FUNDAMENTO TEORICO:

El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio
ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms
simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir
entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales
como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso llamado
fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin puede fijarse con
sustancias qumicas como formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin, si se aade el colorante,
no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La fijacin se realiza habitualmente en
clulas que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador, y siguiendo
inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce habitualmente el encogimiento de las clulas; la
tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que es realmente, de manera que
las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin.
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los
materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente
(cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales
como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de
metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones)
y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos
colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias
liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a
menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Un ejemplo de colorante
liposoluble es el negro Sudn.
Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra sustancia
qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente
habitual es el cido tnico. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo
que ahora s podr atacar el colorante.
Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopa, son suficientes los
procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas
las clulas bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles
celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la
mayor parte del material no celular no se tie.

La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin teir, pero se
colorea en cambio el medio que la rodea. Lo que se ve, por lo tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia
utilizada para la tincin negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares
y que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta cina. La tincin negativa es un modo satisfactorio de
aumentar el contraste de las clulas en la microscopia ptica, pero su mxima utilidad esta en revelar la
presencia de capsulas alrededor de las clulas bacterianas.
 PREPARADOS MICROSCPICOS

EXAMEN EN FRESCO:
las muestras se extienden directamente sobre la superficie de un
portaobjetos para su observacin. El material que es demasiado espeso
para permitir la diferenciacin de sus elementos puede diluirse con
igual volumen de solucin sita suavemente un cubreobjetos sobre la
superficie del material.
Este tipo de preparacin se emplea para detectar trofozotos mviles de
parsitos intestinales como Giardia, Entamoeba, huevos y quistes de
otros parsitos, larvas y gusanos adultos, Trichomonas, hifas de hongos,
etc
En la imagen: Candida sp en un examen en fresco. salina fisiolgica
estril. Se depo

TINCIN SIMPLE

Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tien
con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de
lactofenol).
El Hidrxido de potasio al 10% (solucin de KOH) permite ver elementos de
hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por
ejemplo de la clula husped, pero no acta sobre los polisacridos de las
paredes celulares de los hongos.
La tinta china o Nigrosina permite observar clulas levaduriformes capsuladas
(Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacridos capsulares rechazan la tinta china y la cpsula
aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede
agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos.
En la imagen: Cryptococcus neoformans en una tincin con tinta china.

TINCIN DIFERENCIAL
Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian en funcin de los
diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitucin qumica.
Los ejemplos clsicos sera la tincin de GRAM o la de Ziehl-Neelsen
En la imagen: BGN y levaduras en una tincin GRAM.
 LA TINCIN GRAM
La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio bacteriolgico y
con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad prctica es indiscutible y en el
trabajo microscpico de rutina del Laboratorio de Microbiologa las referencias a la morfologa celular
bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc) se basan justamente en la tincin de GRAM
Descripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente: el Frotis fijado con calor se tie 1 min
con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin Yodada durante 1 min y se lava de nuevo con
agua, decolorar con mezcla alcohol etlico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste)
durante 20 seg. Lavar y secar.
Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll en 1844.
Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos,
grampositivas y gramnegativas (en este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con
carga elctrico, sino simplemente designan dos grupos morfologicos distintos de bacterias).
Las bacterias gran positivas y gran negativas tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas
en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la celula bacteriana sirvepara dar su tamao y forma
al organismo asi como para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular bacterianaque confiere
rigidezes el peptidoglicano. La pared de la celula gran-positiva es gruesa y consiste en varias
capsinterconectadas de peptidoglicano asi como algo de acido teicoico. Generalmente, el 80%-90% de la
pared de la celula gran-positiva es peptidoglicano y esta rodeada por una membrana exterior compuesta de
fosfolipidos, lipopolisacaridos y lipoprotenas. Solo el 10%-20% de la pared de la celula gran-negativa es
peptidoglicano.
Debido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared
celular de las distintas bacterias, describiremos aqu con algn detalle la tincin de Gram y las
interpretaciones que actualmente se hacen sobre el porqu de su funcionamiento.
Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin de cristal violeta
(otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En
este estado, todas las clulas, tanto las gran-positivas como las gran-negativas, estn teidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico. El ingrediente activo es
aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo
insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas gran-positivas como las gran-negativas se
encuentran en la misma situacin.
Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es
soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (gran-positivos) no se decoloran, mientras que
otros (gran-negativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su
resistencia a la decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de
bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana
exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana citoplasmtica a la que se une
peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo
y la clula se decolora.
Las clulas gran-positivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms peptidoglicano y
menos lpido), no son permeables al disolvente ya que ste deshidrata la pared celular y cierra los poros,
disminuyendo as el espacio entre las molculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede
atrapado dentro de la pared celular. Despus de la decoloracin las clulas gran-positivas son todava
azules, ero las gran-negativas son incoloras.
 Para poner de manifiesto las clulas gran-negativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente
es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus de la coloracin de contraste
las clulas gran-negativas son rojas, mientras que las gran-positivas permanecen azules.
Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram:
1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s solo tiene poca
afinidad con las clulas.
2) La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las clulas gran-
positivas. EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso del tiempo para
obtener resultados satisfactorios.
3) Cultivos ms viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta - yodo.
El carcter de gran-positivo no es siempre un fenmeno del todo o nada. Algunos organismos son ms gran-
positivos que otros y algunos son gram-variables, es decir, unas veces gran-positivos y otro gram-negativo.

ZIEHL-NEELSEN (BAAR)

Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos) de
cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracin con
alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol
resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parsitos coccdeos como
Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de
Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene
ceras.
Se ha desarrollado una coloracin de cido-alcohol resistencia modificada que diferencia las especies de
Nocardia (bacterias ramificadas filamentosas cuyas paredes celulares contienen cidos-grasos de unos 50
tomos de carbono), de los actinomiceos (muy semejantes pero no cido-alcohol resistentes). Nocardia spp
son decoloradas por la mezcla cido-alcohol estndar pero no por un tratamiento ms suave con cido
sulfrico 0,5 a 1%. Estos microorganismos se denominan cido-alcohol resistentes parciales o dbiles.
El frotis se tie durante unos 5 min con Carbolfucsina aplicando calor suave. Lavar con agua. Decolorar con
alcohol etlico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y teir durante 30-60 seg con Azul de Metileno
(color de contraste). Lavar y secar

TINCIN DE ESPORAS (WIRTZ-CONKLIN)

Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su
interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones ambientales
son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos txicos,
etc.) formndose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporognesis, la clula
vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina
generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante aos. Algunas de las
bacterias productoras de endosporas son patgenas para el hombre, por lo que su estudio y observacin
son de enorme inters.

FUNDAMENTO
Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores
ambientales adversos. Adems, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio ptico
como estructuras refringentes y de difcil tincin.
La tincin especfica de esporas requiere dos colorantes:
1.- Verde malaquita: capaz de teir las esporas en caliente.
2.- Safranina: colorante de contraste que tie las formas vegetativas.
Las endosporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en el lavado con agua, y s lo
harn las formas vegetativas, que quedarn teidas con el segundo colorante.
 INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS

La posicin y la morfologa de la endospora en el interior de la bacteria constituyen un carcter taxonmico

til para diferenciar especies dentro de un mismo gnero.
Las tres bacterias empleadas en esta prctica difieren en la disposicin y morfologa de las endosporas. B.
sphaericus posee una endospora esfrica con localizacin terminal y deformante de la clula vegetativa, por
lo que suele ser denominada "en palillo de tambor". B. thuringiensis tiene localizada la endospora elipsoidal
en el centro de la clula vegetativa, lo que provoca un abombamiento caracterstico denominado "en huso".
B. subtilis forma una espora cilndrica subterminal no deformante.

TINCIN DE LA CPSULA

La cpsula se pone de manifiesto mediante una coloracin negativa o una modificacin de esta. Uno de
los mtodos de tincin de la cpsula incluye el tratamiento de las bacterias con un solucin caliente de
cristal violeta seguido por un lavado con una solucin de sulfato de cobre. El sulfato de cobre tambin
imparte color al fondo y esto resulta en que la clula y el fondo aparezcan teido en color azul oscuro
mientras la cpsula aparece de color azul plido.

La tincin de cpsula se denomina tincin negativa porque tie el fondo de la preparacin y no el

microorganismo. Desde el punto de vista formal no es una tincin propiamente dicha, porque no fija los
microorganismos. Se parece ms a una preparacin en fresco. Su realizacin es sencillsima, consiste en
colocar la muestra hmeda sobre el porta objetos y mezclarla con tinta china. La tinta cubre toda la
preparacin a excepcin de las cpsulas. En el microscopio se observa el fondo negro y los microorganismos
con cpsula sin color.

OBJETIVOS:
 Reconocer algunas caractersticas morfolgicas de las bacterias.
Reconocer los dos grandes grupos de bacterias existentes mediante el mtodo de coloracin
diferencia de gram.
Demostrar la tincin de la espora con la tincin de la clula vegetativa.
Observar la situacin de las esporas dentro del cuerpo bacteriano.
Demostrar la presencia da la capsula como elemento importante en la estructura de la clula u otra
formacin extracelular.

MATERIALES Y REACTIVOS

Microscopio Safranina
Asa de siembra Lugol
Mechero Alcohol-cetona
Pipetas Verde de malaquita
Placas petri Coloracin de zhiel
Porta objetos Nigrosina o tinta china
Azul de metileno
Cristal violeta

Cultivo en medio lquido o solido:

Escherichia coli
Bacillus subtiles
staphilococcus

CONCLUSIONES:

En esta prctica se utilizo la E. coli para la coloracin simple. Y se pudo observar bacilos.
 Los bacilos subtilis lo utilizamos para identificar los gran-positivos o los gran-negativos.

En la coloracin de la capsula la tinta china no se tie con el colorante.

Se sabe que por falta de nutrientes se forman las esporas, pero si vuelven clulas vegetativas y su
superficie es serosa o de lpido.

BIBLIOGRAFA:

-manual de trabajos prcticos microbiologa general M. Cristina Diaz.

-http//bioquimicawordpress.com

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

NOMBRE: marlon david

APELLIDOS: yoverar ramos

PROFESOR: cesar torres

CURSO: Microbiologa

LABORATORIO: N2

FACULTAD: Industrial

ESCUELA: Agroindustrial

2013