura
Monomer Struktura polimeru z substancj Polimer po usuniciu
substancja
funkcyjny prepolimeryzacyjna substancji wzorcowej
wzorcowa) wzorcow

Rysunek 24. Schemat otrzymywanie molekularnie imprintowanych polimerw

W wyniku tych oddziaywa substancja wzorcowa i monomer, rozpuszczone w wybranym

rozpuszczalniku, tworz trwa struktur, zwan kompleksem prepolimeryzacyjnym. Po dodaniu
odczynnika sieciujcego zachodzi waciwa polimeryzacja, utrwalajca struktur prepolimeru. Po
usuniciu z polimeru substancji wzorcowej, powstaje miejsce zdolne wychwytywa selektywnie
czsteczki analitu z mieszaniny wieloskadnikowej. Molekularnie imprintowany polimer jest stabilny
chemicznie i fizycznie i mona go stosowa wielokrotnie (rysunku 25).

Molekularnie
imprintowany Sorpcja z Desorpcja z
polimer i prbka prbki polimeru

Rysunek 25. Schemat ekstrakcji za pomoc polimeru z nadrukiem molekularnym

Wrd czsto stosowanych monomerw funkcyjnych znajduj si: kwas akrylowy, kwas
metakrylowy, kwas 4-winylobenzoesowy(monomery kwane), winylopirydyna, winyloimidazol,
alliloamina(monomery zasadowe), styren, akrylonitryl, metakrylan metylu, akrylamid(monomery
obojtne). Dobr rozpuszczalnika zaley od stosowanych monomerw i substancji oznaczanej,
najczciej uywane s toluen, acetonitryl, chloroform czy metanol. Molekularnie imprintowane
polimery s stosowane w wielu dziedzinach, ale najszersze zastosowanie znalazy w izolacji i zagszczaniu
substancji. Jako faza stacjonarna w technice SPE stosowane s do izolowania substancji czynnych w
materiale biologicznym, jak np. antybiotykw czy -blokerw w moczu, krwi, osoczu oraz w tkankach

93
wtroby, nerek czy mini. Wykorzystywane s te w testach immunologicznych oraz do izolowania i
oznaczania substancji toksycznych lub szkodliwych w prbkach rodowiskowych: wodzie, glebie, ywnoci
i paszach. Handlowo dostpne s polimery z nadrukiem do oznaczania: -blokerw, -receptorw,
antybiotyku chloramfenikol, ryboflawiny (wit. B2), herbicydw triazynowych i in.

Nowym kierunkiem w ekstrakcji do fazy staej jest poczenie sorbentw stosowanych w technice
RAM z molekularnie imprintowanymi polimerami (RAM-MIP). Schemat takiego rozdzielania,
stosowanego do izolacji triazynowych herbicydw pokazano na rysunku 26.

Prbka Zmiana
rozpuszczalnika

Przemywanie Rozpuszczalnik
wod
organiczny

RAM

Przemywanie
Naoenie rozpuszczalnikiem Mieszanina
prbki organicznym wodnoorganiczna

Rozdzia
skadnikw
wg rozmiaru
moleku

MIP

Analit

Niskoczasteczkowe
skadniki matrycy

Wielkoczsteczkowe
skadniki matrycy
Rozpoznanie Wymycie
czsteczek pozostaoci Desorpcja
analitu matrycy analitu

Rysunek 26. Schemat procedury rozdzielania za pomoc poczonych technik RAM-MIP, u gry, po
lewej stronie schemat rozdzielania na kolumience RAM, po prawej u dou schemat procedury na
kolumience MIP (na podstawie Guiochon G., A., Beaver L., A., Progress and future of instrument al
analytical chemistry applied to the environment, Analytica Chimica Acta, 523,1-14, 2004)

94
Procedura izolacji skada si z dwch etapw:

usuniciu z prbki wielkoczsteczkowych zanieczyszcze,

wyizolowanie czystego analitu z wstpnie oczyszczonej prbki.

W pierwszym etapie, po zaadowaniu prbki na kolumienk nastpuje odmycie wod (roztworem

wodnym) zanieczyszcze wielkoczsteczkowych, nieprzechodzcych przez mae pory wierzchniej
warstwy sorbentu. Analit i inne zanieczyszczenia zostaj na wewntrznej warstwie sorbentu.
Nastpnie, zmieniajc rozpuszczalnik na organiczny, wymywa si zwizki z sorbentu. Wstpnie
oczyszczon prbk nanosi si na kolumienk, w ktrej sorbentem jest polimer imprintowany
czsteczkami triazyny. Czsteczki triazynowego herbicydu pozostaj w aktywnych wnkach polimeru,
a pozostae skadniki s usuwane wraz z rozpuszczalnikiem. Nastpnie, stosujc mieszanin wodno-
organiczn o okrelonym pH, wymywa si czysty analit. Taka technika jest bardzo selektywna i
pozwala unika niekorzystnych oddziaywa w czasie analizy i moe znale szerokie zastosowanie w
analityce medycznej. Kolumienki RAM-MIP mog by wykorzystane wielokrotnie, po uprzednim
przemyciu i kondycjonowaniu.

4.3.7. Mikroekstrakcja do upakowanego sorbentu w strzykawce

Mikroekstrakcja do staego sorbentu upakowanego w strzykawce (ang. microextraction by packed

sorbent lub microextraction in packed syringe, MEPS) jest te nazywana krtk kolumn
chromatograficzn w strzykawce. Jest to nowa technika ekstrakcji, cho oparta na starej zasadzie
jest miniaturyzacj ekstrakcji do fazy staej (SPE). Mikroekstrakcja do upakowanego sorbentu moe
by poczona bezporednio z chromatografem cieczowym lub gazowym lub jako odrbna metoda
izolacji substancji. Najistotniejsz cech tej techniki jest to, e zoe sorbentu jest integraln czci
strzykawki a nie osobn kolumn. Wszystkie czynnoci, jak przemywanie, kondycjonowanie zoa,
sorpcja i desorpcja wykonywane s w tym samym miejscu - w strzykawce, ktr rwnie wprowadza
si prbk do dozownika chromatografu.

W mikroekstrakcji do fazy staej w strzykawce stosuje si te same sorbenty, co w SPE, wic

standardowe fazy RPC-18, RPC-8 i inne produkowane na bazie krzemionki oraz polimery, jak
polidiwinylobenzen czy molekularnie drukowane polimery a take wymieniacze jonowe i
przeciwciaa. Minikolumn w strzykawce przygotowuje si w ten sposb, e do mikrostrzykawki o
pojemnoci 100 250 L wsypuje si midzy dwa filtry polietylenowe sorbent stay w iloci 1-4 mg,
co daje mikrolitrowe objtoci kolumienki. Do wymycia analitu z tak maej iloci zoa wystarcz
mikrolitowe objtoci rozpuszczalnika, stosowne do dozowania do chromatografu. Strzykawka MEPS
moe by uywana do ekstrakcji wiele razy, nawet powyej stu.

Mikroekstrakcja do fazy staej w strzykawce obejmuje podobne etapy jak w metodzie SPE. Po
kondycjonowaniu kolumienki ekstrakcj przeprowadza si nastpujco: 101000 L ciekej
prbki przepuszcza si w strzykawce przez sorbent, nacigajc i wypuszczajc pyn wielokrotnie,
a wymagana ilo analitu zostanie zatrzymana na fazie staej. Nastpnie faz sta naley
przepuka ma objtoci rozpuszczalnika prbki (wody), aby usun niesorbujce si na fazie
stacjonarnej substancje. Zoe wysuszy, po czym ma objtoci rozpuszczalnika organicznego
lub fazy ruchomej eluowa anality bezporednio do dozownika HPLC lub GC. Schemat

95
postpowania przy wykonywaniu mikroekstrakcji w strzykawce przedstawiono na rysunku 27a.
Proces mikroekstrakcji moe by zautomatyzowany, poszczeglne etapy ekstrakcji mog
odbywa si w automatycznym podajniku prbek (autosamplerze).

Strzykawka z sorbentem moe by wykorzystywana wielokrotnie, do rnych analiz, pod warunkiem,

e sposb regeneracji bdzie dopracowany dla kadego zastosowania odrbnie. Zoe sorbentu moe
by upakowane w korpusie strzykawki lub jako wkadka (nabj) midzy korpusem strzykawki a ig
oraz oba warianty jednoczenie (rysunku 27b).

Mikroekstrakcja do upakowanego sorbentu w strzykawce moe by stosowana do ekstrakcji

szerokiego zakresu analitw. Poczenie techniki MEPS z wysokosprawn chromatografi cieczow i
spektrometri mas jest narzdziem do oznaczania w pynach ustrojowych (osocze, krew, mocz) lekw
i ich metabolitw, takich jak: rodki znieczulajce, -blokery, leki przeciwrakowe, antydepresanty
oraz zwizkw toksycznych - narkotykw i ich metabolitw, amfetaminy we wosach,
monoterpenowych metabolitw w moczu i in. Technik t zastosowano rwnie do ekstrakcji
wielopiercieniowych wglowodorw aromatycznych w wodzie, ochratoksyny A (mikotoksyna
kancerogenna) w winie, trichloroanizolu (substancja o stchym, mulistym zapachu) w winie.

Ruchy toczka strzykawki: wielokrotne - , pojedyncze -

Warstwa
sorbentu
staego

Ciecz do
Prbka Eluent Dozownik
przemywania

a) b

Rysunek 27. Schemat postpowania przy wykonywaniu mikroekstrakcji do upakowanego sorbentu

(MEPS)

96
Mikroekstrakcja do upakowanego sorbentu w strzykawce MEPS jest obiecujc metod izolacji i
zagszczania substancji z wielu powodw:

jest prosta w uyciu,

moe by cakowicie zautomatyzowana,
jest szybka,
redukuje iloci rozpuszczalnika i prbki,
jest zdecydowanie tasza od ekstrakcji do fazy stacjonarnej, SPE.

Strzykawki z upakowanym sorbentem s dostpne komercyjnie.

5. Ekstrakcja prbek staych

Ekstrakcja w ukadzie ciao stae ciecz (ang. solid liquid extraction, SLE) jest podstawow metod
wyodrbniania z ciaa staego substancji rozpuszczalnych w wodzie lub rozpuszczalnikach
organicznych. Ekstrakcj ciecz stosuje si do wydzielania substancji z materiau rolinnego
(substancji tuszczowych z rolin oleistych, substancji aktywnych biologicznie z zi, owocw, korzeni,
substancji zapachowych i smakowych z rolin), z materiau pochodzenia zwierzcego (tuszcze,
witaminy) oraz z gleby, osadw i zawiesin. Ekstrakcja w ukadzie ciao stae ciecz jest te czsto
stosowana do desorpcji analitu z sorbentu staego.

Na wydajno i kinetyk ekstrakcji wpywaj trzy, cile ze sob zwizane, czynniki:

rozpuszczalno, przenoszenie masy i wpyw matrycy.

Ekstrahowana substancja musi by dobrze rozpuszczalna w stosowanym ekstrahencie.

Rozpuszczalno analitu zaley od rodzaju rozpuszczalnika, a dla wybranego rozpuszczalnika, od
temperatury i cinienia. Aby zaistniaa ekstrakcja w ukadzie dwufazowym ciao stae ciecz
konieczna jest desorpcja analitu z powierzchni matrycy i rozpuszczenie go w rozpuszczalniku. W tym
celu musi nastpi transport rozpuszczalnika do wntrza matrycy (miejsc adsorpcji), a nastpnie
przeniesienie roztworu z miejsc desorpcji. Transport masy (rozpuszczalnika i analitu) zaley od
wspczynnikw dyfuzji i struktury matrycy.

Wspczynniki dyfuzji zmieniaj si ze zmian warunkw ekstrakcji. Podwyszona

temperatura, niska lepko rozpuszczalnika, rozdrobnienie matrycy oraz mieszanie w czasie
ekstrakcji przyspieszaj przenoszenie masy.

Matryca moe znacznie wpywa na wydajno ekstrakcji, zwaszcza, jeli silnie oddziauje z analitem.
W takim przypadku nawet bardzo dobrze rozpuszczalny analit jest niedostpny, bo silnie zwizany z
matryc zalega w jej porach.
Prbki stae wymagaj wstpnego przygotowania przed ekstrakcj. Bardzo czsto prbki zawieraj
wod, ktr trzeba usun, by uatwi penetracj rozpuszczalnika organicznego. Woda zawarta w
matrycy ogranicza dostp do zaadsorbowanego analitu, zmniejsza jego rozpuszczalno w

97
rozpuszczalniku organicznym i sprawia due problemy przy izolacji z ekstraktu. Sposb usuwania
wody zaley od rodzaju matrycy i lotnoci oraz trwaoci analitu (nietrwao w obecnoci tlenu czy
promieniowania UV). Zwykle prbki suszy si w temperaturze pokojowej do tzw. powietrznie
suchych, lub w suszarce, w temperaturze 40C. Prbki z nielotnymi analitami mona liofilizowa, dla
usunicia wody. Wysuszone prbki naley rozdrobni. W zalenoci od rodzaju prbki rozdrabnianie
wykonuje si przez kruszenie w specjalnych urzdzeniach, mielenie w mynach lub rozcieranie w
modzierzach. Niestety, w ten sposb nie mona postpowa z prbkami zawierajcymi lotne anality
lub/i zagraajce zdrowiu. W takim przypadku zaleca si osuszanie prbki przez roztarcie z
bezwodnym siarczanem sodu lub ziemi okrzemkow (diatomitem).

Wybr techniki ekstrakcji zaley przede wszystkim od stanu skupienia matrycy, waciwoci i
stenia analitu oraz waciwoci i stenia substancji przeszkadzajcych. Technik ekstrakcji
naley dostosowa do celu, czasu analizy, sposobu przygotowania prbki do ekstrakcji oraz
czuoci i selektywnoci metody kocowego oznaczania, jeli takie jest stosowane.

Wybr rozpuszczalnika podyktowany jest waciwociami analitw, matrycy oraz substancji

przeszkadzajcych. W zalenoci od celu ekstrakcji, rozpuszczalnik powinien dobrze izolowa rne
klasy zwizkw lub selektywnie okrelony zwizek.

Niezalenie od celu ekstrakcji, rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalnikw powinna by tak

dobrana, by w najmniejszym stopniu wspekstrahowaa substancje przeszkadzajce.

5.1. Ekstrakcja prbek staych faz gazow

Oznaczanie lotnych substancji, rozpuszczonych lub zaadsorbowanych w kompleksie matrycy staej
(np. glebie, ywnoci, farmaceutykach czy polimerach) metodami tradycyjnymi moe by mao
powtarzalne i niedokadne. Metody tradycyjne wymagaj wstpnego przygotowania prbki, jak
suszenie czy rozdrabnianie. S to czynnoci, ktre powoduj due straty ilociowe zwizkw lotnych.
Zatanie ekstraktw to kolejny etap strat analitw. Jednym ze sposobw dokadnego oznaczania
lotnych zwizkw organicznych (ang. volatile organic compounds, VOCs) jest ekstrakcja do fazy
gazowej. Ekstrakcj prowadzi si w ukadzie zamknitym, prbka moe by ekstrahowana w stanie
natywnym. Poza tym, ekstrakt gazowy moe by bezporednio badany najlepsz, do oznaczania
analitw lotnych, technik chromatografii gazowej.

5.1.1 Ekstrakcja do gazowej fazy nadpowierzchniowej

Ekstrakcj do fazy gazowej mona przeprowadza w ukadzie statycznym (ekstrakcja rwnowagowa,
SHS) lub dynamicznym (PT), w ktrym nie musi by osignity stan rwnowagi termodynamicznej.
Aby uatwi desorpcj analitw z fazy staej i rozpuszczenie w fazie gazowej, czsto dodaje si do
prbki niewielk ilo wody lub innego rozpuszczalnika.
Sposoby i zasady ekstrakcji do fazy gazowej przedstawione s w rozdziale: 4.1.1. Ekstrakcja do
gazowej fazy nadpowierzchniowej.

98
5.1.2. Ekstrakcja dynamiczna technik wymywania i wychwytywania

Sposoby i zasady ekstrakcji do fazy gazowej technik wymywania i wychwytywania przedstawione s

w rozdziale: 4.1.2. Ekstrakcja strumieniem gazu przepywajcym przez prbk.

5.1.3. Ekstrakcja strumieniem gazu z desorpcj termiczn

W metodzie desorpcji termicznej i ekstrakcji strumieniem gazu czynnikiem ekstrahujcym jest

temperatura. Pod wpywem ogrzewania substancje desorbuj si z matrycy staej i s przenoszone
strumieniem gazu do puapki analitw lub bezporednio do analizatora, np. chromatografu gazowego.
Ten sposb ekstrakcji jest przede wszystkim stosowany do desorpcji analitw z adsorbentw staych lub
filtrw, ktre byy uyte do izolacji substancji z matryc gazowych czy ciekych i stosowany zarwno w
laboratoriach analitycznych jak i przemyle.
W przemyle, do desorpcji zwizkw organicznych z sorbentu staego, np. do desorpcji rozpuszczalnikw z
wgla aktywnego, najczciej stosuje si przegrzan par wodn. Para wodna spenia tu podwjn rol:
dostarcza ciepa do desorpcji termicznej i wypiera czsteczki rozpuszczalnika, adsorbujc si na wglu
aktywnym. Desorpcj termiczna przeprowadza si rwnie gorcym gazem obojtnym. Przez zoe
przepuszcza si podgrzany gaz, ktry je ogrzewa, umoliwiajc termiczn desorpcj zaadsorbowanych
zwizkw, przenoszonych nastpnie strumieniem gazu. Proces taki mona prowadzi w otwartym ukadzie
przepywu gazu obojtnego (gaz nie jest zawracany do desorpcji) i zamknietym (koowym), z zawracaniem
do ekstrakcji.
Inny sposobem jest ekstrakcja gazem obojtnym zoa podgrzanego do temperatury desorpcji. Taki
sposb jest stosowany w analityce, w urzdzeniach zwanych desorberami termicznymi. Stosujc
odpowiedni temperatur desorpcji, mona ekstrahowa anality lotne (VOCs) oraz wysokowrzce, jak
WWA czy PCB.
Desorbery termiczne skadaj si z komory, ogrzewanej i termostatowanej elektrycznie, do ktrej wkada si
pojemnik(rurk) z sorbentem staym, zaworu wielodronego i sterownika elektronicznego. Najprostszy
sposb desorpcji polega na poczeniu desorbera termicznego z chromatografem gazowym i bezporednim
wprowadzeniu desorbowanych analitw wraz ze strumieniem gazu nonego na kolumn
chromatograficzn. Ten sposb stosowany jest do zwizkw, ktrych temperatura wrzenia nie przekracza
200C. Bardziej skomplikowanym sposobem, z zastosowaniem midzyoperacyjnego wzbogacania analitw,
jest:
desorpcja termiczna a nastpnie wymraanie uwolnionych analitw pustej kapilarze, dla ich
zagszczenia,
desorpcja termiczna analitw a nastpnie adsorpcja ich na innym sorbencie, z ktrego
desorpcja wprost do kolumny chromatograficznej jest atwiejsza.

Zagszczenie desorbowanych termicznie analitw mona uzyska przez ich bezporednie

wprowadzenie na czoo kolumny chromatograficznej, ktre jest utrzymywane w temperaturze
pokojowej lub chodzone za pomoc par ciekego azotu lub ditlenku wgla. Rozdzielanie
chromatograficzne prowadzone jest nastpnie w programowanej temperaturze kolumny.

Termiczna desorpcja nie wymaga skomplikowanej procedury ekstrakcji, odzwierciedla rzeczywisty

skad prbki, nawet lotnych skadnikw i nie wymaga duych iloci prby.

99
Du zalet desorpcji termicznej w poczeniu z chromatografi gazow jest brak duego sygnau
rozpuszczalnika, ktry moe maskowa obecno innych zwizkw. Termiczna desorpcja w poczeniu z
chromatografi gazow jest stosowana do analizy lotnych zwizkw organicznych (VOCs) w powietrzu
atmosferycznym i w pomieszczeniach zamknitych. Stosowana jest rwnie, jako technika izolacji rnych
zanieczyszcze, zaadsorbowanych w pyach, jak pestycydy, wielopiercieniowe wglowodory aromatyczne i
wiele innych substancji.

5.2. Ekstrakcja w ukadzie ciao stae ciecz

Stosowane obecnie techniki ekstrakcji prbek staych ciecz mona podzieli na:

techniki tzw. klasyczne,

techniki klasyczne wspomagane,
wspczesne techniki ekstrakcji, z zastosowaniem niekonwencjonalnych rozpuszczalnikw
oraz warunkw procesu.
Klasyczne techniki ekstrakcji, cho cigle stosowane, skutecznie wypierane s przez modyfikowane
sposoby izolacji substancji. Stosowanie fizycznych metod wspomagania ekstrakcji, takich jak:
zwikszanie cinienia ekstrahenta, stosowanie promieniowania mikrofalowego lub fal
ultradwikowych, zdecydowanie zwiksza wydajno ekstrakcji, co z kolei zmniejsza zuycie lotnych i
szkodliwych rozpuszczalnikw oraz energii.

5.2.1. Ekstrakcja rozpuszczalnikiem przez wytrzsanie

Najprostsz technik klasyczn, cho niewygodn, jest cigle stosowana ekstrakcja

rozpuszczalnikiem przez wytrzsanie. Jest ona dugotrwaa, wymagajca pracy i duej iloci
ekstrahenta. Prbk po wysuszeniu i rozdrobnieniu umieszcza si w naczyniu, zalewa
rozpuszczalnikiem i wytrzsa. Prbk ekstrahuje si wielokrotnie, za kadym razem wie porcj
rozpuszczalnika. Uzyskane porcje ekstraktu czy si, sczy dla oddzielenia czstek staych prbki i
odparowuje rozpuszczalnik.

5.2.2. Ekstrakcja przez homogenizacj prbki z rozpuszczalnikiem

Do prbek rolinnych i biologicznych czsto stosuje si homogenizacj prbki z rozpuszczalnikiem.

Prbk zalewa si odpowiednim rozpuszczalnikiem i rozdrabnia przez miksowanie lub ucieranie.
Ekstrakcja zachodzi jednoczenie z rozdrabnianiem. Uzyskany ekstrakt jest nastpnie oddzielany od
nierozpuszczalnej pozostaoci przez sczenie lub czciej, zwaszcza w przypadku prbek
biologicznych, poprzez wirowanie. Pozostay osad mona zawrci do nastpnej ekstrakcji.
Powtarzanie homogenizacji kilkoma porcjami wieego rozpuszczalnika daje wiksz wydajno
ekstrakcji. W niektrych przypadkach istnieje potrzeba podgrzania rozdrobnionej w rozpuszczalniku
prbki, wtedy naley j przenie do kolby i ogrzewa pod chodnica zwrotn. Taka metoda nazywa
si digesti i stosowana jest bardzo czsto w analityce farmaceutycznej.

5.2.3. Ekstrakcja przez zmydlanie (saponifikacja)

Sposb zwizania analitu z matryc prbki staej zaley od budowy jego czsteczki. Np. wglowodory
czy sterole zwizane s z hydrofobowymi regionami czsteczek biakowych czy tuszczowo-

100
biakowych wizaniami hydrofobowymi lub Van der Waalsa. W takim przypadku do ich ekstrakcji
mona uy rozpuszczalnika niepolarnego, jak eter di etylowy, heksan czy chloroform. Anality
zwizane wizaniami wodorowymi czy elektrostatycznymi musz by ekstrahowane
rozpuszczalnikami polarnymi, jak metanol czy etanol, aby nastpio rozerwanie wiza wodorowych i
dezaktywacja miejsc przycigania elektrostatycznego. Jeli analit jest zwizany z matryc wizaniami
kowalencyjnymi, np. kwasy tuszczowe zwizane estrowo, amidowo czy glikozydowo z biakami czy
polisacharydami, mona go ekstrahowa dopiero po hydrolizie tych wiza. Wykonuje si zazwyczaj
hydroliz alkaliczn, stosujc alkoholowy roztwr wodorotlenku sodu lub potasu. Reakcj t nazwano
zmydlaniem, bo jej produktem s myda - sole sodowe czy potasowe kwasw tuszczowych. Po
zmydleniu do prbki dodaje si wod, roztwr zobojtnia i wolne kwasy mona ekstrahuje
niepolarnym rozpuszczalnikiem.

Reakcje zmydlania przeprowadza si bardzo czsto, w przypadku prbek pochodzenia rolinnego czy
zwierzcego, np. przy oznaczaniu steroli w komrkach rolinnych.

Sterole wystpuj w formie wolnej lub zwizane estrowo lub glikozydowo. Zwizki steroli mona
wyekstrahowa odpowiednim rozpuszczalnikiem, a nastpnie przeprowadzi reakcj zmydlania i
izolowa wolne sterole niepolarnym rozpuszczalnikiem.
Reakcj zmydlania przeprowadza si rwnie ze wzgldu na charakter matrycy. Gdy analit niepolarny
znajduje si w rwnie niepolarnej matrycy, np. witaminy A, D, E (rozpuszczalne w tuszczach)
zawarte w oleju.

Przeprowadzajc zmydlanie zmienia si charakter matrycy (np. oleju) na polarny, wtedy

niepolarne skadniki mona ekstrahowa niepolarnym rozpuszczalnikiem.

Podobnie mona oznaczy benzo(a)piren (rakotwrczy wielopiercieniowy wglowodr aromatyczny)

w oleju. Zmydlenie oleju powoduje, e prbka zmienia charakter na polarny, z ktrego atwo
wyekstrahowa wglowodr niepolarnym rozpuszczalnikiem. Reakcj zmydlania przeprowadza si na
gorco, pod chodnic zwrotn, a ekstrakcj - jedn z technik w ukadzie ciecz ciecz. Ekstrakcj
poczon ze zmydlaniem, bardzo czsto stosuje si przy ekstrakcji materiau rolinnego i
zwierzcego.

5.2.4. Ekstrakcja za pomoc strumienia rozpuszczalnika

Ekstrakcja za pomoc strumienia rozpuszczalnika polega na cigym przepywie rozpuszczalnika

przez prbk. Prbka jest umieszczona w kolumnie, przez ktr jest pompowany rozpuszczalnik.
Zalet tego procesu jest to, e prbka, bdca w nieprzerwanym kontakcie z rozpuszczalnikiem,
styka si cigle ze wie jego porcj. Proces ten mona prowadzi w podwyszonej
temperaturze, ale nieprzekraczajcej temperatury wrzenia zastosowanego rozpuszczalnika.
Rozpuszczalnik z ekstraktem jest odprowadzany do destylacji, po czym jako czysty zawracany jest
do procesu. Ekstrakcj za pomoc strumienia rozpuszczalnika nazywa si perkolacj i czsto
stosuje w przemyle tuszczowym.

101
5.2.5. Ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika z prbki zmieszanej z wypeniaczem

Wyodrbnianie za pomoc strumienia rozpuszczalnika wraz z jednoczesnym wstpnym

rozdzielaniem mieszaniny mona uzyska, stosujc ekstrakcj za pomoc rozpuszczalnika z prbki
zmieszanej z wypeniaczem (ang. matrix solid-phase dispersion, - MSPD). Ekstrakcja polega na
wymywaniu substancji z prbki staej zmieszanej z sorbentem. Charakter sorbentu dobierany jest
do natury matrycy i waciwoci substancji izolowanej oraz interferentw i moe suy do
zatrzymywania jednych lub drugich. Stosowane s sorbenty polarne, np. el krzemionkowy, Florisil,
tlenek glinu lub niepolarne np. krzemionka zwizana z acuchami wglowodorowymi C-8 lub C-
18. Ucieranie prbki z du iloci sorbentu mechanicznie niszczy struktur tkanki rolinnej czy
zwierzcej, powoduje rozproszenie i sorpcj prbki na powierzchni sorbentu poprzez hydrofobowe
i hydrofilowe oddziaywania. Wynikiem tego jest jakby nowa struktura sorbentu, bdcego
jednorodn mieszank prbki i wypeniacza, wolnej od pynw i prawie suchej. Podczas przepywu
rozpuszczalnika przez t mieszanin, nastpuje ekstrakcja i podzia ekstraktu miedzy faz ciek -
rozpuszczalnik a faz sta sorbent. Wykonanie ekstrakcji technik MSPD przedstawiono na
rysunku 28.

a)

b) c) d) e)

Rysunek 28. Schemat ekstrakcji za pomoc rozpuszczalnika z prbki zmieszanej z wypeniaczem (MSPD)

Etapem pierwszym jest rozdrobnienie i dokadne wymieszanie prbki staej z sorbentem (rysunek
28a). Masa prbki zaley od stenia analitu i czuoci metody stosowanej w kolejnym etapie
analizy, najczciej wynosi od 0,5 do 1,0 g. Prbk miesza si z sorbentem zwykle w proporcji 1 do
4. Stosunek masy prbki do masy sorbentu zaley od natury matrycy, w przypadku prbek
zawierajcych duo wody (owoce, warzywa) masa sorbentu moe by wiksza ni czterokrotna

102
masa prbki. Mieszanin prbki i sorbentu umieszcza si w kolumience (rysunek 28b). Na wierzch
zoa nakada si filtr z bibuy i zawarto kolumienki delikatnie ugniata toczkiem od strzykawki lub
bagietk (rysunek 28c). Nastpnym etapem jest wymycie substancji przeszkadzajcych (rysunek
28d) odpowiednim rozpuszczalnikiem: np. wod, buforem, mieszanin wody z metanolem lub
acetonitrylem lub rozpuszczalnikiem niepolarnym. Rozpuszczalniki niepolarne, np. heksan, stosuje
si w celu odmycia tuszczw, utrudniajcych penetracj eluentu. Na kade 100 mg mieszaniny
prbki z sorbentem zuywa si 1-2 mL rozpuszczalnika. Usuwanie interferentw powinno trwa nie
duej, jak 1-2 min, aby nie doprowadzi do wymycia substancji oznaczanej. Przed elucj analitw
zoe w kolumience naley wysuszy, szczeglnie, gdy eluentem ma by rozpuszczalnik niepolarny.
Zoe suszy si pod prni, w strumieniu azotu lub przez odwirowanie. Ostatnim etapem jest
izolowanie analitu (rysunek 29e) rozpuszczalnikiem, w iloci minimum 250 L/100 mg zoa. Dla
powtarzalnoci oznacze naley rwnie zachowa sta szybko elucji i prowadzi j
dwuetapowo, stosujc kilkuminutowe nasikanie.
MSPD to ekstrakcja na mikroskal, ktra zostaa zastosowana po raz pierwszy 1989 r. Jest to technika
stosowana do oznaczania organicznych analitw, jak: leki, steroidy i inne pozostaoci
farmaceutykw, pestycydy, polichlorowane bifenyle (PCB) w prbkach staych lub semi-staych.
Szczeglnie jest przydatna w oznaczaniu substancji w prbkach zawierajcych duo wody:
warzywach, owocach oraz w matrycach biologicznych: tkance miniowej, wtrobie czy tuszczu.
Wad tej metody s mae odzyski analitw.

5.2.6. Ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika w aparacie Soxhleta

Klasyczn ekstrakcj cig prbek staych jest ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika w aparacie
Soxhleta. Jest to jedna z najstarszych metod, zastosowana po raz pierwszy w 1879 roku przez Franza
Rittera von Soxhleta, niemieckiego chemika. Pocztkowo aparat Soxhleta by stosowany do ekstrakcji
tuszczy z prbek staych. Potem okazao si, e jest to uniwersalna metoda izolacji substancji
redniolotnych i nielotnych oraz trwaych termicznie z wielu matryc staych, jak gleby, osadw,
pyw, sorbentw staych z zaadsorbowanymi zwizkami z matryc ciekych i gazowych, ywnoci,
pasz, materiau rolinnego i zwierzcego, prbek biologicznych, farmaceutykw i in.

Ekstrakcja w aparacie Soxhleta jest poczeniem ekstrakcji i destylacji. Oba procesy odbywaj
si w obiegu zamknitym, w wyniku ktrych prbka jest ekstrahowana wielokrotnie, za kadym
razem wie porcj rozpuszczalnika.

Ekstrakcja w aparacie Soxhleta jest zdecydowanie bardziej ekonomiczna ni klasyczna ekstrakcja

przez wytrzsanie, bo zmniejsza zuycie rozpuszczalnika. Schemat budowy aparatu Soxhleta
przedstawiono na rysunku 29. Gwn cz zestawu stanowi aparat Soxhleta, czyli pojemnik szklany
na prbk, zaopatrzony w rurk przelewow (syfon) i rurk boczn, umoliwiajc przepyw par
rozpuszczalnika do chodnicy. W pojemniku umieszcza si gilz z twardej bibuy filtracyjnej lub
wykonan z innego, porowatego materiau, zawierajc ekstrahowan prbk. Aparat Soxhleta czy
si od dou z kolb okrgodenn, zawierajc ekstrahujcy rozpuszczalnik, a od gry z chodnic
zwrotn. Poczenia aparatu z chodnic i kolb s szlifowe i musz by szczelne. Kolb z
rozpuszczalnikiem ogrzewa si, utrzymujc agodny stan wrzenia. Pary rozpuszczalnika przechodz
rurk boczn do chodnicy, gdzie ulegaj schodzeniu i skropleniu. Kondensat z chodnicy wpywa do

103
gilzy z prbk i pojemnika szklanego, powoli je wypeniajc. Gdy poziom rozpuszczalnika w pojemniku
osignie wysoko rurki bocznej, ekstrakt przelewa si do kolby.

Chodnica

Gilza porowata z
prbk Aparat Soxhleta

Przelew Rurka boczna

Rozpuszczalnik i
ekstrakt

Rysunek 29. Schemat budowy zestawu do ekstrakcji za pomoc aparatu Soxhleta

Proces ten powtarza si automatycznie tak dugo, jak dugo ogrzewana jest kolba z
rozpuszczalnikiem. Z kolby odparowuje tylko rozpuszczalnik i w czasie procesu stenie ekstraktu w
kolbie wzrasta. Kolb naley ogrzewa agodnie, by nie przegrza ekstraktu.

Dobr warunkw ekstrakcji w aparacie Soxhleta polega przede wszystkim na wyborze

rozpuszczalnika i okreleniu czasu ekstrakcji. Przy wyborze rozpuszczalnika obowizuje zasada,
e podobne rozpuszcza podobne.

Dla uatwienia rozpuszczania analitw w rozpuszczalniku organicznym, prbk naley wysuszy i rozdrobni.
W aparacie Soxhleta substancje ekstrahowane s ciepym rozpuszczalnikiem, a temperatura ekstrakcji zaley
od temperatury kondensatu, a ta od temperatury wrzenia uytego rozpuszczalnika. Substancja
ekstrahowana nie styka si z gorcymi parami rozpuszczalnika. To jest korzystne dla analitw lotnych i
niestabilnych termicznie, ktre mogyby si rozoy lub by porywane wraz z parami rozpuszczalnika. Z kolei
nisza temperatura zmniejsza rozpuszczalno analitw, przez co ekstrakcja jest powolna. Ekstrakcja jest
powolna, dlatego e podczas napeniania pojemnika kondensatem przebiega statycznie (nie ma ruchu
rozpuszczalnika wzgldem prbki). Jedynie przelewanie ekstraktu do kolby odbywa si szybko i jest to
jednoczenie mechaniczne pukanie zawartoci gilzy. Szybkie przelewanie uatwia wymian warstwy

104
rozpuszczalnika bezporednio przylegajcej do powierzchni prbki. Ekstrakcja w aparacie Soxhleta trwa
dugo i zwykle wynosi od 6 do 48 godzin.

Czas ekstrakcji mona okrela iloci pojedynczych cykli (przeleww), ktrych powinno by
minimalnie 30.

Czas trwania ekstrakcji ustala si eksperymentalnie, sprawdzajc, czy rozpuszczalnik w gilzie zawiera
jeszcze substancje ekstrahowane (prba na szkieku zegarkowym). Ilo uytego rozpuszczalnika
zaley od nawaki prbki, zwykle stosuje si 300 mL na 10 g prbki.

Technika ekstrakcji w aparacie Soxhleta, mimo e jest procedur dugotrwa, daje

najdokadniejsze wyniki i jest stosowana, jako metoda odniesienia dla innych, szybkich
technik i wci ulepszana.

Aby zwikszy szybko i wydajno ekstrakcji, zastosowano cylindryczne, wykonane ze stali

nierdzewnej, autoklawy z aparatem Soxhleta wewntrz, umoliwiajce ekstrakcj w podwyszonym
cinieniu. Taki zestaw musi by zaopatrzony w system pomp do wody chodzcej, dla otrzymania
kondensatu. Ekstrakcja pod zwikszonym cinieniem jest krtka, redukuje zuycie rozpuszczalnika,
ale aparatura jest droga. Jest stosowana do izolacji chlororganicznych pestycydw i polichlorowanych
bifenyli w warzywach (marchew, pomidory), w oliwie i liofilizowanym misie ryb.
Inny sposb na popraw parametrw ekstrakcji za pomoc aparatw Soxhleta zaproponowano w
automatycznych ekstraktorach, wprowadzonych przez firm Buchi oraz firm Foss. Ekstrakcja w
automatycznych ekstraktorach skada si z dwch etapw:

ekstrakcji waciwej we wrzcym rozpuszczalniku,

ekstrakcji dodatkowej (przemywania) kondensatem rozpuszczalnika.
Podwjn ekstrakcj umoliwia konstrukcja aparatu, w ktrym pojemnik z gilz moe si znajdowa
na dwu rnych poziomach: we wrzcym rozpuszczalniku i ponad jego powierzchni. Aparat firmy
Foss umoliwia rwnie zagszczanie i wstpne suszenie ekstraktu wraz z odzyskiem rozpuszczalnika.
Budow zasad dziaania automatycznego ekstraktora SoxtecTM 2050, firmy Foss przedstawiono na
rysunku 30. Ekstraktor SoxtecTM skada si z systemu ogrzewania elektrycznego (1), pojemnika na
rozpuszczalnik (2), gilzy (3) na prbk (4) oraz chodnicy zwrotnej (5). Proces ekstrakcji w aparacie SoxtecTM
2050 skada si z czterech etapw. W pierwszym etapie gilza z prbk zanurzona jest we wrzcym
rozpuszczalniku, gdzie temperatura i ruch wrzcej cieczy uatwiaj szybk ekstrakcj. Po gwnym etapie
ekstrakcji, gilza z prbk zostaj podniesione i znajduj si nad powierzchni ekstraktu (6). W tym etapie,
ktry odbywa si jak w tradycyjnym aparacie Soxhleta, nastpuje dokoczenie ekstrakcji i przepukanie
prbki i gilzy czystym rozpuszczalnikiem. Po zakoczeniu ekstrakcji ekstrakt zostaje zagszczony (7) a
odparowany i skroplony w chodnicy rozpuszczalnik, krcem (8) zostaje zebrany do ponownego uycia. W
ostatnim etapie ekstrakt jest wstpnie suszony (9) przez agodne ogrzewanie nad powierzchni pyty
grzejnej. Zestaw do ekstrakcji SoxtecTM 2050 skada si z szeciu stanowisk, co oznacza moliwo
ekstrakcji jednoczenie 6 prbek. Cay proces jest w peni zautomatyzowany.

105
 5

3
9
6
2 4
7
1

Rysunek 30. Zasada dziaania automatycznego ekstraktora SoxtecTM 2050 (za zgod Dyrektora Dziau
Handlowego FOSS Polska)

W aparacie Soxtec mona oznacza zawarto rnych substancji rozpuszczalnych w

rozpuszczalnikach organicznych, w takich matrycach, jak: produkty ywnociowe, pasze, gleba,
polimery, produkty wkiennicze, masa papiernicza i inne. System Soxtec jest oficjalnie
zaaprobowany i stosowany m.in. w normie ISO1444:1996, dotyczcej oznaczania wolnego tuszczu w
misie i produktach misnych, oraz w normie EPA 3541, dotyczcej oznaczania polichlorowanych
bifenyli w glebie i osadach.
Ekstrakcja w aparacie Soxhleta moe by wspomagana ultradwikami, zestaw taki przedstawiono na
rysunku 31, w kolejnym rozdziale.
Ekstrakcja w aparacie Soxhleta wspomagana promieniowaniem mikrofalowym (ang. microwave
assisted soxhlet extraction, MASE) prowadzona jest zawsze w systemie otwartym, czyli przy cinieniu
atmosferycznym (patrz rozdz.: II.5.2.8. Ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika wspomagana
promieniowaniem mikrofalowym). Po wczeniu aparatu, gdy pary rozpuszczalnika po skropleniu w
chodnicy wypeni pojemnik z prbk, wczane jest promieniowanie mikrofalowe. Mikrofale s
ogniskowane wycznie na pojemniku z prbk. Po okrelonym czasie, gdy promieniowanie zostanie
wyczone, otwiera si zawr na syfonie i ekstrakt spywa do kolby, po czym zaczyna si kolejny cykl.
Aparaty do MASE s zautomatyzowane, czas procesu jest krtki a ekstrakcja zachodzi z du
wydajnoci.

106
5.2.7. Ekstrakcja wspomagana ultradwikami
Ekstrakcja wspomagana ultradwikami (ang. ultrasound-assisted extraction, UAE) stosowana jest do
prbek staych lub semistaych. Prbk miesza si z rozpuszczalnikiem ekstrahujcym i poddaje
dziaaniu ultradwikw. Rozchodzenie si fal dwikowych w cieczy zwizane jest z cyklami
zagszczenia i rozrzedzenia, ktre w cieczy i gazie s zmianami cinienia (fala cinienia).

Zmienne cinienie akustyczne powoduje zjawiska wtrne, ktre przyspieszaj proces ekstrakcji.
Wrd zjawisk wtrnych, najwiksze znaczenie w procesie przenoszenia mas ma kawitacja
proces dynamicznego tworzenia si, wzrostu i zaniku pcherzy parowo gazowych w cieczy.

Tworzenie si pcherzykw lub innych obszarw zamknitych, tzw. kawern, zawierajcych par danej
cieczy, gaz lub mieszanin parowo-gazow nastpuje w cyklu rozrzedzenia, czyli zmniejszenia
cinienia. Dziaaj wtedy due siy rozcigajce, powodujce lokalne rozerwania cigego orodka
(cieczy). Nadmiar energii przenoszonej przez fal akustyczn powoduje wzrost i w kocu implozj
pcherzyka, ktra jest rdem lokalnych fal udarowych (szybka adiabatyczna kompresja gazu powoduje w
pcherzyku lokalny, gwatowny wzrost temperatury do 5000C i cinienia do 100 MPa). Proces tworzenia si
i rozerwania pcherzyka trwa 0,0004 s. Kiedy kawitacja zachodzi w cieczy pokrywajcej powierzchni ciaa
staego, kawerny i pcherzyki zapadaj si niesymetrycznie, tworzc silny strumie cieczy w kierunku
powierzchni (o szybkoci do 400 km/h). Tak silny strumie powoduje powane uszkodzenie w miejscu
uderzenia i udostpnia do ekstrakcji now powierzchni prbki.

Kawitacja, tarcie na powierzchniach midzyfazowych i absorpcja energii fali akustycznej oraz

zwizane z nimi wydzielanie ciepa sprawia, e wspomaganie ekstrakcji ultradwikami
zwiksza rozpuszczalno, dyfuzj, penetracj rozpuszczalnika i transport analitu, a to
zdecydowanie skraca czas ekstrakcji i zwiksza jej wydajno.

W ekstrakcji wspomaganej ultradwikami stosuje si drgania akustyczne o nieduej czstotliwoci,

rzdu 2050 kHz (rzadziej 500 kHz), ale o duym nateniu 140160 dB (dla wywoania kawitacji).
Ekstrakcj mona przeprowadza dwoma sposobami, pierwszy to zastosowanie ani
ultradwikowej (rysunek 31a i 31c). W tym celu prbk umieszcza si w szklanym lub metalowym
naczyniu i wstawia do ani. Zalet tego sposobu jest moliwo jednoczesnej ekstrakcji wielu prbek.
Drugim sposobem jest uycie sondy generujcej ultradwiki, zanurzanej bezporednio do prbki
(rysunek 31b). Ten sposb stosuje si wtedy, gdy jest konieczno uycia duej energii, np. do
rozerwania tkanek czy komrek.
Ilo energii, jak naley dostarczy do prbki, zaley od wielu czynnikw: lepkoci i temperatury
prbki, obecnoci par i gazw w cieczy, stenia i wielkoci czsteczek staych oraz ksztatu i
geometrii komory z ciecz.

Du zalet ekstrakcji ultradwikami jest moliwo przeprowadzania jej z du wydajnoci w

pokojowej temperaturze, co jest bardzo korzystne dla nietrwaych analitw.

107
Do ekstrakcji wspomaganej ultradwikami stosowane s rne rozpuszczalniki, w zalenoci od
waciwoci chemicznych analitu i matrycy, cznie z wod oraz ich mieszaniny. Podczas ekstrakcji
lotnymi rozpuszczalnikami, zwaszcza w podwyszonej temperaturze, mona zastosowa zestaw z
chodnic zwrotn, pokazany na rysunku 31c. Ekstrakcj w aparacie Soxhleta mona wspomaga
rwnie ultradwikami, jak to pokazano na rysunku 32. Czas trwania ekstrakcji rozpuszczalnikiem,
wspomaganej ultradwikami jest krtki w porwnaniu z klasycznymi metodami i, w zalenoci od
prbki, wynosi od 10 min do 1 h.

Uchwyt Statyw
Chodnica

Prbka z
rozpuszczalnikiem

Woda
Generator
ultradwikw

a) b) c)

Rysunek 31. Ekstrakcja rozpuszczalnikiem wspomagana ultradwikami, a,c w ani

ultradwikowej i b z zastosowaniem sondy generujcej ultradwiki

Niedogodnoci ekstrakcji rozpuszczalnikiem wspomaganej ultradwikami jest konieczno oddzielenia

ekstraktu od pozostaoci poekstrakcyjnej. Technika ta moe rwnie powodowa czciow degradacj
analitu. W czasie kawitacji mog tworzy si wolne rodniki lub inne reaktywne skadniki, prowadzce do
przemian oznaczanych substancji.
Ekstrakcja rozpuszczalnikiem wspomagana ultradwikami jest szeroko stosowana w przemyle
farmaceutycznym (np. ekstrakcja alkaloidw z rolin), perfumeryjnym i spoywczym (np. intensyfikacja
wydobycia cukru z burakw albo tranu z wielorybw i ryb) i innych. Ekstrakcja ultradwikowa znajduje
szerokie zastosowanie w analityce, gwnie w biologii i biotechnologii, farmacji oraz ochronie rodowiska
(np. izolacja pozostaoci pestycydw z warzyw i owocw).

5.2.8. Ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika wspomagana promieniowaniem mikrofalowym

Ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika wspomagana promieniowaniem mikrofalowym (ang. microwave-

assisted extraction, MAE) jest powszechnie stosowana technik do izolacji analitw z prbek staych. W
technice tej wykorzystuje si zjawisko bezporedniej absorpcji promieniowania mikrofalowego przez
czsteczki substancji. Skuteczno wspomagania ekstrakcji promieniowaniem mikrofalowym wynika ze
sposobu przekazywania energii cieplnej. Tradycyjne ogrzewanie prbki czy rozpuszczalnika polega na
przekazywaniu energii cieplnej ze rda przez konwekcj lub przewodzenie, co dugo trwa i wie si ze
stratami energii. Mikrofale natomiast dostarczaj energi bezporednio czsteczce zwizku chemicznego.

108
 Chodnica

Sonda
Aparat
ultradwikowa
Soxhleta

Gilza porowata
z prbk

Termostatowana
ania wodna

cznik
Rozpuszczalnik
teflonowy
i ekstrakt

Rysunek 32. Ekstrakcja w aparacie Soxhleta wspomagana ultradwikami

Przekazywanie energii mikrofal moe odbywa si na dwa sposoby. Pierwszy wynika z polaryzacji
dipolowej. W polu elektrycznym, czsteczki zwizkw o momencie dipolowym rnym od zera, ulegaj
polaryzacji, czyli ustawiaj si zgodnie z kierunkiem i zwrotem tego pola. W przypadku mikrofal o
czstotliwoci 2,45 GHz (taka czstotliwo stosowana jest w piecach mikrofalowych), pole elektryczne
zmienia zwrot 4,9 x 109 razy na sekund (co p okresu fali promieniowania, 2 x 2,45 109 s-1). Zmiany pola
wymuszaj ruch drgajcy dipoli, ktre usiuj ustawi si zgodnie z jego kierunkiem. Intensywno
oscylacji zaley m.in. od wielkoci momentu dipolowego. Ruch czsteczek o wikszym momencie
dipolowym, np. acetonu (2,69 D), metanolu (2,87 D), acetonitrylu (3,44 D) jest intensywniejszy ni
czsteczek o mniejszym momencie dipolowym, np. heksanu (<0,1 D). Zmieniajc swoje pooenie, dipole
uderzaj w ssiadujce z nimi czsteczki, przekazujc im swoj energi. W ten sposb ciepo rozchodzi si
szybko i rwnomiernie w caej prbce. Czsteczki, ktre maj moment dipolowy rwny 0, np. izooktan,
nie wykonuj ruchw w polu elektrycznym.
Drugi sposb przekazywania energii mikrofal opiera si na ruchliwoci jonw w roztworze w polu
elektromagnetycznym (dodatnie przemieszczaj si w jedn, ujemne w drug stron) i wynikajcym z
niego przewodnictwie jonowym. Ciepo prbki jest wynikiem tarcia midzy poruszajcymi si jonami
a roztworem.
Innym wskanikiem okrelajcym zdolno materii do przeksztacania energii mikrofal w energi
ciepln jest tg , zwany tangensem kta strat, tangensem strat lub tangensem delta. Termin

109
strata odnosi si do straty (oddania) energii fali w wyniku jej absorpcji, a wartoci tg dla
poszczeglnych rozpuszczalnikw mona odnale w tablicach fizycznych.

Wybr warunkw ekstrakcji ze wspomaganiem promieniowaniem mikrofalowym uzaleniony

jest od wyboru rozpuszczalnika, ktry przede wszystkim ma rozpuszcza substancj
ekstrahowan. Jeli to moliwe, ekstrahent powinien mie moment dipolowy rny od zera,
czyli by rozpuszczalnikiem polarnym, np.: metanol, etanol, woda, aceton, octan etylu,
dichlorometan, acetonitryl i inne.

Rozpuszczalniki, ktre maj du warto tangensa , np. metanol (tg = 0,64), woda (tg = 0,157) lub
mieszaniny niepolarnych z polarnymi bd absorboway promieniowanie mikrofalowe i szybko si grzay.
Takie rozpuszczalniki zostaj podgrzane bardzo szybko do temperatury powyej temperatury wrzenia -
ten sposb ekstrakcji wymaga specjalnej aparatury, w tzw. ukadzie zamknitym. Umoliwia on szybk
ekstrakcj analitw z matrycy.

Jeli substancja jest ekstrahowana rozpuszczalnikiem nieabsorbujcym promieniowania

mikrofalowego, nie ulega on podgrzaniu. W tym przypadku mikrofale s absorbowane nie
przez ekstrahent, a przez zdolne do absorpcji skadniki prbki, ktre nastpnie oddaj ciepo
do rozpuszczalnika.

Skadnikiem prbki, ktry ogrzewa cao jest bardzo czsto woda w niej zawarta oraz inne polarne
substancje. W tym przypadku temperatura nie jest wysoka i ekstrakcja moe by przeprowadzana w
ukadzie otwartym, przy cinieniu atmosferycznym. Schemat urzdzenia do ekstrakcji w ukadzie
zamknitym przedstawiony jest na rysunku 33a. Prbka z rozpuszczalnikiem znajduje si w
zamknitym naczyniu, najczciej teflonowym, zwanym bomb, poniewa temperatura roztworu
dochodzi zwykle do 150190C lub wyej i wzrasta cinienie. Obudowa bomby teflonowej musi by z
materiau przepuszczajcego (nieabsorbujcego) promieniowanie mikrofalowe i musi posiada
wskanik cinienia i zawr bezpieczestwa, ktry uruchamia si, gdy cinienie przekroczy warto 10
MPa. Materia obudowy pozwala wyj bomb z pieca mikrofalowego bezporednio po ekstrakcji,
gdy nie nagrzewa si. rdem promieniowania mikrofalowego jest magnetron, poczony z komor
pieca falowodem. Dla urednienia energii stosowane jest metalowe mieszado i obrotowa podstawa,
na ktrej znajduj si prbki w bombach. Czujniki temperatury i cinienia poczone s z bombami.
Komercyjnie dostpne s zestawy do MAE, o rnej pojemnoci naczynia ekstrakcyjnego, od 20 do
120 mL.
Schemat urzdzenia do ekstrakcji wspomaganej promieniowaniem mikrofalowym przy cinieniu
atmosferycznym przedstawiono na rysunku 33b. W tym urzdzeniu energia mikrofali jest kierowana
tylko do jednego naczynia, wykonanego zwykle ze szka lub kwarcu. W ekstrakcji wspomaganej
mikrofalami uywa si od 2 do 20 g prbki i do 30 mL rozpuszczalnika. Czas trwania ekstrakcji zwykle
nie przekracza 30 min (1020 min), czas chodzenia trwa ok. 20 min.

110
 Czujniki
temperatury i Chodnica
cinienia Mieszado metalowe
Falowd

Magnetron

Talerz obrotowy Bomba Prbka Rozpuszczalnik

a) b)

Rysunek 33. Zestawy do ekstrakcji wspomaganej promieniowaniem mikrofalowym, a do

cinieniowej ekstrakcji (w naczyniu zamknitym), b - do ekstrakcji przy cinieniu atmosferycznym (w
naczyniu otwartym)

W urzdzeniach do celw badawczych wykorzystuje si mikrofale o czstotliwoci 2,45 GHz (piece

mikrofalowe do zamknitej ekstrakcji pod podwyszonym cinieniem, (rys. 34a) oraz o czstotliwoci
0,9 GHz (w piecach do otwartej ekstrakcji pod cinieniem atmosferycznym, rys. 34b). Generator
mikrofal magnetron jako rdo ciepa zastosowano po raz pierwszy w 1946 r. W laboratorium,
pierwszy raz wykorzystano piec mikrofalowy do mineralizacji kwasowej prbek w 1975 r., a do
ekstrakcji zwizkw organicznych 1986 r. MAE jest obecnie szeroko stosowan technik ekstrakcji
w oznaczaniu takich zanieczyszcze rodowiska, jak: wielopiercieniowe wglowodory aromatyczne,
polichlorowane bifenyle, pestycydy, fenole, olej mineralny. Stosowana jest do oznacze w glebie,
rolinach i innych prbkach staych, jak polimery - do oznaczania oligomerw, tabletki do
oznaczania skadu, zioa do izolacji zwizkw biologicznie aktywnych oraz wiele innych. EPA
(Environmental Protection Agency) wprowadzia ekstrakcj wspomagan promieniowaniem
mikrofalowym jako standardow metod ekstrakcji semilotnych i nielotnych skadnikw z prbek
staych.

5.2.9 Ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika pod zwikszonym cinieniem

Zwikszone cinienie rozpuszczalnika uatwia jego penetracj w gb staej matrycy, dziki temu
ekstrakcja jest wydajniejsza. Ekstrakcj za pomoc rozpuszczalnika pod zwikszonym cinieniem
wykonuje si wykorzystujc pomp chromatografu cieczowego. Rozdrobnion prbk umieszcza si w
kolumnie a nastpnie za pomoc pompy chromatografu, przepuszcza si przez ni rozpuszczalnik pod
zwikszonym cinieniem (rysunek 34).

111
 Kolumna
wypeniona
prbk

Odbieralnik
Zbiornik z Pompa HPLC ekstraktu
ekstrahentem

Rysunek 34. Zestaw do ekstrakcji rozpuszczalnikiem pod zwikszonym cinieniem

Prbki przed ekstrakcj mona zmiesza (ucierajc) z wypeniaczem, np. z adsorbentem polarnym,
takim jak: el krzemionkowy lub tlenek glinu. Adsorbent wie wod zawart w prbce, co uatwia
penetracj rozpuszczalnika organicznego oraz zmienia oddziaywania midzy matryc prbki a
analitami, uatwiajc ich desorpcj i rozpuszczanie w ekstrahencie. Ten sposb ekstrakcji stosuje si
do izolacji z prbek gleby wielopiercieniowych wglowodorw aromatycznych (WWA) lub
polichlorowanych bifenyli (PCB).

5.2.10. Przyspieszona ekstrakcja za pomoc rozpuszczalnika

W przyspieszonej ekstrakcji za pomoc rozpuszczalnika (ang. pressurized fluid extraction, PFE lub
accelerated solvent extraction, ASE lub pressurized liquid extraction, PLE) stosuje si konwencjonalne
rozpuszczalniki, ekstrakcj przeprowadza w szczelnym, wytrzymaym naczyniu, zwanym celk
ekstrakcyjn, a przyspieszenie ekstrakcji osiga przez stosowanie wysokiej temperatury (100200C),
co w zamknitym naczyniu powoduje wzrost cinienia nawet do 20 MPa.

Metoda przyspieszonej ekstrakcji za pomoc rozpuszczalnika stosowana jest do izolacji iloci

ladowych analitw z prbek staych i semistaych. Jest metod szybk i gwarantujc du
wydajno, powszechnie zalecan dla analitw lub/i matryc trwaych temperaturowo.

Podgrzewanie cieczy w zamknitym naczyniu powoduje wzrost cinienia i wzrost temperatury

wrzenia, dlatego ekstrakcja moe by przeprowadzana ciecz, mimo e jej temperatura znacznie
przewysza temperatur wrzenia w warunkach normalnych.

Podwyszona temperatura i cinienie wpywaj na wasnoci rozpuszczalnika, prbki oraz ich

wzajemne oddziaywania.

Gwnym powodem duej wydajnoci technik ASE jest temperatura, ktra powoduje zwikszenie
rozpuszczalnoci substancji oraz zwikszenie kinetyki przenoszenia masy szybszej desorpcji analitu z
fazy staej i szybszej dyfuzji do rozpuszczalnika. Wysoka temperatura zmniejsza lepko

112
rozpuszczalnika oraz napicie powierzchniowe, co uatwia penetracj rozpuszczalnika w gb
matrycy.
Drugim powodem wikszej wydajnoci w wysokiej temperaturze jest zakcanie stanu rwnowagi na
powierzchni styku rozpuszczalnik matryca, przez osabienie oddziaywa rozpuszczalnika z matryca
typu si Van der Waalsa, wiza wodorowych czy przycigania dipoli. Daje to lepszy kontakt
rozpuszczalnika z prbk, co konsekwencji skraca czas ekstrakcji i ilo rozpuszczalnika.
W przyspieszonej ekstrakcji za pomoc rozpuszczalnika cinienie nie odgrywa a tak duej roli jak
temperatura, jednak umoliwia gbsz penetracj w matryc i ekstrakcj analitw zatrzymanych w
porach. Wymuszanie penetracji jest szczeglnie korzystne przy wilgotnych prbkach i matrycach
silnie adsorbujcych anality.
Zestaw do przyspieszonej ekstrakcji prbek staych za pomoc rozpuszczalnikw przedstawiono na
rysunku 35.
Zawory

Pompa Termostat

Celka
ekstrakcyjna z
prbk

Zawr

Odbieralnik
ekstraktu

Butla z
azotem Butelki z rozpuszczalnikami
spronym do ekstrakcji

Rysunek. 35. Schemat zestawu do przyspieszonej ekstrakcji za pomoc rozpuszczalnikw z prbek

staych

Skada si on z termostatowanej komory (pieca), w ktrej umieszcza si celk z ekstrahowan

prbk, pompy dozujcej rozpuszczalniki, odbieralnika ekstraktu i zbiornika obojtnego gazu
spronego oraz szeregu zaworw, umoliwiajcych odpowiednie dozowanie. Celka wykonana jest
najczciej ze stali kwasoodpornej. Po umieszczeniu celki z prbk w termostacie, ukad wypenia si
zimnym rozpuszczalnikiem i nastpnie wcza ogrzewanie komory termostatu. Ekstrakcj prowadzi
si zwykle w zakresie temperatur 100200C w czasie 510 min. Cinienie w celce ekstrakcyjnej moe
wzrosn do ok. 20 MPa. Jeli ekstrakcja jest jednostopniowa, analit wypukuje si wie porcj
rozpuszczalnika do naczynka na ekstrakt. Ruch rozpuszczalnika jest wymuszany cinieniem gazu z

113
butli (najczciej azotu). Jeli ekstrakcja ma by wielokrotna, ponownie napenia si ukad zimnym
ekstrahentemi, wcza ogrzewanie komory termostatu i powtarza cay cykl.
W technice ASE stosuje si kilku gramowe nawaki prbek, maksymalnie od 10 do 30 g i mae iloci
(kilka mL) rozpuszczalnikw, stosownie do iloci prbki. Przy oznaczaniu WWA w glebie moliwa bya
nawet miniaturyzacja ekstrakcji, w ktrej uyto 50 mg prbki i 100 L estrahenta. Technika
przyspieszonej ekstrakcji prbek staych za pomoc rozpuszczalnikw moe by w peni
zautomatyzowana i umoliwia wielokrotn ekstrakcj jednym lub rnymi rozpuszczalnikami. Czas
ekstrakcji zaley od iloci cykli, jeden cykl trwa zwykle kilka minut.
W przyspieszonej ekstrakcji za pomoc rozpuszczalnika wykorzystuje si takie same rozpuszczalniki
jak w klasycznych metodach. Najczciej s to aceton, octan etylu, dichlorometan, heksan, toluen,
woda. Czsto stosuje si mieszanin rozpuszczalnikw lub dodatek kwasw: octowego, fosforowego i
trifluoroctowego.
Na szczegln uwag zasuguje przyspieszona ekstrakcja za pomoc wody. Technik t nazywa si
SHWE (ang. subcritical hot-water extraction) lub PHWE (ang. plessurized hot water extraction).

Woda, poniej punktu krytycznego, ktry osiga w temperaturze 374C i cinieniu 22 MPa,
zmienia swoje waciwoci.

W warunkach normalnych, 20C i cinieniu atmosferycznym, warto staej dielektrycznej wody

wynosi = 78,3, natomiast w temperaturze 250C i cinieniu 5 MPa, warto spada do ok. 27, co
zblia waciwoci wody w tych warunkach do waciwoci etanolu w warunkach normalnych ( etanol =
24,3). W konsekwencji zwiksza si rozpuszczalno w wodzie wielu zwizkw redniopolarnych.
Poza tym wzrost temperatury i cinienia zmniejsza napicie powierzchniowe wody oraz lepko, co
zwiksza wydajno ekstrakcji.
W przyspieszonej ekstrakcji wod stosuje si temperatury od 100 do 374C i cinieniu pozwalajcym
utrzyma stan cieky wody. Jeli woda przejdzie w stan pary stanie si bardzo korozyjnym i
agresywnym dla analitw medium, o czym naley pamita przy doborze warunkw ekstrakcji.
Woda nie jest rozpuszczalnikiem, ktry mona stosowa bezporednio w chromatografii gazowej.
Konieczna staje si wic ekstrakcja z wody do rozpuszczalnika organicznego (LLE, SDME) lub do fazy
staej (SPME, SBSE). Ekstrakcja z wody jest bardzo wydajna, bo przy obnianiu temperatury ekstraktu
wodnego do pokojowej, rozpuszczalno analitw gwatownie spada.
Najczciej wymieniane zalety techniki przyspieszonej ekstrakcji prbek staych za pomoc
rozpuszczalnikw to:

nie wymaga suszenia prbek (cinienie i temperatura zapewniaj wystarczajc penetracj

matrycy przez rozpuszczalniki o rnej polarnoci),
korzystna kinetyka ekstrakcji - desorpcja z matrycy, rozpuszczanie w ekstrahencie i transport
analitw zachodz szybko),
krtkie czasy ekstrakcji, wynikajce z kinetyki,
moliwo zbudowania zestawu do ASE,
atwo automatyzacji procesu,
atwo obsugi aparatu.

114
Technik przyspieszonej ekstrakcji za pomoc rozpuszczalnika pocztkowo zastosowano do ekstrakcji
organicznych, ladowych zanieczyszcze gleby i osadw ciekowych. Amerykaska Agencja Ochorony
rodowiska (ang. Environmental Protection Agency, EPA) wprowadzia ASE jako metod
standardow izolacji organicznych analitw ze rodowiskowych prbek staych, zwaszcza do
ekstrakcji WWA, oleju mineralnego oraz trwaych zanieczyszcze rodowiska, tzw. POP (ang.
persistent organic pollutants) z gleby, osadw oraz pyw. Do POP zalicza si takie zanieczyszczenia,
jak: chloroorganiczne i fosforoorganiczne pestycydy, polichlorowane bifenyle i dioksyny. Obecnie
technika ASE jest stosowana do oznaczania pestycydw w rolinach, produktach ywnociowych i w
tkankach zwierzcych, do oznaczania aflatoksyn, furanw, zwizkw cyjanoorganicznych. Stosowana
jest rwnie do izolowania plastyfikatorw z polimerw, dodatkw i aktywnych skadnikw
farmaceutykw jak i izolacji tuszczw z prbek ywnoci.

5.2.11. Ekstrakcja pynem w stanie nadkrytycznym

Ciecz a raczej pynem w stanie nadkrytycznym jest medium znajdujce si w warunkach powyej
warunkw punktu krytycznego, tzn. ma temperatur wysz od temperatury krytycznej i jest pod
cinieniem wyszym od cinienia krytycznego. Definicj t obrazuje diagram przemian fazowych
przedstawiony na rysunku 36.
Wykres przemian fazowych przy zmianie temperatury i cinienia charakteryzuj dwa punkty, ktre
okrelaj, w jakich warunkach trwae s rne stany skupienia substancji. S to punkt potrjny i punkt
krytyczny. Punktem potrjnym jest stan, w ktrym wspistniej w stanie rwnowagi
termodynamicznej trzy stany skupienia danej substancji.

Ciao Pyn w stanie

stae nadkrytycznym
Ciecz
Cinienie

ciliwa
Pk
Faza cieka
Punkt krytyczny

Faza gazowa Para

Para przegrzana
Ppp
Punkt potrjny

Tk
Tpp
Temperatura

Rysunek 37. Schemat typowego diagramu przemian fazowych w ukadzie cinienia i temperatury dla
czystej substancji

Przy wartociach cinienia i temperatury poniej wartoci punktu potrjnego mog istnie tylko dwie
fazy; staa i gazowa, oddziela je krzywa sublimacji. Powyej wartoci punktu potrjnego, w zalenoci

115
od zmian wartoci cinienia i temperatury, a do wartoci punktu krytycznego, mog istnie trzy stany
skupienia substancji gazowa, cieka i staa. Faz sta od ciekej oddziela krzywa topnienia, faz
ciek od gazowej krzywa parowania (wrzenia). Powyej wartoci okrelanych przez punkt krytyczny,
substancja znajduje si w stanie nadkrytycznym, w ktrym zanika rnica midzy gazem a ciecz i
zmiany cinienia i temperatury powyej tego punktu nie zmieniaj jej stanu skupienia.

Punkt potrjny i punkt krytyczny s wielkociami charakterystycznymi dla danej substancji.

Substancja w stanie nadkrytycznym ma waciwoci porednie midzy gazem a ciecz. Pyn w stanie
nadkrytycznym ma gsto zblion do gstoci cieczy (0,20,9 g/mL), lepko zblion do lepkoci
gazu (10-4 g/s cm) a wspczynnik dyfuzji mniejszy ni dla gazu ale wyszy ni dla cieczy (10-4 cm2/s).

Gsto pynu w stanie nadkrytycznym sprawia, e substancje rozpuszczaj si w nim jak w

cieczy, maa lepko pynu i niskie napicie powierzchniowe sprzyjaj penetracji matrycy,
podobnej do penetracji gazu, wspczynnik dyfuzji powoduje, e przenoszenie masy jest szybsze
ni w cieczy.

Wymienione cechy s bardzo korzystne dla procesu ekstrakcji. Rozpuszczalno w pynie

nadkrytycznym zaley przede wszystkim od temperatury i gstoci, a w mniejszym stopniu od
cinienia. Wiele substancji w stanie nadkrytycznym posiada dobre waciwoci rozpuszczania, jednak
w ekstrakcji znalazo zastosowanie tylko kilka. Ograniczeniem s wysokie wartoci cinienia i
temperatury stanu krytycznego.
Najpowszechniej stosowany jest ditlenek wgla (CO2), przede wszystkim dlatego, e ma nisk
temperatur krytyczn (31,1C), niskie cinienie krytyczne (7,38 MPa), jest nietoksyczny i niepalny
oraz atwy do otrzymania o wysokiej czystoci. Ditlenek wgla jest niepolarny, wic mona nim
ekstrahowa tylko niepolarne i redniopolarne zwizki. Ekstrakcja polarnych i silnie zwizanych z
matryc zwizkw za pomoc samego CO2 w stanie nadkrytycznym jest niewydajna, ale mona
zastosowa dodatek maych iloci (110%) substancji polarnych, zw. modyfikatorami. Najczciej
stosowanymi modyfikatorami s metanol, etanol, alkohol izopropylowy, aceton, acetonitryl,
dichlorometan, toluen, kwas mrwkowy i ditlenek siarki.
Ekstrakcj pynem w stanie nadkrytycznym (ang. supercritical fluid extraction, SFE) mona
przeprowadza statycznie i dynamicznie. Prbki o zwartej strukturze matrycy, zawierajce trudno
rozpuszczalne anality musz mie zapewniony dugi czas kontaktu z ekstrahentem, dlatego ich
ekstrakcj przeprowadza si sposobem statycznym. Prbk umieszcza si w pynie w stanie
nadkrytycznym i po okrelonym czasie ekstrakcji, usuwa pyn z analitami do odbieralnika. Sposb
dynamiczny stosuje si do prbek atwo penetrowanych przez pyn i zawierajcych anality dobrze w
nim rozpuszczalne. Pyn w stanie nadkrytycznym przepuszcza si w sposb cigy przez prbk a
ekstrakt zbierany jest w odbieralniku. Sposb dynamiczny ekstrakcji moe by prowadzony rwnie z
wielokrotnym zawracaniem ekstrahenta do prbki (recyrkulacja), zanim zostanie zebrany w
odbieralniku. W odbieralniku nastpuje odzyskiwanie analitw z roztworu. Schemat zestawu do
ekstrakcji pynem w stanie nadkrytycznym przedstawiono na rysunku 37. Zestaw skada si z pieca o
regulowanej temperaturze, w ktrym znajduje si ekstraktor, restryktora i odbieralnika ekstraktu. Do
ekstraktora doprowadzany jest, ze stalowej butli, sprony CO2 oraz - jeli to konieczne modyfikator.

116
Sprony CO2 i modyfikator, po osigniciu w piecu waciwej temperatury stanu nadkrytycznego,
stanowi ekstrahent, ktry jest wprowadzany do prbki w sposb statyczny lub dynamiczny. Po
zakoczeniu procesu ekstrakt wprowadzany jest do odbieralnika poprzez restryktor (przewenie),
ktrego zadaniem jest obnienie cinienia wychodzcego pynu. Stosowne s dwie grupy
restryktorw, stae i zmienne.

Zawory

Pompy Piec

Ekstraktor

Restryktor

Odbieralnik
ekstraktu

Butla z CO2 Pojemnik z

spronym modyfikatorem

Rysunek 37. Schemat zestawu do ekstrakcji pynem (CO2) w stanie nadkrytycznym

Restryktor stay to rurka o staej rednicy wykonana z metalu lub topionej krzemionki lub kwarcu.
Restryktor zmienny ma kryz lub otwr wylotowy sterowany elektronicznie. Restryktory stae czsto
zatykaj si z powodu zamarzania wody, przy szybkim rozpraniu pynu oraz z powodu obecnoci
siarki elementarnej lub duych iloci wglowodorw czy tuszczw w ekstrakcie.
S za to bardzo tanie i atwe do zamontowania, w porwnaniu do bardzo drogich restryktorw
zmiennych (elektronicznych). Po obnieniu cinienia, ekstrakt jest kierowany do odbieralnika.
Stosowane s dwa sposoby odzyskiwania analitw z ekstraktu: absorpcja w rozpuszczalniku i
adsorpcja na sorbencie staym. Absorpcja w rozpuszczalniku jest prosta i atwa w optymalizacji
warunkw, ale wie si ze stratami analitu w postaci aerozolu lub/i strat rozpuszczalnika. Warunki
adsorpcji na sorbencie staym s trudniejsze do ustalenia, ale odzysk jest bez strat i istnieje moliwo
selektywnego wymywania substancji z adsorbentu.

Dobr warunkw SFE powinien uwzgldnia parametry procesu (cinienie, temperatur,

szybko przepywu w procesie dynamicznym, czas ekstrakcji, wielko prbki i pojemno
ekstraktora) oraz waciwoci chemiczne i fizyczne matrycy (np. posta fizyczna, jednorodno,
rozpuszczalno, zdolno do adsorpcji i desorpcji analitw i in.).

117
Zmieniajc parametry procesu, zmienia si waciwoci pynu w stanie nadkrytycznym. Gsto pynu
ulega zmianie ze zmian cinienia oraz temperatury. Pyn o mniejszej gstoci ma waciwoci
rozpuszczalnikw niepolarnych, natomiast o duej gstoci waciwoci bardziej polarnych
rozpuszczalnikw, jak dichlorometanu. Due znaczenie w zwikszaniu rozpuszczalnoci analitw ma
dodatek do CO2 modyfikatora. Czas ekstrakcji i szybko przepywu pynu w procesie dynamicznym
naley dopasowa do waciwoci matrycy, aby zapewni wystarczajcy czas kontaktu CO2 z analitem.
Mona zmodyfikowa rwnie prbk przez wymieszanie jej z sorbentem staym o odpowiednich
waciwociach, aby nie dopuci do ekstrakcji zwizkw przeszkadzajcych. Dodatek do prbki
polarnego elu krzemionkowego powoduje zatrzymanie w matrycy wielu balastowych, polarnych i
rednio polarnych substancji. SFE trwa zwykle od 10 do 60 min, w analityce prbki maj zwykle mas
mniejsz ni 10 g a minimalna ilo pynu wynosi ok. 10 mL. W metodzie dynamicznej szybko
przepywu pynu wynosi od 1 do 4 mL/min.
Pyn w stanie nadkrytycznym do ekstrakcji zastosowano po raz pierwszy w 1978 r. Technik t
wprowadzi koncern Kraft General Foods, obecny Maxwell House Coffee Division do produkcji kawy
bezkofeinowej. Obecnie jest szeroko stosowan technik ekstrakcji zanieczyszcze rodowiska, jak
WWA i innych wglowodorw, PCB, fenoli, pestycydw, herbicydw z prbek staych. SFE stosuje si
rwnie do oznaczania zanieczyszcze wody, po izolacji z wody do sorbentu staego (zanieczyszczenia
na sorbencie staym s sta prbk). Ekstrakcja pynem w stanie nadkrytycznym znalaza rwnie
zastosowanie w izolacji zanieczyszcze z ywnoci i paszy, do izolacji aktywnych biologicznie
skadnikw zi, przy oznaczaniu aktywnych skadnikw farmaceutykw i kosmetykw. SFE jest
rwnie czona z innymi technikami ekstrakcyjnymi, np. przy oznaczaniu parabenowych (estry kwasu
p-hydroksybenzoesowego) rodkw konserwujcych i polifenolowych przeciwutleniaczy w
kosmetykach zastosowano ekstrakcj SFE w poczeniu z bezporedni derywatyzacj analitw i
ekstrakcj metod HS-SPME. Parabeny i polifenole s nielotne, aby je oznacza metod
chromatografii gazowej, naley je przeprowadzi w pochodne, np. w etery sililowe. Schemat takiej
procedury przedstawiono na rysunku 38. Ekstrakt uzyskany technik SFE jest wprowadzany do
odbieralnika, zawierajcego odczynnik do sililowania.

Strzykawka
do SPME

Zestaw Odczynnik
do SFE sililujcy

Rysunek 38. Schemat zestawu do izolacji parabenw i polifenoli z kosmetykw poczonymi

metodami SFE i HS-SPME

118
Parabeny i polifenole zawieraj grupy hydroksylowe, ktre reaguj z odczynnikiem. W wyniku reakcji
powstaj etery sililowe, sorbujce si na wknie SPME. Wkno z analitami jest nastpnie
wprowadzane do dozownika chromatografu gazowego i analizowane poczonymi technikami
chromatografii gazowej i spektrometrii mas (GC/MS). Ekstrakcja pynem w stanie nadkrytycznym ma
wiele zalet:

moliwo stosowania do termolabilnych zwizkw,

niezbyt wysokie cinienie krytyczne, umoliwiajce atwe konstrukcyjnie systemy regulacji
cinienia a tym samym gstoci pynu, co daje du selektywno procesu,
atwo usuwania ekstrahenta (nie zostawia ladw),
dostpno i niski koszt CO2,
moliwo bezporedniego analizowania ekstraktu metod chromatografii gazowej;
moliwo poczenia z innymi technikami (chromatograficznymi i elektromigracyjnymi).

Najczciej SFE jest stosowana w oznaczeniach zanieczyszcze rodowiska (ponad 40% wszystkich
zastosowa), w przemyle (ok. 20%) oraz w analizie ywnoci (ok. 14%).

5.2.12. Ekstrakcja poprzez mineralizacj

Oznaczanie cakowitej zawartoci pierwiastkw w prbkach staych wymaga uprzedniej ich

mineralizacji.

Mineralizacja jest zespoem procesw w wyniku, ktrych zwizki organiczne przeksztacane s

w proste zwizki mineralne takie, jak: CO2, H2O, NH3 i inne. W rodowisku naturalnym procesy
mineralizacji zachodz z udziaem najczciej organizmw ywych. W przypadku mineralizacji z
dostpem tlenu mwimy o butwieniu, w warunkach beztlenowych za o gniciu.

W chemii analitycznej, mineralizacja prbki staej prowadzi do otrzymania zwizkw mineralnych,

ktre atwo przeprowadzi ilociowo do roztworu. Podczas mineralizacji oglna struktura
poszczeglnych czci prbki, w tym mineraw ulega destrukcji, odwrotnie ni w analizie
specjacyjnej. Wybr sposobu mineralizacji zaley od rodzaju analizowanej prbki i od oznaczanego
pierwiastka. Do najwaniejszych sposobw mineralizacji zaliczamy mineralizacj na mokro oraz
mineralizacj na sucho, a kad z nich mona przeprowadzi metod redukcyjn lub utleniajc.
Najczciej stosowan metod pozyskiwania analitw w postaci dogodnej do oznaczenia jest
mineralizacja utleniajca na mokro. W tej technice uywa si mieszaniny jednego lub kilku kwasw
mineralnych (najczciej: HNO3, H2SO4, HClO4) oraz zwizku o waciwociach utleniajcych (np.
H2O2). Przykadem mineralizacji utleniajcej mokrej jest metoda Kjeldahla, wykorzystywana gwnie
do oznaczania azotu organicznego. Mineralizacj w kwasie azotowym z dodatkiem kwasu
nadchlorowego lub wody utlenionej stosuje si do pozyskiwania metali, boru, fosforu, siarki i
chlorowcw z prbek organicznych.
Mineralizacja jest procesem dugotrwaym, dlatego wspomagana jest:

stosowaniem podwyszonej temperatury,

wykorzystaniem promieniowania UV, jako katalizatora reakcji utleniania,

119
 wykorzystaniem ani ultradwikowej, wykorzystanie zjawiska kawitacji,
uyciem energii mikrofalowej, jako nonika energii bezporednio do czsteczki
zwizku mineralizowanego,
uyciem podwyszonego cinienia.

Wrd metod mineralizacji na sucho stosuje si stapianie z solami mineralnymi o waciwociach

utleniajcych, jak NaNO3, KNO3, Na2CO3. Proces ten uatwia rozpuszczanie w kwasach lub wodzie
oznaczanych analitw.

120
6. Literatura
1. Kocjan, R. (red.) Chemia analityczna. Podrcznik dla studentw; Wydawnictwo Lekarskie PZWL:
Warszawa, 2000; Tom 2.
2. Komider, J.; Mazur-Chrzanowska, B.; Wyszyski, B. Odory; Wydawnictwo Naukowe PWN:
Warszawa, 2002.
3. Mitra, S. (red.) Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry; John Wiley & Sons Inc.:
New York, 2003.
4. Molenda, J.; Steczko, K. Ochrona rodowiska w gazownictwie i wykorzystaniu gazu;
Wydawnictwo Naukowo-Techniczne: Warszawa, 2000.
5. Namienik, J. (red.) Metody instrumentalne w kontroli zanieczyszcze rodowiska; Wydawnictwo
Politechniki Gdaskiej: Gdask, 1992.
6. Namienik, J.; Jamrgiewicz, Z.; Pilarczyk, M.; Torres. L. Przygotowanie prbek rodowiskowych
do analizy; Wydawnictwo Naukowe PWN: Warszawa, 2000.
7. Namienik, J.; Jamrgiewicz, Z. (red.) Fizykochemiczne metody kontroli zanieczyszcze
rodowiska; Wydawnictwo Naukowo-Techniczne: Warszawa, 1998.
8. Paderewski, M. L. Procesy adsorpcyjne w inynierii chemicznej; Wydawnictwo Naukowo-
Techniczne: Warszawa, 1999.
9. Abdel-Rehim, M. J. Chromatogr. A 2010, 1217, 2569-2580.
10. Babic, S.; Petrovic, M.; Kastelan-Macan, M. J. Chromatogr. A 1998, 823, 39.
11. Beyer, A.; Biziuk, M. Ecol. Chem. Eng. S 2007, 14, 291-313.
12. Cheng, D. H.; Chen, X. W.; Shu, Y.; Wang, J. H. Talanta 2008, 75, 1270-1278.
13. Ciemniak, A. ywno. Nauka. Technologia. Jako 2007, 3, 54-61.
14. Clement, M.; Arzel, S.; Le Bot, B.; Seux, R.; Millet, M. Chemosphere 2000, 40, 49-56.
15. Curyo, J.; Wardencki, W.; Namienik, J. Pol. J. Environ. Stud. 2007, 16, 5-16.
16. Dbrowska, H.; Dbrowski, .; Biziuk, M.; Gaca, J.; Namienik, J. J. Chromatogr. A 2003, 1003, 29
42.
17. Deng, C.; Yao, N.; Wang, B.; Zhang, X. J. Chromatogr. A 2006, 1103, 15-21.
18. Dziadek, K.; Wacawek, W. Chemia, Dydaktyka, Ekologia i Metrologia 2005, 10, 33-37.
19. Eskilsson, C. S.; Bjorklund, E. J. Chromatogr. A 2000, 902, 227250.
20. Fernandes, J. O.; Soares, C. J. Chromatogr. A 2007, 1175, 16, 2007
21. Ge, L.; Wang, X. T.; Tan, S. N.; Tsai, H. H.; Yong, J. W. H.; Hu, L. Talanta 2010, 81, 18611864.
22. Gonzlez, E. J.; Gonzlez, B.; Calvar, N.; Domnguez, A. Fluid Phase Equilibria 2010, 295, 249254.
23. Guan, W.; Wang, Y.; Xu, F.; Guan, Y. J. Chromatogr. A 2008, 1177, 28-35.
24. Guiochon, G. A.; Beaver, L. A. Anal. Chim. Acta 2004, 523, 1-14.
25. Hennion, M.-C. J. Chromatogr. A 1999, 856, 354.
26. Hu, Y.; Zheng, Y.; Zhu, F.; Li, G. J. Chromatogr. A 2007, 1148, 16-22.
27. Huie, C. W. Anal. Bioanal. Chem. 2002, 373, 2330.
28. Jeannot, M. A.; Cantwell, F. F. Anal. Chem. 1997, 69, 235-239.
29. Jonsson, S.; Hagberg, J.; Bavel B. J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 49624967.
30. Karasova, G.; Brandsteterova, A.; Lachova, M. Czech J. Food Sci. 2003, 21, 219234.
31. Kawaguchi, M.; Takahashi, S.; Seshimo, F.; Sakui, N.; Okanouchi, N.; Ito, R.; Inoue, K.; Yoshimura,
Y.; Izumi, S.; Makino, T.; Nakazawa, H. J. Chromatogr. A 2004, 1046, 8388.
32. Klein, D. R.; Flannelly, D.F.; Schultz, M. M. J. Chromatogr. A 2010, 1217, 1742-1747.
33. Kloskowski, A.; Pilarczyk, M.; Namienik J. Anal. Chem. 2009, 81, 7363-7367.

121
34. Koning, S.; Janssen, H. G.; Brinkman, U. A. Th. Chromatographia 2009, 69, Suplement 1, 33-78.
35. Kosikowska, M.; Biziuk, M. Ecol. Chem. Eng. S 2009, 16, 207-220.
36. Kot, A.; Namienik, J. Trends Anal. Chem. 2000, 19, 69-79.
37. Kotowski, W. Ecol. Chem. Eng. S 2008, 15, 43-60.
38. Liang, P.; Liu, R.; Cao J. Microchim. Acta 2008, 160, 135-139.
39. Liu, H.; Dasputa P. K. Anal. Chem. 1996, 68, 1817.
40. Lopez, P.; Sanchez, C.; Batlle, R.; Nerian, C. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 4348-4356.
41. Luque de Castro, M. D.; Priego-Capote, F. J. Chromatogr. A 2010, 1217, 23832389.
42. Maltez, H. F.; Borges, D. L. G.; Carasek, E.; Welz, B.; Curtius, A. J. Talanta 2008, 74, 800805.
43. Novkov, L.; Vlkov, H. Anal. Chim. Acta 2009, 656, 8-35.
44. Onuska, F. I.; Terry, K.A. Chromatographia 1993, 36, 191-194.
45. Poole, C. F.; Poole, S. K. J. Chromatogr. A 2010, 1217, 2268-2286.
46. Prieto, A.; Basauri, O.; Rodin, R.; Usobiaga, A.; Fernndez, L. A.; Etxebarria, N.; Zuloaga, O. J.
Chromatogr. A 2010, 1217, 26422666.
47. Przyjazny, A.; Kokosa, J. M. J. Chromatogr. A 2002, 977, 143153.
48. Raynie, D. E. Anal. Chem. 2006, 78, 3997-4003.
49. See, H. H.; Sanagi, M. M.; Ibrahim, W.; Naim, A. A. J. Chromatogr. A 2010, 1217, 1767-1772.
50. Shariati-Feizabadi, S.; Yamini, Y.; Bahramifar, N. Anal. Chim. Acta 2003, 489, 2131.
51. Smith, R. M. J. Chromatogr. A 2003, 1000, 3-27.
52. Souza Pinheiro, A.; Andrade, J. B. Talanta 2009, 79, 13541359.
53. Wardencki, W.; Curyo, J.; Namienik, J. J. Biochem. Biophys. Methods 2007, 70, 275288.
54. Waterman, D.; Horsfield, B.; Leistner, F.; Hall, K.; Smith, S. Anal. Chem. 2000, 72, 3563-3567.
55. Wei, G-T.; Yang, Z.; Chen, C-J. Anal. Chim. Acta 2003, 488, 183192.
56. Xu, H.; Pan, W.; Song, D.; Yang, G. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 9351-9356.
57. Yang, T-J.; Tsai, F-J.; Chen, C-Y.; Yang, T. C-C.; Lee, M-R. Anal. Chim. Acta 2010, 668, 188194.
58. Zougagh, M.; Valcarcel, M.; Ros, A. Trends Anal. Chem. 2004, 23, 399 405.
59. US EPA Method 3546.
60. US EPA Method 3545A.
61. Dmochowski, D.; Prdecka, A.; Dmochowska, A. Zeszyty Naukowe SGSP 2008, 37, 49-61,
http://www.zn.sgsp.edu.pl/37/zn_nr_37.pdf
62. Luliski, P.; Cielak, A.; Maciejewska, D. Biul. Wydz. Farm. WUM 2008, 1, 1-11,
http://biuletynfarmacji.wum.edu.pl/
63. Namienik, J. Materiay z Konferencji Zielona Chemia Analityczna, lesin, 11-13.05.2009,
http://www.sge.com.pl/sympozja/pdfy/slesin2009_namiesnik.pdf
64. wietlik, R; Trojanowska, M. Monitoring rodowiska Przyrodniczego 2008, 9, 29-36,
http://www.ujk.edu.pl/ios/wydawnictwa/z9/Ryszard%20Swietlik.pdf

122
III. Techniki chromatograficzne
1. Wprowadzenie do chromatografii
1.1. Wstp

Chromatografia jest jedn z gwnych technik separacyjnych stosowanych przede wszystkim w

analityce zwizkw chemicznych. Umoliwia ona wykrywanie badanej substancji i oznaczanie jej iloci
w prbkach o zoonym skadzie. Prbki mog by gazowe, cieke lub stae, za sam proces
chromatograficzny moe by prowadzony albo przy uyciu kosztownej aparatury, albo powszechnie
dostpnego sprztu laboratoryjnego.
Chromatografia jest zarwno metod analityczn jak i metod preparatywn suc do izolacji
czystych substancji. Jest obecnie najbardziej rozpowszechnion i jednoczenie wszechstronn
technik separacyjn, dostpn nie tylko w nowoczesnych laboratoriach. Stosuje si j powszechnie
w przemyle chemicznym, farmaceutycznym, kosmetycznym, spoywczym a take w subie zdrowia,
ochronie rodowiska, rolnictwie i innych gaziach przemysu i gospodarki.
Chromatografia narodzia si na pocztku XX wieku w wyniku prac rosyjskiego botanika, Michaia
Semenowicza Cwieta (1872-1919), ktrego wspczenie uwaa si za jej twrc. Cwiet, pracujc
nota bene na Uniwersytecie Warszawskim i zajmujc si badaniem barwnikw rolinnych podj
prb rozdzielenia ich na kolumnie wypenionej adsorbentem. Kolorowe pasma barwnikw,
uzyskane na kolumnie w czasie rozdzielania day pocztek nazwie chromatografia (z greckiego:
chromatos = barwa oraz grapho = pisze), std aparat do rozdzielania na kolumnie zosta nazwany
chromatografem. Prace Cwieta zostay docenione dopiero w poowie XX wieku wraz z rozwojem
bada nad fizykochemi powierzchni i zjawisk midzyfazowego podziau, ktre zapocztkoway
intensywny rozwj chromatografii. Obecnie chromatografia jest stosowana do separacji wszystkich
(nie tylko barwnych) rodzajw zwizkw chemicznych.
Chromatografia jest oparta na systemie dwch niemieszajcych si faz: fazy stacjonarnej
(nieruchomej) oraz fazy ruchomej, ktra porusza si wzdu fazy stacjonarnej. Prbka jest
wprowadzana do kolumny w postaci wskiego pasma, co znaczy, e ma niewielk objto (rysunek
1). Skadniki prbki s separowane dziki temu, i w rny sposb dziel si pomidzy obie fazy i tym
samym przemieszczane s przez faz ruchom z rn prdkoci. Kinetyczny ruch czsteczek
powoduje cig wymian skadnikw prbki pomidzy obydwoma fazami. Jednoczenie faza
ruchoma porusza si wzdu fazy stacjonarnej i czsteczki, ktre s w danym momencie rozpuszczone
w fazie ruchomej poruszaj si wraz z ni. Natomiast te czsteczki, ktre s w danym momencie
zatrzymane przez faz stacjonarn, nie przemieszczaj si wzdu kolumny. Skadniki prbki, ktre
wykazuj wiksze powinowactwo do fazy ruchomej poruszaj si znacznie szybciej ni skadniki, ktre
wykazuj wiksze powinowactwo do fazy stacjonarnej, i tym samym te pierwsze wczeniej
opuszczaj ukad chromatograficzny. Tak wic separacja skadnikw prbki jest spowodowana
rnymi szybkociami migracji poszczeglnych skadnikw prbki w ukadzie chromatograficznym.
Proces chromatograficzny mona prowadzi w kolumnach chromatograficznych (rysunek 1) bd
technik planarn (rysunek 2). Najprostsza chromatografia kolumnowa wymaga jedynie szklanej rurki
(kolumny) zakoczonej zaworem. Szklana kolumna jest wypeniona faz stacjonarn, przez ktr
przepywa faza ruchoma. Badan mieszanin (prbk) wprowadza si na pocztek (czoo) zoa fazy
stacjonarnej, a nastpnie przepuszcza si faz ruchom przez kolumn. W tym czasie skadniki prbki

123
ulegaj separacji i kolejno opuszczaj kolumn, czyli ulegaj elucji z kolumny (s eluowane, eluuj si
z kolumny).

Faza ruchoma wprowadzana do

kolumny w sposb cigy

Prbka wprowadzona
do kolumny

Zwizki rozdzielane
Faza stacjonarna w kolumnie

Czas

Rysunek 1. Chromatografia kolumnowa

Technika planarna polega na wykonaniu procesu chromatograficznego na bibule lub na cienkich

warstwach fazy stacjonarnej osadzonych na podou z pytek szklanych, folii aluminiowej lub
polimerach (chromatografia cienkowarstwowa) (rysunek 2). Gwn rnic pomidzy
chromatografi kolumnow a chromatografi cienkowarstwow jest ksztat fazy stacjonarnej, czyli
ksztat zoa chromatograficznego. W chromatografii cienkowarstwowej faza ruchoma porusza si w
gr pytki chromatograficznej dziki dziaaniu si kapilarnych.

Faza Czoo fazy

stacjonarna ruchomej

Rozdzielone
zwizki

Faza
Linia ruchoma
startu

Rysunek 2. Chromatografia cienkowarstwowa, pytka przygotowana do rozdzielania z naniesionymi

plamkami badanych prbek (po lewej), pytka po wykonaniu rozdzielania (po prawej)

124
1.2. Podstawowe definicje chromatograficzne

Intensywny rozwj chromatografii spowodowa powstanie wielu terminw i poj zwizanych z t

technik separacyjn. Ich znajomo jest niezbdna do prawidowego zrozumienia tej dziedziny
wiedzy. Midzynarodowa Unia Chemii Czystej i Stosowanej (IUPAC) opublikowaa nomenklatur
chromatograficzn w jzyku angielskim w 1993 roku. Nomenklatura ta zostaa przetumaczona na
jzyk polski i wydana przez Polskie Towarzystwo Chemiczne w 1996 roku. W niniejszym rozdziale
zostan przedstawione podstawowe pojcia i definicje wybrane z nomenklatury chromatograficznej.
Chromatografia jest fizyczn metod rozdzielania, w ktrej skadniki rozdzielane ulegaj podziaowi
pomidzy dwie niemieszajce si fazy; jedna z nich jest nieruchoma (faza stacjonarna), a druga (faza
ruchoma) porusza si w okrelonym kierunku.
Faza stacjonarna jedna z dwch faz tworzcych ukad chromatograficzny, okrelana te terminem
zoe chromatograficzne. Faza stacjonarna moe by staa lub cieka. Jeeli faza stacjonarna jest
ciecz to moe by albo zwizana chemicznie z ciaem staym (nonikiem) albo unieruchomiona na
nim fizycznie.
Faza ruchoma pyn (gaz lub ciecz), ktry przemieszcza si przez nieruchom faz stacjonarn albo
wzdu niej w okrelonym kierunku. W chromatografii gazowej stosujemy termin gaz nony
natomiast w chromatografii cieczowej stosujemy termin eluent dla okrelenia fazy ruchomej.
Wyrniamy eluent (faza ruchoma wprowadzana do kolumny) oraz eluat (faza ruchoma, wraz z
rozpuszczonymi w niej skadnikami prbki, opuszczajca kolumn), a proces przemieszczania si
eluentu przez kolumn i opuszczania kolumny przez eluat nazywa si elucj.
Chromatografia elucyjna technika, w ktrej faza ruchoma przemieszcza si cigle przez zoe
chromatograficzne natomiast prbka jest wprowadzona do ukadu w jednej porcji.
Strefa (pasmo) objto zoa chromatograficznego, w ktrej znajduje si jeden lub wicej
skadnikw prbki.
Chromatogram (gazowy, cieczowy) jest to wykres przedstawiajcy zmiany stenia analitu w fazie
ruchomej opuszczajcej kolumn w zalenoci od czasu lub objtoci fazy ruchomej.
Chromatograf jest to przyrzd lub zestaw przyrzdw sucy do wykonywania rozdzielania
chromatograficznego. Najwaniejsze czci chromatografu to dozownik, kolumna chromatograficzna
oraz detektor.
Dozownik urzdzenie za pomoc, ktrego wprowadzamy prbk do fazy ruchomej przed zoem
chromatograficznym lub na to zoe.
Detektor urzdzenie, ktre okrela zmiany w skadzie fazy ruchomej przepywajcej przez niego
poprzez pomiar jej waciwoci fizycznych lub chemicznych. Innymi sowy jest to urzdzenie, ktre
monitoruje skad wypywajcego z kolumny eluatu w sposb cigy, a zapis wskaza detektora w
czasie rozdzielania to chromatogram.
Kolumna rurka ze znajdujc si w niej faz stacjonarn, przez ktr przepywa faza ruchoma.
Kolumna pakowana rurka zawierajca zoe chromatograficzne w caej objtoci.
Kolumna otwarta kolumna o maej rednicy, w ktrej faza stacjonarna jest naniesiona w postaci
warstwy na wewntrzn cian rurki a faza ruchoma przepywa w sposb swobodny. Stosuje si te
pojcia: kolumna o przekroju otwartym bd kolumna kapilarna.

125
Chromatografia w odwrconym ukadzie faz rodzaj chromatografii cieczowej, w ktrej faza
ruchoma jest znacznie bardziej polarna ni faza stacjonarna.
Chromatografia w normalnym ukadzie faz rodzaj chromatografii cieczowej, w ktrej faza ruchoma
jest mniej polarna ni faza stacjonarna.
Elucja izokratyczna proces rozdzielania chromatograficznego z wykorzystaniem fazy ruchomej o
niezmiennym skadzie jakociowym i ilociowym.
Elucja gradientowa - proces rozdzielania chromatograficznego z wykorzystaniem fazy ruchomej o
zmieniajcym si, w sposb cigy lub stopniowo, skadzie jakociowym lub/i ilociowym. Techniki
chromatograficzne dzieli si wedug nastpujcych kryteriw:

stanu skupienia fazy ruchomej,

mechanizmu rozdzielania,
sposobu prowadzenia procesu chromatograficznego (ksztat zoa chromatograficznego, skala
procesu).
Ze wzgldu na stan skupienia fazy ruchomej wyrniamy nastpujce rodzaje chromatografii:
chromatografia gazowa (GC) technika rozdzielania, gdzie faz ruchom jest gaz; w
chromatografii gazowej zawsze stosujemy kolumny chromatograficzne,
chromatografia cieczowa (LC) technika rozdzielania, gdzie faz ruchom jest ciecz; w
chromatografii cieczowej rozdzielania chromatograficzne mona prowadzi w kolumnach
bd technik planarn, wyrnia si rwnie wysokosprawn chromatografi cieczow
(HPLC) a take ultrasprawn chromatografi cieczow (UPLC),
chromatografia z faz ruchom w stanie nadkrytycznym (SFC) technika rozdzielania, w
ktrej faza ruchoma jest pynem powyej jego krytycznej temperatury i krytycznego cinienia;
stosuje si rwnie terminy: chromatografia fluidalna czy chromatografia nadkrytyczna.
Ze wzgldu na mechanizm rozdzielania wyrniamy nastpujce rodzaje chromatografii:
chromatografia adsorpcyjna rozdzielanie jest wynikiem rnic pomidzy skadnikami prbki
w zdolnoci do adsorbowania si na powierzchni ciaa staego (adsorbentu),
chromatografia podziaowa rozdzielanie jest wynikiem rnej rozpuszczalnoci skadnikw
prbki w fazie stacjonarnej (w przypadku chromatografii gazowej) lub rnej rozpuszczalnoci
skadnikw w fazie stacjonarnej i ruchomej (w przypadku chromatografii cieczowej),
chromatografia jonowa (jonowymienna) technika, w ktrej rozdzielanie jest wynikiem
rnej zdolnoci skadnikw prbki do ulegania wymianie jonowej,
chromatografia wykluczania technika, w ktrej o rozdziale skadnikw prbki decyduj
rnice w wielkociach czsteczek i/lub w ich ksztacie; w przeszoci stosowane byy rwnie
nazwy: chromatografia elowa, sczenie molekularne, chromatografia sitowa,
chromatografia powinowactwa - technika, w ktrej rozdzielanie jest wynikiem biologicznej
specyficznoci oddziaywa midzy dwiema substancjami oznaczanym skadnikiem prbki i
reaktywnym chemicznie ligandem zwizanym z powierzchni nonika, ten rodzaj
chromatografii jest stosowany do izolacji i oczyszczania biaek oraz kwasw nukleinowych.
Ze wzgldu na sposb prowadzenia procesu chromatograficznego wyrnia si nastpujce rodzaje
chromatografii:

chromatografia kolumnowa technika rozdzielania, w ktrej faza stacjonarna znajduje si w

rurce (kolumnie), czstki staej fazy stacjonarnej albo nonika pokrytego ciek faz

126
 stacjonarn wypeniaj ca objto rurki (kolumna pakowana) lub s osadzone na
wewntrznych ciankach rurki (kolumna otwarta, czyli kolumna ze swobodnym przepywem
fazy ruchomej),
chromatografia planarna technika rozdzielania, w ktrej faza stacjonarna jest pask
warstw; rozrnia si tu chromatografi bibuow oraz chromatografi cienkowarstwow
(TLC), gdzie faza stacjonarna jest naniesiona w postaci warstwy na pytk,
chromatografia analityczna i preparatywna techniki rozrniane ze wzgldu na skal
procesu; obie chromatografie: kolumnowa i planarna mog by prowadzone w skali
analitycznej i preparatywnej.

1.3. Chromatogram

W kadej technice chromatograficznej na pocztku rozdziela si badan prbk a nastpnie

przeprowadza si detekcj poszczeglnych skadnikw. Wynik procesu chromatograficznego zapisuje
si w postaci chromatogramu przedstawiajcego wykres wskaza sygnau uzyskanego w detektorze
(odpowiadajcego zmianom stenia substancji w fazie ruchomej opuszczajcej kolumn i
przechodzcej przez detektor) w funkcji czasu lub (rzadko) w funkcji objtoci fazy ruchomej (rysunek
3 i 4). Na osi X chromatogramu mierzymy czas natomiast na osi Y wielko (wysoko lub
powierzchnia) pikw .

Maksimum piku

Pik
h

Linia podstawowa

Podstawa piku

Czas Czas
Rysunek 3. Pik chromatograficzny

Zapis stenia pojedynczej substancji w fazie ruchomej w funkcji czasu ma posta krzywej Gaussa i
nosi nazw piku (ang. peak - szczyt) (rysunek 3). Inaczej mwic jest to cz chromatogramu
ilustrujca sygna detektora w czasie, gdy kolumn opuszcza skadnik prbki.
Wysoko piku (h) jest to odlego pomidzy podstaw piku a maksimum piku (rys. 4). Wysoko
piku mierzy si do linii podstawowej piku a nie do osi X chromatogramu. Wielko piku, w tym i
wysoko, jest proporcjonalna do iloci rozdzielanej substancji a wic moe suy do analizy

127
ilociowej. Jednake, bardziej rozpowszechnione w analizie ilociowej, bo dokadniejsze, jest
korzystanie z pola powierzchni piku.
Linia podstawowa (linia zerowa) jest to cz chromatogramu ilustrujca sygna detektora w
czasie, gdy z kolumny wypywa jedynie faza ruchoma.

Podstawa piku jest wyznaczana poprzez interpolacj linii podstawowej chromatogramu pomidzy
kocami piku.

Chromatogram przedstawiony na rysunku 4 zawiera pik substancji niezatrzymywanej na fazie

stacjonarnej. Na rysunku przedstawiono te podstawowe parametry retencyjne
chromatografowanych substancji.

tR
Wysoko piku

Pik badanej substancji

tM

Pik substancji
niezatrzymywanej na
Pocztek fazie stacjonarnej
analizy
Linia podstawowa

Czas

Rysunek 4. Chromatogram elucyjny oraz podstawowe parametry retencyjne: czas retencji substancji
niezatrzymywanej tM, cakowity czas retencji tR oraz zredukowany czas retencji tR badanej substancji

Chromatogram dostarcza wielu cennych informacji, w tym dwie najwaniejsze:

o skadzie jakociowym rozdzielanej prbki (pooenie piku substancji na
chromatogramie, czyli czas retencji piku, pozwala na jej identyfikacj),
o skadzie ilociowym rozdzielanej prbki (wysoko i pole powierzchni piku substancji
odpowiada jej steniu w prbce).

W praktyce, nie zawsze w badanej prbce wystpuj substancje niezatrzymywane na fazie

stacjonarnej, co powoduje, e wyznaczenie czasu retencji substancji niezatrzymywanej nie jest
spraw prost. W chromatografii gazowej tak substancj byby hel.

128
1.4. Podstawowe parametry retencyjne

Retencja (ac. retentio powstrzymywanie) w chromatografii charakteryzuje czas przebywania

substancji w kolumnie chromatograficznej. Skadniki prbki mog wdrowa przez kolumn
chromatograficzn wolniej ni faza ruchoma - to zjawisko nazywa si retencj. Na chromatogramie
mona okreli parametry retencyjne rozdzielanej substancji. Parametry retencji opisuj zachowanie
si rozdzielanych skadnikw mieszaniny. Parametry retencji wyznacza si poprzez pomiar odlegoci
na chromatogramie, zapisywanym przez rejestrator na papierze z okrelon prdkoci i przeliczeniu
na czas lub odczytuje bezporednio z wydruku chromatogramu, zapisanego przez odpowiednie
urzdzenie (np. komputer). Sposb pomiaru jest przedstawiony na rysunku 5.Najczciej stosowane
w chromatografii parametry retencyjne to:

czas retencji substancji niezatrzymywanej tM - czas liczony od momentu wprowadzenia do

kolumny (od pocztku analizy) substancji niezatrzymywanej przez faz stacjonarn do
momentu pojawienia si na chromatogramie maksimum piku; odpowiada czasowi, w ktrym
faza ruchoma migruje przez kolumn chromatograficzn oraz przez dozownik, detektor i
czniki; poprzednio nazywany rwnie czasem martwym lub czasem zerowym,
objto retencji substancji niezatrzymywanej VM - objto fazy ruchomej, ktra jest potrzebna do
elucji substancji niezatrzymywanej przez faz stacjonarn; poprzednio nazywana objtoci martw
lub zerow; objto retencji substancji niezatrzymywanej jest oczywicie proporcjonalna do czasu
retencji substancji niezatrzymywanej:

VM = t M Fc (1)
gdzie:
Fc - natenie przepywu fazy ruchomej (objtociowa prdko przepywu fazy
ruchomej) w temperaturze kolumny,

cakowity czas retencji tR - czas liczony od momentu wprowadzenia badanej substancji do

kolumny (od pocztku analizy) do momentu pojawienia si na chromatogramie maksimum
piku, czyli momentu maksymalnego stenia substancji na wyjciu z kolumny,
cakowita objto retencji VR - objto fazy ruchomej, ktra jest potrzebna do elucji
badanej substancji mierzona od momentu wprowadzenia substancji do kolumny do momentu
pojawienia si na chromatogramie maksimum piku; cakowita objto retencji jest
proporcjonalna do cakowitego czasu retencji:

VR = t R Fc (2)

zredukowany czas retencji tR rnica pomidzy cakowitym czasem retencji badanej

substancji i czasem retencji substancji niezatrzymywanej:

t 'R = t R t M (3)
Zredukowany czas retencji charakteryzuje retencj substancji na fazie stacjonarnej i jest
charakterystyczny dla danej substancji a wic moe suy do jej identyfikacji,
zredukowana objto retencji VR rnica pomidzy cakowit objtoci retencji badanej
substancji i objtoci retencji substancji niezatrzymywanej:

129
 V ' R = VR V M (4)

wspczynnik retencji k miara czasu, w jakim substancja przebywa w fazie stacjonarnej, w

stosunku do czasu, w ktrym przebywa ona w fazie ruchomej; okrela, ile razy duej
substancja jest zatrzymywana przez faz stacjonarn ni potrzebowaaby na przejcie przez
kolumn z szybkoci fazy ruchomej. Wspczynnik retencji oblicza si z nastpujcego wzoru:

t'R
k= (5)
tM

Wspczynnik retencji jest to jednoczenie stosunek iloci substancji w fazie stacjonarnej do iloci
tej substancji w fazie ruchomej w stanie rwnowagi.

1.5. Podstawy teoretyczne procesu chromatograficznego

Pomidzy czsteczkami prbki a czsteczkami fazy stacjonarnej i fazy ruchomej zachodz

oddziaywania midzyczsteczkowe, ktre rni si midzy sob, w zalenoci od charakteru
zwizkw oddziaujcych (por roz. I.2.3) i od miejsca wystpowania na powierzchni graniczcych ze
sob faz, np. podczas adsorpcji lub w caej objtoci faz ukadu, jak w przypadku podziau (por.roz. I.
2.2.). Oddziaywania midzyczsteczkowe powoduj, e skadniki mieszaniny s w rnym stopniu
zatrzymywane przez faz stacjonarn. Oczywicie silniejsze oddziaywanie z faz stacjonarn
powoduje wiksz retencj danego skadnika prbki i tym samym pniejsze opuszczenie ukadu (np.
kolumny chromatograficznej). Oddziaywania midzyczsteczkowe mog zachodzi tylko midzy
skadnikami prbki a faz stacjonarn, jak w przypadku chromatografii gazowej, gdzie gaz nony nie
oddziauje ze skadnikami prbki natomiast w chromatografii cieczowej zachodz oddziaywania
midzyczsteczkowe pomidzy wszystkimi elementami ukadu faz stacjonarn, faz ruchom
(rozpuszczalnikiem) i skadnikami prbki (rysunek 6). Tym samym w chromatografii gazowej jedynie
faza stacjonarna wpywa na retencj a w przypadku chromatografii cieczowej, na retencj skadnikw
prbki wpywa zarwno faza stacjonarna jak i faza ruchoma.

Skadniki mieszaniny wprowadzanej do kolumny chromatograficznej migruj poprzez kolumn z

rn prdkoci a tym samym opuszczaj j w rnym czasie. Zatrzymywanie skadnikw prbki na
powierzchni fazy stacjonarnej jest spowodowane rnorodnymi zjawiskami, takimi jak:

adsorpcja,
podzia,
oddziaywania jonowe,
oddziaywania jonowo-asocjacyjne,
efekty zwizane z rozmiarami czsteczek (wykluczanie),
powinowactwo biologiczne.

130
 Chromatografia gazowa Chromatografia cieczowa

Faza Faza Faza

stacjonarna stacjonarna ruchoma

Oddziaywania analit : Oddziaywania midzy

faza stacjonarna fazami Analit

Rysunek 6. Oddziaywania midzyczsteczkowe w chromatografii gazowej oraz w chromatografii

cieczowej

Oddziaywania midzyczsteczkowe, ktre bior udzia w procesie chromatograficznym s efektem

wystpowania si midzyczsteczkowych, takich jak:

siy dyspersyjne,
polarne (oddziaywania dipol-dipol, oddziaywania -, wizania wodorowe),
jonowe.
Proces chromatograficzny moe by prowadzony trzema technikami: technik elucyjn, jako analiza
czoowa oraz jako rozwijanie przez rugowanie. Wspczenie, wikszo rozdziele
chromatograficznych jest wykonywana technik elucyjn; pozostae techniki s stosowane bardzo
rzadko. W technice elucyjnej nastpuje seria procesw adsorpcji-desorbcji chromatografowanego
zwizku zachodzcych pomidzy dwiema fazami: stacjonarn i ruchom. Istot procesu oddaje
rysunek 7.

Profile ste zwizku w obu fazach odpowiadaj krzywym Gaussa. Poruszajca si faza ruchoma
przesuwa profil stenia zwizku w fazie ruchomej do przodu w porwnaniu z faz stacjonarn. To
powoduje, e stenie zwizku w fazie ruchomej w czci frontowej piku przekracza stan rwnowagi i
nastpuje przejcie czci masy zwizku z fazy ruchomej do fazy stacjonarnej. Odwrotny proces
nastpuje w tylnej czci piku. Pasmo zwizku porusza si wzdu kolumny chromatograficznej w
rezultacie transferu zwizku z fazy ruchomej do stacjonarnej we frontowej poowie piku przy
jednoczesnym transferze zwizku z fazy stacjonarnej do ruchomej w czci tylnej piku.

131
 Rysunek 7. Proces elucji zwizku w chromatografii [na podstawie Chromatography theory.
Cazes J., Scott R.P.W., 2002]

Istniej dwie fundamentalne teorie chromatograficzne: teoria pek oraz teoria kinetyczna. Teoria pek
opisuje czynniki, ktre kontroluj retencj chromatograficzn oraz pozwala na obliczenie objtoci retencji.
Teoria kinetyczna opisuje zjawisko rozmycia pasma chromatograficznego.

1.5.1. Teoria pek

W chromatografii podziaowej rozdzielanie skadnikw prbki jest wynikiem ich rnej
rozpuszczalnoci w fazach chromatograficznych. Dla zobrazowania procesu podziau przyjmuje si, e
kolumna chromatograficzna skada si z wielkiej iloci poczonych ze sob sekcji, czyli tzw. pek
teoretycznych (rysunek 8). Termin ten zosta zaczerpnity z teorii destylacji i ma wymiar cakowicie
teoretyczny. Pod pojciem pki teoretycznej rozumiemy tak objto kolumny, w ktrej zostaje
osignity stan (dynamicznej) rwnowagi pomidzy steniem zwizku w fazie stacjonarnej, a jego
steniem w fazie ruchomej.

Pka teoretyczna

Kolumna chromatograficzna

Rysunek 8. Ilustracja pki teoretycznej kolumny chromatograficznej

Tak jak to opisano wczeniej, rozkad czsteczek analitu pomidzy dwie niemieszajce si fazy
charakteryzuje staa podziau K opisana rwnaniem Nernsta (por. roz. I.2.2 rwnanie 26)

132
Kiedy substancja jest wprowadzona do kolumny chromatograficznej natychmiast dzieli si pomidzy
faz stacjonarn a faz ruchom w pierwszej pce zgodnie z wartoci staej podziau.
Rozpuszczone w fazie ruchomej czsteczki substancji poruszaj si wraz z ni, a napotykaj faz
stacjonarn w drugiej pce. Ponownie dziel si pomidzy obie fazy zgodnie z wartoci staej
podziau. Jednoczenie stenie substancji w fazie ruchomej w pierwszej pce ulega zmniejszeniu,
a wic cz czsteczek przechodzi z fazy stacjonarnej do fazy ruchomej, aby stosunek ste
odpowiada wartoci staej podziau. W krtkim czasie wszystkie czsteczki substancji przechodz z
pierwszej pki do nastpnej. Faza ruchoma porusza si poprzez kolejne pki i w kadej z nich
ustala si lokalna rwnowaga opisana prawem Nernsta. Proces trwa dopki wszystkie czsteczki
substancji nie opuszcz kolumny chromatograficznej.

K=1 K = 1/2

Rysunek 9. Mechanizm procesu chromatograficznego na przykadzie chromatografii gazowej na

kolumnie o przekroju otwartym; rozdzielane substancje charakteryzuj si zrnicowanymi staymi
podziau K

Gdy do kolumny chromatograficznej wprowadzona jest mieszanina dwch lub wicej substancji,
charakteryzujcych si rnymi staymi podziau, substancje, ktrych staa podziau jest mniejsza od
jednoci (K < 1) migruj znacznie szybciej przez kolumn ni te, ktrych K > 1. W rezultacie,
substancje o niszej wartoci staej podziau ulegaj rozdzieleniu od substancji o jej wyszej wartoci
(rysunek 9).
Teoria pek wprowadza fundamentalne rwnanie chromatografii czce cakowit objto retencji
substancji VR ze sta podziau K:
VR = Vm + KVs + VE (6)
gdzie:
VR objto retencji substancji,
K staa podziau,
Vm objto fazy ruchomej,
Vs objto fazy stacjonarnej,
VE objto pozakolumnowa (objto dozownika, cznikw itp.); dla VE << Vm, warto VE
pomija si.

Objto retencji substancji niezatrzymywanej na kolumnie VM w praktyce jest sum objtoci fazy
ruchomej Vm oraz objtoci pozakolumnowej VE:

133
 VM = Vm + VE (7)
gdzie:
VM objto retencji substancji niezatrzymywanej na kolumnie,
Vm objto fazy ruchomej,
VE objto pozakolumnowa.
Czas retencji tR jest proporcjonalny do objtoci retencji:
VR = t R VC (8)
gdzie:
VR objto retencji substancji,
tR czas retencji substancji,
Fc natenie przepywu fazy ruchomej.
Z rwnania wywodzcego si z teorii pek wynikaj praktyczne wnioski:

im wiksza warto staej podziau K, tym wikszy czas retencji tR danego zwizku,
wzrost objtoci fazy stacjonarnej Vs powoduje wzrost czasu retencji tR danego zwizku,
czyli czas retencji zaley rwnie od wymiarw kolumny.

Dla dwch rnych zwizkw chemicznych A i B:

VR ( A) = Vm + K ( A)Vs + VE
(9)
VR ( B ) = Vm + K ( B )Vs + VE
(10)

Dwa rne skadniki mieszaniny zostaj rozdzielone, jeli rni si objtoci retencji a tym
samym rni si sta podziau:
VR ( A) VR ( B )

K ( A) K ( B )

Wspczynnik retencji k jest definiowany jako stosunek liczby moli substancji w fazie stacjonarnej do
liczby moli substancji w fazie ruchomej:
ns cV
k= = s s
nm cmVm (11)
gdzie:
k wspczynnik retencji,
ns liczba moli substancji w fazie stacjonarnej,
nm liczba moli substancji w fazie ruchomej.
Wspczynnik retencji k jest zaleny od staej podziau K:

134
 Vs
k=K
Vm (12)

1.5.2. Teoria kinetyczna

Teoria kinetyczna jest drug fundamentaln teori chromatograficzn. Opisuje przyczyny poszerzenia
pasma chromatograficznego. Obszar w zou chromatograficznym, w ktrym znajduje si substancja
rozdzielana (pasmo) stale poszerza si w czasie, kiedy substancja migruje poprzez zoe
chromatograficzne. Poszerzanie si pasma chromatograficznego jest wynikiem zachodzcych w kolumnie
procesw kinetycznych i termodynamicznych. Efektem tego, widocznym na chromatogramie, moe by
szeroki pik substancji.

Rys. 10. Porwnanie chromatogramw mieszaniny substancji A i B otrzymanych na kolumnie o niskiej

sprawnoci (a) oraz o duej sprawnoci (b)

Na rysunku 10 przedstawiono dwa przykady rozdzielania chromatograficznego mieszaniny dwch

substancji A i B, rnicych si czasami retencji. Poszczeglne skadniki mieszaniny s rozdzielone
jedynie wtedy, jeeli profil stenia (pik) kadego z nich jest dostatecznie wski, aby piki nie czyy
si ze sob.

Sprawno kolumn chromatograficznych decyduje o tym, czy uzyskane piki s wskie czy
szerokie. Sprawno kolumn zaley od liczby pek teoretycznych (N) w danej kolumnie. Im
wicej pek teoretycznych, tym kolumna jest sprawniejsza i uzyskane piki rozdzielanych
substancji s wsze.

Liczba pek teoretycznych zaley od dugoci kolumny L oraz od wysokoci pojedynczej pki H:

L
N = (13)
H
gdzie:
N liczba pek teoretycznych,
L dugo kolumny,
H wysoko rwnowana pce teoretycznej, inaczej oznaczana WRPT.

135
Im wiksza jest wysoko pki teoretycznej, tym mniej pek teoretycznych znajduje si w danej
kolumnie i tym mniej sprawna jest kolumna, co powoduje, e uzyskane piki rozdzielanych
substancji s szersze.

Wysoko pki teoretycznej zaley od warunkw eksperymentalnych w danym ukadzie

chromatograficznym, midzy innymi od liniowej prdkoci przepywu fazy ruchomej przez kolumn.
Dla danego ukadu chromatograficznego istnieje optymalna liniowa prdko przepywu fazy
ruchomej, przy ktrej uzyskuje si najmniejsz wysoko pki teoretycznej, a wic najwiksz
sprawno kolumny.
W praktyce liniow prdko przepywu fazy ruchomej oblicza si poprzez podzielenie dugoci
kolumny L przez czas retencji substancji niezatrzymywanej tM:

L
u= (14)
tM
gdzie:
u liniowa prdko przepywu fazy ruchomej.

Wzory opisujce zaleno wysokoci pki teoretycznej od liniowej prdkoci przepywu fazy
ruchomej s bardzo podobne w chromatografii gazowej oraz w chromatografii cieczowej. W
przypadku chromatografii gazowej stosujemy rwnanie van Deemtera natomiast w chromatografii
cieczowej rwnanie Kennedyego i Knoxa.
Wysoko pki teoretycznej H opisana jest rwnaniem van Deemtera:

B
H = A+ + C s u + Cm u (15)
u
gdzie:
A dyfuzja wirowa,
B dyfuzja poduna w fazie ruchomej,
Cs opr przenoszenia masy zwizany z faz stacjonarn,
Cm opr przenoszenia masy zwizany z faz ruchom.

W kolumnie wypenionej faz stacjonarn czsteczki chromatografowanego zwizku poruszaj si

rnymi drogami (rysunek 11), co powoduje, e ich czasy przebywania w kolumnie, a tym samym ich
czasy retencji s rne. Zjawisko to nosi nazw dyfuzji wirowej i jest powodem rozmycia piku. Dyfuzja
wirowa wystpuje w kolumnach pakowanych, w ktrych czstki fazy stacjonarnej wypeniaj ca
wewntrzn objto kolumny, a jej efekt, czyli rozmycie pikw zaley od wymiarw czstek
wypenienia kolumny, ich ksztatu, porowatoci i sposobu upakowania w kolumnie.

136
 Rysunek 11. Mechanizm dyfuzji wirowej. Czerwone linie pokazuj rne drogi czsteczek w
wypenieniu kolumny [na podstawie Chromatography theory. Cazes J., Scott R.P.W., 2002]

Dyfuzja poduna jest efektem przypadkowych ruchw czsteczek chromatografowanego zwizku w

fazie ruchomej (rysunek 12), ktrym ulegaj w sposb naturalny w cieczy lub w gazie. Profil stenia
zwizku w fazie ruchomej ma ksztat krzywej Gaussa, poniewa proces dyfuzji jest przypadkowy.

Rysunek 12. Poszerzanie pasma chromatograficznego w kolumnie z powodu dyfuzji podunej na

podstawie [Chromatography theory. Jack Cazes, Raymond P. W. Scott, 2002]

Parametry C w rwnaniu van Deemtera dotycz oporw przenoszenia masy. Parametr Cs dotyczy
oporu przenoszenia masy zwizanego z faz stacjonarn. W trakcie migracji przez kolumn czsteczki
zwizku chromatografowanego s przenoszone cigle z fazy ruchomej do stacjonarnej i odwrotnie.
Proces ten nie jest byskawiczny, ale wymaga okrelonego czasu, czego efektem jest poszerzanie si
pasma chromatograficznego. Parametr Cm dotyczy oporu przenoszenia masy pomidzy ssiednimi
strumieniami fazy ruchomej.

137
Rwnanie van Deemtera pokazuje jak wysoko pki teoretycznej zaley od liniowej prdkoci
przepywu fazy ruchomej i jest rwnaniem hiperboli (rysunek 13a). Dla danego ukadu
chromatograficznego istnieje optymalna prdko przepywu fazy ruchomej, przy ktrej uzyskuje si
najmniejsz warto wysokoci pki teoretycznej a wic najwiksz sprawno kolumny.
Rysunek 13b ilustruje wpyw indywidualnych czynnikw (A, B/u, Csu, Cmu) na wysoko pki teoretycznej i
na wypadkow krzyw van Deemtera. Wartoci A, B i C s okrelone i stae dla okrelonej substancji
chromatografowanej i okrelonych warunkw chromatograficznych.

a)

b)

Rysunek 13. Krzywa van Deemtera. Zaleno wysokoci pki teoretycznej od prdkoci przepywu
fazy ruchomej w chromatografii gazowej [na podstawie Instrumental Methods of Analysis. Willard et
al., 1988]

W przypadku chromatografii gazowej czynnik Cm jest maoznaczcy i mona go zaniedba. Rwnanie

van Deemtera w chromatografii gazowej podaje si czsto w formie uproszczonej:

B
H = A+ + Cu (16)
u
gdzie:
C opr przenoszenia masy.
Rwnanie Kennedyego i Knoxa opisujce zaleno wysokoci pki teoretycznej od prdkoci
przepywu fazy ruchomej w chromatografii cieczowej:

138
 B
H = Au 1/ 3 + + Cu (17)
u

Wysoko pki teoretycznej H oraz prdko przepywu fazy ruchomej u w chromatografii cieczowej
mog by wyraone jako tzw. wartoci zredukowane: zredukowana wysoko pki teoretycznej h oraz
zredukowana prdko fazy ruchomej v. Wielkoci zredukowane s bezwymiarowe i umoliwiaj
porwnanie waciwoci rnych kolumn chromatograficznych w chromatografii cieczowej. Na sprawno
kolumn w chromatografii cieczowej duy wpyw ma rednia rednica czstek dp wypenienia kolumny,
czyli fazy stacjonarnej. Zredukowana wysoko pki teoretycznej w chromatografii cieczowej jest
stosunkiem wysokoci pki teoretycznej H do redniej rednicy czstek wypenienia kolumny dp:

H
h= (18)
dp
gdzie:
h zredukowana wysoko pki teoretycznej,
dp rednia rednica czstek fazy stacjonarnej.
Zredukowana prdko fazy ruchomej w chromatografii cieczowej:

ud p
v= (19)
DM
gdzie:
v zredukowana liniowa prdko przepywu fazy ruchomej,
DM wspczynnik dyfuzji w fazie ruchomej.
Wykorzystujc pojcia zredukowanej wysokoci pki teoretycznej i zredukowanej prdkoci
fazy ruchomej, rwnanie Knoxa mona przedstawi w nastpujcej formie:

B
h = Av 1 / 3 + + Cv (20)
v

Warto zredukowanej wysokoci pki teoretycznej okrela liczb czstek wypenienia kolumny
tworzcych jedn pk teoretyczn kolumny. W chromatografii cieczowej, kolumna ma dobr
sprawno, gdy h ma warto w przedziale 2 3, jeeli warto h > 10 to kolumna jest le upakowana
lub wypenienie jest zej jakoci.

1.6. Sprawno kolumn chromatograficznych

Liczb pek teoretycznych, czyli sprawno kolumny mona wyznaczy bezporednio z
chromatogramu przy uyciu substancji testowej. Substancj testow moe by zwizek, dla ktrego
wspczynnik retencji k mieci si w granicach od 5 do 10. Pik substancji testowej powinien by
symetryczny (rysunek 14). Liczb pek teoretycznych w kolumnie wyznacza si z nastpujcych
zalenoci:
2
t
N = R (21)

139
 2
t
N = 5,54 R (22)
W1 / 2
lub

2
t
N = 16 R (23)
WB
gdzie:
odchylenie standardowe krzywej Gaussa (szeroko piku na wysokoci rwnej
0,882 h),
W1/2 szeroko piku w poowie jego wysokoci,
WB szeroko piku przy podstawie.

Wszystkie wielkoci mierzone s w jednostkach czasu i wyznaczane bezporednio z chromatogramu

(rys. 14). Liczba pek teoretycznych jest oczywicie wartoci bezwymiarow.

Rysunek 14. Wielkoci odczytywane z chromatogramu; wyznaczanie liczby pek teoretycznych z piku
chromatograficznego

Efektywn liczb pek teoretycznych w kolumnie wyznacza si z nastpujcych zaleznoci:

2
t t
N ef = 5,54 R M (24)
W1 / 2
lub
2
k N
N ef = (25)
1 + k
gdzie:
Nef efektywna liczba pek teoretycznych,
Sprawno rozdzielenia jest wyraana take rozdzielczoci pikw. Rozdzielczo pikw okrela
rozdzielenie dwch pikw z uwzgldnieniem ich rednich szerokoci na linii podstawy. Rozdzielczo
pikw liczy si z nastpujcego wzoru:

140
 2(t R 2 t R1 )
RS = (26)
W B1 + W B 2
gdzie:
RS rozdzielczo pikw, nazywana te zdolnoci rozdzielcz kolumny,
tR1 czas retencji substancji 1,
tR2 czas retencji substancji 2, przy czym tR2 > tR1,
WB1 szeroko piku 1 na linii podstawy,
WB2 szeroko piku 2 na linii podstawy.

Purnell wprowadzi zaleno czc w sobie wielko rozdzielczoci pikw (Rs), selektywno
rozdzielenia (a) oraz sprawno kolumny (N):

1 1 k 2
RS = N2 (27)
4 1 + k 2
gdzie:
k2 wspczynnik retencji substancji 2, przy czym tR2 > tR1,
N2 liczba pek teoretycznych odniesiona do substancji 2,
wspczynnik selektywnoci.

Wspczynnik selektywnoci liczymy z nastpujcego wzoru:

t'R2 k2
= = (28)
t ' R1 k1
gdzie:
tR1 zredukowany czas retencji substancji 1,
tR2 zredukowany czas retencji substancji 2, przy czym tR2 > tR1,
k1 wspczynnik retencji substancji 1,
k2 wspczynnik retencji substancji 2.

1.7. Analiza jakociowa

Analiz jakociow technikami chromatograficznymi mona wykona dwoma sposobami:
poprzez wykorzystanie parametrw retencyjnych analitu (czas retencji, indeksy retencji),
poprzez stosowanie detekcji o duym potencjale identyfikacyjnym, takiej jak spektrometri
mas czy spektroskopi w podczerwieni z transformacj Fouriera (FTIR).

Parametry retencyjne su do identyfikacji zwizkw chemicznych analizowanych technikami

separacyjnymi, poniewa w danych warunkach chromatograficznych okrelony zwizek
chemiczny ma zawsze tak sam retencj.

Jednakowe warunki chromatograficzne oznaczaj jednakowy rodzaj i wymiary kolumny

chromatograficznej, rodzaj i prdko przepywu fazy ruchomej, temperatur analizy itd.
Do identyfikacji zwizkw chemicznych metod chromatografii gazowej oraz chromatografii
cieczowej stosuje si wielko czasu retencji lub zredukowanego czasu retencji. Identyfikacj

141
skadnika prbki wykonuje si w ten sposb, e w staych warunkach chromatograficznych analizuje
si bezporednio po sobie badan prbk oraz wzorzec (rysunek 15), nastpnie porwnuje si czasy
retencji skadnikw prbki oraz wzorca. Jeeli s inne to na pewno mona wykluczy identyczno
substancji. Jeeli s takie same to istnieje due prawdopodobiestwo, e s to identyczne substancje.
Naley zwrci uwag, e pomiar czasu retencji moe by obarczony niewielkimi bdami (rzdu
setnych czci minuty) wynikajcymi ze sposobu dozowania czy chociaby z opnienia w naciniciu
przycisku rozpoczynajcego pomiar (rysunek 15).

a)

b)

Rys. 15. Chromatogramy GC-FID roztworu dokozanu (tR = 9,12 min) (a) oraz badanej prbki (b), pik o
tR = 9,08 min na chromatogramie badanej prbki jest pikiem dokozanu, piki o tR = 2,34 min oraz o tR =
2,42 min na chromatogramie roztworu dokozanu s pikami rozpuszczalnikw, w ktrych
rozpuszczono wzorzec dokozanu, rwnie pik o tR = 2,32 min na chromatogramie badanej prbki jest
pikiem rozpuszczalnika

142
Jednake niektre zwizki chemiczne o rnej budowie mog przypadkowo wykazywa tak sam
retencj. Aby uzyska wiksz pewno co do tosamoci zwizku naley powtrzy analiz
jakociow, stosujc inne warunki chromatograficzne, to znaczy uywajc kolumny
chromatograficznej wypenionej faz stacjonarn o innej polarnoci.
Zamiast czasw retencji mona porwnywa zredukowane czasy retencji analitu i wzorca, co
prowadzi do dokadniejszych wynikw, ale wymaga znajomoci czasu zerowego.
Niewielkie rnice warunkw chromatograficznych pomidzy analiz prbki oraz analiz wzorca
(rysunek 15) mog prowadzi do bdnej interpretacji wynikw. Aby temu zapobiec mona doda
wzorzec do badanej prbki i nastpnie sprawdzi, czy uzyskujemy jeden czy dwa piki
chromatograficzne. Tak sytuacj przedstawia rysunek 19: po dodaniu wzorca do prbki pik analitu
zwikszy si, co oznacza, e jest to ta sama substancja.
Wad powyszych metod jest konieczno dysponowania wzorcami wielu zwizkw chemicznych
oraz wstpnymi informacjami, co do charakteru prbki. Ten sposb identyfikacji stosujemy
najczciej wtedy, kiedy poszukujemy w prbce okrelonej substancji. Jeeli prbka jest zupenie
nieznana to dobieranie wzorcw metod prb i bdw jest praktycznie niewykonalne. Wtedy
lepsz alternatyw jest stosowanie detektorw jakociowych.
Do identyfikacji zwizkw chemicznych metod chromatografii gazowej stosuje si take indeksy
Kovtsa (nazywane rwnie indeksami retencji).

Indeks retencji jest w znacznym stopniu niezaleny od warunkw analizy chromatograficznej i

przez to jest charakterystyczny dla danego zwizku w okrelonej temperaturze analizy i
polarnoci fazy stacjonarnej.

Identyfikacja nieznanego zwizku moe nastpi poprzez porwnanie wyznaczonych indeksw

retencji z danymi zamieszczonymi w literaturze naukowej. Indeks retencji substancji X wyznacza si w
stosunku do retencji n-alkanw, jednego o (z) atomach wgla w acuchu, eluowanego z kolumny
przed substancj, i drugiego o (z + 1) atomach wgla w acuchu, eluowanego z kolumny za
substancj. Indeks retencji n-alkanu wynosi stukrotno liczby atomw wgla, czyli na przykad dla n-
pentanu indeks retencji wynosi 500.
Indeks Kovtsa dla substancji X, wyznaczony w warunkach izotermicznych, oblicza si ze wzoru:
log t ' R X log t ' RZ
K I = 100z + 100 (29)
log t ' RZ + 1 log t ' RZ
gdzie:
t' R Z zredukowany czas retencji n-alkanu o (z) atomach wgla w acuchu,
t' RX zredukowany czas retencji substancji X,
t' RZ +1 zredukowany czas retencji n-alkanu o (z + 1) atomach wgla w acuchu,
t' RZ t' RX t' RZ +1 .

W przypadku chromatografii gazowej z programowaniem temperatury analizy, indeks retencji

wyznacza si stosujc bezporednio wartoci liczbowe zredukowanych czasw retencji. Indeks

143
retencji dla substancji X, wyznaczony w warunkach programowanej temperatury, oblicza si ze
wzoru:
t ' R X t ' RZ
R I = 100 z + 100 (30)
t ' RZ +1 t ' RZ

Wyraenie w liczniku i mianowniku wzoru (30) oznacza rnic czasw retencji, wic w przypadku
chromatografii gazowej z programowaniem temperatury analizy mona wyznaczy indeks retencji
stosujc wartoci cakowitych czasw retencji zamiast zredukowanych czasw retencji. Wzr mona
atwo przeksztaci korzystajc z zalenoci:
t' R = t R t M (3)
gdzie:
tR zredukowany czas retencji substancji,
tR cakowity czas retencji substancji,
t R X t RZ
R I = 100z + 100 (31)
t RZ +1 t RZ
gdzie:
t RZ czas retencji n-alkanu o (z) atomach wgla w acuchu,
tRX czas retencji substancji X,
t RZ +1 czas retencji n-alkanu o (z + 1) atomach wgla w acuchu,
t RZ t RX tRZ +1 .

Detektor o duym potencjale identyfikacyjnym, taki jak spektrometr mas (MS), pozwala na analiz
jakociow skadnikw prbki, poniewa dostarcza informacji o ich masie czsteczkowej i budowie
strukturalnej. W wyniku poczenia chromatografu ze spektrometrem mas uzyskuje si rozdzielenie
mieszaniny skadnikw prbki w kolumnie chromatograficznej a nastpnie identyfikacj
poszczeglnych skadnikw prbki w spektrometrze mas. Moliwe jest poczenie chromatografu
gazowego ze spektrometrem mas (GC-MS) a take chromatografu cieczowego ze spektrometrem
mas (LC-MS). Wynikiem analizy technik spektrometrii mas jest widmo mas. Widmo mas zawiera
informacj o masie czsteczkowej badanego zwizku oraz o budowie strukturalnej. Widmo mas jest
charakterystyczne dla okrelonego zwizku chemicznego i dziki temu pozwala na jego identyfikacj,
albo poprzez interpretacj widma albo poprzez proste porwnanie z katalogami widm.

1.8. Analiza ilociowa

Techniki chromatograficzne, podobnie jak wikszo technik instrumentalnych, nale do metod
porwnawczych, ktre wymagaj kalibracji wzgldem wzorcw.

Analiza ilociowa w technikach chromatograficznych opiera si na tym, e ilo (masa lub

stenie) skadnika prbki jest proporcjonalna do powierzchni (lub wysokoci) jego piku.

Analiz mona wykona poprzez porwnywanie powierzchni (lub wysokoci) piku analitu z
powierzchni (lub wysokoci) piku wzorca o znanej masie lub steniu. Wyniki analizy
chromatograficznej zale od jakoci zastosowanego chromatografu oraz warunkw analizy.

144
Parametr mierzony, pole powierzchni lub wysoko piku, jest funkcj stenia (lub masy)
chromatografowanej substancji.

A = f (c ) (32)
h = f (c ) (33)
gdzie:
A pole powierzchni piku,
h wysoko piku,
c stenie substancji w prbce dozowanej do chromatografu.

Najczciej stosowane s trzy metody analizy ilociowej:

metoda krzywej kalibracyjnej (kalibracja bezwzgldna),
metoda wzorca wewntrznego,
metoda dodatku wzorca.

1.8.1. Metoda krzywej kalibracyjnej

W metodzie krzywej kalibracyjnej mierzony parametr (pole powierzchni lub wysoko piku) jest
funkcj liniow stenia. Mona go opisa rwnaniem prostej:

h = ac + b (34)
gdzie:
c stenie substancji w prbce dozowanej do chromatografu,
a wspczynnik kierunkowy prostej,
b warto staa, bdca wartoci wyznaczon dla lepej prby.

Podobn posta ma rwnie rwnanie wykorzystywane w metodzie krzywej kalibracyjnej w

przypadku, kiedy mierzymy pole powierzchni piku a nie jego wysoko.
Zaleno mierzonego parametru (pola powierzchni lub wysokoci piku) od stenia zwizku mona
przedstawi graficznie (rysunek 16).

h = ac + b h = ac
25 20
20 15
h [cm]

h [cm]

15
10
10
5 5

0 0
0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10
c [m g/ml] c [m g/ml]

Rysunek 16. Przykady krzywych kalibracyjnych, zaleno wysokoci piku chromatograficznego (h) od
stenia badanego zwizku (c)

145
Wspczynnik a okrela czuo metody; im wiksze zmiany parametru mierzonego na jednostk
stenia c, tym wiksza jego warto i tym wysza czuo metody. Metody o maym kcie nachylenia
krzywych kalibracyjnych nie s przydatne do celw analitycznych. Warto staa b moe przyjmowa
wartoci dodatnie, ujemne lub zero.
W metodzie krzywej kalibracyjnej przygotowuje si szereg roztworw o znanych steniach
substancji analizowanych oraz tzw. lep prb roztwr, w ktrym s wszystkie skadniki
roztworw wzorcowych z wyjtkiem analitu. Nastpnie wykonuje si analiz chromatograficzn
kadego roztworu i mierzy si pole powierzchni (lub wysoko) piku substancji analizowanej. Pole
powierzchni lub wysoko piku mierzy si rwnie dla prbki badanej, nanosi na krzyw kalibracyjn i
odczytuje stenie analitu w prbce badanej lub oblicza si je z rwnania prostej.

Metod krzywej kalibracyjnej stosuje si wtedy, kiedy mona z du dokadnoci wyznaczy

objto dozowanych prbek. Jest to najczciej stosowana metoda analizy ilociowej w
chromatografii cieczowej.

1.8.2. Metoda wzorca wewntrznego

W metodzie wzorca wewntrznego do badanej prbki dodaje si okrelon ilo wzorca (substancji
standardowej), dobrze oddzielajcego si w danych warunkach analizy od wszystkich badanych
skadnikw prbki. Wzorzec powinien mie waciwoci fizyko-chemiczne maksymalnie zblione do
waciwoci substancji badanej, nie moe by skadnikiem analizowanej prbki, poza tym powinien by
nielotny, trway i dostpny w postaci czystej. Ilo dodanego wzorca powinna by porwnywalna z iloci
badanej substancji.
Sygna wikszoci detektorw zaley od rodzaju analizowanych zwizkw i dlatego stosunek
wysokoci (lub powierzchni) pikw dwch zwizkw nie jest rwny stosunkowi ich zawartoci w
mieszaninie. W chromatografii gazowej odpowied detektora pomieniowo-jonizacyjnego (FID) jest
wprost proporcjonalna do liczby atomw wgla niezwizanych z tlenem a nie do masy zwizku.
Rwnania krzywej kalibracyjnej dla analitu i dla wzorca, ktry jest inn substancj, nie bd
identyczne. Metod wzorca wewntrznego mona zastosowa, jeeli wartoci b w obu rwnaniach
bd rwne zeru.
ha = aa c a
h w = a w cw (35)
gdzie:
ha wysoko piku analitu,
aa wspczynnik kierunkowy prostej (analit),
ca stenie analitu w prbce dozowanej do chromatografu,
hw wysoko piku wzorca,
aw wspczynnik kierunkowy prostej (wzorzec),
cw stenie wzorca w prbce dozowanej do chromatografu.

Rwnania mona podzieli stronami:

ha a c
= a a (36)
hw a w c w

146
Wprowadzajc tzw. wspczynnik odpowiedzi f:
aa
f = (37)
aw
Otrzymuje si rwnania stosowane w metodzie wzorca wewntrznego:
ha c
= f a (38)
hw cw
ha m
= f a (39)
hw mw
gdzie:
ca stenie analitu w prbce,
ma masa analitu w prbce,
cw stenie wzorca w prbce.
mw masa wzorca w prbce,
f wspczynnik odpowiedzi.

Podobn posta maj rwnie rwnania wykorzystywane w metodzie wzorca wewntrznego w

przypadku, kiedy mierzy si pole powierzchni piku a nie jego wysoko.

Wspczynnik odpowiedzi jest wartoci charakterystyczn dla okrelonej pary zwizkw

chemicznych, analitu i wzorca wewntrznego, zalen od warunkw przeprowadzanej analizy.

Wykonanie analizy skada si z dwch etapw. W pierwszym etapie przygotowuje si roztwr

wzorcowy zawierajcy analit oraz wybrany wzorzec wewntrzny o okrelonych znanych steniach
(ca oraz cw). Wykonuje si analiz roztworu wzorcowego i mierzy wysoko piku analitu oraz
wysoko piku wzorca wewntrznego (ha oraz hw) (rysunek 17). Znajc wartoci ca, cw, ha oraz hw,
mona wyznaczy eksperymentalnie warto wspczynnika detekcji f, korzystajc z wzoru (38) lub
(39), stosowanego w metodzie wzorca wewntrznego.
W drugim etapie dodaje si okrelon znan ilo wzorca wewntrznego do badanej prbki (cw),
wykonuje analiz roztworu prbki i mierzy wysoko piku analitu oraz wysoko piku wzorca
wewntrznego (ha oraz hw) (rysunek 18). Znajc warto wyznaczonego wczeniej wspczynnika
detekcji f, korzysta si z wzoru (38) lub (39), stosowanego w metodzie wzorca wewntrznego i oblicza
zawarto analitu w prbce.
Metoda wzorca wewntrznego jest czsto stosowana w chromatografii gazowej. Powodem jest
przede wszystkim mnogo operacji wykonywanych na prbce (min. ekstrakcji i przeprowadzania jej
w pochodne odpowiednie do analizowania metod GC), w ktrych czasie moe nastpi pewna
utrata prbki. Inne przyczyny to: problemy z okreleniem maych objtoci rozpuszczalnika, w ktrym
rozpuszcza si badan prbk, niemono uzyskania powtarzalnego dozowania przy zastosowaniu
dozownika z dzieleniem oraz to, e eliminuje si konieczno wykonania krzywej kalibracyjnej.

147
Rysunek 17. Chromatogram GC-FID roztworu wzorcowego, wzorzec wewntrzny (tR = 9,07 min; c = 1
mg/ml) oraz analit (tR = 12,23 min; c = 1 mg/ml); na podstawie zamieszczonych danych mona
obliczy warto wspczynnika detekcji f (sposb wyznaczania wysokoci piku chromatograficznego
jest wyjaniony na rysunku 4)

Rysunek 18. Chromatogram GC-FID badanej prbki, wzorzec wewntrzny (tR = 9,08 min; c = 0,4
mg/ml) oraz analit (tR = 12,25 min) (na podstawie zamieszczonych danych oraz wyznaczonej wartoci
wspczynnika detekcji f mona obliczy stenie analitu w prbce)

148
1.8.3. Metoda dodatku wzorca
Metod dodatku wzorca stosuje si, jeeli rwnanie krzywej kalibracyjnej ma przebieg prostoliniowy
za warto b jest rwna zeru. Ponadto, objto prbki wprowadzanej na kolumn
chromatograficzn musi by staa. Warunek ten jest speniony w przypadku stosowania dozownikw
z ptl dozownicz. Procedura oznacze w metodzie dodatku wzorca jest nastpujca:

pobiera si dwie identyczne prbki 1 i 2,

przygotowuje si prbk 1 i wykonuje analiz chromatograficzn, mierzc pole powierzchni
lub wysoko piku analitu;
do prbki 2 dodaje si znan ilo wzorca, ktry jest badan substancj (analitem), roztwr
miesza i wykonuje analiz chromatograficzn, mierzc pole powierzchni lub wysoko piku
analitu; warto parametru mierzonego wzrasta, a wzrost jest proporcjonalny do iloci
dodanego analitu (rysunek 19).

Wynikiem dodania roztworu wzorca jest zmiana objtoci prbki badanej, std naley skorygowa
stenia. W przypadku stosowania mikrostrzykawek i wprowadzania niewielkich (rzdu kilku l)
objtoci roztworu wzorca do analizowanej prbki, ktre nie wpywaj w zasadniczy sposb na
zmian objtoci prbki, taka korekta objtoci nie jest konieczna.

Analit Analit + wzorzec

Rysunek 19. Chromatogramy prbki 1 (z lewej) oraz prbki 2 z dodatkiem wzorca (z prawej)

Stenie analitu mona wyliczy na podstawie ukadu dwch rwna:

h1 = ac
h2 = a (c + c w ) (40)
gdzie:
h1 wysoko piku analitu zmierzona dla prbki 1 bez dodatku wzorca,
a wspczynnik kierunkowy prostej,
c stenie analitu w badanej prbce,

149
 h2 wysoko piku zmierzona dla prbki 2 po dodaniu wzorca,
cw stenie wzorca w badanej prbce.
Z rwnania pierwszego oblicza si a:
h1
a= (41)
c
Po podstawieniu a do rwnania drugiego otrzymuje si:

h1
h2 = (c + cw ) (42)
c

Po rozwizaniu rwnania wzgldem c otrzymuje si rwnanie stosowane w metodzie dodatku

wzorca:
h1 cw
c= (43)
h2 h1

1.8.4. Metoda normalizacji wewntrznej

Metoda normalizacji wewntrznej polega na wyznaczeniu udziau procentowego wszystkich substancji w
prbce. Jest to najprostsza metoda analizy ilociowej, umoliwiajca oszacowanie wzgldnych iloci
skadnikw prbki, na przykad przy oznaczaniu czystoci prbki. Warunkiem koniecznym stosowania
metody normalizacji wewntrznej jest, aby wszystkie skadniki prbki (anality) wyeluoway z kolumny
chromatograficznej i zostay zarejestrowane na chromatogramie. Metoda normalizacji wewntrznej jest
stosowana przede wszystkim w chromatografii gazowej (GC-FID) natomiast nie jest stosowana w
chromatografii cieczowej.

Metoda prostej normalizacji wewntrznej

Powierzchnie pikw chromatograficznych mierzy si, a ich sum przyjmuje za 100% prbki (pomijajc
pik rozpuszczalnika, w ktrym rozpuszczono prbk badan. Powierzchnia sygnau okrelonego
zwizku w stosunku do sumy powierzchni wszystkich sygnaw odpowiada zawartoci zwizku w
prbce:
Ai
%i = 100

(44)
Ai
gdzie:
%i udzia % okrelonego analitu w prbce,
Ai powierzchnia piku okrelonego analitu.

Jednake, aby uzyska dokadne wyniki, detektor musi wykazywa tak sam odpowied (takie same
wspczynniki detekcji) dla wszystkich analitw obecnych w prbce.

Metoda normalizacji wewntrznej z zastosowaniem wspczynnikw korekcyjnych

Jeli analizuje si zwizki o podobnych waciwociach fizykochemicznych, tak jak na przykad

skadniki szeregu homologicznego, to nie jest konieczne wyznaczanie wspczynnikw korekcyjnych
(dla substancji o rnych waciwociach fizykochemicznych naley je koniecznie wprowadzi, w
przeciwnym wypadku otrzyma si tylko szacunkowe wyniki ilociowe).

150
W celu wyznaczenia wspczynnikw korekcyjnych sporzdza si roztwr wzorcowy, zawierajcy
znane iloci wszystkich analitw wystpujcych w badanej prbce i oblicza jego skad procentowy. Po
wykonaniu analizy chromatograficznej roztworu wzorcowego wyznacza si wspczynniki korekcyjne
dla kadego analitu:
S i ( m)
fi = (45)
S i( chr )
gdzie:
fi wspczynnik korekcyjny okrelonego analitu,
Si(m) zawarto procentowa okrelonego analitu w roztworze wzorcowym obliczona przy
uwzgldnieniu nawaek wszystkich skadnikw,
Si(chr) zawarto procentowa okrelonego analitu w roztworze wzorcowym wyznaczona na
podstawie analizy chromatograficznej roztworu wzorcowego.

Dysponujc wyznaczonymi wspczynnikami korekcyjnym dla kadego analitu w prbce mona obliczy
dokadn (skorygowan) zawarto procentow kadego analitu w badanej prbce:

f i Ai
%i = 100

(46)
( f i Ai )
gdzie:
%i udzia % okrelonego analitu w prbce,
Ai powierzchnia piku okrelonego analitu,
fi wspczynnik korekcyjny okrelonego analitu.

151
2. Chromatografia cieczowa
2.1. Wstp
Chromatografia cieczowa jest rodzajem chromatografii, w ktrej faz ruchom jest ciecz, natomiast
faz stacjonarn moe by ciao stae (chromatografia adsorpcyjna) lub ciecz osadzona na noniku
(chromatografia podziaowa). Warunkiem stosowania chromatografii cieczowej jest rozpuszczalno
w fazie ruchomej analitw rozdzielanych. Za pomoc chromatografii cieczowej mona analizowa
okoo 80% znanych zwizkw chemicznych, stosujc rne jej rodzaje, klasyfikowane wg kilku
gwnych kryteriw.
Ze wzgldu na geometri ukadu chromatografi cieczow mona podzieli na:

chromatografi kolumnow,
chromatografi planarn.
Chromatografi kolumnow mona dalej podzieli na:

chromatografi kolumnow niskocinieniow (zwyk, tradycyjn),

wysokosprawn chromatografi cieczow (HPLC).
Ze wzgldu na mechanizm oddziaywania rozdzielanych zwizkw z faz stacjonarn, chromatografi
cieczow mona podzieli na:

chromatografi adsorpcyjn,
chromatografi podziaow,
chromatografi jonow,
chromatografi jonowo-asocjacyjn,
chromatografi wykluczania,
chromatografi powinowactwa.

W chromatografii cieczowej na przebieg i efekty separacji zwizkw wpywaj waciwoci zarwno

fazy stacjonarnej jak i fazy ruchomej. Chromatografi adsorpcyjn oraz chromatografi podziaow
dzieli si na chromatografi w normalnym ukadzie faz oraz chromatografi w odwrconym ukadzie
faz. Jeeli faza stacjonarna jest polarna to faza ruchoma jest mniej polarna lub niepolarna. Jest to
chromatografia w normalnym ukadzie faz (NP). W chromatografii w normalnym ukadzie faz jako
skadniki fazy ruchomej stosuje si niepolarne rozpuszczalniki, takie jak: heksan, eter izopropylowy,
chloroform i in. (patrz rozdzia 2.3.4). Rozpuszczalniki sklasyfikowane wedug wzrastajcej polarnoci,
a tym samym wedug wzrastajcej mocy elucyjnej w chromatografii w normalnym ukadzie faz
nazywamy szeregiem eluotropowym rozpuszczalnikw (por.roz. II. 2.3.4, tab. 1).

Czas retencji zwizku rozdzielanego w chromatografii w normalnym ukadzie faz ulega

skrceniu, jeeli zastosuje si rozpuszczalnik o wikszej sile elucyjnej (wikszej polarnoci)
natomiast wydua si, jeeli zastosuje si rozpuszczalnik o mniejszej sile elucyjnej (mniejszej

W chromatografii w normalnym ukadzie faz, jako faz stacjonarn stosuje si przede wszystkim el
krzemionkowy (por.roz. II.2.3.3), a take fazy zwizane chemicznie, w ktrych struktury wchodz
polarne grupy funkcyjne.

152
Jeeli faza stacjonarna jest niepolarna, to faza ruchoma jest polarna. Jest to chromatografia w
odwrconym ukadzie faz (RP). W chromatografii w odwrconym ukadzie faz skadnikami fazy
ruchomej s rozpuszczalniki polarne, takie jak: mieszanina woda-metanol lub woda-acetonitryl.

Wzrost zawartoci wody w fazie ruchomej powoduje wyduenie czasw retencji zwizkw
rozdzielanych i odwrotnie wzrost zawartoci modyfikatora organicznego (metanolu lub
acetonitrylu) w fazie ruchomej powoduje skrcenie czasw retencji zwizkw rozdzielanych w
chromatografii w odwrconym ukadzie faz.

Niejednokrotnie w ukadach fazy ruchomej znajduj si take odpowiednie roztwory buforowe,

umoliwiajce utrzymanie odpowiedniego pH w trakcie procesu separacyjnego.
Elucj, czyli wymywanie rozdzielanych zwizkw z fazy stacjonarnej za pomoc fazy ruchomej, mona
prowadzi jednym rozpuszczalnikiem lub jedn mieszanin rozpuszczalnikw o okrelonym staym
skadzie i jest to elucja izokratyczna.

Elucja izokratyczna jest to rodzaj elucji, podczas ktrej skad jakociowy i ilociowy fazy
ruchomej pozostaje stay.

Elucja gradientowa polega na tym, e prowadzi si wymywanie kolejno kilkoma rozpuszczalnikami lub
kolejno kilkoma mieszaninami rozpuszczalnikw, o wzrastajcej lub malejcej mocy elucyjnej.

Elucja gradientowa jest to rodzaj elucji, w ktrym skad fazy ruchomej zmienia si w sposb
cigy lub stopniowo.

2.2. Chromatografia cienkowarstwowa

2.2.1. Wstp
Termin chromatografia cienkowarstwowa (TLC) zosta wprowadzony przez E. Stahla w 1956 i oznacza
proces chromatograficzny prowadzony na cienkiej warstwie fazy stacjonarnej, naniesionej na podoe z
pytek szklanych lub z folii aluminiowych czy polimerowych (por.roz. III.1.1, rysunek 2). TLC jest rodzajem
chromatografii cieczowej planarnej.
Zalet chromatografii cienkowarstwowej jest przede wszystkim moliwo analizy substancji nielotnych
lub o maej lotnoci, zarwno substancji niepolarnych, polarnych lub o redniej polarnoci, a take w
formie zjonizowanej. Jednak przede wszystkim gwnymi zaletami tej techniki wci pozostaj prostota i
niska cena sprztu, niewymagajcego dostpu do elektrycznoci. Warunki analiz TLC mog by atwo
modyfikowane z moliwoci stosowania realtywnie reaktywnych rozpuszczalnikw jak i prbek, co jest
ograniczeniem w chromatografii kolumnowej (niektre prbki czy reaktywne rozpuszczalniki mog
zniszczy lub uszkodzi kolumn GC lub HPLC). Kolejn zalet jest rwnie atwo detekcji, dziki ktrej
wszystkie skadniki prbki mog by monitorowane, co jest wane przy sprawdzaniu czystoci prbki.
Obecnie chromatografi cienkowarstwow stosuje si powszechnie w:

153
 analizie farmaceutycznej, gwnie przy identyfikacji analitw, testach czystoci, oznaczaniu
skadnikw aktywnych, pomocniczych i konserwantw oraz kontroli procesu produkcji,
analizie medycznej, kryminalistycznej i biochemicznej przy oznaczaniu aktywnych substancji i ich
metabolitw w matrycach biologicznych oraz przy diagnostyce chorb,
analizie kosmetycznej przy analityce surowcw i produktw, konserwantw, rodkw
powierzchniowo-czynnych, kwasw tuszczowych, skadnikw perfum i innych,
analizie ywnoci przy oznaczaniu pestycydw i rodkw grzybobjczych w wodzie pitnej,
oznaczaniu substancji zakazanych w warzywach, misie, oznaczaniu witamin i innych,
analizie zanieczyszcze rodowiska (sporadycznie).

2.2.2. Proces chromatograficzny

Proces chromatograficzny przeprowadza si w odpowiednich komorach chromatograficznych
(rysunek 20). Prbk nanosi si na pytk TLC w postaci roztworu o bardzo maej objtoci, tworzc
ma plamk w punkcie startowym (rysunek 2). Pytki umieszcza si w komorze chromatograficznej,
w ktrej na dnie znajduje si faza ruchoma. W wyniku dziaania si kapilarnych faza ruchoma wdruje
w gr pytki. Jest to proces rozwijania chromatogramu metod wstpujc.
Oddziaywanie substancji znajdujcych si w prbce z adsorbentem oraz z poruszajcym si
rozpuszczalnikiem powoduje rozdzielenie si skadnikw prbki na pytce. W wyniku rozdzielenia
poszczeglne skadniki tworz oddzielne plamki. W przedstawionym na rysunku 2 rozdziale TLC,
plamka z lewej strony nie ulega rozdzieleniu (lub jest pojedyncz substancj) natomiast plamka z
prawej strony ulega rozdzieleniu.

Proces separacji skadnikw prbki naniesionej na pytk TLC nazywa si rozwijaniem

chromatogramu.

Plamki rozdzielonych skadnikw (o ile nie posiadaj grup chromoforowych w zakresie

widzialnym) uwidacznia si, czyli wywouje.

Chromatogramy wywouje si najczciej odczynnikami chemicznymi, ktre tworz barwne zwizki z

analitami. Czsto oglda si chromatogramy TLC owietlane nadfioletem, aby zobaczy substancje
wykazujce waciwoci fluorescencyjne pod wpywem promieniowania UV.
W chromatografii cienkowarstwowej stosuje si takie same fazy ruchome, jak w kolumnowej chromatografii
cieczowej, dlatego dobr fazy ruchomej jest oparty na tych samych zasadach (por.roz.III.2.3.4.). Fazy
stacjonarne stosowane w TLC s rwnie podobne, jak w kolumnowej chromatografii cieczowej i s opisane
w nastpnych rozdziaach. Najbardziej popularn faz stacjonarn stosowan w TLC jest el krzemionkowy
(por.roz. III.2.3.3.). redni rozmiar czstek zoa fazy stacjonarnej to 11 m w analitycznej TLC i 5 m w
wysokosprawnej chromatografii cienkowarstwowej (HPTLC), natomiast w preparatywnej TLC - powyej 20
m. W chromatografii cienkowarstwowej stosuje si rwnie zoa chemicznie zmodyfikowane, np. grupami
NH2 (normalny ukad faz) lub grupami oktadecylowymi C-18 (odwrcony ukad faz).

154
 Rysunek 20. Komora do chromatografii cienkowarstwowej

Podstawowym parametrem w chromatografii cienkowarstwowej, ktry okrela pooenie substancji

na chromatogramie, jest wspczynnik opnienia RF. Jest to stosunek drogi migracji substancji (a) do
drogi przebytej przez faz ruchom (b):
a
RF = (51)
b

Wspczynnik opnienia przyjmuje wartoci od 0 do 1. Jest charakterystyczny dla danej

substancji w danych warunkach chromatograficznych i moe suy do jej identyfikacji.

Sposb jego wyznaczania jest pokazany na rysunku 21.

Rysunek 21. Sposb pomiaru wspczynnika opnienia RF

Jeeli dana substancja ma t sam warto wspczynnika opnienia, jak ma wzorzec, wyznaczon
w takich samych warunkach chromatograficznych, to prawdopodobnie jest identyczna ze wzorcem.
Najczciej analiz jakociow wykonuje si w ten sposb, e na jedn pytk TLC nanosi si badan

155
prbk oraz obok nanosi si rwnie wzorzec. Po rozwiniciu pytki sprawdza si, ktra plamka
badanej prbki ma tak sam warto wspczynnika opnienia jak wzorzec. Na rysunku 22
przedstawiono chromatogram TLC ekstraktu barwnikw wyizolowanych ze szpinaku. W punkcie E
naniesiono cay ekstrakt, w punkcie 1 wzorzec, ktrym jest czysty -karoten a w punkcie 2 jedn z
frakcji, wydzielon z ekstraktu metod niskocinieniowej chromatografii preparatywnej. -karoten
stanowi pomaraczow plamk o wartoci RF bliskiej jednoci. Podobna plamka znajduje si w caym
ekstrakcie, natomiast wydzielona frakcja nie zawiera -karotenu.

Rysunek 22. Przykadowy chromatogram TLC ekstraktu barwnikw ze szpinaku (E), wzorca -
karotenu (1) i frakcji ekstraktu wydzielonej metod niskocinieniowej chromatografii preparatywnej
(2)

Wyrniamy nastpujce sposoby rozwijania chromatogramw:

metoda wstpujca (rysunek 2 i 22), ktra jest najczciej stosowana,

metoda zstpujca (spywowa), polegajca na tym, e rozpuszczalnik podawany jest od gry
pytki TLC; w metodzie tej ruch fazy ruchomej wywoywany jest siami kapilarnymi i
dodatkowo si cienia (w praktyce bardzo rzadko uywana),
metoda dwukierunkowa (dwuwymiarowa), 2D-TLC (rysunek 23),
metoda horyzontalna, polegajca na rozwijaniu chromatogramu na pytkach uoonych
poziomo w specjalnej komorze.

Niekiedy mieszaniny zwizkw s trudne do rozdzielenia za pomoc jednowymiarowych technik TLC.

Czsto ma to miejsce w przypadku mieszanin zwizkw naturalnych. Aby uzyska pene rozdzielenie
zwizkw o podobnych waciwociach chemicznych stosuje si technik dwuwymiarow (2D-TLC).
Pojedyncz prbk nanosi si w jednym rogu pytki TLC, ktr nastpnie rozwija si w pierwszym
kierunku (rys. 23), uzyskujc czciowe rozdzielenie skadnikw prbki (cztery frakcje).

156
Chromatogram po wysuszeniu i obrceniu o 90 jest rozwijany ponownie, ale w drugim kierunku
(prostopadym do pierwszego) i z uyciem fazy ruchomej o innym skadzie. Tym samym cztery
uzyskane frakcje (plamki) stanowi punkty startowe. W wyniku drugiego procesu rozdzielenia, kada
z frakcji ma moliwo separacji na pojedyncze skadniki: frakcje pierwsza, trzecia i czwarta (od
prawej) s mieszanin 3 substancji, frakcja druga jest pojedynczym zwizkiem.

W dwuwymiarowej chromatografii cienkowarstwowej pooenie substancji na

chromatogramie okrelaj dwa wspczynniki opnienia: RF1 = a1/b1 oraz RF2 = a2/b2.

Sposb wyznaczania obu wspczynnikw przedstawiony jest na rysunku 23.

Rysunek 23. Dwuwymiarowa chromatografia cienkowarstwowa (2D-TLC); zasada rozwijania oraz

sposb wyznaczania wartoci wspczynnikw opnienia w obu kierunkach rozwijania: RF1 = a1/b1
oraz RF2 = a2/b2

2.2.3. Zasady dobrej praktyki laboratoryjnej w TLC

Pytki TLC gotowe do uycia s dostpne komercyjnie. Pytki s pakowane i przechowywane w

odpowiednich pudekach. Mona je atwo uszkodzi, co negatywnie wpywa na proces

157
chromatograficzny. Przestrzeganie pewnych zasad pozwala poprawnie przeprowadzi rozdzielanie na
pytkach TLC.

Zasady poprawnego rozdziau na pytkach TLC:

powierzchni pytek nie wolno dotyka palcami,

przy ciciu pytki noyczkami nie wolno zniszczy warstwy fazy stacjonarnej,
dobrze jest usun ukruszon cz fazy stacjonarnej z brzegu, ktry by pytki,
dobrze jest wstpnie przemy pytk TLC metanolem lub innym rozpuszczalnikiem,
uywanym pniej do rozwijania chromatogramu, aby pozby si zanieczyszcze
zaabsorbowanych w fazie stacjonarnej; przemyt pytk suszy si i przechowuje w
szczelnie zamknitym naczyniu,
faz stacjonarn (el krzemionkowy) mona aktywowa, poprzez suszenie pytki TLC w
cigu 30 minut w temp. 120 C dla usunicia czci zaadsorbowanej wody z elu
krzemionkowego, obniajcej jego aktywno (aktywowane pytki przechowuje si w
szczelnie zamknitym naczyniu),
na pytce delikatnie zaznacza si mikkim owkiem jedynie punkt startowy i
ewentualnie lini kocow czoa fazy ruchomej, za pomoc niewielkiej kreski o
szerokoci 0,5 cm z boku pytki. Opis nanoszonych prbek najlepiej zamieci w zeszycie
laboratoryjnym a nie na pytce TLC. Zniszczenie powierzchni fazy stacjonarnej poprzez
rysowanie na pytce powoduje bdy w analizach TLC.

Nanoszenie prbki na pytk TLC

Punkt startowy, gdzie nanosi si prbk, nie powinien by za nisko na pytce TLC, aby plamka nie bya
zanurzona w fazie ruchomej. Z tego samego powodu, przy wkadaniu pytki do komory chromatograficznej,
naley unika gwatownych ruchw. Naley ponadto pamita, e im mniejsza jest objto naniesionego
roztworu prbki tym lepiej. Przy analizie jakociowej nanosi si od 0,5 do 2,0 l roztworu prbki, przy
okrelaniu czystoci prbki - okoo 10 l nanoszonych w niewielkich porcjach. Plamka naniesionej prbki
powinna by jak najmniejsza. rednica plamki nie powinna przekracza 2 mm. Naley take starannie wybra
rozpuszczalnik do rozpuszczenia prbki: im mniejsza sia elucyjna rozpuszczalnika tym lepiej, bo uzyskuje si
plamk o mniejszej rednicy, im lotniejszy rozpuszczalnik, tym atwiej go usun. Z plamki naniesionej prbki
naley usun rozpuszczalnik. W przypadku lotnych zwizkw rozpuszczonych w lotnym rozpuszczalniku,
pozostawia si pytk na kilka minut w temp. pokojowej., Do suszenia nie powinno si stosowa suszarki do
wosw, cho jest do powszechnie uywana w wikszoci laboratoriw (lotne zwizki mog zosta
usunite ze strumieniem powietrza). W przypadku termicznie stabilnych substancji, rozpuszczonych w
chloroformie lub metanolu pytk pozostawia si na 20 minut w suszarce, w temperaturze bliskiej
temperatury wrzenia rozpuszczalnika, tu stosowanie suszarki do wosw moe by niewystarczajce.

158
Rozwijanie chromatogramw TLC
W tym procesie niezbdne jest odpowiednie, wczeniejsze nasycenie komory chromatograficznej
oparami fazy ruchomej.

Naley pamita, i kada pytka ma prawo do swojej wasnej fazy ruchomej. Oznacza to, e
nie wolno uywa komory chromatograficznej napenionej jedn faz ruchom do rozwijania
kolejnych pytek TLC, zwaszcza, jeli uywa si fazy ruchomej bdcej mieszanin kilku
rozpuszczalnikw.

Podczas chromatografowania moe nastpi zmiana skadu fazy ruchomej, dlatego komor naley
napenia wie faz ruchom przed rozwijaniem kadej pytki. Jeeli faza ruchoma jest
jednoskadnikowa, to sprawdza si jej czysto i ilo, i ewentualnie uzupenia lub wymienia.
Najlepiej uywa wieo przygotowanej fazy ruchomej. Przechowywane przez dugi czas roztwory
fazy ruchomej mog zmienia swj skad i w sposb negatywny wpywa na wynik analizy. Komora
chromatograficzna nie powinna sta pod wycigiem laboratoryjnym w trakcie rozwijania
chromatogramu. Przepyw powietrza zmienia temperatur, a to wpywa na rozdzielanie
chromatograficzne. Nie wolno take poruszy komory chromatograficznej w trakcie rozwijania
chromatogramu.

2.3. Chromatografia kolumnowa niskocinieniowa

2.3.1. Wstp
Zalet niskocinieniowej chromatografii kolumnowej jest moliwo rozdzielania duych iloci prbki,
zazwyczaj wikszych ni za pomoc wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Z tego powodu ten
rodzaj chromatografii jest najczciej stosowany, jako rodzaj chromatografii preparatywnej
pozwalajcej na separacj duych iloci zwizkw.
W chromatografii kolumnowej niskocinieniowej stosuje si zarwno polarne jak i niepolarne fazy
stacjonarne. Stosowanie w chromatografii niskocinieniowej faz stacjonarnych niepolarnych
(chromatografia w odwrconym ukadzie faz, RP) jest duo rzadsze ni stosowanie faz stacjonarnych
polarnych (chromatografia w normalnym ukadzie faz, NP), ze wzgldu na zdecydowanie wysz cen
takich z chromatograficznych.

Chromatografi cieczow w normalnym ukadzie faz jest chromatografia adsorpcyjna,

pozwalajca na separacj zwizkw organicznych na klasy zwizkw wg ich polarnoci.

Rozdzielanie mieszaniny zwizkw organicznych, niernicych si grupami funkcyjnymi

(niernicych si polarnoci) wymaga wyszej, ni w chromatografii adsorpcyjnej, rozdzielczoci.
Separacja w chromatografii adsorpcyjnej zaley od rnic w rodzaju i iloci grup funkcyjnych a nie od
rnic w masie czsteczkowej zwizkw. Zoone mieszaniny mog wic by podzielone na klasy
zwizkw, na przykad: alkany, alkeny, estry, alkohole i in. Chromatografia cieczowa adsorpcyjna
zostaa opisana w rozdziale III.2.4.3.

159
W preparatywnej chromatografii niskocinieniowej dominuje uywanie elu krzemionkowego, jako
polarnej fazy stacjonarnej. Kolejno elucji zwizkw z kolumny zaley od ich polarnoci. Zwizki o
niskiej polarnoci s eluuowane jako pierwsze od chwili wprowadzenia, a nastpnie eluuj zwizki o
wikszej polarnoci (rysunek 24).

Kwasy karboksylowe
Amidy
Alkohole/Aminy
Estry/Aldehydy/Ketony
Zwizki nitrowe
Etery
Sulfidy
Zwizki aromatyczne
Olefiny
Alkany

Rysunek 24. Kolejno elucji zwizkw z elu krzemionkowego [na podstawie Laboratory
Chromatography Guide. Talamona, 2005]

2.3.2. Proces chromatograficzny

Zasadnicz czci kadego zestawu do niskocinieniowej chromatografii kolumnowej jest kolumna ze szka
obojtnego (rysunek 25), ktrej wymiary s dostosowane do skali przeprowadzanego rozdzielenia.
Najczciej mieci ona od 10 do 100 g fazy stacjonarnej, co wystarcza do separacji od 0,1 do kilku gramw
prbki. Z reguy dobiera si tak ilo fazy stacjonarnej, aby masa rozdzielanej prbki wynosia 5-10% masy
fazy stacjonarnej. Dla przyspieszenia przepywu fazy ruchomej stosuje si sabe ssanie (pompka wodna) lub
sabe toczenie.
Napenianie kolumny faz stacjonarn mona przeprowadza na sucho i na mokro. W metodzie na
sucho faz stacjonarn wsypuje si maymi porcjami do kolumny i ubija paeczk szklan. Nastpnie
przemywa si j faz ruchom. Metoda na mokro polega na wprowadzaniu do kolumny zawiesiny
fazy stacjonarnej w fazie ruchomej. W obu metodach napenianie naley wykona w taki sposb, by
zoe byo jednorodne, pozbawione pcherzykw powietrza i tak uoone, by nie zmieniao objtoci
w czasie procesu rozdzielania.

Powierzchnia zoa powinna by stale pokryta pynem od chwili nalania pierwszych porcji fazy
ruchomej a do zakoczenia procesu chromatograficznego.

160
 Faza
ruchoma

Przepyw grawitacyjny
Faza stacjonarna

szot
Objto martwa

Rysunek 25. Zestaw do chromatografii cieczowej niskocinieniowej

Metoda napeniania kolumny na mokro jest atwiejsza i czciej stosowana. Rozpoczynajc proces
chromatograficzny nanosi si badan prbk w postaci roztworu na wierzchni warstw fazy
stacjonarnej, wypeniajcej kolumn. Wybr rozpuszczalnika do nanoszenia prbki zaley przede
wszystkim od rozpuszczalnoci jej skadnikw, poza tym naley wybiera rozpuszczalnik
charakteryzujcy si moliwie jak najmniejsz si elucyjn. Nastpnie eluuje si, czyli wymywa
rozdzielone skadniki prbki z fazy stacjonarnej, przepuszczajc faz ruchom przez kolumn. Faz
ruchom wprowadza si do zbiornika na wierzchoku kolumny. Wypywajc z kolumny faz ruchom
zawierajc separowane skadniki prbki zbiera si, jako tzw. frakcje, do kolejnych prbwek lub
cylindrw miarowych.

Zbieranie frakcji zaczyna si od momentu wprowadzenia prbki na wierzch fazy stacjonarnej,

czyli od pocztku procesu chromatograficznego.

Poszczeglne frakcje odparowuje si i bada innymi metodami. Do monitorowania skadu frakcji w

chromatografii niskocinieniowej mona stosowa analiz technik TLC. Proces rozdzielania LC mona
rwnie atwo monitorowa, jeeli zwizki rozdzielane s barwnikami.

2.3.3. el krzemionkowy jako faza stacjonarna

el krzemionkowy jest polarnym adsorbentem o oglnym wzorze sumarycznym SiO2nH2O. Jest to
materia porowaty i amorficzny. Kontrolujc proces produkcji elu krzemionkowego, mona uzyska

161
materia o bardzo rozwinitej powierzchni waciwej od 200 do 800 m2/g. Na powierzchni elu
krzemionkowego znajduj si nastpujce grupy:

silanolowe: SiOH
siloksanowe: SiOSi.

Obecno przede wszystkim polarnych grup silanolowych powoduje, e jest on polarn faz stacjonarn,
stosowan w chromatografii w normalnym ukadzie faz. Waciwoci rnych grup silanolowych zale od
wzajemnej odlegoci i przestrzennego rozmieszczenia. Grupy zwizane, poczone ze sob wizaniem
wodorowym maj waciwoci protonoakceptorowe natomiast grupy silanolowe swobodne oraz aktywne
stanowi centra silnie protonodonorowe (rysunek 26). Uwaa si, e najwiksz rol w procesie adsorpcji
odgrywaj grupy swobodne i aktywne a adsorpcja na powierzchni elu krzemionkowego polega przede
wszystkim na tworzeniu z nimi wiza wodorowych.

H H O H H
O O O O

Si Si Si Si

swobodne zwizane aktywne

Rysunek 26. Typy grup silanolowych na powierzchni elu krzemionkowego [na podstawie Liquid
column chromatography: a survey of modern techniques and applications. Deyl et al., 1975]

Aktywno elu krzemionkowego zaley od iloci wody zaadsorbowanej na jego powierzchni, gdy
powoduje ona dezaktywacj tej powierzchni. Przed uyciem mona aktywowa el krzemionkowy
poprzez wygrzewanie w temp. 120 C, aby czciowo usun zaadsorbowan wod. el
krzemionkowy jest stosowany w chromatografii cieczowej rwnie jako nonik ciekych faz
stacjonarnych (por.roz. III.2.4.4).

2.3.4. Klasyfikacja rozpuszczalnikw w normalnym ukadzie faz

Rozpuszczalniki, ktre s skadnikami fazy ruchomej w chromatografii cieczowej wpywaj na
rozdzielanie chromatograficzne ze wzgldu na ich polarno i selektywno.
Rozpuszczalniki, ktre s bardziej polarne powoduj mniejsz retencj zwizkw w chromatografii w
normalnym ukadzie faz (NP). Efektywno wymywania zwizku z kolumny napenionej polarn faz
stacjonarn zaley od mocy elucyjnej (siy elucyjnej) rozpuszczalnika (0), ktra z kolei zaley od jego
polarnoci (P) i mona j wyznaczy eksperymentalnie. Polarno rozpuszczalnikw wynosi od P=0
dla niepolarnego rozpuszczalnika, jakim jest pentan, do P=10,2 dla bardzo polarnej wody. W tab. 1
zamieszczone s wartoci P oraz moc elucji popularnych rozpuszczalnikw, uywanych jako skadniki
faz ruchomych w chromatografii cieczowej.

Rozpuszczalniki sklasyfikowane wedug wzrastajcej mocy elucyjnej nazywa si szeregiem

eluotropowym rozpuszczalnikw.

162
Znajomo szeregu eluotropowego rozpuszczalnikw uatwia dobranie odpowiedniej fazy ruchomej
do rozdzielania chromatograficznego badanej mieszaniny zwizkw.
Waciwoci rozpuszczalnika, ktre wpywaj na selektywno to:

waciwoci zasadowe, czyli zdolno do przyjmowania protonw (akceptor protonw),

waciwoci kwasowe, czyli zdolno do oddawania protonw (donor protonw),
zdolno do tworzenia dipoli.

Tabela 1. Waciwoci wybranych rozpuszczalnikw. Moc elucyjna rozpuszczalnika (0) jest podana
dla elu krzemionkowego[ na podstawie Handbook of HPLC. Katz et al., 1998]

Rozpuszczalnik 0 P c d n Grupa

n-Heptan 0,00 - - - -

n-Heksan 0,00 0,1 - - -

Cykloheksan - 0,17 - - -

Czterochlorek wgla 0,11 1,56 0,26 0,40 0,34

Eter izopropylowy 0,32 1,83 0,51 0,10 0,39 I

Chloroform 0,26 4,31 0,31 0,35 0,34 VIII

Chlorek metylenu 0,30 4,29 0,27 0,33 0,40 VII

Eter metylo-tert-butylowy 0,47 - 0,41 0,19 0,40 I

Tetrahydrofuran 0,53 4,28 0,36 0,22 0,42 III

Octan etylu 0,48 4,24 - - -

Trietyloamina - 2,19 0,66 0,08 0,26

Acetonitryl 0,52 5,64 0,33 0,25 0,42 VI

Dioksan 0,51 5,27 0,37 0,23 0,40 II

tert-Butanol - 4,03 0,56 0,20 0,24 II

n-Butanol - 4,11 0,54 0,18 0,28 II

Izopropanol 0,60 3,92 0,57 0,17 0,26 II

Etanol - 4,40 0,52 0,19 0,29 II

Metanol 0,70 5,10 0,48 0,22 0,31 II

Woda - 10,2 0,37 0,37 0,26 VIII

163
Aby okreli udzia kadej z waciwoci w oglnej polarnoci rozpuszczalnika (P) podzielono j na trzy
parametry: c (akceptor protonw), d (donor protonw) oraz n (zdolno do tworzenia dipoli). Na
przykad dla chloroformu, ktry jest rednio polarnym rozpuszczalnikiem (P = 4,31), wartoci
poszczeglnych parametrw wynosz: c = 0,31, d = 0,35, n = 0,34, co oznacza, e udzia waciwoci
zasadowych wynosi 31%, udzia waciwoci kwasowych wynosi 35% za udzia oddziaywa dipolowych
wynosi 34% (tabela 1).
Rozpuszczalniki zostay uporzdkowane i podzielone na grupy majce podobn selektywno.
Klasyfikacja rozpuszczalnikw ze wzgldu na selektywno jest przedstawiana graficznie w postaci
trjkta selektywnoci rozpuszczalnikw (rysunek 27).

akceptory H

II
I
d IV c
III

VIII VI V

VII
oddziaywania
dipolowe
n
Rysunek 27. Trjkt selektywnoci rozpuszczalnikw Snydera [na podstawie Handbook of HPLC. Katz
et al., 1998]

Grupy rozpuszczalnikw o podobnej selektywnoci zachodz na siebie. Przy wybieraniu

rozpuszczalnikw, jako skadnikw fazy ruchomej naley przestrzega zasady, e jeeli
rozpuszczalnik z jednej grupy nie ma dostatecznej selektywnoci to naley wybra drugi
rozpuszczalnik z innej grupy, aby poprawi t selektywno.

Dwa rozpuszczalniki z tej samej grupy maj podobn selektywno i zamienianie ich nie poprawi
rozdzielania chromatograficznego. Na przykad: zastosowanie eteru izopropylowego do separacji nie
dao zadowalajcej selektywnoci. Eter izopropylowy naley do grupy I, ktra znajduje blisko grnego
rogu trjkta. Aby poprawi selektywno rozdzielania naley w drugiej prbie zastosowa
rozpuszczalnik o odmiennych waciwociach, np. chlorek metylenu z grupy VII, ktra jest oddalona
od grupy I.

164
Faza ruchoma jest czsto mieszanin rozpuszczalnikw. Jeeli uywa si mieszaniny dwch
rozpuszczalnikw, to rozpuszczalnik o mniejszej sile elucyjnej oznacza si liter A za rozpuszczalnik o
wikszej mocy elucyjnej - B. W normalnym ukadzie faz, gdy niepolarnym rozpuszczalnikiem organicznym
jest na przykad heksan (A) a polarnym na przykad propanol (B), to wzrost zawartoci % B w fazie ruchomej
zmniejsza retencj badanego zwizku. Polarno (sia elucyjna) takiej mieszaniny jest korygowana poprzez
zawarto rozpuszczalnika nieselektywnego takiego jak heksan lub inne nasycone wglowodory, ktre nie
wpywaj na selektywno fazy ruchomej.

2.3.5. Dobr warunkw rozdzielania w chromatografii kolumnowej na elu krzemionkowym za

pomoc analizy TLC
Warunki rozdzielania LC na elu krzemionkowym mona przetestowa i zaplanowa wczeniej za
pomoc analizy TLC na pytkach pokrytych rwnie elem krzemionkowym. Byoby idealnie, gdyby
charakterystyka zoa do LC jak i TLC bya identyczna, tzn. ten sam typ i rozmiar porw zoa. Rne
ele krzemionkowe maj rne parametry. Jeeli nie dobierze si identycznego zoa w TLC i w LC, to
dobr warunkw rozdzielania za pomoc analizy TLC bdzie jedynie przyblieniem.
Rozdzielanie w chromatografii kolumnowej zaley od fazy stacjonarnej oraz od fazy ruchomej.

Skadniki fazy ruchomej dobieramy w taki sposb, aby uzyska najlepsz selektywno
rozdziau oraz dobra odpowiedni si elucyjn fazy ruchomej.

Faza ruchoma powinna by tak dobrana, aby uzyska wspczynnik opnienia RF w zakresie
0,15 0,4 w analizie TLC dla interesujcych nas zwizkw (rysunek 28). Rnica
wspczynnikw opnienia dla zwizkw powinna by jak najwiksza; zadowalajce efekty
uzyskuje si, gdy RF 0,15.

Rysunek 28. Optymalny zakres wspczynnika opnienia wynosi od 0,15 (substancja pomaraczowa)
do 0,4 (substancja niebieska) przy zastosowaniu wybranej fazy ruchomej

Wspczynnik RF = 1 oznacza, e badany zwizek eluuje z czoem fazy ruchomej w TLC i tak samo
bdzie si zachowywa w LC. Opuci kolumn chromatograficzn po tym, jak opuci j jedna objto
fazy ruchomej rwna w tym przypadku objtoci retencji substancji niezatrzymywanej VM (dawniej

165
zwana objtoci martw lub objtoci zerow). Warto RF = 0,1 oznacza, e dystans, jaki badany
zwizek pokonuje na pytce TLC od linii startu wynosi 1/10 dystansu, jaki pokonuje faza ruchoma.
Czyli badany zwizek wymaga 10-krotnie wikszej objtoci fazy ruchomej (VR=10VM, VR - objto
retencji), aby opuci kolumn chromatograficzn. W doborze fazy ruchomej do LC na podstawie
zachowania si zwizku w analizie TLC pomocna jest nastpujca zaleno:

1
VR = V (52)
RF M
gdzie:
VR objto retencji substancji badanej,
VM objto retencji substancji niezatrzymywanej,
RF wspczynnik opnienia substancji badanej.
Zaleno t mona wyprowadzi z nastpujcych wzorw na wspczynnik retencji:

1 RF VR VM
k= k = (53, 54)
RF VM
gdzie:
k wspczynnik retencji substancji badanej,
VR objto retencji substancji badanej,
VM objto retencji substancji niezatrzymywanej,
RF wspczynnik opnienia substancji badanej.

Objto retencji substancji niezatrzymywanej VM jest w przyblieniu rwna objtoci fazy ruchomej
znajdujcej si w kolumnie, czyli fazy ruchomej znajdujcej si pomidzy czstkami wypenienia kolumny
oraz wewntrz porw tyche czstek. W chromatografii niskocinieniowej objto fazy ruchomej w
kolumnie oznacza si czsto symbolem CV (ang. column volume).

W przykadzie przedstawionym na rys. 28, warto wspczynnika opnienia zwizku

pomaraczowego, wynoszca w analizie TLC - 0,15 (0,15 = VM/VR, ze wzoru 45) oznacza, e objto
fazy ruchomej VR potrzebna do elucji tego zwizku z kolumny LC musi by 6,6 razy wiksza od
objtoci retencji substancji niezatrzymywanej VM. Warto wspczynnika opnienia zwizku
niebieskiego, wynoszca w analizie TLC - 0,4 (0,4 = VM/VR) oznacza, e objto fazy ruchomej VR
potrzebna do elucji tego zwizku z kolumny LC musi by 2,5 razy wiksza od objtoci retencji
substancji niezatrzymywanej VM.

Przykad wyboru fazy ruchomej do elucji izokratycznej

Rozpuszczalniki mog mie tak sam si elucyjn a uzyskane wyniki rozdzielania mog by zupenie
rne. Wybr skadu fazy ruchomej dokonuje si najczciej w dwch etapach:

dobr rozpuszczalnika o najlepszej selektywnoci dla oznaczanych substancji,

dobr odpowiedniej mocy elucyjnej fazy ruchomej, zawierajcej uprzednio wybrany,
selektywny rozpuszczalnik.
Proces wyboru skadu fazy ruchomej przedstawiono w poniszym przykadzie.

166
Rozdzielana prbka stanowi mieszanin czterech zwizkw (A, B, C i D). W pierwszym etapie doboru
skadu fazy ruchomej porwnuje si rozpuszczalniki z rnych grup, korzystajc z trjkta
selektywnoci rozpuszczalnikw (rysunek 27) i wykonuje analizy TLC w wybranych rozpuszczalnikach.
Dla badanej mieszaniny wybrano cztery rozpuszczalniki i wykonano w nich analizy TLC:

octan etylu (TLC 1),

eter diizopropylowy (TLC 2),
chloroform (TLC 3),
chlorek metylenu (TLC 4).
Wyniki wykonanych analiz przedstawiono na rysunku 29 oraz w tabeli 2. Na chromatogramie TLC 4
nie uzyskano separacji, co oznacza, e chlorek metylenu nie jest rozpuszczalnikiem o odpowiedniej
selektywnoci do rozdzielenia badanych substancji. Najlepsze rozdzielenie (najlepsz selektywno)
uzyskano przy zastosowaniu eteru diizopropylowego (TLC 2). Potwierdzaj to wyniki zebrane w tab.
2, w ktrej zamieszczono wartoci RF dla badanych zwizkw w kolejnych analizach oraz wyliczone
(ze wzoru 45), odpowiadajce im wartoci VR i VR, jako krotnoci objto retencji substancji
niezatrzymywanej VM. Najwiksze rnice w objtoci fazy ruchomej, potrzebnej do wymycia z
kolumny kolejnych zwizkw, uzyska si stosujc eter diizopropylowy.

Rysunek 29. Analizy TLC mieszaniny zawierajcej zwizki: A, B, C i D przy zastosowaniu czterech rnych faz
ruchomych: 1, 2, 3, i 4 [na podstawie Laboratory Chromatography Guide. Talamona, 2005]

Tabela 2. Wyniki analizy TLC mieszaniny zawierajcej zwizki A, B, C i D przy zastosowaniu trzech
rnych faz ruchomych [na podstawie Laboratory Chromatography Guide. Talamona, 2005]

TLC 1 TLC 2 TLC 3

Zwizek RF VR VR RF VR VR RF VR VR
A 0,54 1,8 0,56 1,8 0,6 1,7
0,5 0,6 0,1
B 0,43 2,3 0,42 2,4 0,55 1,8
0,2 1,3 1,1
C 0,40 2,5 0,27 3,7 0,35 2,9
3,7 8,8 2,4
D 0,16 6,2 0,08 12,5 0,19 5,3

167
W drugim etapie dobiera si odpowiedni moc elucyjn fazy ruchomej. Moc elucyjn fazy ruchomej
mona dopasowa poprzez dodanie do niej rozpuszczalnika nieselektywnego o maej mocy elucyjnej,
na przykad niskowrzcego wglowodoru nasyconego, ktry nie wpywa na selektywno fazy
ruchomej (eteru diizopropylowego).
W podanym powyej przykadzie, z mieszaniny naley wydzieli zwizek B oraz zwizek C. Optymalny
zakres wartoci wspczynnika opnienia RF to 0,15 0,4. Z tab. 2 wynika, e si elucyjn fazy
ruchomej naley zmniejszy. Do tego celu wybrano heksan i wykonano kolejn analiz TLC badanej
mieszaniny przy uyciu fazy ruchomej o skadzie: heksan-eter diizopropylowy (3:1, v/v).Wynik tej
analizy przedstawiono na rys. 30 oraz w tab. 3. Uzyskano, mieszczce si w optymalnym zakresie,
wartoci wspczynnika opnienia RF nie tylko dla substancji B i C, ale i dla pozostaych, przy
zachowaniu odpowiedniej selektywnoci rozdzielania. Wynikajce z wartoci RF objtoci retencji VR
dla substancji A, B, i C s rwnie optymalne. Nie jest konieczne wymywanie substancji D du
objtoci fazy ruchomej (25,2 x VM), gdy stanowi ona w podawanym przykadzie substancj zbdn.
W ten sposb dobrana faza ruchoma pozwala rozdzieli na kolumnie chromatograficznej wybrane
zwizki B i C z odpowiedni selektywnoci oraz przy uyciu optymalnych objtoci fazy ruchomej
potrzebnych do ich elucji z kolumny.

Tabela 3. Wyniki analizy TLC mieszaniny zawierajcej zwizki A, B, C i D przy zastosowaniu fazy ruchomej:
heksan-eter diizopropylowy (3:1, v/v) [na podstawie Laboratory Chromatography Guide. Talamona, 2005]

Zwizek RF VR
A 0,37 2,7
B 0,25 4,0
C 0,12 8,4
D 0,04 25,2

Rysunek 30. Analiza TLC mieszaniny zawierajcej zwizki: A, B, C i D przy zastosowaniu fazy ruchomej:
heksan-eter diizopropylowy (3:1, v/v) [na podstawie Laboratory Chromatography Guide. Talamona, 2005]

168
Przykad wyboru fazy ruchomej do elucji gradientowej
Przedstawiony wczeniej przykad dotyczy elucji izokratycznej, czyli takiej, gdzie skad fazy ruchomej
jest stay w cigu caego rozdzielania chromatograficznego. Jeeli zwizki rni si mocno
polarnoci to trudno jest dobra taki skad fazy ruchomej, aby uzyska si elucyjn odpowiedni dla
wszystkich skadnikw prbki. W takim przypadku stosuje si w chromatografii kolumnowej elucj
gradientow.
Sposb postpowania jest nastpujcy:

dobranie w analizie TLC rozpuszczalnika z odpowiedni selektywnoci,

dobranie kilku faz ruchomych, skadajcych si z wybranego rozpuszczalnika selektywnego
(skadnik B) i niepolarnego rozpuszczalnika organicznego (skadnik A, obniajcy moc elucji),
ale rnicych si si elucyjn dziki zastosowaniu rnego skadu procentowego (na
przykad 2% B, 5% B, 10% B, 25% B itd.) mieszaniny,
sprawdzenie w analizie TLC zaproponowanych faz ruchomych a nastpnie wybranie takiej
sekwencji rozpuszczalnikw, ktra pozwoli optymalnie wyeluowa badane zwizki.
Proces rozdzielania mieszaniny zwizkw na kolumnie chromatograficznej wykonuje si, stosujc
kolejno mieszaniny rozpuszczalnikw o zwikszajcej si sile elucyjnej, uzyskanej dziki zwikszajcej
si procentowej zawartoci rozpuszczalnika bardziej polarnego (%B).

2.4. Wysokosprawna chromatografia cieczowa

2.4.1. Wstp
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest szeroko stosowan nowoczesn technik
separacyjn. Z punktu widzenia mechanizmu separacji, HPLC mona najoglniej podzieli na
nastpujce rodzaje:

chromatografi adsorpcyjn,
chromatografi podziaow,
chromatografi jonow,
chromatografi wykluczania,
chromatografi powinowactwa.
Wybierajc odpowiedni metod chromatograficzn naley rozway wybrane informacje o badanej
prbce i jej skadnikach, takie jak: chemiczna budowa skadnikw prbki, masy czsteczkowe,
stenia i liczebno skadnikw, rozpuszczalno, widma UV-Vis skadnikw a take inne dostpne.
Po zebraniu informacji, dla uatwienia wyboru odpowiedniej techniki chromatograficznej, stosuje si
pewne zasady.

Gwnymi kryteriami wyboru metody chromatograficznej s wielko czsteczek rozdzielanych

zwizkw i ich rozpuszczalno w wodzie.

Jeli skadniki prbki, maj masy czsteczkowe mniejsze ni 2000 daltonw, to w przypadku prbki
nierozpuszczalnej w wodzie i zawierajcej zwizki alifatyczne bd aromatyczne stosuje si:

chromatografi adsorpcyjn do separacji zwizkw na grupy (analiza grupowa) lub do

separacji izomerw,

169
 chromatografi podziaow w odwrconym ukadzie faz do separacji zwizkw z grup
homologicznych.
Jeli prbka jest rozpuszczalna w wodzie i zawiera zwizki obdarzone adunkiem (jony lub formy
zdysocjowane) stosuje si chromatografi jonow.
W przypadku skadnikw prbki, ktrych masy czsteczkowe przekraczaj 2000 daltonw, stosuje
si chromatografi wykluczania, ktra jest najlepszym wyborem:

dla prbek rozpuszczalnych w wodzie uywa si roztworw wodnych, jako fazy ruchomej,
dla prbek nierozpuszczalnych w wodzie, jako faz ruchom stosuje si inne, odpowiednie
rozpuszczalniki.
Chromatografia powinowactwa jest stosowana do separacji prbek pochodzenia biologicznego.
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) charakteryzuje si wysok sprawnoci, dobr
rozdzielczoci, krtkim czasem analizy oraz stosowaniem wysokich cinie. W tabeli 4
przedstawiono porwnanie niektrych parametrw kolumn chromatograficznych, stosowanych w
chromatografii niskocinieniowej i wysokosprawnej.

Tabela 4. Porwnanie przykadowych parametrw kolumn do chromatografii cieczowej

niskocinieniowej i wysokosprawnej

Chromatografia Wysokosprawna
Parametr niskocinieniowa chromatografia cieczowa
Rozmiar czstek wypenienia kolumny [m] 100600 5
Dugo kolumny [cm] 10100 25
rednica wewntrzna kolumny [mm] 2050 4,6
Sprawno [liczba pek/m] <100 15000
Cinienie na wlocie kolumny [MPa] 0,0010,01 520

Zasadnicz rnic pomidzy chromatografi kolumnow niskocinieniow a chromatografi

wysokosprawn jest rozmiar czstek wypenienia kolumny. W HPLC stosuje si drobne ziarna
wypenienia, o wymiarach rzdu 5 m lub mniejsze. Tak mae ich rozmiary poprawiaj upakowanie
kolumny, co zdecydowanie zmniejsza dyfuzj wirow i pozwala osign wysok sprawno kolumny.
May rozmiar ziaren wypenienia wymaga jednoczenie stosowania wysokiego cinienia, aby wymusi
przepyw fazy ruchomej przez kolumn.

2.4.2. Aparatura
Analiz zwizkw chemicznych technik wysokosprawnej chromatografii cieczowej wykonuje si przy
uyciu chromatografw cieczowych. Schemat chromatografu cieczowego przedstawiono na rysunku
31. Podstawowymi czciami kadego chromatografu cieczowego s:

zbiornik fazy ruchomej,

pompa,
dozownik,
kolumna,
detektor,

170
 komputer lub rejestrator.

Zasada dziaania chromatografu cieczowego jest nastpujca. Faza ruchoma jest pobierana przez
pomp (3) ze zbiornikw (1 lub/i 2) i nastpnie toczona pod cinieniem poprzez dozownik (4) do
kolumny chromatograficznej (5) i dalej do detektora (6). Prbk (x) w postaci roztworu wprowadza
si do strumienia fazy ruchomej w dozowniku. Skadniki prbki wraz z faz ruchom przedostaj si
do kolumny, gdzie s rozdzielane, po czym trafiaj wraz z faz ruchom do detektora. Detektor
wykrywa skadniki prbki w fazie ruchomej i wysya sygna do komputera (7), w ktrym jest on
zapisywany w postaci pikw chromatograficznych, tworzc chromatogram (8). Kolumna dodatkowo
moe by umieszczana w termostacie.

8
4
7

5
3
1 2
6

Rysunek 31. Schemat blokowy chromatografu cieczowego HPLC. 1, 2 zbiorniki skadnikw fazy
ruchomej, 3 pompa, 4 dozownik, 5 kolumna, 6 detektor, 7 komputer lub rejestrator (linia
zielona pokazuje drog fazy ruchomej, linia czerwona drog rozdzielanej prbki; obie drogi cz si
w dozowniku)

Chromatografy cieczowe s wyposaone w dozowniki umoliwiajce wprowadzenie ciekych prbek

pod cinieniem atmosferycznym do kolumny, w ktrej panuje zwikszone cinienie nawet rzdu
kilkudziesiciu MPa. Prbk dozuje si przy uyciu szklanej mikrostrzykawki (rysunek 32), ktrej iga
ma tpo zakoczony koniec.
Prbka

!
Iga strzykawki

Toczek

Rysunek 32. Mikrostrzykawka do odmierzania maych objtoci cieczy (Uwaga! Koniec igy
mikrostrzykawki stosowanej do dozowania prbki w HPLC jest tpo zakoczony)

171
Najczciej stosuje si szeciodrone zawory dozujce (rysunek 33). Kierunek przepywu fazy
ruchomej przez dozownik zaley od pooenia dwigni zaworu:

pozycja A (LOAD) faza ruchoma omija ptl dozujc, mona j przepuka i napeni za pomoc
szklanej mikrostrzykawki; w ptli panuje cinienie atmosferyczne,
pozycja B (INJECT) faza ruchoma przepywa przez ptl dozujc i zabiera ze sob
znajdujc si w ptli prbk wprowadzajc j jednoczenie do kolumny; jest to pocztek
analizy chromatograficznej.
Ciekaw animacj pokazujc proces dozowania prbki na kolumn za pomoc zaworu dozujcego
mona obejrze w Internecie: http://www.restek.com/info_sixport.asp

Rysunek 33. Dozownik HPLC zasada dziaania; (a) - wprowadzanie prbki za pomoc
mikrostrzykawki do ptli oraz (b) - dozowanie do kolumny

Kolumna chromatograficzna jest zasadniczym elementem chromatografu w niej zachodzi proces

rozdzielenia skadnikw wprowadzonej prbki. Kolumny stosowane w HPLC s wykonane ze stali i
fabrycznie wypenione faz stacjonarn (rysunek 34). Uywane s kolumny o rnych wymiarach,
najczciej o dugoci od 10 do 30 cm i o rednicy od 4 do 5 mm. Czstki wypenienia kolumny maj
zazwyczaj rednic okoo 3 do 6 m. Wspczenie jednak coraz popularniejsze staj si
zminiaturyzowane formy kolumn chromatograficznych, zwaszcza przy zastosowaniu tzw.
ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC), gdzie dugo kolumn nie przekracza 2,5 cm, a czstki
wypenienia maj rednic poniej 2m.

172
 Rysunek 34. Kolumny HPLC

W chromatografii cieczowej stosuje si rne typy detektorw do wykrywania okrelonych grup

zwizkw chemicznych. S to przede wszystkim detektory spektrofotometryczne. Ich zasada dziaania
polega na rejestrowaniu rnicy waciwoci fazy ruchomej oraz poszczeglnych skadnikw
chromatografowanej prbki. Faza ruchoma opuszczajc kolumn chromatograficzn przepywa przez
przepywow komrk pomiarow w detektorze. Pojemno takiej komrki jest bardzo maa, rzdu
0,01 10 l.
Najczciej stosowanym detektorem jest detektor spektrofotometryczny UV. Mierzy on absorpcj
promieniowania w zakresie UV/Vis zgodnie ze znanym prawem Lamberta-Beera:

I = I 0 10 bc (55)
gdzie:
I natenie promieniowania po przejciu przez komrk pomiarow detektora,
I0 natenie promieniowania przed komrk pomiarow detektora,
wspczynnik absorpcji,
b dugo celki pomiarowej,
c stenie badanej substancji w fazie ruchomej w komrce pomiarowej detektora.
Detektor rejestruje bezporednio absorbancj A i podaje j jako warto bezwymiarow:

I0
A = log (56)
I
gdzie:
A absorbancja,
I natenie promieniowania po przejciu przez komrk pomiarow detektora,
I0 natenie promieniowania przed komrk pomiarow detektora.

Warunkiem stosowania detektora spektrofotometrycznego UV jest zdolno badanych substancji do

pochaniania promieniowania UV. Absorpcja promieniowania z zakresu UV/Vis przez czsteczk
zwizku chemicznego zwizana jest z przejciami elektronw wiza pojedynczych (), wiza
wielokrotnych () oraz elektronw wolnych par elektronowych (n) z orbitalu o niszej energii na
wolny orbital o wyszej energii. Przejcia elektronw wiza pojedynczych ( *) wymagaj
najwyszej energii, ktra odpowiada zakresowi fal poniej 200 nm. W detektorach UV nie

173
wykorzystuje si zakresu promieniowania poniej 190 nm, gdy wymagaoby to ukadu prniowego.
W detektorach takich wykorzystuje si natomiast absorpcj promieniowania przez ugrupowania
chromoforowe. Typowymi chromoforami s sprzone wizania podwjne wgiel-wgiel i wgiel-
heteroatom oraz ugrupowania aromatyczne, w ktrych pochanianie energii w zakresie UV/Vis
zwizane jest z przejciami elektronw oraz n na orbital *.
Aby moliwe byo przeprowadzenie pomiaru detektorem UV/Vis w chromatografii cieczowej, faza
ruchoma nie powinna absorbowa promieniowania przy zastosowanej dugoci fali.
Najprostsze detektory umoliwiaj wykrywanie rozdzielanych zwizkw przy jednej dugoci fali
254 nm, natomiast inne umoliwiaj pynn regulacj dugoci fali w zakresie UV/Vis. Popularne s
rwnie detektory z matryc fotodiodow (ang. diode array detector, DAD). Detektor DAD umoliwia
rejestracj caego widma badanej substancji w trakcie jej przechodzenia przez detektor, dziki czemu
mona j zidentyfikowa.
Detektor spektrofotometryczny UV jest niewraliwy na zmiany przepywu fazy ruchomej i zmiany
temperatury. Moe by take stosowany w elucji gradientowej.
Detektor refraktometryczny jest detektorem uniwersalnym. Wykonuje nim si pomiar rnicy
midzy wspczynnikiem zaamania wiata fazy ruchomej oraz rozdzielanych substancji. W
detektorze refraktometrycznym znajduj si dwie komrki pomiarowe:

przez jedn przepywa czysta faza ruchoma (eluent),

przez drug przepywa faza ruchoma opuszczajca kolumn zawierajca substancje
rozdzielane (eluat z kolumny).
Im wiksza jest rnica wspczynnikw zaamania wiata midzy faz ruchom a substancj, tym
lepsza jest czuo detektora. Im wiksze stenie substancji rozdzielanej, tym wiksza rnica
wspczynnikw zaamania wiata i tym wikszy sygna z detektora.
Detektor refraktometryczny moe by stosowany jedynie w elucji izokratycznej, w elucji
gradientowej ciga zmiana skadu fazy ruchomej powodowaaby cig zmian wspczynnika
zaamania wiata. Zmienno wartoci wspczynnika zaamania wiata powoduj rwnie zmiany
przepywu fazy ruchomej i zmiany temperatury, dlatego detektor refraktometryczny musi by
termostatowany. Detektory refraktometryczne stosuje si midzy innymi do analiz wglowodanw.
Detektor konduktometryczny (przewodnociowy) stosuje si do detekcji zwizkw obdarzonych
adunkiem. Detektor konduktometryczny mierzy zmiany przewodnictwa eluatu w porwnaniu z
eluentem, czyli czyst faz ruchom. Pomiar polega na zmierzeniu przewodnoci cieczy znajdujcej
si pomidzy dwoma elektrodami, do ktrych podcza si zmienne napicie. Przewodno waciwa
jest liniow funkcj stenia rozcieczonego elektrolitu i dlatego detektor konduktometryczny znalaz
zastosowanie w chromatografii jonowej. Zgodnie ze znanym prawem Kohlrauscha, przewodno
elektryczna rozcieczonych roztworw elektrolitw jest sum przewodnoci poszczeglnych jonw w
roztworze pomnoonych przez ich wartociowoci i stenia:
0i zici
= (57)
1000
gdzie:
przewodno waciwa [S/cm],
0i graniczna przewodno molowa [Scm2/mol],

174
 zi wartociowo jonu,
ci stenie molowe jonu [mol/L].

2.4.3. Chromatografia adsorpcyjna

Chromatografia adsorpcyjna zachodzi w ukadzie ciecz-ciao stae (LSC, ang. liquid-solid

chromatography). Faz stacjonarn jest adsorbent - ciao stae.
W chromatografii adsorpcyjnej czsteczki substancji rozdzielanej konkuruj z czsteczkami fazy
ruchomej o miejsca adsorpcji na powierzchni fazy stacjonarnej. Im silniejsza adsorpcja czsteczek fazy
ruchomej na powierzchni fazy stacjonarnej tym mniejsza adsorpcja czsteczek substancji
rozdzielanych. Czyli im oddziaywanie czsteczek fazy ruchomej z powierzchni fazy stacjonarnej jest
silniejsze, tym atwiej wypieraj one z tej powierzchni czsteczki substancji zaadsorbowanej.

Efektywno wymywania substancji z adsorbentu zaley od mocy elucyjnej fazy ruchomej. Im

moc elucyjna fazy ruchomej jest wiksza tym czasy retencji substancji rozdzielanych s nisze.

Uszeregowanie rozpuszczalnikw wg wzrastajcej mocy elucyjnej nosi miano szeregu eluotropowego

(por.roz. III.2.3.4.).
Faz stacjonarn w chromatografii adsorpcyjnej jest najczciej el krzemionkowy (por.roz. III.2.3.3.),
rzadziej tlenek glinu bd wgiel aktywny. el krzemionkowy ma charakter polarny i stosowany jest
jako faza stacjonarna w chromatografii w normalnym ukadzie faz. W takim przypadku kolejno
elucji substancji rozdzielanych na kolumnie zaley od ich polarnoci. Substancje o niskiej polarnoci
eluuj si pierwsze a nastpnie eluuj te o wikszej polarnoci.
Fazy ruchome uywane w chromatografii w normalnym ukadzie faz zostay opisane w rozdziale
2.3.4.

Chromatografia adsorpcyjna pozwala na rozdzia mieszaniny zwizkw na klasy zwizkw o tych

samych grupach funkcyjnych (analiza grupowa).

Na przykad, z uyciem tej techniki mona wydzieli klas wielopiercieniowych wglowodorw

aromatycznych od wglowodorw alifatycznych. Z drugiej strony nie mona rozdzieli grupy
wglowodorw alifatycznych na pojedyncze zwizki homologiczne.
Chromatografia adsorpcyjna jest stosowana rwnie do rozdzielania izomerw strukturalnych, ktre
rni si przestrzennym rozmieszczeniem grup funkcyjnych w czsteczkach, w odniesieniu do miejsc
adsorpcji na powierzchni elu krzemionkowego.

2.4.4. Chromatografia podziaowa

Chromatografia podziaowa zachodzi w ukadzie ciecz-ciecz (LLC, ang. liquid-liquid chromatography).

Faz stacjonarn jest ciecz zwizana chemicznie z ciaem staym, ktre jest jej nonikiem. Obie ciecze,
faza ruchoma i faza stacjonarna, nie mog wzajemnie rozpuszcza si w sobie, aby mg powsta
ukad dwufazowy. Ten warunek jest speniony, gdy jedna faza jest polarna a druga niepolarna, lub
odwrotnie.

175
Podstawowym nonikiem fazy stacjonarnej jest mikroporowaty el krzemionkowy o niewielkich
ziarnach (3, 5 lub 10 m). Sam el krzemionkowy jest stosowany jako faza stacjonarna w
chromatografii adsorpcyjnej, natomiast w chromatografii podziaowej jest jedynie nonikiem, z
ktrym faza stacjonarna jest chemicznie zwizana.
Na powierzchni elu krzemionkowego znajduj si grupy silanolowe (SiOH) zdolne do rnego typu
reakcji chemicznych. W reakcji elu krzemionkowego z pochodnymi chlorosilanw powstaje wizanie
silanolowe (silikonowe) wg poniej reakcji:

SiOH + ClSi(CH3)2R SiOSi(CH3)2R +HCl

W wyniku tych reakcji, grupy hydroksylowe obecne na powierzchni elu krzemionkowego s
zastpowane nowymi grupami: alkilowymi, fenylowymi, cyjanopropylowymi lub propyloaminowymi.
Reakcje te su do otrzymywania faz stacjonarnych niepolarnych oraz faz stacjonarnych polarnych.
Taki typ faz stacjonarnych nazywa si oglnie fazami zwizanymi.

Mechanizm separacji zwizkw na fazach stacjonarnych zwizanych ma gwnie charakter

podziaowy, std nazwa chromatografia podziaowa. W chromatografii podziaowej
rozdzielanie skadnikw prbki jest wynikiem ich rnej rozpuszczalnoci w fazach
chromatograficznych.

Jednake nie wszystkie grupy hydroksylowe na powierzchni elu krzemionkowego s zastpowane

nowymi grupami i w konsekwencji powierzchnia elu krzemionkowego jest pokryta zwizanymi
grupami oraz wolnymi grupami silanolowymi. Te grupy silanolowe, chocia czciowo ekranowane
grupami organicznymi, mog jednak wpywa na proces rozdzielania chromatograficznego. Std
chromatografia na fazach zwizanych przebiega w pewnym stopniu rwnie przy udziale procesw
adsorpcyjnych.
W zalenoci od tego, jakie grupy (niepolarne czy polarne) zastosuje si do modyfikacji powierzchni
elu krzemionkowego, otrzymuje si:

faz stacjonarn niepolarn, stosowan w chromatografii w odwrconym ukadzie faz (RP),

faz stacjonarn polarn, stosowan w chromatografii w normalnym ukadzie faz (NP).

Chromatografia w odwrconym ukadzie faz

W chromatografii w odwrconym ukadzie faz najczciej stosowana jest zwizana faza
oktadecylosilanowa (oznaczana skrtami: ODS, RP-18 lub C18), w ktrej grupy alkilowe na powierzchni
elu krzemionkowego maj 18 atomw wgla w acuchach (rysunek 35). Te acuchy alkilowe maj
charakter hydrofobowy a wic zwizana faza stacjonarna bdzie rwnie niepolarna. acuch
alkilowy moe by take zakoczony grup fenylow (C6H5) lub dwoma grupami fenylowymi.
Separacja substancji za pomoc chromatografii w odwrconym ukadzie faz jest podobna do
ekstrakcji rnych substancji z wody do rozpuszczalnika organicznego, takiego jak na przykad oktanol
(por.roz. I.2.4). Substancje hydrofobowe (niepolarne) przechodz do niepolarnego rozpuszczalnika.
Faza stacjonarna oktadecylosilanowa jest mniej polarna ni faza ruchoma o skadzie woda-metanol
lub woda-acetonitryl.

176
 Rysunek 35. Zwizana faza oktadecylosilanowa

Substancje bardziej hydrofobowe s silniej zatrzymywane w fazie stacjonarnej i eluuj z kolumny

pniej ni substancje bardziej polarne. Na przykad wglowodory s silniej zatrzymywane na
kolumnie ni alkohole. Wzrost zawartoci wody w fazie ruchomej powoduje wyduenie czasw
retencji zwizkw rozdzielanych i odwrotnie wzrost zawartoci metanolu lub acetonitrylu
(skadnika organicznego) w fazie ruchomej powoduje skrcenie czasw retencji zwizkw
rozdzielanych w chromatografii w odwrconym ukadzie faz.
Chromatografia w odwrconym ukadzie faz jest stosowana do rozdzielania wikszoci zwizkw
organicznych. Pozwala na rozdzielenie mieszaniny zwizkw na pojedyncze zwizki homologiczne. Z
szeregu homologicznego wglowodorw, pierwsze eluuj si wglowodory o mniejszych masach
czsteczkowych a potem te o wikszych masach czsteczkowych. Rozpuszczalno wglowodorw o
mniejszych masach czsteczkowych w polarnej fazie ruchomej jest wiksza ni tych o wikszych
masach czsteczkowych, ktre s silniej zatrzymywane w niepolarnej fazie stacjonarnej.

Chromatografia w normalnym ukadzie faz

Zwizane fazy stacjonarne o charakterze hydrofilowym (redniopolarne), ktre mona stosowa w

chromatografii w normalnym ukadzie faz to:

fazy z grupami cyjanopropylowymi: (CH2)3CN,

fazy z grupami propyloaminowymi: (CH2)3NH2.

Fazy ruchome uywane w chromatografii w normalnym ukadzie faz zostay opisane w rozdziale
III.2.3.4.

2.4.5. Chromatografia jonowa

Chromatografia jonowa jest odmian wysokosprawnej chromatografii cieczowej stosowan do
separacji i analizy anionw i kationw oraz innych zwizkw chemicznych w formie zdysocjowanej.

177
Chromatografi jonow stosuje si midzy innymi do oznaczania anionw i kationw w wodach i
ciekach. Zalety chromatografii jonowej:

moliwo jednoczesnego oznaczania kilkunastu jonw,

moliwo oznaczania jednoczenie kationw i anionw,
moliwo oznaczania jonw pierwiastka na rnych stopniach utlenienia (analiza
specjacyjna),
wykrywalno jonw na poziomie mol/l lub mniejszym,
wysoka selektywno oznaczania jonw w prbkach o zoonym skadzie,
niewielka ilo prbki potrzebna do analizy,
prosty sposb przygotowania prbek do analizy,
krtki czas analizy.

Chromatografia jonowa rni si od innych rodzajw wysokosprawnej chromatografii cieczowej

rodzajem stosowanych wypenie kolumn, rodzajem eluentw oraz ewentualnie stosowaniem
dodatkowego urzdzenia (kolumny tumienia lub supresora) do obniania przewodnoci elektrycznej
eluentu. Chromatografi jonow dzieli si na dwa rodzaje:

chromatografi jonow z tumieniem przewodnoci fazy ruchomej,

chromatografi jonow bez tumienia przewodnoci fazy ruchomej.

Jeeli stosuje si obnianie przewodnoci elektrycznej eluentu to jest to chromatografia jonowa z

tumieniem przewodnoci. W chromatografii jonowej bez tumienia przewodnoci nie ma potrzeby
stosowania ani supresora, ani kolumny tumienia. Eluent jest tak dobrany, aby jego przewodno bya
odpowiednio niska i umoliwiaa detekcj konduktometryczn jonw prbki. Chromatografia jonowa
bez tumienia przewodnoci jest stosowana rzadko; dominuje stosowanie chromatografii jonowej z
tumieniem przewodnoci i ten rodzaj chromatografii zostanie opisany poniej.
Ze wzgldu na agresywne dziaanie faz ruchomych (eluentw), zwyky chromatograf HPLC zbudowany z
metalowych czci, nie nadaje si do stosowania w chromatografii jonowej. Chromatograf jonowy
skada si z nastpujcych czci:

zbiornik fazy ruchomej,

pompa,
dozownik,
przedkolumna,
kolumna analityczna,
supresor lub kolumna tumienia,
detektor,
komputer lub rejestrator.
Zasada dziaania chromatografu jonowego jest nastpujca. Faza ruchoma jest pobierana przez
pomp ze zbiornika i nastpnie toczona pod cinieniem poprzez dozownik i przedkolumn do
kolumny chromatograficznej. Prbk wprowadza si do strumienia fazy ruchomej w dozowniku. Jony
obecne w prbce s rozdzielane na kolumnie. Eluat przechodzi do supresora (lub do kolumny
tumienia), gdzie w wyniku reakcji chemicznych przewodno elektryczna eluentu ulega obnieniu.
Dziki temu przewodno elektryczna jonw prbki jest wysoka w porwnaniu do obnionej

178
przewodnoci elektrycznej jonw eluentu. Umoliwia to odrnienie jonw prbki od jonw eluentu i
ich detekcj w detektorze konduktometrycznym.
Detektor wysya sygnay do komputera, w ktrym s one zapisywane w postaci pikw
chromatograficznych, tworzc chromatogram. W chromatografii jonowej wystpuj nastpujce
mechanizmy rozdzielania jonw:

wymiana jonowa,
wykluczanie jonw,
tworzenie par jonowych.
Chromatografia wymiany jonowej jest nazywana po prostu chromatografi jonow (IC), podczas gdy
chromatografia par jonowych (IPC) i chromatografia wykluczania jonowego (IEC) s uwaane za
techniki bardziej wyspecjalizowane.

Wysokosprawna chromatografia jonowa

W wysokosprawnej chromatografii jonowej zachodzi mechanizm wymiany jonowej (rysunek

36), ktra polega na wymianie jonw pomidzy roztworem a jonitem.

Jonity, inaczej wymieniacze jonowe, s to stae substancje nieorganiczne lub organiczne zawierajce
jony zdolne do wymiany na inne jony o tym samym adunku, znajdujce si w roztworze, w ktrym
wymieniacze jonowe s nierozpuszczalne.
Jonity s wielkoczsteczkowymi ciaami staymi o strukturze przestrzennej usieciowanej. Maj
zdolno wymiany jonw z roztworem, w ktrym si znajduj. We wspczesnej chromatografii
jonowej stosuje si jonity syntetyczne, czyli wielkoczsteczkowe polimery organiczne z
wbudowanymi grupami funkcyjnymi, zdolnymi do wymiany jonw w roztworze elektrolitu. S
nierozpuszczalne w wodzie i w wikszoci rozpuszczalnikw organicznych. Najczciej s to
kopolimery styrenu i diwinylolobenzenu (PS/DVB). Jonity skadaj si z kulistych czsteczek
polimerw o rednicy od 5 do 15 m. Jonity dzieli si na nastpujce rodzaje:

kationity - grupami funkcyjnymi s kationy zdolne do wymiany; jeeli kationit jest polimerem
organicznym to stosuje si rwnie nazw ywica kationowymnienna,
anionity - grupami funkcyjnymi s aniony zdolne do wymiany; jeeli anionit jest polimerem
organicznym to stosuje si rwnie nazw ywica anionowymnienna,
wymieniacze amfoteryczne - w zalenoci od pH roztworu maj zdolno wymiany anionw
albo kationw,
wymieniacze bipolarne - mog jednoczenie wymienia aniony i kationy.

O waciwociach kolumny wypenionej ywic jonowymienn decyduje rodzaj ywicy, stopie

jej usieciowania, rodzaj i ilo grup jonowymiennych, stopie oddziaywa hydrofobowych
oraz wielko czstek wypenienia.

Faza stacjonarna w wysokosprawnej chromatografii jonowej jest jonitem z grupami funkcyjnymi o staym
adunku, w ktrych bezporednim otoczeniu znajduj si odpowiednie przeciwjony, zapewniajce

179
elektryczn obojtno ukadu. Zwykle przeciwjon pochodzi z fazy ruchomej i dlatego te jest nazywany
jonem eluentu. Przy wymianie anionw grupami funkcyjnymi s czwartorzdowe zasady amoniowe, za
przy wymianie kationw grupy sulfonowe lub karboksylowe. Przeciwjon moe by wymieniony przez jon
substancji analizowanej, ktry zostanie czasowo zatrzymany w kolumnie. Jony skadnikw analizowanej
prbk i rni si pomidzy sob czasem przebywania w kolumnie wynikajcym z ich rnego
powinowactwa do fazy stacjonarnej. Na rysunku 36 pokazano schematycznie procesy wymiany jonowej.

W chromatografii jonowej czas retencji analizowanych jonw zaley przede wszystkim od

liczby i rodzaju grup funkcyjnych zwizanych na powierzchni jonitu, ale take od siy jonowej i
rodzaju eluentu oraz pH eluentu.

Oglne zasady elucji w chromatografii jonowej:

ze wzrostem wartociowoci jonu analitu zwiksza si jego powinowactwo do grupy

funkcyjnej jonitu - jony trjwartociowe s silniej wizane ni jony dwuwartociowe, dla elucji
jonw trjwartociowych trzeba uy eluentu o wikszej sile jonowej ni dla
dwuwartociowych,
jeeli analizowane jony maj t sam wartociowo, to im wikszy jest promie jonowy i
stopie polaryzacji, tym silniej jon jest zatrzymywany na jonicie,
jony analitw, charakteryzujcych si silnymi oddziaywaniami hydrofobowymi lub van der Waalsa z
faz stacjonarn, bd eluoway pniej ni jony o sabszych oddziaywaniach, na przykad jony
poczone z piercieniem aromatycznym bd si silniej wiza z ywic polistyrenow ni pozostae
jony, nieposiadajce ukadu aromatycznego.

Rysunek 36. Mechanizm wymiany jonowej (A jony analitu, E jony eluentu) [na podstawie
Praktyczna chromatografia jonowa. Viehweger K. H. (red.), Metrohm]

180
Podobnie jak we wszystkich rozdzieleniach metod chromatografii cieczowej, rwnie w chromatografii
jonowej faza ruchoma wpywa na separacj analitw. Dobiera si rodzaj przeciwjonu, pH oraz si jonow
eluentu. Dla mocnych kationitw i anionitw im wysza sia jonowa eluentu, tym wysza jego sia elucyjna.
Natomiast pH eluentu powinno by tak dopasowane, aby zapewniao dysocjacj jonw analitu oraz jonw
zwizanych z powierzchni jonitu.
Eluentami stosowanymi do rozdzielania anionw w chromatografii jonowej z tumieniem
przewodnoci s najczciej wodne roztwory wglanu sodu Na2CO3, wodorowglanu sodu NaHCO3
lub ich mieszaniny (elucja izokratyczna) lub wodne roztwory NaOH lub Na2B4O7 (elucja gradientowa).
Do oznaczania kationw eluentami s gwnie kwasy mineralne, takie jak HCl lub HNO3.

Wysokosprawna chromatografia wykluczania jonowego

W chromatografii wykluczania jonowego wykorzystane jest zjawisko rwnowagi membranowej

Donnana. Rwnowaga membranowa Donnana jest to stan ustalajcy si midzy dwoma roztworami
przedzielonymi membran pprzepuszczaln. W chromatografii wykluczania jonowego funkcj
pprzepuszczalnej membrany peni porowaty wymieniacz jonowy. Oddziela on wodn faz ruchom
od wodnej fazy stacjonarnej zawartej w porach wymieniacza. Membrana jest przepuszczalna tylko
dla zwizkw niezjonizowanych lub sabo zjonizowanych. Ulegaj one podziaowi pomidzy faz
stacjonarn i faz ruchom a tym samym wolniej migruj przez kolumn. Natomiast jony, ktre nie
wnikaj do wntrza porw wypenienia kolumny, nie s zatrzymywane przez kolumn.

Rysunek 37. Mechanizm wykluczania Donnana w chromatografii wykluczania jonowego na

przykadzie kwasu karboksylowego [na podstawie Praktyczna chromatografia jonowa. Viehweger K.
H. (red.), Metrohm]

Najwaniejszym zastosowaniem chromatografii wykluczania jonowego jest analiza sabych kwasw,

takich jak kwasy karboksylowe, lub zasad. Na rysunku 37 pokazano mechanizm separacji metod IEC na
przykadzie kwasu karboksylowego R-COOH. Wypenieniem kolumny jest sulfonowany wymieniacz
kationowy, ktrego grupy sulfonowe z protonami, jako jonami przeciwnymi s elektrycznie obojtne.
Grupy funkcyjne s uwodnione za uwodniona warstwa jest ograniczona przez hipotetyczn, ujemnie

181
naadowan membran Donnana. Przez membran przenika swobodnie woda natomiast organiczne
kwasy karboksylowe mog przenikn, jeeli bd w postaci niezdysocjowanej. Kwasy karboksylowe,
majce niskie wartoci staych kwasowych (pKA), s w mocno kwanych eluentach praktycznie cakowicie
niezdysocjowane. Faz ruchom jest w takim przypadku roztwr mocnego kwasu mineralnego.

Chromatografia par jonowych

W chromatografii par jonowych, zwanej rwnie chromatografi jonowo-asocjacyjn, do fazy

ruchomej dodawany jest tak zwany odczynnik pary jonowej. Skada si on ze zwizkw
powierzchniowoczynnych (anionowych lub kationowych), takich jak sole tetraalkiloamonowe lub
kwasy n-alkilosulfonowe. Jony analitu X oddziauj z jonami L odczynnika pary jonowej. Tworzy si
kompleks typu XL. Kompleks XL moe zwiza si w sposb odwracalny z niepolarn powierzchni
fazy stacjonarnej S, tworzc z kolei kompleks XLS. Jeeli rozdzielane jony prbki (w postaci
kompleksw XL) rni si powinowactwem do niepolarnej fazy stacjonarnej, to bd eluoway z
kolumny w rnym czasie i ulegn rozdzieleniu. W chromatografii par jonowych stosuje si
hydrofobowe fazy stacjonarne, takie same jak w chromatografii podziaowej, np. RP-18 czy RP-8. Na
rysunku 38 pokazano schematycznie mechanizm wymiany jonowej w chromatografii par jonowych.

Faza ruchoma

Jon eluentu
Jony analitw

XL
XLS Odczynnik
LS pary
jonowej

Faza stacjonarna

Rysunek 38. Mechanizm wymiany jonowej w chromatografii par jonowych [na podstawie Praktyczna
chromatografia jonowa. Viehweger K. H. (red.), Metrohm]

2.4.6. Chromatografia wykluczania

W chromatografii wykluczania rozdzielanie skadnikw prbki zaley od rnic w wymiarach
czsteczek i/lub w ich ksztacie. Prbka wprowadzana jest do kolumny wypenionej faz stacjonarn
o okrelonych wymiarach czstek i o okrelonych wymiarach porw. Czsteczki skadnikw prbki, o
wymiarach mniejszych ni wymiary porw czstek wypenienia kolumny, penetruj wewntrz porw i
zostaj zatrzymane na kolumnie natomiast czsteczki o wikszych wymiarach eluuj si z kolumny
pierwsze.

182
2.4.7. Chromatografia powinowactwa
Chromatografia powinowactwa (AC, ang. affinity chromatography) pozwala na rozdzielenie
mieszanin substancji dziki wykorzystaniu specyficznych oddziaywa biologicznych. Takie
oddziaywania mona zaobserwowa pomidzy przeciwciaami i antygenami (zasada klucza i dziurki
do klucza), enzymami i substratami, enzymami i inhibitorami lub hormonami i receptorami.
S to bardzo specyficzne oddziaywania midzy dwiema substancjami, decydujce o bardzo dobrej
selektywnoci rozdzielenia. Jedna z tych substancji jest reaktywnym ligandem, zwizanym chemicznie
z powierzchni nonika i tworzy faz stacjonarn, drug substancj jest analit, wykazujcy
powinowactwo do ligandu.
W chromatografii powinowactwa wykorzystuje si najczciej przeciwciaa lub enzymy
unieruchomione na noniku. Jeli w prbce wystpuje odpowiedni antygen lub substrat, to jest on
selektywnie zatrzymywany na kolumnie.

Rysunek 39. Mechanizm rozdzielenia skadnikw prbki w chromatografii powinowactwa

Chromatografia powinowactwa jest czsto stosowana w analizie i preparatyce substancji aktywnych

biologicznie, na przykad w farmakologii.

183
3. Chromatografia gazowa
3.1. Wstp
W chromatografii gazowej (GC) faz ruchom jest gaz, zwany w tym przypadku gazem nonym. Faz
stacjonarn w chromatografii gazowej moe by ciecz osadzona na noniku staym w postaci
jednorodnego filmu (warstwy) lub ciao stae adsorbent. W pierwszym przypadku ukad nazywamy
chromatografi podziaow (ang. gas-liquid chromatography, GLC) natomiast w drugim,
chromatografi adsorpcyjn (ang. gas-solid chromatography, GSC).

Chromatografia gazowa jest stosowana do analiz zwizkw chemicznych, ktre w warunkach

analizy chromatograficznej, maj posta gazw lub par. S to substancje gazowe, cieke i stae,
ktrych temperatura wrzenia lub sublimacji nie przekracza 350 - 400C.

Typowy chromatogram otrzymywany poprzez analiz roztworu prbki badanej metod

chromatografii gazowej zamieszczony jest na rysunku 15b. Najczciej pierwszy pik, jaki pojawia si
na chromatogramie prbki jest pikiem rozpuszczalnika, w ktrym zostaa ona rozpuszczona. Zwykle
pik rozpuszczalnika jest te najwikszym sygnaem na chromatogramie.

3.2. Aparatura
Analiz zwizkw chemicznych technik chromatografii gazowej wykonuje si przy uyciu
chromatografw gazowych. Schemat chromatografu gazowego przedstawiono na rysunku 40. Gaz
nony (faza ruchoma) doprowadzony z butli (1) pynie przez regulator przepywu (2) do dozownika
(3), a nastpnie przez kolumn (4) i detektor (5), skd jest usuwany na zewntrz do atmosfery.
Kolumna jest umieszczona w termostacie (piecu chromatograficznym) (6). Temperatura dozownika,
detektora i kolumny jest odpowiednio regulowana. Do dozownika wprowadza si prbk, ktra po
przejciu w stan pary w dozowniku, miesza si ze strumieniem gazu nonego i nastpnie jest
przenoszona do kolumny. W kolumnie nastpuje rozdzielenie chromatograficzne skadnikw prbki,
ktre opuszczaj kolumn wraz z gazem nonym i trafiaj kolejno do detektora. Skadniki prbki
generuj w detektorze sygna elektryczny i w ten sposb s monitorowane. Sygnay elektryczne po
wzmocnieniu we wzmacniaczu mog by rejestrowane w komputerze lub rejestratorze (7) w postaci
chromatogramu (8).
Gaz nony
W chromatografii gazowej faz ruchom stanowi gazy o maej gstoci, niskiej lepkoci, w ktrych
wspczynniki dyfuzji s due. Najczciej jest to: wodr, azot, argon lub hel. Gazy te przechowywane
s w postaci spronej w butlach stalowych (1 na rysunku 40).

Rodzaj gazu nonego ma niewielki wpyw na wynik rozdziau chromatograficznego. Zadaniem

gazu jest transport prbki przez dozownik, kolumn i detektor.

Ruch gazu przez kolumn wymuszany jest jego cinieniem w butli i ustalany do odpowiedniej prdkoci
przepywu za pomoc reduktora cinienia, umieszczonego na butli (2 na rysunku 40). Przy wyborze gazu
nonego naley si kierowa przede wszystkim rodzajem wybranego detektora oraz cen, dostpnoci i
czystoci gazu. Wymagana czysto gazw wynosi >99,999%.

184
 7 8

2
2
3 5

1 9 10

Rysunek 40. Schemat blokowy chromatografu gazowego z detektorem pomieniowo-jonizacyjnym

FID; 1 butla z gazem nonym, 2 zawr redukcyjny, 3 - dozownik, 4 kolumna, 5 detektor, 6
piec chromatograficzny, 7 komputer lub rejestrator, 8 chromatogram, 9 butla z wodorem, 10
butla z powietrzem; linia niebieska pokazuje drog gazu nonego, linia czerwona drog
chromatografowanej prbki, obie drogi cz si w dozowniku
Dozownik
Dozownik jest elementem umoliwiajcym wprowadzenie prbki w strumie gazu nonego, ktry
przenosi j do kolumny. Stosujc chromatografi gazow mona analizowa substancje, ktre w
warunkach chromatografowania maj posta gazw lub par. Okoo 20% znanych zwizkw
chemicznych spenia ten warunek i mona je analizowa technik chromatografii gazowej. S to
substancje gazowe oraz cieke i stae, ktrych temperatura wrzenia lub sublimacji nie jest wysza ni
350C 400C. Klasyczne dozowanie prbki do typowej kolumny kapilarnej polega na wprowadzeniu
niewielkich objtoci (0,1 2 l) cieczy (roztworu prbki) do dozownika za pomoc strzykawki.
Prawidowy sposb odmierzenia w strzykawce danej objtoci roztworu prbki przedstawia rysunku
41.
Prbka

Iga strzykawki
Powietrze
Toczek

Rysunek 41. Mikrostrzykawka do odmierzania maych objtoci cieczy (Uwaga! Koniec igy
mikrostrzykawki stosowanej do dozowania prbki w chromatografii gazowej jest ostro zakoczony)

185
Po wprowadzeniu roztworu prbki do dozownika nastpuje gwatowne przejcie rozpuszczalnika i prbki w
stan gazu, ktry po zmieszaniu z gazem nonym jest wprowadzany na kolumn.

Praktyczne zasady dozowania prbki za pomoc mikrostrzykawki:

strzykawk naley trzyma za cz szklan a nie za toczek,
strzykawka jest bardzo delikatna, upuszczenie jej na tward powierzchni powoduje jej
zniszczenie,
nie napenia si caej strzykawki roztworem prbki, poniewa w trakcie dozowania do
chromatografu gazowego cz roztworu moe wydosta si na zewntrz,
przed nabraniem roztworu prbki do strzykawki dobrze jest zwily j za pomoc
rozpuszczalnika, w ktrym jest rozpuszczona (napeniajc strzykawk rozpuszczalnikiem
i usuwajc go), pozwoli to na dokadniejsze odmierzenie waciwej objtoci roztworu
prbki,
naley nabiera niewielkie iloci (0,1 2 l) roztworu prbki do strzykawki,
nie naley zostawia roztworu prbki w igle strzykawki, naley przesun toczek tak,
aby zobaczy powietrze w strzykawce (rys. 44); w igle strzykawki o pojemnoci 10 l
mieci si okoo 0,5 l cieczy, pozostawiona w igle ciecz, po wprowadzeniu do gorcego
dozownika moe spowodowa wyrzucenie zawartoci strzykawki w wyniku
gwatownego wzrostu cinienia,
ig strzykawki przed dozowaniem prbki do chromatografu naley wytrze, najlepiej
papierowym rcznikiem, zapobiegnie to zabrudzeniu membrany,
toczek jest duszy od szklanej czci strzykawki i nie naley go naciska zbyt mocno
przy dozowaniu prbki, poniewa mona go zgi lub zama,
strzykawk naley umy rozpuszczalnikiem od razu po dozowaniu prbki i schowa do
waciwego opakowania,
mycie strzykawki polega na wielokrotnym napenianiu czystym rozpuszczalnikiem i
usuwaniu go, stosowane tradycyjnie trzykrotne umycie jest niewystarczajce.

Dla wikszoci kolumn kapilarnych, dopuszczalna objto prbki wynosi 0,01 do 0,001 l cieczy,
dlatego w chromatografii kapilarnej stosuje si czsto dozowniki z dzieleniem strumienia gazu
nonego (rysunek 42). Takim dozownikiem dozuje si do kolumny tylko niewielk cz prbk, np.
1/100 1/300, a pozostaa cz jest usuwana na zewntrz i tracona. Dzielenie prbki powinno
pozwoli przede wszystkim zredukowa rozmycie piku chromatograficznego, ktre jest zwizane z
procesem gwatownego odparowywania substancji w dozowniku i w ten sposb polepszy
rozdzielczo, dlatego tzw. stosunek dzielenia jest wanym parametrem, ktry charakteryzuje ten

186
sposb dozowania. Okrela on stosunek objtociowy szybkoci wypywu gazu nonego zaworem
odprowadzajcym na zewntrz do szybkoci przepywu gazu nonego przez kolumn.

Rysunek 42. Schemat dozownika z dzieleniem strumienia gazu nonego (a) oraz proces dozowania za
pomoc mikrostrzykawki (b) [na podstawie Quantitative Chromatographic Analysis. Beesley et al.,
2000]
Kolumna chromatograficzna
W kolumnie chromatograficznej zachodzi waciwy proces chromatografowania i dlatego jej rodzaj
ma wpyw decydujcy na wynik analizy chromatograficznej, czyli na jako rozdzielenia skadnikw
prbki. Rozrnia si nastpujce rodzaje kolumn (rysunek 43):
pakowane (kolumny z wypenieniem): analityczne, mikropakowane i preparatywne,
kolumny o przekroju otwartym kapilarne.

187
Kolumny pakowane napenione s zoem zawierajcym faz stacjonarn w caej swojej objtoci.
Ten rodzaj kolumn jest najczciej stosowany do preparatywnego otrzymywania niewielkich iloci
czystych zwizkw chemicznych.
Kolumny kapilarne pozwalaj na osignicie duo wyszych sprawnoci ni kolumny pakowane i
obecnie wikszo analiz chromatograficznych wykonuje si przy zastosowaniu kolumn kapilarnych.
Kolumny kapilarne maj okoo 100 tys. pek teoretycznych. Fazy stacjonarne w kolumnach
kapilarnych mog by zarwno adsorbentami, jak i cieczami i mog by osadzone na ciankach
kapilar w rny sposb.
a) b)

Rysunek 43. Kolumna pakowana (a) oraz kolumna kapilarna (b)

Wyrnia si nastpujce rodzaje kolumn kapilarnych (rysunek 44):

WCOT (ang. wall-coated open tubular) kapilary ze ciankami wewntrznymi pokrytymi

nielotn ciek faz stacjonarn, najczciej zwizan chemicznie ze ciankami kolumny; jest
to najbardziej popularny typ kolumn,
PLOT (ang. porous layer open tubular) kapilary ze ciankami pokrytymi warstw ziaren
adsorbenta,
SCOT (ang. support-coated open tubular) ziarna wypenienia pokryte s ciek faz
stacjonarn, obecnie rzadko stosowane.

Ziarna adsorbenta

Cieka faza stacjonarna

Rysunek 44. Schematyczne przekroje kolumn kapilarnych

188
Kolumny kapilarne do GC s najczciej wykonane ze stopionego kwarcu, czyli ditlenku krzemu.
Stopiony kwarc jest atwy do formowania, elastyczny i duo wytrzymalszy ni inne szka, co
powoduje, e mona wyprodukowa kapilary o rednicy wewntrznej od 0,1 do 1 mm i dugoci od
10 do 60 m. rednica wewntrzna kolumn kapilarnych wynosi najczciej: 0,1 mm, 0,25 mm, 0,32
mm lub 0,53 mm. Najczciej uywane s kolumny o wymiarach 0,25 mm 30 m. Kolumny kapilarne
przechowuje si w postaci zwoju, w uchwytach chronicych je przed uszkodzeniem (rys. 43b).
Adsorbenty stosowane w chromatografii gazowej to adsorbenty wglowe, ele krzemionkowe, sita
molekularne i polimery porowate.

Adsorbenty stosuje si do analiz gazw i wglowodorw o niskich masach czsteczkowych.

Cieke fazy stacjonarne w chromatografii gazowej to najczciej:

fazy niepolarne wglowodory, bdce dobrymi rozpuszczalnikami substancji niepolarnych,

np. skwalan,
fazy redniopolarne, tzw. silikony, s to siloksany o rnej masie czsteczkowej, z ktrych
najczciej stosowane s polidimetylosiloksan, polimetylofenylosiloksan i
policyjanoalkilosiloksan,
fazy polarne - glikole polietylenowe (np. Carbowax) oraz estry,
fazy polarne oparte o kopolimery styrenu i diwinylobenzenu (np. Porapak Q).

Detektory
Substancje rozdzielane w kolumnie chromatograficznej s wykrywane przez detektor w miar, jak
eluuj z kolumny. Detektor reaguje sygnaem elektrycznym na obecno chromatografowanego
zwizku chemicznego w gazie nonym opuszczajcym kolumn. Detektory mona podzieli na:
nieselektywne - detektory uniwersalne, reaguj na wszystkie skadniki prbki,
selektywne - reaguj na pewn grup zwizkw, ktre maj podobne waciwoci chemiczne
lub fizyczne,
specyficzne - reaguj na pojedynczy zwizek chemiczny.
Najczciej uywanym detektorem jest detektor pomieniowo-jonizacyjny (FID). Jest to
detektor uniwersalny, czyli taki, ktry jest czuy na prawie wszystkie zwizki organiczne.

Detektor pomieniowo-jonizacyjny FID nie wykrywa obecnoci zwizkw nieorganicznych oraz

niektrych zwizkw wgla, jak: CO, CO2, CS2, HCOOH, COCl2.

Zasada dziaania detektora FID przedstawiona jest na rysunku 45. Do detektora doprowadzane s z
butli dwa gazy: wodr i powietrze (9 i 10 na rysunku 40). Natenie przepywu wodoru i powietrza
regulowane s reduktorami (2 na rysunku 40). Gaz nony wypywajcy z kolumny jest mieszany z
wodorem i kierowany przez dysz do komory, przez ktr przepywa powietrze. Wodr spala si
tworzc pomie. Skadniki prbki doprowadzone wraz z gazem nonym do pomienia ulegaj
spaleniu. Niewielka cz atomw wgla (okoo 0,0018 %) ulega jonizacji w trakcie spalenia, co
odpowiada wytworzeniu okoo dwch jonw lub elektronw na 105 czsteczek analitu dostarczonych

189
do detektora. W komorze znajduj si dwie elektrody: jedn jest dysza palnika, drug (zbierajc)
stanowi piercie umieszczony w odpowiedniej odlegoci od dyszy. Powstajcy prd jonowy jest
wzmacniany i rejestrowany przez potencjometr. Sygna z detektora jest proporcjonalny do liczby
atomw wgla niezwizanych z tlenem a wic w przyblieniu jest proporcjonalny do masy substancji
(atomy wgla zwizane z tlenem lub siark nie tworz w detektorze jonw, dlatego FID nie jest czuy
na wymienione wyej tlenowe i siarkowe zwizki wgla).
Chromatograf gazowy moe by sprzony ze spektrometrem mas (GC/MS), ktry w takim
poczonym ukadzie bdzie peni funkcj detektora. Ukad GC/MS zosta opisany w rozdziale III.4.

Rysunek 45. Schemat detektora FID [na podstawie Quantitative Chromatographic Analysis. Beesley
et al., 2000]

3.3. Wybr parametrw analizy GC

Parametry analizy metod chromatografii gazowej dobierane s do konkretnego analitu i konkretnej
prbki. Najwaniejsze parametry pracy ukadu chromatograficznego to:

rodzaj fazy stacjonarnej,

wymiary kolumny,
temperatura pieca chromatograficznego,
rodzaj detektora i dozownika,
temperatura detektora i dozownika,
wielko dozowanej prbki.

Wybr fazy stacjonarnej do analizy nie jest spraw atw i cigle jeszcze bywa dokonywany
eksperymentalnie. Najwaniejsz cech faz stacjonarnych, decydujc o oddziaywaniu z
czsteczkami zwizkw rozdzielanych jest ich polarno.

190
 Oglne zasady wyboru ciekych faz stacjonarnych (GLC) s nastpujce:
do rozdziau substancji niepolarnych stosuje si faz stacjonarn niepolarn,
do rozdziau substancji polarnych stosuje si faz stacjonarn polarn,
zwizki niepolarne s rozdzielane na niepolarnej fazie stacjonarnej zgodnie z
uszeregowaniem ich wedug temperatur wrzenia (lotnoci),
na fazie stacjonarnej polarnej zwizki niepolarne s eluowane przed zwizkami
polarnymi o tej samej temperaturze wrzenia,
na fazie stacjonarnej niepolarnej zwizki polarne s eluowane przed zwizkami
niepolarnymi o tej samej temperaturze wrzenia.

Wpyw dugoci kolumny na wyniki analizy jest nastpujcy: im dusza kolumna, tym czasy retencji
s wiksze i tym wyraniejsze s rnice midzy czasami retencji dwch substancji. Jednak duszy
czas analizy powoduje, e piki s bardziej rozmyte.
Temperatura kolumny ma ogromny wpyw na wynik analizy. Proces chromatograficzny mona
prowadzi w staej temperaturze (tzw. analiza izotermiczna) lub metod programowanej
temperatury (analiza z programowan temperatur). T drug chromatografi stosuje si wtedy,
gdy skadniki mieszaniny rni si znaczco temperaturami wrzenia, np. wglowodory z ropy
naftowej lub szereg homologiczny alkoholi.
W analizie z programowan temperatur roztwr prbki jest wprowadzany do kolumny
chromatograficznej utrzymywanej w stosunkowo niskiej temperaturze niszej (o okoo 90C) ni
temperatura wrzenia najbardziej lotnego skadnika prbki. Nastpnie temperatura kolumny
chromatograficznej jest stopniowo podwyszana. Narost temperatury jest odpowiednio
programowany, moe by stay, na przykad 4C/min. Kocowa temperatura kolumny powinna by
bliska temperaturze wrzenia najmniej lotnego skadnika prbki, ale nie moe przekracza
dopuszczalnego limitu temperaturowego pracy kolumny, okrelanego przez jej producenta.
Dozowana prbka powinna by bardzo maa, wwczas strefa startowa jest bardzo wska. Wielko
prbki wprowadzonej do kolumny nie moe by wiksza od pojemnoci sorpcyjnej kolumny,
poniewa przeadowanie kolumny prowadzi do zego rozdzielenia skadnikw prbki i powstawania
niesymetrycznych, szerokich pikw. Pojemno kolumny zwykle nie przekracza okoo 40 ng dla
pojedynczego skadnika prbki.

191
4. Poczenie chromatografii ze spektrometri mas
Identyfikacja analitw jedynie na podstawie parametrw retencji, typowa w technikach
chromatograficznych (GC i HPLC), jest na og metod niewystarczajc, poniewa wystpuje wiele
rnych substancji, ktre mog mie bardzo zbliony lub nawet identyczny czas retencji jak anality. W
celu dokonania poprawnej analizy jakociowej stosuje si czenie technik, np. chromatografi w
poczeniu ze spektrometri mas. Substancje rozdzielane w kolumnie chromatograficznej kierowane s
wraz z faz ruchom do spektrometru mas, gdzie nastpuje ich jonizacja i ewentualnie fragmentacja,
natomiast identyfikacja poszczeglnych zwizkw potwierdzana jest na podstawie analizy ich widm mas.
Spektrometria mas (MS) jest uywana do identyfikacji zwizkw organicznych oraz do ich detekcji i
oznacze ilociowych. Ujmujc najprociej, spektrometr mas jest urzdzeniem do wytwarzania
jonw, czyli jonizacji czsteczki a nastpnie mierzenia stosunku masy powstaych jonw do ich
adunku (m/z).

Rejestracja iloci powstaych jonw (wielkoci prdu jonowego) i wartoci stosunku m/z
poszczeglnych jonw daje zapis analizy - widmo mas.

Uzyskiwane widma mas, a tym samym rodzaj informacji o zwizku, zale przede wszystkim od
sposobu jonizacji.

Widmo mas jest charakterystyczne dla okrelonego zwizku chemicznego i zawiera informacje
o jego masie czsteczkowej i budowie strukturalnej.

Spektrometr mas skada si z kilku istotnych elementw:

ukad wprowadzenia prbki (na przykad wprowadzenie bezporednie lub poprzez

chromatograf gazowy czy chromatograf cieczowy),
komora jonizacyjna i ukad przyspieszania jonw,
analizator jonw,
detektor jonw i rejestrator.

Najczciej w spektrometrii mas stosuje si jonizacj strumieniem elektronw. Jest to te jonizacja

zwykle stosowana w spektrometrii mas poczonej z chromatografi gazow (GC/MS). Jonizacja
strumieniem elektronw (ang. electron impact, EI) polega na bombardowaniu wizk elektronw
analizowanych czsteczek, znajdujcych si w stanie gazowym (pary) (rysunek 46) w komorze
jonizacyjnej. Jonizacja przebiega w prni rzdu 10-6 do 10-5 Tr (1,3310-4 1,3310-3 Pa). Wizka
elektronw jest emitowana z katody wykonanej z trudno topliwych metali, wolframu lub renu oraz
ogrzewanej prdowo do temperatury kilku tysicy stopni. Energi elektronw mona zmienia
poprzez zmian napicia midzy katod a anod, do ktrej kierowana jest wizka elektronw z
katody. Zwykle wszystkie pomiary wykonuje si przy standardowej energii 70 eV. Strumie
elektronw wchodzi w kolizj z czsteczkami badanego zwizku bdcymi w stanie pary.

W wyniku bombardowania wizk elektronw czsteczek substancji organicznej, bdcej w stanie

gazowym, powstaj jony zwane molekularnymi M+, ktre mog rozpada si, czyli fragmentowa
(rysunek 47).

192
 Jon molekularny jest kationorodnikiem o masie czsteczkowej niemal identycznej jak masa
czsteczkowa zwizku chemicznego, z ktrego powsta. Pomijalna rnica masy wynika z
utraty jednego elektronu z molekuy zwizku.

Rysunek 46. Schemat rda jonw w jonizacji EI [na podstawie Mass spectrometry: a foundation
course. Downard K., 2004]

Rysunek 47. Powstawanie i drogi fragmentacji jonu molekularnego w jonizacji EI, M molekua
badanego zwizku, M+ jon molekularny

Drugi sposb jonizacji, stosowany w technice GC/MS, to jonizacja chemiczna (ang. chemical
ionization, CI). Czynnikiem jonizujcym czsteczki analitu s jony, powstae w wyniku jonizacji wizk

193
elektronw specjalnie do tego celu wprowadzonego do komory jonizacyjnej, gazu reagujcego.
Jonizacja chemiczna nastpuje w wyniku reakcji czsteczki analitu z jonem pierwotnym gazu
reagujcego (rysunek 48). S to reakcje przeniesienia protonu pomidzy jonem pierwotnym a
czsteczk analitu. Gazem reagujcym jest metan, izobutan, amoniak lub woda. Warunki jonizacji s
bardzo agodne, tote fragmentacja zachodzi w niewielkim stopniu.

Rysunek 49. Powstawanie pozornego jonu molekularnego w jonizacji CI - nawiasy prostoktne

oznaczaj, e miejsce lokalizacji adunku nie jest okrelone, M molekua badanego zwizku, [M + H]+
pozorny jon molekularny

W widmach mas uzyskanych technik CI obserwuje si intensywne tzw. pozorne jony

molekularne [M + H]+, ktre su do wyznaczenia masy czsteczkowej badanego zwizku.

W widmach mas uzyskanych technik CI obserwuje si intensywne tzw. pozorne jony molekularne
[M + H]+, ktre su do wyznaczenia masy czsteczkowej badanego zwizku. Masa pozornego jonu
molekularnego jest o jednostk wiksza ni masa czsteczkowa zwizku chemicznego, z ktrego
powsta. Pozorne jony molekularne nazywamy te jonami pseudomolekularnymi. Wad jonizacji CI,
podobnie jak EI, jest konieczno przeprowadzenia analitu w stan pary.
Powstae w komorze jonizacyjnej jony s przypieszane polem elektrostatycznym o potencjale 6000-
8000 V i nastpnie kierowane poprzez szczelin ogniskujc do analizatora. W analizatorze strumie
jonw zostaje rozdzielony wedug stosunku ich masy do adunku (m/z) a nastpnie w detektorze
nastpuje pomiar natenia prdu jonowego, odpowiadajcego rozdzielonym poszczeglnym jonom.
Wynikiem analizy MS jest widmo mas. Widma mas s rejestrowane kolejno dla kadej substancji,
eluujcej si z kolumny chromatograficznej.

Widmo mas EI przedstawia wzgldne intensywnoci jonw fragmentacyjnych oraz jonu

molekularnego, uporzdkowanych wedug stosunku ich masy do adunku (m/z).

194
Fragmentacja jest procesem charakterystycznym dla kadego zwizku i dlatego widmo mas pozwala
na jego identyfikacj. Badan substancj mona zidentyfikowa korzystajc z regu fragmentacji lub
przez porwnanie z widmami mas substancji wzorcowych, zebranych w atlasach (katalogach) widm.
Widmo mas EI zawiera informacj, na jakie fragmenty rozpad si badany zwizek. Jego interpretacja
przypomina prac archeologa, ktry na podstawie zachowanych fragmentw stara si odtworzy
pierwotny ksztat rozbitego naczynia.

Jon molekularny odpowiada masie czsteczkowej tych czsteczek zwizku, ktre s zbudowane
z najlejszych izotopw pierwiastkw, wchodzcych w skad zwizku, np. z izotopw 1H, 12C, 14N,
16
O, 32S, 35Cl i 79Br.

Znalezienie jonu molekularnego pozwala na okrelenie masy czsteczkowej analizowanego zwizku.

Przy zastosowaniu innych technik jonizacji, takich jak CI, APCI (jonizacja chemiczna pod cinieniem
atmosferycznym, ang. atmospheric pressure chemical ionization) czy ESI (jonizacja na drodze
elektrorozpraszania, ang. electrospray ionization), zamiast jonu molekularnego uzyskuje si pozorne
jony molekularne (jony pseudomolekularne), z ktrych rwnie mona obliczy mas czsteczkow
analizowanego zwizku. Wikszo pierwiastkw zawiera dodatkowe izotopy, np. podstawowemu
izotopowi wgla 12C (98,931% rozpowszechnienia) towarzyszy izotop 13C (1,069%). Skad izotopowy
pierwiastkw jest praktycznie stay w naturze. W badanej prbce, czsteczki zwizkw chemicznych
s zbudowane z rnych izotopw danego pierwiastka. Powoduje to, e obok czsteczek
zbudowanych z najlejszych izotopw pierwiastkw wchodzcych w skad danego zwizku
chemicznego bd znajdowa si te czsteczki zawierajce rwnie cisze izotopy, np. metan:
12 1
C H4 (masa czsteczkowa 16 Da) oraz 13C1H4 (17 Da). W spektrometrze mas zostan zmierzone
dokadne masy jonw a wic bd rozrnione te dwa typy czsteczek.

Sygnay w widmie mas odpowiadajce jonom zawierajcym cisze izotopy nazywa si pikami
izotopowymi. Piki izotopowe maj mniejsz intensywno w widmie mas ni piki molekularne,
ze wzgldu na mniejsze rozpowszechnienie ciszych izotopw.

Stosunek intensywnoci jonu molekularnego do piku izotopowego w widmie mas metanu wynosi jak
99 do 1.
Przykadowe widmo mas EI jest zamieszczone na rysunku 50. Nie zawsze jon molekularny jest
widoczny na widmie mas EI. Jeeli dany zwizek chemiczny ulega silnej fragmentacji, to jon
molekularny moe nie by intensywny lub moe w ogle nie wystpowa. W takiej sytuacji okrelenie
masy czsteczkowej badanego zwizku nie jest moliwe i naley zastosowa inn metod jonizacji np.
jonizacj chemiczn. Widmo mas CI zawiera przede wszystkim pozorny jon molekularny natomiast
jony fragmentacyjne s nieliczne i mao intensywne, gdy jest to tzw. agodna technika jonizacji.
Chromatografia gazowa poczona ze spektrometri mas (GC/MS) jest stosowana zarwno do
identyfikacji skadnikw analizowanych prbek jak i do oznaczania ilociowego poszczeglnych
zwizkw. Obie techniki doskonale si uzupeniaj. W technice GC/MS preferowane s kolumny
kapilarne, poniewa umoliwiaj bezporednie wprowadzenie eluatu z kolumny do komory
jonizacyjnej spektrometru. Gazem nonym w technice GC/MS jest hel. Technika GC/MS z jonizacj
strumieniem elektronw bd z jonizacj chemiczn jest stosowana do analizy zwizkw

195
organicznych, ktre mog by przeprowadzone w stan pary. Z tego wzgldu badane substancje
musz wykazywa w temperaturze pokojowej lub po ogrzaniu prno par, co najmniej 10-7 do 10-6
Tr (1,3310-5 1,3310-4 Pa). Jest to istotne ograniczenie tej metody, ktra nie moe by zastosowana
do analizy zwizkw wielkoczsteczkowych bd polarnych, takich jak aminokwasy, peptydy, biaka,
wglowodany czy zwizki jonowe.

Rysunek 50. Widmo mas (EI) 2-heptakozanolu; jon molekularny 2-heptakozanolu ma niewielk
intensywno i nie jest widoczny na zamieszczonym widmie mas natomiast widoczne s jony
fragmentacyjne, w tym jon o wartoci m/z 45, tzw. pik gwny, ktry jest jonem o najwikszej
intensywnoci w widmie

Wysokosprawna chromatografia cieczowa w poczeniu ze spektrometri mas (LC/MS) lub

tandemow spektrometri mas (MS/MS) jest jedn z najpopularniejszych technik do oznaczania
wielu zwizkw organicznych w prbkach o zoonej matrycy. Wrd wielu zalet tej techniki
najwaniejsza to moliwo analizy zwizkw polarnych oraz wielkoczsteczkowych. W technice
LC/MS anality rozdzielane w kolumnie chromatograficznej, ze wzgldu na rne powinowactwo do
fazy stacjonarnej, s eluowane za pomoc odpowiednio dobranych faz ruchomych do komory
jonizacyjnej spektrometru mas. W wielu przypadkach preferowane jest stosowanie rozdzielania w
odwrconym ukadzie faz (RP), przy zastosowaniu kolumn z niepolarn faz stacjonarn oraz
polarnych faz ruchomych. Najczciej stosowane s mieszaniny metanol/woda oraz acetonitryl/woda
przy odpowiednio dobranym pH, z dodatkiem octanu amonu, mrwczanu amonu lub/i kwasu
mrwkowego czy octowego, ktrych dodatek powoduje zwikszenie czuoci oznaczenia i popraw
jonizacji prbki. W technice LC/MS moliwe jest stosowanie rda jonw typu ESI lub komory
jonizacyjnej typu APCI. Jonizacja ESI jest najczciej stosowan technik jonizacji zwizkw polarnych
natomiast dla redniopolarnych i mniej polarnych zwizkw bardziej odpowiednia jest technika APCI.
Jonizacja na drodze elektrorozpraszania, ESI polega na tym, e w silne pole elektryczne wprowadza
si strumie cieczy (eluatu z kolumny chromatograficznej) pod cinieniem atmosferycznym (rysunek
51). Pole elektryczne jest wytwarzane poprzez przyoenie napicia 3 6 kV pomidzy kapilar a
elektrod. Nastpuje odparowywanie kropelek rozpuszczalnika, co powoduje wzrost gradientu
potencjau przy powierzchni kropli i prowadzi w efekcie do desorpcji jonw z kropli. Jonizacja ESI jest
agodn technik jonizacji. Widma mas ESI zawieraj serie wielokrotnie protonowanych pozornych

196
jonw molekularnych [M + zH]z+. Jony z wieloma adunkami s zalet tej metody jonizacji. W
spektrometrze mas mierzona jest warto m/z, czyli warto stosunku masy do liczby adunkw.
Dziki temu, zwizki o duej masie czsteczkowej i na przykad tworzce jony z 2 lub 3 adunkami s
analizowane przy odpowiednio niszych wartociach m/z, odpowiadajcych masie czsteczkowej
podzielonej odpowiednio przez 2 lub 3. Metod ESI mona analizowa zwizki chemiczne o masie
czsteczkowej nawet rzdu 100 300 tys. u.

Rysunek 51. Schemat rda jonw typu ESI [na podstawie Spektrometria mas. de Hoffmann E. et al.,
1998]

Jonizacja APCI
rdo jonw APCI (rysunek 52) skada si z:

kapilary, przez ktr przepywa faza ruchoma z HPLC zamieniajca si w aerozol,

ogrzewanej rurki,
igy wyadowawczej, ktra produkuje jony z powstaego aerozolu.
APCI jest metod jonizacji, w ktrej zachodzi reakcja w fazie gazowej pod cinieniem atmosferycznym
pomidzy jonem pierwotnym a czsteczk analitu. Jest to metoda podobna do jonizacji chemicznej
stosowanej w technice GC/MS. Rnica polega na tym, e jony pierwotne powstaj ze skadnikw
fazy ruchomej poprzez wyadowania koronowe. Zaostrzona elektroda (iga wyadowawcza) wytwarza
gradient potencjau. Przy wyadowaniach koronowych powstae napicie jest wystarczajce, aby
medium ulego czciowej jonizacji natomiast za niskie, aby powsta uk elektryczny. W atmosferze
azotu i w obecnoci wody, pod wpywem wyadowa koronowych zachodz reakcje, ktre prowadz
do powstania jonw pierwotnych. Nastpnie powstaj protonowane pozorne jony molekularne [M +
H]+, poprzez przeniesienie protonu z jonu pierwotnego do czsteczki analitu. Chocia APCI jest

197
agodn technik jonizacji, wystpujc niewielk fragmentacj czsteczek mona wykorzysta do
badania struktury zwizku.

Rysunek 52. Schemat rda jonw typu APCI [na postawie Spektrometria mas. de Hoffmann E. et al.,
1998]

5. Chromatografia z faza ruchom w stanie nadkrytycznym

5.1. Wstp
Chromatografia z faz ruchom w stanie nadkrytycznym (ang. supercritical fluid chromatography,
SFC) jest technik rozdzielania mieszanin zwizkw chemicznych posiadajc waciwoci porednie
midzy chromatografi gazow a cieczow. W literaturze spotyka si rwnie inne terminy na
okrelenie tej techniki, jak: chromatografia fluidalna czy chromatografia nadkrytyczna.
Faz ruchom w stanie nadkrytycznym jest medium znajdujce si w warunkach powyej warunkw
punktu krytycznego, tzn. ma temperatur wysz od temperatury krytycznej i jest pod cinieniem
wyszym od cinienia krytycznego. Punkt krytyczny jest wielkoci charakterystyczn dla danej
substancji. Poniej wartoci punktu krytycznego, w zalenoci od zmian wartoci cinienia i
temperatury, mog istnie trzy stany skupienia substancji gazowa, cieka i staa. Powyej wartoci
cinienia i temperatury okrelanych przez punkt krytyczny, substancja znajduje si w stanie
nadkrytycznym, w ktrym zanika rnica midzy gazem a ciecz. Powyej tego punktu, niezalenie od
zmian cinienia i temperatury, stan skupienia substancji nie zmienia si. Powysze obrazuje diagram
przemian fazowych przedstawiony na rysunku 37 w rozdziale II.5.2.11.
Substancja w stanie nadkrytycznym ma waciwoci porednie midzy gazem a ciecz. Ma ona gsto
zblion do gstoci cieczy, lepko zblion do lepkoci gazu a wspczynnik dyfuzji mniejszy ni dla
gazu, ale wyszy ni dla cieczy. Porwnanie waciwoci gazu, cieczy i pynu w stanie nadkrytycznym
przedstawiono w tabeli 5.
Gsto pynu w stanie nadkrytycznym sprawia, e ma on dobre waciwoci rozpuszczalnikowe,
substancje rozpuszczaj si w nim jak w cieczy, podobnie jak w chromatografii cieczowej. Maa
lepko pynu i niskie napicie powierzchniowe powoduj, e jego wspczynnik dyfuzji jest wyszy ni
dla cieczy, co skutkuje szybszym przenoszeniem masy, podobnie jak w chromatografii gazowej.

198
 Tabela 5. Porwnanie niektrych waciwoci gazu, cieczy i pynu w stanie nadkrytycznym [na
podstawie Podstawy chromatografii, Witkiewicz Z., WNT, Warszawa, 2000]

Parametr Gaz Ciecz Pyn w stanie

nadkrytycznym
Wspczynnik dyfuzji
[cm2/s] 0,01 1,0 (0,5 2,0) 10-5 (0,5 3,3) 10-4
Lepko [g/s cm] (2,0 9,9) 10-4 (0,3 2,4) 10-2 (0,5 3,5) 10-4
Gsto [g/cm3] (0,6 2,0) 10-3 0,8 1,0 0,2 0,9

Wymienione cechy pynu w stanie nadkrytycznym s bardzo korzystne dla procesu

chromatograficznego. Umoliwiaj rozdzielanie substancji o maej trwaoci termicznej, o maej
lotnoci i duych masach czsteczkowych. Chromatografia z faz ruchom w stanie nadkrytycznym
jest technik uzupeniajc, uatwiajc rozdzielanie takich mieszanin substancji, ktrych rozdzielenie
innymi technikami chromatograficznymi jest trudne, dugotrwae lub wrcz niemoliwe.

5.2. Fazy ruchome

W chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym due znaczenie w procesie rozdzielania
maj lotno oraz rozpuszczalno substancji badanych w fazie ruchomej. Wiele substancji w stanie
nadkrytycznym posiada dobre waciwoci rozpuszczania. Rozpuszczalno analitw w pynie
nadkrytycznym zaley przede wszystkim od temperatury i gstoci, a w mniejszym stopniu od
cinienia. Odpowiedni rozpuszczalno oraz niskie parametry punktu krytycznego, umoliwiajce
zastosowanie jako fazy ruchomej w stanie nadkrytycznym posiadaj m.in.: freony, pentan, amoniak,
podtlenek azotu i ditlenek wgla.
Najpowszechniej stosowany jest ditlenek wgla (CO2), przede wszystkim dlatego, e ma nisk
temperatur krytyczn (31,3C), niskie cinienie krytyczne (7,29 MPa), jest nietoksyczny i niepalny
oraz atwy do otrzymania w wysokiej czystoci. Gsto ditlenku wgla w punkcie krytycznym wynosi
0,448 g/cm3. Ditlenek wgla w stanie nadkrytycznym posiada waciwoci protonowo-akceptorowe,
posiada zdolno tworzenia wiza wodorowych i ma nisk polarno (porwnywaln z polarnoci
heksanu). W przypadku stosowania chromatografii z kolumnami kapilarnymi, polarno ditlenku
wgla jest wystarczajca nawet dla zwizkw polarnych. Przy zastosowaniu kolumn pakunkowych,
polarno ditlenku wgla w stanie nadkrytycznym umoliwia chromatografi zwizkw niepolarnych i
redniopolarnych. Dla zwizkw polarnych stosuje si polarne modyfikatory fazy ruchomej, np.
alkohole, aminy, wod. Modyfikator polarny dodany w maych ilociach (110%) do ditlenku wgla
zwiksza rozpuszczalno polarnych analitw, tym samym si elucji fazy ruchomej, selektywno
procesu rozdzielania i sprawno kolumny. Dodatek modyfikatora zmienia jednak parametry
krytyczne ditlenku wgla, np. podwysza temperatur punktu krytycznego. Zbyt wysoka temperatura
moe by powodem rozkadu substancji analizowanych.

5.3. Proces rozdzielania chromatograficznego

W chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym na retencj zwizkw rozdzielanych ma
wpyw znacznie wicej czynnikw ni w pozostaych rodzajach chromatografii. Czas retencji zaley od:
waciwoci analitw,

199
 waciwoci wypenienia kolumny (rodzaju fazy stacjonarnej),
rozmiarw kolumny,
rodzaju, gstoci i prdkoci przepywu fazy ruchomej,
temperatury i cinienia w kolumnie,
rodzaju i iloci zastosowanego modyfikatora.
Zmieniajc parametry procesu, zmienia si waciwoci pynu w stanie nadkrytycznym. Gsto pynu
jest podstawowym czynnikiem wpywajcym na retencj, od gstoci pynu zaley jego zdolno do
rozpuszczania analitw. Gsto pynu w stanie nadkrytycznym ulega zmianie ze zmian cinienia oraz
temperatury. Pyn o mniejszej gstoci ma waciwoci rozpuszczalnikw niepolarnych, natomiast o
duej gstoci waciwoci rozpuszczalnikw bardziej polarnych, jak np. dichlorometanu. Zmiany
gstoci fazy ruchomej powoduj zmiany czasu retencji analitw. Wspczynnik retencji zmniejsza si
ze wzrostem gstoci w staej temperaturze oraz ze wzrostem temperatury przy staej gstoci.
Wpyw wzrostu temperatury na wspczynnik retencji analitu moe by odmienny dla niskich i
wysokich temperatur stanu nadkrytycznego. W niszych temperaturach stanu nadkrytycznego
wspczynnik retencji wzrasta ze wzrostem temperatury, natomiast w wyszych temperaturach
maleje ze wzrostem temperatury dla tych samych analitw. Fakt ten tumaczy si tym, e w niszych
temperaturach stanu nadkrytycznego na retencj ma wpyw gwnie proces rozpuszczania, natomiast
w wyszych temperaturach stanu nadkrytycznego, ktrym towarzyszy wysokie cinienie, wiksze
znaczenie ma lotno analizowanych zwizkw. Przeciwne dziaanie tych dwch efektw: lotnoci i
rozpuszczalnoci powoduje, e w chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym przy staym
cinieniu, w zalenoci wspczynnika retencji od temperatury istnieje wyrane maksimum.
Warunki separacji technik chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym mog by stae lub
zmienne. Opracowanie warunkw procesu rozdzielania polega na:

ustaleniu temperatury kolumny, programowaniu jej wzrostu lub obniania, jak w

chromatografii gazowej,
programowaniu zmiany cinienia i gstoci fazy ruchomej,
ustaleniu skadu fazy ruchomej, zaprogramowanie zmiennoci skadu jak w elucji
gradientowej w chromatografii cieczowej.

Zmienia mona kolejno poszczeglne parametry rozdzielania lub programowa jednoczesne zmiany
wszystkich lub wybranych parametrw.

5.4. Aparatura
Chromatograf
Aparaty do chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym skadaj si z tych samych
podstawowych elementw, co kady chromatograf, gazowy czy cieczowy. Nowym i istotnym
elementem jest restryktor, ktry umoliwia utrzymanie w kolumnie odpowiednio wysokiego cinienia.
Nowoczesne chromatografy, dostpne obecnie na rynku, dostosowane s do pracy w trzech
systemach: z gazow faz ruchom, jako chromatograf gazowy, z faz ruchom w stanie
nadkrytycznym oraz z ciek faz ruchom, jako chromatograf cieczowy. Schemat chromatografu do
pracy z faz w stanie nadkrytycznym przedstawiono na rysunku 53.
Pompy

200
Odpowiedni przepyw fazy ruchomej wymuszaj pompy, takie jak stosowane w chromatografii
cieczowej. W przypadku stosowania ditlenku wgla, w pompach tokowych stosuje si chodzenie
gowic do temperatury -10C, aby zapobiec odparowywaniu fazy ruchomej i utrzymaniu jej w stanie
pynnym. W przypadku stosowania pomp strzykawkowych, toczenie fazy ruchomej odbywa si za
pomoc spronego helu z butli gazowej.
Dozowniki
Do wprowadzania substancji na kolumn stosuje najczciej zawr z ptl, podobnie jak w
chromatografii cieczowej. Do kolumn kapilarnych stosuje si zawory o pojemnoci ptli ok. 0,10,2 L
z dzieleniem strumienia. Waciwe dozowanie prbki, zwaszcza w analizie ilociowej jest trudne i
wymaga waciwego poczenia zaworu z kolumn dla zachowania odpowiedniego cinienia i
temperatury.

Zawr Manometr

Pompa Dozownik

Zbiornik fazy
ruchomej
Kolumna
chromatograficzna
Zbiornik
modyfikatora Termostat

Komputer,
rejestrator

Detektor

Manometr

Restryktor

Rysunek 53. Schemat budowy chromatografu do pracy z faz ruchom w stanie nadkrytycznym

Kolumny i fazy stacjonarne

Do pracy z faz ruchom w stanie nadkrytycznym stosuje si kolumny pakowane, mikropakowane i
kapilarne. Rozmiary kolumn pakowanych s podobne do rozmiarw kolumn stosowanych w
chromatografii cieczowej. Kolumny kapilarne maj rednice 100 m lub mniejsze i dugo do kilku

201
metrw Dla zapewnienia dobrego rozdzielenia na kolumnie kapilarnej, dozowane prbki powinny by
jak najmniejszej wielkoci oraz konieczna jest staa prdko przepywu fazy ruchomej przy
programowanym cinieniu. Kolumny mikropakowane s to pakowane kolumny kapilarne o rednicach
0,25 0,5 mm.
Fazy stacjonarne stosowane w chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym to, podobnie jak w
HPLC, el krzemionkowy i chemicznie zwizane fazy z elem krzemionkowym, jak oktadecylosilan (RP-C18)
czy el krzemionkowy zwizany z grupami propyloaminowymi i inne. Od rodzaju fazy stacjonarnej zaley
zakres temperaturowy pracy z faz w stanie nadkrytycznym. Faza stacjonarna RP-C18 wytrzymuje
temperatur do 150C, natomiast aminopropylowa - tylko 75C. Sprawno kolumn pakowanych jest
porwnywalna ze sprawnoci kolumn do HPLC z tym, e t sam sprawno uzyskuje si przy przepywach
fazy ruchomej 5-10 razy wikszych ni w HPLC, co oznacza zdecydowanie krtsze analizy w chromatografii z
faz w stanie nadkrytycznym. W kolumnach mikropakowanych wypenieniem mog by porowate kulki
szklane, suce rwnie jako nonik dla rnych polimerw siloksanowych.
Detektory
Detektory stosowane w chromatografii gazowej i cieczowej mog by wykorzystane w chromatografii
z faz ruchom w stanie nadkrytycznym. W przypadku zastosowania detektorw do chromatografii
gazowej, pyn wychodzcy z kolumny chromatograficznej musi mie obnione cinienie
(dekompresja), obnion temperatur (schodzony) i przeksztacony w gaz. Przy stosowaniu
detektorw do chromatografii cieczowej, eluat z kolumny moe wpywa do detektora w stanie
nadkrytycznym.

Wrd wielu detektorw uywanych w chromatografii gazowej najwiksze zastosowanie w

chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym ma detektor pomieniowo jonizacyjny
(FID). Na rysunku 54 przedstawiono schemat takiego detektora. Jest on wyposaony
dodatkowo w przetwornik cinieniowy i odpowiednie zawory, umoliwiajce wprowadzanie
eluatu z kolumny w postaci gazu (por.roz. III.3.2 rys. 48). Ograniczeniem detektora FID jest
niemono stosowania modyfikatorw organicznych, gdy tworz one karbojony. W
chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym z detektorem FID modyfikatorami
mog by jedynie zwizki nietworzce karbojonw, jak kwas mrwkowy czy woda.
Detektory optyczne stosowane w chromatografii cieczowej s rwnie wykorzystywane w
chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym. Najczciej, tak samo jak w HPLC, stosowany
jest detektor UV. Jednak najlepszym detektorem w chromatografii z faz ruchom w stanie
nadkrytycznym jest spektrometr mas. Poczenie spektrometru mas z tym rodzajem chromatografii
jest atwiejsze ni poczenie z HPLC.
Restryktory
Aby utrzyma faz ruchom w stanie nadkrytycznym naley zachowa w czasie separacji warunki
cinienia i temperatury powyej wartoci krytycznych. Utrzymanie waciwej temperatury jest
osigane w piecu chromatograficznym, natomiast do uzyskania waciwego cinienia stosuje si
urzdzenia zwane restryktorami. Restryktor znajduje si przed detektorem, jak w przypadku
detektorw stosowanych w chromatografii gazowej, np. FID lub za detektorem, jak w przypadku
detektorw stosowanych w chromatografii cieczowej, np. detektora UV. Najprostszym restryktorem, o
staych parametrach pracy jest przewenie w postaci krtkiego odcinka kapilary na drodze przepywu
fazy ruchomej, jest to restryktor liniowy o dugoci zwykle 1015 cm i rednicy do kilkunastu

202
mikrometrw. W cienkiej kapilarze pyn pynie szybciej ni przez przewd o wikszej rednicy przed
kapilar, co pociga za sob spadek cinienia w kapilarze (rwnanie Bernoulliego). Wane, by spadek
cinienia nastpowa na bardzo krtkim odcinku restryktora, co zapobiega kondensacji analitw.
Restryktory liniowe wykonane s ze szka, kwarcu lub stali nierdzewnej. Zmian warunkw pracy
restryktora liniowego mona osign przez programowanie jego temperatury. Restryktory
mechaniczne lub elektryczne s lepsze od restryktorw liniowych, umoliwiaj pynn regulacj
cinienia, ale s bardzo skomplikowanymi urzdzeniami.

Gazy wylotowe

Elektroda
Poczenie elektryczne
elektrod Pomie palnika
Dysza palnika

Wodr Powietrze

Do przetwornika
cinieniowego

Wylot

Zawr

Z kolumny

Rysunek 54. Schemat detektora pomieniowo-jonizacyjnego (FID) stosowanego w chromatografie z

faz ruchom w stanie nadkrytycznym [na podstawie Podstawy chromatografii, Witkiewicz Z., WNT,
Warszawa, 2000]

5.5. Zastosowanie chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym

Chromatografi z faz ruchom w stanie nadkrytycznym mona stosowa w rnych ukadach
pocze: z chromatografi gazow, cieczow lub ekstrakcj pynem w stanie nadkrytycznym. Ten
rodzaj chromatografii ma zastosowanie do rozdzielenia substancji nielotnych lub nietrwaych
termicznie. Przykadami zastosowania chromatografii z faz ruchom w stanie nadkrytycznym s
oznaczanie lekw i substancji biologicznie czynnych, pestycydw i herbicydw, mieszanin
wglowodorw nasyconych, nienasyconych i aromatycznych w mieszaninach, nitropochodnych i
hydroksynitropochodnych wglowodorw policyklicznych, wolnych kwasw tuszczowych, amin,
materiaw wybuchowych, oligomerw, oznaczanie zwizkw chiralnych i wielu innych zwizkw
chemicznych.

203
6. Literatura
1. Ahuja, S. Chromatography and separation science; Academic Press: 2003.
2. Beesley, T. E.; Buglio, B.; Scott, R. P. W. Quantitative Chromatographic Analysis; Marcel Dekker:
New York, 2000; e-ksiki.
3. Cazes, J.; Scott, R. P. W. Chromatography theory; Marcel Dekker: New York, 2002.
4. de Hoffmann, E.; Charette, J.; Stroobant, V. Spektrometria mas; Wydawnictwo Naukowo-
Techniczne: Warszawa, 1998.
5. Deyl, Z.; Macek, K.; Jank, J. Liquid column chromatography: a survey of modern techniques and
applications; Elsevier: Amsterdam, 1975.
6. Downard, K. Mass spectrometry: a foundation course; The Royal Society of Chemistry:
Cambridge, 2004.
7. Ettre, L. S. Pure Appl. Chem. 1993, 65, 819-872,
http://www.iupac.org/publications/pac/65/4/0819/
8. Fried, B.; Sherma, J. Thin-Layer Chromatography, Marcel Dekker: New York, 1999; e-ksiki.
9. Hahn-Deinstrop, E. Applied Thin-Layer Chromatography: Best Practice and Avoidance of
Mistakes; Wiley-VCH: Weinheim, 2007.
10. Katz, E.; Eksteen, R.; Schoenmakers, P.; Miller, N. (red) Handbook of HPLC; Marcel Dekker: New
York, 1998.
11. Kocjan, R. (red.) Chemia analityczna. Podrcznik dla studentw; Wydawnictwo Lekarskie PZWL:
Warszawa, 2000; Tom 2.
12. Lindsay, S. High performance liquid chromatography; Analytical Chemistry by Open Learning;
John Wiley & Sons Inc.: New York, 1997.
13. Michalski, R. Chromatografia jonowa: podstawy i zastosowania; Wydawnictwo Naukowo-
Techniczne: Warszawa, 2005.
14. Patnaik, P. Dean's Analytical Chemistry Handbook; McGraw-Hill: New York, 2004; e-ksiki.
15. Sadek, P. C. Illustrated pocket dictionary of chromatography; John Wiley & Sons Inc.: New York,
2004.
16. Scott, R. P. W. Techniques and practice of chromatography; Chromatographic Science Series;
Marcel Dekker: New York, 1995.
17. Snyder, L. R.; Kirkland, J. J. Introduction to modern liquid chromatography; John Wiley & Sons Inc.:
New York, 1979.
18. Snyder, L. R.; Kirkland, J. J.; Glajch, J. L. Practical HPLC method development; John Wiley & Sons
Inc.: New York, 1997.
19. Szczepaniak, W. Metody instrumentalne w analizie chemicznej; Wydawnictwo Naukowe PWN:
Warszawa, 1996.
20. Talamona, A. Laboratory Chromatography Guide; Bchi Labortechnik AG: Flawil, Switzerland,
2005.
21. Viehweger, K. H. (red.) Praktyczna chromatografia jonowa; Metrom: Herisau, Szwajcaria, 2010.
22. Willard, H. H.; Merritt, L. J.; Dean, J. A.; Settle, F. A. Instrumental Methods of Analysis;
Wadsworth Publishing Company: Belmont, USA, 1988.
23. Witkiewicz, Z.; Hepter, J. Chromatografia gazowa; Wydawnictwo Naukowo-Techniczne:
Warszawa, 2001.
24. Witkiewicz, Z. Podstawy chromatografii; Wydawnictwo Naukowo-Techniczne: Warszawa, 1992.
25. Witkiewicz, Z. (red.); Soczewiski, E. (red.); Suprynowicz, Z. (red.) Nomenklatura

204
 chromatograficzna; Polskie Towarzystwo Chemiczne: Warszawa, 1996.
26. Zieliski, W.; Rajca, A.; Metody spektroskopowe i ich zastosowanie do identyfikacji zwizkw
organicznych; Wydawnictwo Naukowo-Techniczne: Warszawa, 1995.

205
IV. Techniki elektromigracyjne
1. Wstp
Przyoenie pola elektrycznego do wodnego roztworu elektrolitu zawsze powoduje ruch jonw w
kierunku elektrod o przeciwnym znaku adunku elektrycznego. Jeli w roztworze elektrolitu znajduj
si makroczsteczki obdarzone niezrwnowaonym adunkiem elektrycznym (makrojony), bd si
one rwnie przemieszczay w kierunku elektrod, ale z inn prdkoci. Rnice w prdkoci
poruszania si jonw w polu elektrycznym s podstaw rozdzielania za pomoc technik
elektromigracyjnych.
Migracji jonw i makrojonw towarzysz zjawiska fizyczne okrelane mianem elektrolizy oraz
elektroforezy.
Elektroliza - proces zachodzcy przy powierzchni elektrod, polegajcy na odkadaniu si substancji,
pochodzcych z elektrolitu, na elektrodach pod wpywem przepywajcego prdu (reakcje utleniania i
redukcji). Procesy te opisywane s ilociowo prawami elektrolizy Faradaya.
Elektroforeza (grecki: elektron elektryczno + phoresis przenoszenie) jest zjawiskiem
elektrokinetycznym, zachodzcym w objtoci elektrolitu, w ktrym makroczsteczki obdarzone
niezrwnowaonym adunkiem elektrycznym przemieszczaj si pod wpywem przyoonego pola
elektrycznego w kierunku elektrody o przeciwnym adunku.
Jony w rodowisku wodnym posiadaj otoczk hydratacyjn, czyli ukad dipoli wodnych, zwizanych z
jonem do sabymi siami oddziaywania elektrostatycznego. Zarwno obecno otoczki
hydratacyjnej, jak i jej wielko w istotny sposb wpywaj na moliwo ruchu jonw i makrojonw
w otaczajcym je rodowisku. Waciwoci otoczki hydratacyjnej zale od rozmiaru jonu i
zgromadzonego na nim niezrwnowaonego adunku elektrycznego oraz od waciwoci elektrolitu,
tj. jego siy jonowej oraz wartoci pH. O ile rozmiar jonu i zgromadzony na nim adunek ju nie mog
by zmieniane, to waciwoci elektrolitu mog by atwo modyfikowane dla uzyskania lepszej
rozdzielczoci.
Sia jonowa () - jest funkcj stenia jonw elektrolitu (buforu) i rwna jest poowie sumy iloczynw
ste molowych i kwadratw adunkw wszystkich jonw znajdujcych si w roztworze:

1 n
=
2
c z2
i=1 i i
(1)

gdzie:
n liczba rodzajw jonw,
ci stenie i-tego jonu [mol/dm3],
zi ladunek i-tego jonu.
Dla elektrolitw o niewielkim steniu, gdy odlegoci pomidzy jonami, a cilej pomidzy otoczkami
jonw s due, wzrost wartoci siy jonowej powoduje wzrost wartoci przewodnoci jonowej
elektrolitu, spowodowany wzrostem liczby nonikw adunku elektrycznego. Dalszy wzrost wartoci
siy jonowej powoduje zagszczenia jonw i ich otoczek hydratacyjnych. Pojawiajce si tarcie
pomidzy otoczkami zaczyna odgrywa decydujc rol w ich ruchu w polu elektrycznym, w zwizku
z tym przewodnictwo elektryczne elektrolitu znaczco spada. Wpyw wartoci siy jonowej na
zachowanie jonw w polu elektrycznym naley uwzgldnia przy doborze skadu elektrolitw

206
przeznaczonych do elektroforezy Biorc pod uwag wpyw wartoci siy jonowej na zachowanie
jonw w polu elektrycznym naley podkreli wag doboru skadu elektrolitw przeznaczonych do
elektroforezy. Istotne jest zachowanie rozsdnego stosunku liczby jonw do liczby makrojonw tak,
aby przenoszony przez elektrolit adunek elektryczny rozkada si korzystnie na wszystkie obecne
tam jony. Zbyt wysokie stenie jonw powoduje ograniczenie ich ruchliwoci, natomiast zbyt niskie,
wpywa na niedobr nonikw adunku elektrycznego. Wzrost opornoci elektrycznej roztworu
spowodowany niedoborem nonikw adunku elektrycznego, podczas elektroforezy
przeprowadzanej w warunkach staego natenia prdu, wymusza wzrost napicia niezbdnego dla
przepywu prdu. To z kolei powoduje zwikszenie iloci ciepa wydzielanego w obrbie elektrolitu,
ktra moe mie istotny wpyw na rozdzielczo.
Warto pH, czyli miara stenia jonw wodorowych (hydroniowych) w elektrolicie, ma szczeglnie
istotne znaczenie w odniesieniu do separacji biaek i peptydw. Zwizki te posiadaj wasnoci
amfoteryczne, czyli s obdarzone wypadkowym adunkiem elektrycznym dodatnim albo ujemnym, w
zalenoci od warunkw rodowiskowych. adunek elektryczny biaek pochodzi z, zalenej od
wartoci pH, jonizacji bocznych acuchw grup karboksylowych oraz grup aminowych:
-COOH COO- + H+ - rodowisko zasadowe
-NH2 + H+ -NH3+ - rodowisko kwasowe
Wypadkowy adunek elektryczny czsteczki peptydu lub biaka zaley od wartoci pH roztworu i jest
rwny zero przy wartoci pH, charakterystycznej dla danego biaka lub peptydu, zw. punktem
izoelektrycznym (pI). W rodowisku o wartoci pH < pI biako obdarzone jest adunkiem dodatnim,
wic migruje w kierunku elektrody ujemnej. W celu uzyskania odpowiedniej separacji
amfoterycznych skadnikw mieszaniny, konieczne jest utrzymywanie staej wartoci pH elektrolitu.
W trakcie rozdzielania elektroforetycznego warto pH elektrolitu zmienia si na skutek zachodzcej
elektrolizy wody, w ktrej wyniku na katodzie generowane s jony H+, natomiast na anodzie - OH-.
Dlatego sta warto pH podczas rozdziele elektroforetycznych osiga si poprzez buforowanie
stosowanych elektrolitw.
Zachowanie si makrojonu w polu elektrycznym zaley od jego parametrw. Na makrojon dziaa sia
F, ktra jest proporcjonalna do natenia wytworzonego pola elektrycznego oraz adunku
zgromadzonego na molekule

F = Eq (2)

gdzie:
q adunek zgromadzony na makrojonie [C],
E - natenia pola elektrycznego [V/cm].
Natenie wytworzonego pola elektrycznego E jest proporcjonalne do przyoonego napicia U oraz
odwrotnie proporcjonalne do odlegoci pomidzy elektrodami:

U
E= (3)
I
gdzie:
U przyoone napicie elektryczne (rnica potencjaw),
l - odlego pomidzy elektrodami (przyoonymi potencjaami).

207
Poczenie obu powyszych rwna daje wyraenie na si F dziaajc na makrojon o adunku q
umieszczony w ukadzie, do ktrego przyoone jest napicie U:

qU
F= (4)
I
Z powyszego wzoru wynika, e wzrost wartoci przyoonego napicia U powoduje zwikszenie
natenia wytworzonego pola F, a wic zwikszenie siy dziaajcej na makrojon, co powoduje
szybsz jego migracj. Natomiast zwikszenie odlegoci l pomidzy elektrodami wpywa na
zmniejszenie natenia wytworzonego pola elektrycznego, czyli spowalnia migracj makroczsteczki.
Makrojon osiga prdko graniczn, ktra jest wypadkow oporu rodowiska i wytworzonego pola
elektrycznego. Dla makrojonu o ksztacie kulistym (zgodnie z prawem Stokesa) mona zapisa
nastpujc zaleno:

Eq = 6rv (5)

gdzie:
- lepko rodowiska, w ktrym migruje jon,
r - promie makrojonu,
- prdko ruchu makrojonu.

Podstaw rozdziaw elektroforetycznych jest rnica w prdkociach migracji czstek

obdarzonych adunkiem w polu elektrycznym o staym nateniu.

Prdko migracji v [cms-1] w kierunku elektrod jest rna dla rnych czsteczek i zaley od
natenia pola elektrycznego E [V/cm] oraz ruchliwoci elektroforetycznej danej czsteczki ef :

v = ef E (6)

Prdko przemieszczania si naadowanych elektrycznie makroczsteczek zaley od ich

adunku, rozmiaru, ksztatu oraz oporw ruchu rodowiska. Dana molekua bdzie porusza si
ze sta prdkoci, jeeli w trakcie analizy nastpujce parametry nie ulegn zmianie:
rnica potencjaw,
natenie prdu,
pH rodowiska,
temperatura roztworu,
przewodno roztworu,
lepko roztworu.

Ruchliwo elektroforetyczna ef [m2V-1s-1] jest wielkoci charakterystyczn dla makrojonu w

danym orodku. Jest ona proporcjonalna do wartoci adunku czsteczki q [C], natomiast odwrotnie

208
proporcjonalna do lepkoci rodowiska [kgm-1s-1] i promienia czstki r [cm] (mniejsze czsteczki
obdarzone wikszym adunkiem wykazuj szybsz migracj):

q
ef = (7)
6r
Czynniki wpywajce na ruchliwo elektroforetyczn makrojonu, to:
rodzaj i stenie buforu,
pH buforu,
temperatura,
natenie pola elektrycznego,
waciwoci i rodzaj rozdzielanego materiau.
Przy rozwaaniu procesw zachodzcych w technikach elektromigracyjnych naley pamita o oporze
elektrycznym elektrolitu, opisywanym prawem Ohma. Prawo to przedstawia zaleno pomidzy
przyoonym napiciem U, a pyncym w wyniku tego prdem I [A] oraz oporem elektrycznym
(rezystancj) R [] elektrolitu:
U = IR (8)

Podczas przepywu prdu elektrycznego, w wyniku wykonywania pracy przesunicia adunku

elektrycznego przez pole, na opornociach obwodu tracona jest moc P [W]. Pracy tej towarzyszy
wydzielanie si ciepa, zwanego ciepem Joulea. Ilo wydzielonego ciepa QJ [J] opisuje rwnanie:

QJ = UIt (9)

W czasie trwania elektroforezy nastpuje wzrost temperatury elektrolitu na skutek wydzielania ciepa
Joulea. Zwykle ze wzrostem temperatury obnia si oporno elektrolitu, co powoduje wzrost
prdkoci migracji makrojonw, dlatego utrzymywanie staej temperatury w czasie seapracji jest
konieczne dla osigania zadowalajcych i powtarzalnych rezultatw elektroforetycznej separacji.
Zmienna temperatura podczas separacji elektroforetycznych wpywa na jako uzyskanych wynikw:
powoduje znaczne poszerzenie pasma migrujcej substancji, co obnia rozdzielczo procesu
separacji,
powoduje nierwnomierne przemieszczanie si frontu elektroforezy; makrojony w centralnej
czci nonika, gdzie moe by wysza temperatura ni przy bocznych jego krawdziach,
migruj znacznie szybciej z powodu niszego oporu ni ich odpowiedniki znajdujce si poza
centrum nonika.
Zbyt wysoka temperatura moe powodowa tzw. przegrzanie ukadu, co moe by szkodliwe
zarwno dla rozdzielanych substancji jak i samego sprztu:
moe nastpi strata analitw, np. na skutek ich denaturacji i inaktywacji w podwyszonej
temperaturze,
moe nastpi uszkodzenie zestawu do elektroforezy, na skutek termicznych odksztace lub
nawet pkni niektrych jego elementw.
Dobrej jakoci aparaty do elektroforezy maj moliwo odprowadzania lub rozpraszania nadmiaru
ciepa z ukadu, w celu zapobieenia ewentualnym zniszczeniom.

209
2. Podzia technik elektroforetycznych
Ze wzgldu na sposb prowadzenia separacji stosowane w praktyce metody elektroforetyczne s
pochodnymi lub kombinacjami trzech podstawowych rodzajw separacji (Rysunek 1):

elektroforeza strefowa (ZE - zone electrophoresis),

izotachoforeza (ITP - isotachphoresis),
ogniskowanie izoelektryczne (IEF - isoelectric focusing).

Rysunek 1. Zasady rozdziele: a) - elektroforeza strefowa, b) izotachoforeza, c) - ogniskowanie izoelektryczne

Elektroforeza strefowa - rozdzielanie makrojonw odbywa si na podstawie rnic w ich ruchliwoci

przy staej wartoci pH (stay ukad buforw) i przy staym nateniu pola elektrycznego.
Izotachoforeza - rozdzielanie prowadzone jest w niecigym systemie buforw. Zjonizowana prbka
wdruje pomidzy szybkim elektrolitem wiodcym a wolnym elektrolitem koczcym.
Makrojony o najwyszej ruchliwoci elektroforetycznej poruszaj si tu za jonami elektrolitu

210
wiodcego, a te o najmniejszej ruchliwoci elektroforetycznej wdruj bezporednio przed jonami
elektrolitu koczcego.
Ogniskowanie izoelektryczne - metoda stosowana do rozdzielania substancji amfoterycznych np.
biaek i peptydw, ktrych adunek elektryczny zaley od wartoci pH. Rozdzielanie prowadzone jest
w gradiencie pH. Przy pH powyej i poniej wartoci punktu izoelektrycznego czstka jest obdarzona
adunkiem, wic przesuwa si w kierunku anody lub katody do momentu dotarcia do punktu, w
ktrym warto pH odpowiada waciwemu jej punktowi izoelektrycznemu. W punkcie tym
sumaryczny adunek czstki substancji amfoterycznej wynosi zero, wic jest czstk obojtn i
zatrzymuje si (ogniskuje w jednym miejscu).
Ze wzgldu na rodowisko, w ktrym poruszaj si jony wyrnia si:

elektroforez swobodn - bezporednio w roztworze elektrolitu (np. elektroforeza kapilarna),

elektroforez w noniku elektroforetycznym (bibua, azotan celulozy, agaroza,
poliakryloamid i innych), wypenionym odpowiednim elektrolitem.

Elektroforeza swobodna, nie liczc elektroforezy kapilarnej, jest rzadko uywana, ze wzgldu na
dyfuzj termiczn oraz konwekcj rozdzielanych czstek. Skutkiem tego jest rozmycie prbki jeszcze
przed rozpoczciem waciwego procesu separacji, w zwizku z tym uzyskuje si bardzo sab jako
rozdzielania analizowanych substancji. Problem ten zosta rozwizany przez zastosowanie nonika,
np. elu lub bibuy, stabilizujcego elektrolit, ale rwnie wpywajcego na lepsz separacj
makroczsteczek przez ich dodatkowe frakcjonowanie na zasadzie chromatografii wykluczania.
Spord wymienionych powyej nonikw najpowszechniej wykorzystywany jest obecnie el
poliakrylamidowy (ze wzgldu na jego waciwoci), ktry zosta szczegowo omwiony w
podrozdziale 2.2.1.
Ze wzgldu na geometri nonika elektroforetycznego (przestrze, w ktrej umieszczony jest nonik
nazywa si komor elektroforetyczn) mona wyrni:

elektroforez kapilarn (ang. capillary electrophoresis),

elektroforez elow na paszczynie: pionow (ang. vertical electrophoresis) oraz poziom
(ang. horizontal electrophoresis).

2.1. Elektroforeza kapilarna

Pocztki elektroforezy kapilarnej sigaj lat 30 ubiegego wieku, kiedy to szwedzki uczony Tisselius
zbudowa zestaw skadajcy si z rurki w ksztacie litery U, do ktrej kocw przyczy rdo
zasilania prdem elektrycznym a w rodku umieci mieszanin biaek. W wyniku tego eksperymentu
zaobserwowa, e biaka migruj do kocw elektrod z rnymi prdkociami. Uzyskiwane przez
niego rozdzielenia nie byy zbyt udane na skutek maej rozdzielczoci, wynikajcej z dyfuzji termicznej
oraz konwekcji rozdzielanych czsteczek. Z powodu tych ogranicze, przez nastpne lata rozwj tej
techniki dotyczy tylko elektroforezy, w ktrej elektrolit umieszczany by we wspomnianych ju
wczeniej nonikach. Dopiero w latach 70 ubiegego wieku, po zastosowaniu kapilar o bardzo maej
rednicy, rozpocz si szybki rozwj elektroforezy kapilarnej. Schemat zestawu do elektroforezy
kapilarnej przedstawiony jest na rysunku 2. Aparat skada si z dwch zbiornikw z elektrolitem
podstawowym, w ktrym zanurzone s koce kapilary oraz dwie elektrody platynowe z podczonym
napiciem prdu elektrycznego.

211
 Rysunek 2. Schemat zestawu do elektroforezy kapilarnej

Niewielka ilo analizowanego materiau, rzdu kilku nanogramw, zawarta w roztworze prbki o
objtoci 10-100 nL, dozowana jest do anodowego koca kapilary. Do dozowania tak maych objtoci
prbki, najczciej wykorzystywany jest jeden z trzech podstawowych sposobw (rysunek 3):

hydrodynamiczno-grawitacyjny (najczciej stosowany), polega na umieszczeniu anodowego koca

kapilary w naczyniu z roztworem prbki, znajdujcym si wyej wzgldem katodowego koca kapilary,
hydrodynamiczno-cinieniowy, polega na umieszczeniu wlotu kapilary w szczelnym zbiorniku
z prbk i zastosowaniu wysokiego cinienia, lub umieszczenie wylotu kapilary w szczelnym
zbiorniku, w ktrym wytworzone jest podcinienie,
elektrokinetyczny, polega na umieszczeniu anody w naczyniu z prbk i przyoeniu do
kocw kapilary napicia rzdu 5 kV - rozdzielana mieszanina zostaje wprowadzona do
kapilary dziki przepywowi elektroosmotycznemu.

kapilara
a) [lub prnia]

cinienie
prbka

b) kapilara

prbka

c)
+ -
kapilara

prbka

Rysunek 3. Sposoby dozowania prbek do kapilary: a) hydrodynamiczno-cinieniowy;

b) hydrodynamiczno-grawitacyjny; c) elektrokinetyczny

212
W elektroforezie kapilarnej powszechnie wykorzystuje si kapilary ze szka krzemowego o
wewntrznej rednicy 20-100 m i dugoci 20-100 cm (rysunek 4). W zalenoci od rodzaju
elektroforezy, stosuje si kapilary z wypenieniem (el) lub bez wypenienia. Wewntrzna
powierzchnia kapilar, w zalenoci od potrzeb, moe by pozostawiona bez obrbki lub pokryta
substancjami chemicznymi (polimetylosiloksanem, glikolem polietylenowym, polietylenem, amidem
poliakrylowym, metyloceluloz i in.). Waciwoci rozdzielcze kolumny zale od uytej substancji, np.
uycie polimetylosiloksanu zwiksza przepyw elektroosmotyczny, natomiast uycie glikolu
polietylenowego przepyw ten zmniejsza.

Otoczka
poliimidowa
Stopiona
krzemionka

Wntrze
kapilary

Rysunek 4. Przekrj poprzeczny kolumny kapilarnej

Do obu kocw kapilary zanurzonych w pojemnikach z odpowiednimi elektrolitami (buforami)

przykadane jest wysokie napicie (do 30 kV i 10 mA), co powoduje powstanie we wntrzu kapilary
pola elektrycznego o wartoci do 500 V/cm.
W zwizku z ma wewntrzn objtoci kapilary, ktra limituje ilo wprowadzanych analitw,
elektroforeza kapilarna wymaga ekstremalnej czuo detektora. Detekcja prowadzona jest u wylotu
kapilary przy pomocy detektorw o konstrukcji zblionej do przepywowych detektorw stosowanych
w chromatografii cieczowej. Oczywicie, w zwizku z ma iloci wprowadzonych analitw,
wykrywalno ich jest znaczco mniejsza w porwnaniu do klasycznej chromatografii cieczowej.
Zestawienie sposobw detekcji wykorzystywanych w elektroforezie kapilarnej przedstawione jest w
tab. 1. Czas analizy jednej prbki wynosi okoo 10-20 minut. Proces separacji jest sterowany a dane
zbierane za pomoc komputera.

Tabela. 1. Zestawienie najczciej stosowanych detektorw w elektroforezie kapilarnej

Detektor Wymagania Identyfikacja granica oznaczalnoci

[mol]
UV/Vis Obecno chromoforw Tak/nie 10-5-10-7
Z laserowym Obecno fluoroforw Nie 10-13-10-16
wzbudzeniem (derywatyzacja)
fluorescencji
MS - Tak 10-8-10-10
Amperometryczny - Nie 10-7-10-10
Konduktometryczny adunek Nie 10-7-10-9

213
Kapilarne techniki elektroforetyczne s stosunkowo blisko spokrewnione z chromatografi cieczow.
Posiadaj szereg zalet w porwnaniu z HPLC, np. wysok sprawno i szybko rozdzielania, trwae i
uniwersalne kapilary, moliwo separacji bardzo maych iloci substancji i w zwizku z tym,
niewielkie zuycie rozpuszczalnikw. Wad kapilarnych metod elektroforetycznych jest maa czuo,
wynikajca ze wspomnianych wczeniej niewielkich ste analizowanych substancji i maej objtoci
prbki wprowadzanej do detektora, zamontowanego u wylotu kapilary. Szacuje si, e czuo
elektroforezy kapilarnej jest 10-100 razy mniejsza od HPLC.
W elektroforezie kapilarnej, podobnie jak w chromatografii gazowej lub cieczowej, sprawno
elektroforezy mona wyrazi liczb pek teoretycznych, ktra moe by wyliczona z wyraenia:

ef V
N= (10)
2D
gdzie:
D - wspczynnik dyfuzji.
Z rwnania wynik, e liczba pek jest proporcjonalna do przyoonego napicia, jednak naley
pamita, e przyoenie wysokiego napicia powoduje wydzielanie duej iloci ciepa co znacznie
obnia sprawno ukadu. W HPLC liczba pek teoretycznych wynosi najczciej do 10 000,
natomiast w elektroforezie nawet do 250 000.
Sprawno mona rwnie wyliczy bezporednio z zarejestrowanego elektroforegramu
wykorzystujc zalenoci znane z chromatografii:
2 2
t t
N = 5,545 m lub N = 16 m (11)
W1 / 2 Wb
gdzie:
tm- czas migracji,
W1/2 szeroko piku w poowie wysokoci,
Wb szeroko piku w podstawie.
Rozdzielczo Rs dwch sygnaw moe by obliczona ze wzoru:

ef
RS = 1 / 4 N (12)
ef
gdzie:
ef - rnica w ruchliwoci elektroforetycznej dwch rozdzielanych substancji,
ef - rednia ruchliwo elektroforetyczne dwch rozdzielanych substancji.
ktry po uwzgldnieniu rwnania 10 moe by przedstawiony w postaci:

ef V
R S = (0,177 ) (13)
ef D
Selektywno w elektroforezie kapilarnej mona wyznaczy z zalenoci:
t m 2 t0
= (14)
tm1 t0

214
gdzie:
tm1 i tm2 czasy migracji ssiednich pikw,
t0 czas migracji substancji, ktrej czsteczki nie maj adunkw.

Zjawisko elektroosmozy
W elektroforezie kapilarnej na szybko migracji analitw w kapilarze, oprcz wspomnianej wczeniej
ruchliwoci elektroforetycznej, decydujcy wpyw ma zjawisko osmozy i zwizana z nim ruchliwo
elektroosmotyczna eo. Wysokie napicie przyoone do kocw kapilary wypenionej roztworem
elektrolitu, powoduje tzw. przepyw elektroosmotyczny, czyli przemieszczanie si caej masy
elektrolitu w kierunku jednej z elektrod. Przepyw elektroosmotyczny zaley od adunkw
rozmieszczonych na powierzchni kapilary. Obecno tych adunkw a take ich rodzaj i ilo zwizana
jest z jonizacj cianki kapilary lub adsorpcj jonw buforu. Wewntrzna cianka kapilary wykonana
ze stopionej krzemionki i przy pH > 3 posiada adunek ujemny, z powodu dysocjacji grup silanolowych
SiOH (przy niszej wartoci pH jonizacja nie jest cakowita). Kationy elektrolitu podstawowego
przycigane s przez adunki ujemne na ciankach kapilary (SiO-), w wyniku czego na granicy faz
roztwr/kapilara powstaje wewntrzna (zwizana) oraz zewntrzna (dyfuzyjna) warstwa kationw,
tworzca podwjn warstw elektryczn (rysunek 5). Kationy warstwy zewntrznej przycigane s
przez ujemn katod, a poniewa kationy te s solwatowane przez czsteczki rozpuszczalnika
porywaj one razem ze sob ca mas roztworu znajdujcego si w kapilarze.

cianka kapilary
- - - - - - - - - - - - - - - - Wewntrzna (zwizana)
+ + + + + + + + + + + + + + + warstwa kationw
+ + + + +
Zewntrzna (dyfuzyjna)
+ + + + warstwa kationw

+ + + Gbia roztworu
+
+

Rysunek 5. Schematyczne przedstawienie podwjnej warstwy elektrycznej w kapilarze

elektroforetycznej

Pomidzy warstwami wytwarza si tzw. potencja zeta ( ), ktrego warto mona wyliczy z
zalenoci:
4e
= (15)

gdzie:
e adunek jednostki powierzchni,
- grubo dyfuzyjnej warstwy podwjnej,
- staa dielektryczna.

215
 Natomiast szybko przepywu elektroosmotycznego z uwzgldnieniem potencjau mona wyrazi
wzorem:
E
eo = (16)
4
Szybko przepywu elektroosmotycznego jest zazwyczaj wiksza od szybkoci elektroforetycznych
poszczeglnych jonw, co powoduje, e zarwno kationy, czstki obojtne jak i aniony poruszaj si
w kierunku katody. Szybko, z jak dany jon porusza si w kierunku katody vobs [cm/s] (szybko
obserwowana) jest wypadkow ruchliwoci elektroforetycznej oraz elektroosmotycznej i jest
opisywana nastpujc zalenoci:

v obs = ( ef + eo ) E (17)

gdzie:
eo ruchliwo elektroosmotyczna,
ef ruchliwo elektroforetyczna.
W klasycznej elektroforezie ruchliwo elektroforetyczna anionw ef przyjmuje wartoci ujemne
(aniony wdruj w kierunku anody, a kationy w kierunku katody). W elektroforezie kapilarnej, w
wyniku istnienia przepywu elektroosmotycznego oraz faktu, e w wikszoci przypadkw ruchliwo
elektroosmotyczna przyjmuje wiksz warto od ruchliwoci elektroforetycznej, w detektorze na
kocu kapilary pojawiaj si kolejno wszystkie czsteczki analitu, niezalenie od zgromadzonego na
nich adunku (rysunek 6). I tak kolejno, w jakiej rozdzielane czsteczki docieraj do katodowego
koca kapilary przedstawia si nastpujco:
mae obdarzone duym adunkiem kationy,
wiksze kationy o mniejszym adunku,
nierozdzielone czsteczki obojtne,
due aniony o maym adunku,
mae aniony posiadajce duy adunek elektryczny.

Anoda (+) -- - - n + + ++ Katoda (-)

Kierunek przepywu elektroosmotycznego

Prdko Prdko Prdko
elektroosmotyczna elektroforetyczna obserwowana

kation
+ =
czsteczka
obojtna
+ =
anion + =
Rysunek 6. Kolejno czsteczek docierajcych do katody w elektroforezie kapilarnej

216
Przepyw elektroosmotyczny jest generowany przy ciankach kapilary na caej jej dugoci, dlatego te
charakteryzuje si on sta szybkoci przepywu w caym jego przekroju. Paski profil przepywu
elektroosmotycznego jest bardziej korzystny od przepywu laminarnego, spotykanego, np. w
technikach chromatograficznych (rysunek 7). W przepywie laminarnym, ktry jest wymuszany przez
zastosowanie cinienia na jednym z kocw kapilary, roztwr znajdujcy si w rodku porusza si
szybciej ni roztwr bdcy bliej cianek, co powoduje poszerzenie strefy zajmowanej przez prbk
w kapilarze i co za tym idzie rwnie poszerzenie sygnaw z detektora.

a) b)

Rysunek 7. Porwnanie HPLC i CE; a) - porwnanie przepywu elektroosmotycznego (CE) i

laminarnego (HPLC), b) porwnanie uzyskiwanych rozdzielczoci

Analiza ilociowa i jakociowa

W elektroforezie kapilarnej analiza ilociowa i jakociowa wykonywana jest w podobny sposb jak w
chromatografii gazowej czy cieczowej. Identyfikacji dokonuje si poprzez porwnanie czasw
migracji oznaczanych substancji z czasami migracji odpowiednich wzorcw lub poprzez poczenia z
detektorami takimi jak spektrometr mas lub spektrofotometr UV-Vis. Analiz ilociow wykonuje si
wykorzystujc metod krzywej kalibracyjnej, metod wzorca wewntrznego lub metod wzorca
zewntrznego opisanych w rozdziale III. Techniki chromatograficzne.

Zalety elektroforezy kapilarnej

Kapilarne techniki elektromigracyjne, ktre s blisko spokrewnione z HPLC, posiadaj szereg
istotnych zalet, z ktrych na podkrelenie zasuguj:
moliwo analizowania zwizkw zarwno o duej jak i o maej masie czsteczkowej,
obdarzonych adunkiem lub obojtnych,
dua czuo metody (przy wykorzystaniu odpowiednich detektorw) umoliwiajca
analizowanie bardzo maych iloci substancji,
stosunkowo dua niezawodno, wysoka sprawno i selektywno,
atwo przygotowania prbek (czsto wystarczy odpowiednie rozcieczenie),
krtki czas analizy i moliwo automatyzacji rozdziele,
niewielka ilo odczynnikw potrzebna do analizy,
trwae i dugo przydatne do analizy kapilary.

217
2.1.1. Strefowa elektroforeza kapilarna
Strefowa elektroforeza kapilarna (ang. capillary zone electrophoresis, CZE) - podstawowa i
najczciej wykorzystywana odmiana elektroforezy kapilarnej, ktra zostaa omwiona na pocztku
tego podrozdziau (Elektroforeza kapilarna). Separacja polega na wykorzystaniu rnicy w
szybkociach migracji poszczeglnych jonw. Technika ta ma zastosowanie do rozdzielenia substancji
posiadajcych adunek. Niemoliwe jest jej wykorzystanie do rozdzielania substancji elektrycznie
obojtnych.

2.1.2. Micelarna elektrokinetyczna chromatografia kapilarna

Micelarna elektrokinetyczna chromatografia kapilarna (ang. micellar electrokinetic capillary
chromatography, MEKC) - odmiana elektroforezy kapilarnej pozwalajca na separacj czsteczek
obojtnych, aczkolwiek moe by rwnie wykorzystywana do czstek obdarzonych adunkiem.
Stosowane s jonowe zwizki powierzchniowo czynne (surfaktanty), ktre w steniu
przekraczajcym krytyczne stenie micelarne tworz micele. Gdy w roztworze brak jest surfaktanta,
lub jego stenie nie jest wystarczajce, aby powstay micele, czstki obojtne poruszaj si w
kierunku katody z szybkoci rwn szybkoci przepywu elektroosmotycznego. W przypadku
obecnoci miceli, rozdzielana substancja elektrycznie obojtna ulega podziaowi midzy roztwr
elektrolitu, a niepolarne wntrze miceli (separacja dokonuje si na podstawie rnic staych podziau
analitw elektrolit/hydrofobowa faza wntrza miceli (rysunek 8). Substancje hydrofobowe
przemieszczaj si wewntrz miceli z prdkoci inn ni znajdujce si w roztworze substancje
hydrofilowe. Polarno elektrolitu (faza wodna) moe by zmieniana w zalenoci od potrzeb przy
wykorzystaniu rnych modyfikatorw organicznych np. metanol lub acetonitryl. Rwnie
waciwoci fazy micelarnej mog by modyfikowane przez dobr odpowiednich detergentw, np.
dodecylosulfonian sodu (SDS), sole kwasw ciowych, sole amoniowe z acuchem
wglowodorowym. Przy najczciej stosowanym surfaktancie anionowym SDS, micele posiadaj
sumaryczny adunek ujemny, co powoduje, e czsteczka niepolarna, znajdujca si we wntrzu
takiej miceli porusza si wolniej od przepywu elektroosmotycznego. Wynika to z faktu, i kierunek
migracji miceli i przepywu elektroosmotycznego s przeciwne. Jednak przepyw elektroosmotyczny
jest wikszy od ruchliwoci miceli i przenosi je wraz z zawartymi analitami w kierunku katody.

czsteczka obojtna

Rysunek 8. Schemat tworzenia miceli z czsteczek surfaktanta

Rozdzielczo w MEKC moe by przedstawiona za pomoc rwnania:

218

1 t0 t
N 1 k2 mc

RS =
4 1 + k 2 1 + t0 k (18)
t 1
mc

gdzie:
t0 czas migracji markera przepywu elektroosmotycznego, najczciej metanolu,
tmc czas migracji miceli.

2.1.3. Kapilarna elektroforeza elowa

Kapilarna elektroforeza elowa (ang. capillary gel electrophoresis, CGE) - wypenienie kapilary
stanowi el, ktry dziaa jak sito molekularne. Najczciej stosowany jest omawiany ju wczeniej el
poliakryloamidowy, ktrego usieciowanie dobiera si na podstawie wielkoci rozdzielanych moleku.
Skadniki prbki migruj wzdu kapilary z szybkoci zalen od ich wielkoci (mniejsze migruj
szybciej). Separacja skadnikw mieszanin odbywa si najczciej w wyniku mechanizmu mieszanego,
tzn. rozdzielania w elektroforezie kapilarnej zwizanego z obecnoci adunku na molekule oraz
efektu wykluczania, zwizanego z obecnoci porowatego elu w kapilarze.

2.1.4. Ogniskowanie izoelektryczne

Ogniskowanie izoelektryczne (ang. capillary isoelectric focusing, CIEF) - modyfikacja elektroforezy
wykorzystywana jest do separacji czsteczek amfiprotycznych (posiadajcych zarwno adunki
dodatnie jak i ujemne, jak aminokwasy, peptydy, biaka). Przy pewnej charakterystycznej wartoci pH
(punkt izoelektryczny pI, charakterystyczny dla kadego biaka lub peptydu), adunek dodatni
czsteczki jest rwny adunkowi ujemnemu, w zwizku z tym elektrycznie obojtna molekua nie
migruje w polu elektrycznym. W metodzie tej kapilara wypeniona jest roztworem buforowym o
rnej wartoci pH (gradient pH we wntrzu kapilary pozostaje stay w czasie analizy). Prbka
wprowadzana jest do koca kapilary o niszej wartoci pH, skadniki mieszaniny posiadajce adunek
dodatni wdruj w kierunku katody i detektora. Dany skadnik mieszaniny zatrzymuje si, gdy dotrze
do tej czci kapilary, gdzie warto pH odpowiada jego punktowi izoelektrycznemu. Jeeli czsteczki
w wyniku dyfuzji przejd do ssiedniej strefy, to w wyniku zmiany pH, uzyskaj adunek i ponownie
migruj do strefy izoelektrycznej. W wyniku ogniskowania anality skupiane s w wskich strefach w
kapilarze, skd mog by atwo usuwane za pomoc pneumatycznej pompy. Proces monitorowania
uzyskanych stref odbywa si w detektorze umieszczonym na kocu kapilary.
Rozdzielczo CIEF moe by przedstawiona za pomoc wyraenia:

D (dpH / dx )
pI = 3 (19)
E ( d / dpH )
gdzie:
pI - rnica pI pomidzy dwoma ssiednimi pasmami amfolitw,
D - wspczynnik dyfuzji amfolitu,
E - natenie pola elektrycznego,
dpH / dx - gradient pH,
d / dpH - spadek mobilnoci.

219
Z powyszego rwnania wynika, e rozdzielczo tej techniki moe by poprawiona poprzez zwikszenie
natenie pola elektrycznego, obnienie wspczynnika dyfuzji, wski gradient pH oraz wysoki spadek
mobilnoci.

2.1.5. Izotachoforeza kapilarna

W izotachoforezie kapilarnej (ang. capillary isotachophoresis, CITP) wykorzystuje si dwa rne ukady
buforowe. Prbk umieszcza si pomidzy elektrolitem wiodcym, o wikszej ruchliwoci od jonw prbki a
terminujcym, o mniejszej ruchliwoci od jonw prbki. Podczas jednorazowej analizy technik
izotachoforezy mog by rozdzielane tylko jony o tym samym znaku. Elektrolit podstawowy dobiera si w
taki sposb, aby kation lub anion elektrolitu wiodcego (ang. Leading Electrolyte, LE) i terminujcego (ang.
Terminating Electrolyte, TE) mia odpowiednio najwysz i najnisz ruchliwo () w stosunku do
oznaczanych analitw, co oznacza, e warunkiem rozdzielenia metod izotachoforezy jest nastpujca
zaleno
LE > analitu > TE
Skadniki prbki rozdzielaj si zgodnie ze swoj ruchliwoci w formie odrbnych stref. W wyniku
przeprowadzonego rozdzielenia otrzymuje si izotachoferogram schodkowy. Wysoko schodka,
mierzona od podstawy, czyli sygnau (schodka) elektrolitu wiodcego jest charakterystyczna dla danego
jonu i na podstawie jej porwnania z wysokoci wzorca mona zidentyfikowa badan substancj.
Szeroko danego schodka jest proporcjonalna do iloci analitu i jest wykorzystywana do oznacze
ilociowych. Schemat aparatu to przeprowadzania izotachoforezy kapilarnej przedstawiono na rysunku
9.
4

1
2

8
1
3
9

Rysunek 9. Analizator elektroforetyczny ItaChrom EA 101 (Merck): 1 zbiornik elektrolitu terminujcego,

2, 3 zbiorniki elektrolitu wiodcego, 4 - zawr dozujcy z ptl, 5 kolumna wstpnego rozdzielania
(przedkolumna) w obudowie, 6 blok rozgaziajcy z zaworem, 7 kolumna analityczna w obudowie, 8
detektor spektrofotometryczny, 9 blok rozdzielajcy z zaworem, 10 detektor konduktometryczny
przedkolumny, 11 detektor konduktometryczny kolumny analitycznej, 12 zbiornik na zlewki

220
Izotachoforeza, jako jedna z najszybciej rozwijajcych si technik elektromigracyjnych, znajduje
zastosowanie w wielu dziedzinach, m.in. w oznaczeniach zanieczyszcze rodowiska oraz analizie
ywnoci, ktre z punktu widzenia chemii analitycznej zajmuj si analiz niejednorodnych prbek
zawierajcych trudne do usunicia matryce.
Przykadowy izotachoferogram z separacji mieszaniny anionw jest przedstawiony na rysunku 10.
Szeroko schodka (L) oznacza dugo kroku odpowiadajca jednemu analitowi i jest proporcjonalna
do jego zawartoci w prbce badanej. Do oznacze jakociowych wykorzystuje si wysoko sygnau
danego analitu (h - wysoko mierzona od podstawy elektrolitu wiodcego) oraz wysoko cakowit
mierzon od podstawy, czyli elektrolitu wiodcego, do maksimum krzywej, czyli elektrolitu
terminujcego (H - elektrolitu terminujcego). W celu zidentyfikowania analitu naley wykona
analiz wzorcw oraz oznaczanych analitw, a nastpnie porwna wartoci stosunku h/H (wzgldna
wysoko kroku), ktra jest charakterystyczna dla danego analitu.

Rysunek 10. Izotachoferogram przedstawiajcy rozdzielenie mieszaniny anionw: 1 NO3- 2 ClO3-, 3

PF6-, 4 [N(CN)2]-, 5 [F3CSO3]- 6 HPO4 2-, 7 [(F3CSO2)2N]-. Ukad buforw: LE 10 mM Lhistydyna,
10 mM Lhistydyny monochlorowodorek; TE 5 mM kwas glutaminowy, 5 mM Lhistydyna; detekcja
konduktometryczna

2.1.6. Elektrochromatografia kapilarna

Elektrochromatografia kapilarna (ang. capillary electrochromatography, CEC) jest poczeniem
elektroforezy kapilarnej (CE) i wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Technika ta oferuje
poczenie wysokiej sprawnoci CE z szerokim zakresem parametrw, ktre mog by modyfikowane
w HPLC, zwaszcza z moliwoci doboru rnych faz stacjonarnych oraz stosowania gradientu fazy
ruchomej.
Migracja analitw przez kolumn odbywa si dziki przepywowi elektroosmotycznemu, ktry zaley
od natenia pola elektrycznego, rodzaju wypenienia kolumny, skadu fazy ruchomej oraz pH i siy
jonowej zastosowanego buforu. Wykorzystanie przepywu elektroosmotycznego, w odrnieniu od
przepywu hydraulicznego w HPLC, umoliwia stosowanie kolumne z wypenieniami rzdu 3 m, co
znacznie polepsza rozdzielczo tej techniki. Wykorzystywane fazy stacjonarne i fazy ruchome s

221
podobne do RP HPLC (modyfikacje C8 i C18 jako fazy stacjonarne oraz wodne bufory z organicznymi
modyfikatorami jako fazy ruchome).
W tabeli 2 przedstawiono zastosowanie omwionych modyfikacji elektroforezy kapilarnej do analizy
rnych klas zwizkw chemicznych.

Tabela. 2. Zastosowanie odmian elektroforezy kapilarnej do analizy rnych klas zwizkw

chemicznych
Elektroforeza Ogniskowanie Kapilarna Micelarna Elektrochromatografia Izotachoforeza
strefowa (CZE) izoelektryczne elektroforeza elektrokinetyczna kapilarna (CEC) kapilarna (CITP)
(CIEF) elowa (CGE) chromatografia
kapilarna ( MEKC)

Jony Peptydy Kwasy Mae czsteczki Mae molekuy Jony

nukleinowe
Mae molekuy Biaka Peptydy Peptydy Mae molekuy

Peptydy Biaka Peptydy

Biaka Wglowodany Biaka

Wglowodany

2.2. Elektroforeza elowa na paszczynie

Elektroforeza elowa na paszczynie (elektroforeza pytowa) jest najpopularniejsz odmian
elektroforezy ze wzgldu na stosunkowo niewielki koszt aparatury i szeroki wachlarz zastosowa.
Podstaw tej techniki jest obecno nonika (el poliakryloamidowy, el agarozowy, bibua, azotan
celulozy) wypenionego elektrolitem. Najczciej, jako nonik wykorzystuje si ele
poliakryloamidowe lub agarozowe w postaci pyt umieszczonych pomidzy pytkami szklanymi. W
zalenoci od uoenia pyt wyrniamy elektroforez elow pionow lub poziom (rys. 11).

a) b)

Rysunek 11. Elektroforeza pytowa; a) pionowa, b) pozioma

222
W wyniku rozdzielania substancje wystpuj w postaci prkw (pasm) na pytach nonika (rysunek
12).

Rysunek 12. Przykadowe rozdzielenie elektroforetyczne

Rozdzielenie elektroforetyczne z wykorzystaniem eli skada si z kilku etapw:

przygotowanie elu o odpowiednim usieciowaniu,

zanurzenie elu w elektrolicie.
wprowadzenie analizowanych prbek do wskich studzienek na czole elu,
podczenie elektrod przeprowadzenie rozdzielenia,
wyczenie zasilania,
wizualizacja rozdziele.

2.2.1. ele stosowane w elektroforezie

ele agarozowe i poliakryloamidowe maj posta przestrzennie usieciowanych struktur, zajmujcych
zaledwie okoo 0,51,0 % objtoci komory rozdzielczej ukadu do elektroforezy. Pozostaa przestrze
wypeniona jest przez elektrolit. Rozmiary porw mog by modyfikowane na etapie przygotowania
eli a ich wielko powinna by porwnywalna z rozmiarami rozdzielanych jonw czy moleku
(wiksze czstki doznaj wikszych oporw ruchu w polu elektrycznym, co znaczco poprawia
separacj analizowanych substancji). Powszechnie wykorzystuje si ele poliakryloamidowe oraz ele
agarozowe. ele akryloamidowe umoliwiaj przygotowania nonikw o bardzo gstym usieciowaniu
i niewielkich porach, co umoliwia separacj makroczsteczek biakowych o masach rzdu 5 kD - 300
kD lub polinukleotydw o wielkoci 5-2000 par zasad. Noniki agarozowe wykazuj mniejsze
usieciowanie i wiksze pory ni ele poliakryloamidowe, dlatego mog by wykorzystywane do
rozdzielania wikszych czsteczek.
ele agarozowe przygotowywane s z agarozy, liniowego polisacharydu zbudowanego z 3,6-anhydro-
D-galaktozy i L-galaktozy, izolowanej z agaru (substancja wyodrbniana z krasnorostw). Agaroza w
postaci handlowej jest biaym lub lekko tawym proszkiem, atwo rozpuszczajcym si we wrzcej
wodzie. W temperaturze poniej 40oC zestala si w postaci porowatego elu. Po zestaleniu ulega
ponownemu topnieniu w temperaturze wrzcej wody. Rozmiary porowatoci mona regulowa

223
wykorzystujc roztwory agarozy o rnych steniach. Wiksze stenie agarozy powoduje
powstanie eli bardziej usieciowanych i o drobniejszych porach, czyli nadajcych si do rozdzielania
moleku o odpowiednio mniejszych masach czsteczkowych. Zwykle przygotowuje si ele o
steniach agarozy od 0,4 do 4,0 %. Zaletami eli agarozowych jest atwo i szybko przygotowania
oraz moliwo separacji duych makroczsteczek. Do wad zalicza si sab wytrzymao
mechaniczn oraz trudno ich utrwalania po rozdziale (wyschnite ele rozsypuj si pod wpywem
bardzo niewielkich si).
ele poliakrylamidowe s obecnie najczciej wykorzystywanymi elami ze wzgldu na bardzo dobre
waciwoci fizykochemiczne. Po raz pierwszy taki el zosta zrobiony przez Raymonda i Weitrauba w
1959. ele poliakrylamidowe przygotowywane s z roztworu monomerw akryloamidu i substancji
sieciujcych (ang. cross-linkers) (rys. 13). Najczciej, jako substancji sieciujcej uywa si N,N'-
metylenobisakryloamidu (bis-akryloamid).

Przy przygotowaniu elu naley zawsze pamita, e akryloamid w postaci monomerycznej jest
bardzo siln neurotoksyn i nawet po procesie polimeryzacji stanowi powane zagroenie dla
zdrowia ze wzgldu na pozostaoci swobodnych monomerw w objtoci elu.

Reakcja polimeryzacji inicjowana jest chemicznie (nadsiarczan amonu w obecnoci katalizatora

N,N,N,N-tetrametyletylenodiaminy - TEMED) lub fotochemicznie (nawietlanie promieniowaniem UV
w obecnoci ryboflawiny, rwnie w obecnoci katalizatora - TEMED).

O O O

NH2
+ NH NH

akrylamid N,N'-metylenobisakrylamid
akryloamid

chemiczna lub fotochemiczna

inicjacja reakcji polimeryzacji

CONH 2 CONH 2 CONH 2 CONH2

O
HN

HN
O
CONH2 CONH2 CONH2 CONH2

Rysunek 13. Schemat powstawania eli poliakryloamidowych

Gsto usieciowania oraz rozmiary porw regulowane s poprzez odpowiedni dobr stenia
akryloamidu i bisakryloamidu. Waciwoci te opisywane s za pomoc cakowitego stenia
akryloamidu T (ang. total), oraz dopeniajcego parametru, ktrym jest wagowy stosunek iloci
substancji sieciujcej do sumy akryloamidu i substancji sieciujcej:

224
 T [%] = ((akryloamid + bis-akryloamid) [g] / objto [ml]) x 100
C [%] = (bis-akryloamid [g] / (akryloamid + bis-akryloamid) [g]) x 100
Wybr parametrw elu uzaleniony jest od mas czsteczkowych analizowanych substancji. Do
analizy substancji wielkoczsteczkowych przygotowuje si ele o mniejszym usieciowaniu (mniejszej
gstoci) natomiast do analizy substancji o maych masach czsteczkowych przygotowuje si ele
bardziej usieciowane.
Najczciej el poliakryloamidowy wykorzystywany w rozdzieleniach elektroforetycznych skada si z
opisanego powyej elu rozdzielajcego oraz umieszczonej na nim cienkiej warsty elu
zagszczajcego. Warstwa elu zagszczajcego jest mniej usieciowana, co umoliwia szybkie
wnikanie naniesionych prbek w zoe, a co za tym idzie uzyskiwanie wskich pasm analizowanych
zwizkw.

2.2.2. Przygotowanie prbek

Przygotowanie prbek jest rwnie wane jak waciwa polimeryzacja elu oraz sporzdzenie
elektrolitw. Separowana prbka nie moe zawiera zbyt duej iloci soli, ktre w postaci
zjonizowanej powoduj zakcenie migracji makrojonw (powstawanie smug i niejednorodnoci
prkw). Niezmiernie wane jest rwnie naniesienie odpowiedniej iloci rozdzielanych substancji.
Zbyt maa ilo makrojonw w prbce utrudnia detekcj, natomiast zbyt dua pogarsza warunki
separacji (rozlege i nakadajce si prki).

2.2.3. Rozdzielenie
Przygotowane pytki z elem umieszcza si w odpowiednich aparatach do elektroforezy, w ktrych
elektrody zanurzone s w zbiornikach wypenionych buforami o odpowiednim pH. Po naniesieniu
rozdzielanych prbek elektrody podcza si do rda zasilania. Czsto nanosi si niewielk ilo
barwnika, ktry wdruje wraz z buforem wzdu elu i pozwala okreli moment zakoczenia analizy.

Jedna z regu mwi, e ilo makroczsteczek przypadajcych na jeden prek powinna

znajdowa si w przedziale 1-10 g.

Po zakoczeniu analizy el wyjmuje si ostronie z aparatu i poddaje obrbce w celu wizualizacji

rozdzielonych substancji.

2.2.4. Wizualizacja
Wikszo biaek i kwasw nukleinowych, ktre s najczciej separowane za pomoc elektroforezy
elowej, nie jest widoczna w wietle widzialnym. W zwizku z tym, prki substancji uzyskane po
rozdziale na elach czy membranach naley wybarwi (wizualizowa), w celu uzyskania informacji o
dystansie ich migracji oraz ich iloci. Do wizualizacji moe by wykorzystywane barwienie za pomoc
tzw. barwnikw naturalnych, fluoroforw, a take barwienie enzymatyczne, immunobarwienie oraz
znakowanie radioizotopowe.
Naturalne barwniki, takie jak bkit kumassi (ang. coomassie brilant blue) czy czer amidowa,
pozwalaj wykry 1 g biaka w prku, natomiast metod barwienia srebrem - nawet 10 ng biaka w
prku.

225
Fluorofory, jak np. tradycyjnie stosowany bromek etydyny. Barwnik ten wykazuje waciwoci
fluorescencyjne, co pozwala na obserwacj sygnaw w wietle UV (przy okoo 300 nm).
Barwienie enzymatyczne dotyczy wizualizaji biaek enzymatycznych. Jest to barwienie przez
przeprowadzenie specyficznej reakcji katalitycznej, w ktrej w wyniku enzym staje si barwny.
Znakowanie radioizotopowe charakteryzuje si bardzo wysok czuoci detekcji. Znakowanie
makroczsteczek radioizotopami odbywa si zawsze przed procesem separacji elektroforetycznej,
czsto na etapie ich syntezy. Biaka i peptydy zwykle znakuje si izotopami jodu 125I lub 131I, rzadziej
izotopami wgla 14C, wodoru 3H lub siarki 35S. Oligonukleotydy najczciej znakowane s izotopem
fosforu 32P lub siarki 35S.
Immunobarwienie jest wysoce selektywnym barwieniem biaek i peptydw na membranach, przy
zastosowaniu specyficznych przeciwcia, znakowanych fluorescencyjnie, enzymatycznie lub
radioizotopowo (odpowiednie wykrywanie to detekcja: immunofluorescencyjna,
immunoenzymatyczna lub radioimmunologiczna).

2.2.5. Dokumentacja rozdziele

Bardzo istotna jest dokumentacja uzyskanych rezultatw oraz przechowywanie otrzymanych eli.
ele poliakrylamidowe, po ich wysuszeniu, mona przechowywa dowolnie dugo bez widocznego
uszczerbku pomidzy warstw bibuy i celofanu lub pomidzy dwoma warstwami celofanu. ele
agarozowe nie mog by przechowywane, poniewa ulegaj zniszczeniu ju na etapie ich suszenia. W
obu przypadkach najlepszym sposobem dokumentacji uzyskanych separacji jest wykonanie fotografii
lub zeskanowanie.

3. Wykorzystanie technik elektromigracyjnych

Elektroforeza jest wykorzystywana do analizowania wielu indywiduw, poczynajc od caych

komrek i czstek poprzez kwasy nukleinowe, biaka, peptydy, aminokwasy, organiczne kwasy i
zasady, a po narkotyki, pestycydy, nieorganiczne kationy i aniony. Zastosowanie elektroforezy
obejmuje m.in.:
preparatywne i ilociowe wydzielanie czystych frakcji z badanych mieszanin,
okrelanie czystoci i jednorodnoci badanych substancji,
oznaczanie punktu izoelektrycznego badanych substancji,
oznaczanie masy czsteczkowej badanych substancji,
zastosowanie do celw diagnostycznych i badawczych.
Biaka, spord wielu klas zwizkw wymienionych powyej, s najczciej rozdzielanymi
substancjami za pomoc elektroforezy elowej. Separacj prowadzi si przy zastosowaniu tzw.
elektroforezy natywnej albo elektroforezy w obecnoci SDS.
Elektroforeza natywna jest to rodzaj elektroforezy prowadzony zwykle w elu poliakryloamidowym
w warunkach, w ktrych makroczsteczki pozostaj niezdenaturowane. Zalet tej techniki jest
moliwo odzyskania czsteczek biakowych w stanie penej aktywnoci biologicznej, wad
natomiast stosunkowo saba rozdzielczo metody.

226
Elektroforeza w obecnoci siarczanu dodecylu sodu jest najczciej stosowan metod
elektroforetyczn do separacji biaek. Zastosowanie substancji powierzchniowo czynnej SDS,
prowadzi do powstania kompleksw biako-SDS o ustalonym stosunku adunku elektrycznego do
masy (rysunek 14). SDS skutecznie maskuje oryginalny adunek biaka, co umoliwia atwe i dokadne
oznaczenie mas czsteczkowych rozdzielonych biaek (1 g biaka wie 1,4 g SDS).

+ -

biako SDS

Rysunek 14. Tworzenie kompleksw biako-SDS

4. Literatura
1. Everaerts, F. M.; Beckers, J. L.; Verheggen, T. P. E. M. Isotachophoresis: Theory, Instrumentation
and Applications; Elsevier: Amsterdam, 1976.
2. Kocjan, R. (red.) Chemia analityczna. Podrcznik dla studentw; Wydawnictwo Lekarskie PZWL:
Warszawa, 2000; Tom 2.
3. Landers, J. P. Handbook of Capillary and Microchip Electrophoresis and Associated
Microtechniques; CRC Press: Boca Raton, London, New York , 2008.
4. Righetti, P. G. Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications; Elsevier Biomedical
Press: New York , 1983.
5. Weinberger, R. Practical Capillary Electrophoresis; Academic Press: New York , 2000.
6. Westemeier, R. Electrophoresis in Practice, John Wiley & Sons Inc.: New York, 1997.
7. Witkiewicz, Z. Podstawy chromatografii; Wydawnictwo Naukowo-Techniczne: Warszawa, 2005.
8. Witkiewicz, Z.; Hepter, J. Sownik chromatografii i elektroforezy; Wydawnictwo Naukowe PWN:
Warszawa, 2004.
9. Rilbe, H. Electrophoresis 1995, 16, 13541359.
10. Tiselius, A. Trans. Faraday Soc. 1937, 33, 524-531.
11. Piotr Diakowski; http://chemfan.pg.gda.pl/Badania/ce.html
12. Walkowiak, B.; Kochmaska, V. (red.) Elektroforeza: przykady zastosowa;
http://www.biofizyka.p.lodz.pl/elektroforeza.pdf

227
Na stronie internetowej www.chem.univ.gda.pl/analiza

w sposb cigy aktualizowane s instrukcje do wicze laboratoryjnych oraz zada rachunkowych z

technik separacyjnych Zapraszamy do korzystania z tych materiaw

Autorzy

228