CONFERENCIA

REPARACIN DEL DNA

Sumario

Dao en el DNA
Reparacin directa
Mecanismos de escisin
Reparacin de desapareamiento de bases
Reparacin inducida

Dao en el DNA

La funcin de la reparacin del DNA es el mantenimiento de la informacin gentica intacta La

reparacin del DNA est muy relacionada con la replicacin puesto que en la mayor parte de
los procesos de reparacin se da algo de replicacin y con la recombinacin, puesto que la
recombinacin es una de las vas de reparacin. El DNA est expuesto a multitud de agentes
que pueden producirle daos.

Cmo se produce el Dao en el DNA?

1) Errores en la replicacin: la seguridad con que una secuencia de DNA se copia durante la
replicacin depende de la fidelidad de la polimerasa en la seleccin correcta del dNTP para
insertarlo en la cadena complementaria que se sintetiza a partir del DNA parental. Los errores
en la replicacin se incrementan si el balance de los 4 dNTP en la clula del DNA precursor se
desordena, si un dNTP se encuentra en exceso se puede alterar la normalidad de la
polimerasa e incorporar este nucletido en lugar del correcto.

2) Daos espontneos: a 37 C miles de bases se pierden espontneamente, dejando sitios

apurnicos y apirmidnicos incapaces de determinar la insercin correcta de las bases en la
cadena complementaria.

3) Daos endgenos: la mayor parte de estos cambios se producen por la generacin

de radicales librescomo subproductos de la respiracin aerobia normal. Estos radicales que
son molculas o fragmentos moleculares con electrones sin aparear son capaces de acelerar la
ruptura de las cadenas del DNA.

4) Daos exgenos:

a) Radiaciones ionizantes: los rayos X y , provocan ruptura de simple cadena, ruptura de

doble cadena, bases daadas por ionizacin directa y generan radicales libres.

b) Radiaciones ultravioleta (UV): es el agente que daa el DNA ms estudiado, causa la

formacin de enlaces intracadenas (dimerizacin de pirimidinas), en orden de abundancia
TT, CT y CC. La figura siguiente muestra dos tipos de dmero de timina:
c) Agentes alguilantes: Etil Metano Sulfonato (EMS), N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina
(MNNG):

d) Acido nitroso: provoca desaminacin de bases.

e) Agentes voluminosos: forman una lesin voluminosa. Ej.: Benzopireno, Mitomicina C.

f) Agentes que forman enlaces covalentes intercadenas: detienen la replicacin.

Daos en el DNA

Cambios de 1 base: afectan la secuencia, pero no la estructura total del DNA. Ellos no
afectan la transcripcin o replicacin, cuando las cadenas del DNA dplex se separan. As
estos cambios ejercen su dao sobre futuras generaciones a travs de las consecuencias del
cambio en la secuencia del DNA.
Distorsiones estructurales: ellas causan un impedimento fsico a la replicacin y
transcripcin. Un ejemplo muy estudiado es la formacin de dmeros de pirimidinas. Otros
ejemplos son la introduccin de enlaces covalentes entre bases de cadenas opuestas y la
adicin de aductos.

En todos estos casos el dao permanece en el DNA y contina causando problemas

estructurales y/o induce mutaciones, hasta que es eliminado. Los daos se han de reparar, de
lo contrario aparecen mutaciones que eventualmente pueden ser letales, de ah que existan
muchos mecanismos de reparacin. Algunos de estos mecanismos son especficos de lesin:
la lesin ms estudiada es la formacin de dmeros de pirimidina (mas frecuentemente timina)
causados por radiacin ultravioleta. Lo normal es que un mecanismo de reparacin repare
multitud de lesiones y, en cualquier caso, los mecanismos de reparacin son redundantes:
una misma lesin puede ser reparada por varios mecanismos de reparacin; esto constituye un
mecanismo de seguridad: si existe un fallo o mutacin en un mecanismo de reparacin pueden
actuar otros. Mecanismos de reparacin no funcionales producen abundantes mutaciones: los
desarrollos tumorales se producen por la acumulacin de mutaciones que pueden provenir de
diferentes deficiencias en los sistemas de reparacin.

Mecanismos de reparacin
En lneas generales los mecanismos de reparacin eucariticos son similares a los
mecanismos de reparacin de E. coli (que es donde mejor se han estudiado), aunque en
eucarioticos hay muchas ms protenas implicadas.

Los mecanismos de reparacin pueden clasificarse como (ver Tabla 25-5 Lehninger):

1) Reparacin directa o in situ

2) Reparacin por escisin

Reparacin por escisin de bases BER (Base Excision Repair) reparacin de parches muy
cortos (VSP)

Reparacin por escisin de nucletidos NER (Nucleotide Excision Repair) reparacin de

parches cortos (SP)

3) Reparacin de desapareamiento de bases (Mitsmach Repair) reparacin de parches muy

largos (VLP)

4) Reparacin inducida:

Respuesta SOS.

Reparacin inducida en clulas eucariticas

Reparacin directa

Es aquella en la que se revierte la lesin. Ejemplo: la reparacin de dmero de timina

producidos por luz ultravioleta entre los 200-300 nm, mediante la enzima fotoliasa. La fotoliasa
reconoce la distorsin en el DNA causada por el dmero, dos timinas adyacentes en una misma
banda de DNA unidas covalentemente por un anillo de tipo ciclobutano, que detienen la
maquinaria de replicacin y la transcripcin. La luz ultravioleta (200-500 nm) activa dicha
enzima, encausando as la rotura del anillo ciclobutano y a continuacin se libera. Las figuras
siguientes representan el modelo de la estructura de la fotoliasa de E. coli y el mecanismo de
esta enzima:

La mayor parte de los dmeros de timina se reparan por mecanismos de escisin, que inducen
la eliminacin de las zonas donde se encuentran. Adems de los dmeros de timina, algunas
bases modificadas se reparan por este mecanismo, ej: O6 metil guanina se repara por una
metiltransferasa que elimina el metilo, que se transfiere al enzima quedando inactivada. Las
figuras siguientes representan la aparicin de guanina metilada y el mecanismo por el cual se
repara este error:
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Mecanismos de escisin

Son aquellos mecanismos de reparacin en los que se elimina la zona en la que se encuentra
la lesin. Hay dos tipos de mecanismos de reparacin por escisin:

1) BER: Reparacin por escisin de bases: la base que se encuentra modificada se escinde.
Ejemplo: oxidacin de citosinas que se convierten en deoxiuracilos. La N-uracil glicosidasa
rompe el enlace glicosdico que une la base con el azcar, origindose as un hueco en el
DNA: sitio apirimidnico si le falta una pirimidina o apurnico si la base que faltara fuera una
purina. Existen AP endonucleasas que reconocen el DNA al que le falta una base y producen
un corte; una exonucleasa degrada el DNA a partir de este corte y deja una zona que es
reparada por la DNA polimerasa y sellada por la ligasa. A veces, la AP endonucleasa corta la
cadena con la base modificada. En cada clula humana se generan diariamente unos 10000
sitios AP que son reparados por una mquina proteica, el reparosoma, formado por cuatro
protenas que actan concertadamente: la UDG (Uracil-DNA glicosilasa, que elimina el
uracilo), HAP1 (AP endonucleasa humana, que corta la cadena azcar-fosfato), la polimerasa
(que introduce el nucletido que faltaba) y la ligasa (que sella el corte).
2) NER: Reparacin por escisin de nucletidos, se corta la cadena de azcar - fosfato. Los
genes implicados, en el caso de E. coli, son Uvr (A, B, C, D). Los mutantes en genes Uvr son
muy sensibles a la luz ultravioleta, por tanto, los genes Uvr confieren resistencia a UV. Las
figuras siguientes muestran el mecanismo:

2 UvrA rastrean el DNA hasta encontrar una distorsin estructural (por ejemplo un dmero de
timina). UvrB queda unido en la zona lesionada, UvrA es eliminado y se recluta UvrC, que
produce dos cortes endonucleotdicos a ambos lados de la lesin, unos 5 nts en direccin 3' y
unos 8 nt 5'. UvrD que es una helicasa (tambin llamada helicasa II) desplaza el oligo que
incluye la distorsin (aproximadamente 14 nucletidos). La DNA polimerasa I rellena el hueco a
partir del extremo 3' OH libre y la ligasa lo sella. (Ver tambin la figura 14.28 Genes VII y otra
representacin alternativa del mecanismo).

En organismos eucariticos tambin se da este mecanismo. Los pacientes de xeroderma

pigmentosa son extremadamente sensibles a la luz solar (sufren quemaduras abundantes en
su piel, desarrollan melanomas, etc., por esto suelen vivir muy poco). Tienen mutaciones en
genes implicados en vas de reparacin por escisin de nucletidos. Hay 7 genes implicados: XP
A, XP B, XP C, XP D, XP E, XP F y XP G. Si encontramos una lesin en el DNA, por ejemplo
de dmeros de timina, la XP A reconoce dicha lesin, entonces se introduce una helicasa TFII y
se va abriendo el DNA en la zona adyacente a la lesin. XP G y XP F van cortando y
eliminando la zona de la lesin. Se libera el oligo (23-24 nts) y RFC coloca la pinza PCNA para
que la DNA polimerasa rellene el hueco y la ligasa selle el nick (en esencia es lo mismo que
ocurre en E. coli).

Sistemas eucariticos responsables del mecanismo de

reparacin por escisin de nucletidos (NER)
Reparacion de desapareamiento de bases (Mismatch Repair)

Los errores que comete la DNA polimerasa dan lugar a desapareamientos de bases, as si a
una G por error se le enfrenta una A, aunque son bases normales, no lo es su apareamiento,
(mismatch: bases desapareadas). En condiciones normales la actividad exonucleasa asociada
a la polimerasa evita los desapareamientos, pero si no lo hace hay que eliminarlo antes de que
la banda se replique, ya que si no, la mutacin quedara fijada. En E. coli existe un grupo de
genes llamados Mut, implicados en la eliminacin de estos desapareamientos (si hay mutantes
en estos genes Mut se produce una tasa de mutacin ms elevada de lo normal). El sistema
de E. coli usa un reparisoma formado por las siguientes protenas:

Pasos en el mecanismo de reparacin del sistema de Mut:

1. Unin de Mut S al error: Mut S recluta al menos otros 2 polipptidos Mut H y Mut L.El
ensamblaje del complejo activa la endonucleasa latente de Mut H, la cual entonces inicia el
proceso de escisin introduciendo una mella en la cadena nuevamente sintetizada, del lado 5'
del todava no metilado GATC. El reconocimiento se lleva a cabo por las secuencias GATC que
no estn metiladas en la banda de nueva sntesis, ya que la metilasa Dam an no ha actuado
sobre ellas, recordemos que la actuacin de la metilasa Dam tarda unos minutos, este es el
tiempo que permite reconocer la base errnea (ver Fig. 14.29Genes VII).

2. La degradacin de la cadena conteniendo el nucletido mal incorporado comienza en esta

mella y contina hacia y despus de las bases mal apareadas.Este proceso es mediado por
Exo VII, si la mella se encuentra del lado 5' del error o Exo I, si la mella se encuentra del lado 3'
del error.

3. La regin de simple cadena expuesta es protegida del error por SSB.

4. El hueco es llenado por Pol III y sellado por DNA ligasa.

Se asume que eventos similares tienen lugar durante la correccin de errores en levaduras y
humanos, excepto que la discriminacin de las cadenas no es dictada por metilacin, En su
lugar discontinuidades en la cadena nuevamente sintetizada pueden estar implicadas en el
proceso.

En organismos eucariotas se han encontrado que cnceres colorrectales (HNPCC, hereditary

nonpolyposis colon cancer) estn asociados (al menos un 90% de ellos) a mutaciones en
genes parecidos a los Mut L y Mut S, estos ltimos reconocen las mutaciones, lo que indica
que es un mecanismo muy conservado. No se han encontrado homlogos a Mut H, y parece
que no se necesita, ya que el mecanismo de reconocimiento se basa en la interaccin del
homlogo de Mut S con PCNA unido al ltimo cebador en la horquilla de replicacin.

En ocasiones el sistema reparador no tiene una forma intrseca de distinguir la base salvaje de
la mutada y es esta una forma en que se fijan las mutaciones. Existen sin embargo otras formas
de dirigir la restauracin de la secuencia salvaje. Por ejemplo para casos tales como la
desaminacin de 5-metil citosina a timina, hay un sistema especial para restablecer la propia
secuencia. La desaminacin genera un par G-T, y el sistema que acta sobre tal par tiene un
sesgo para corregilos a G-C (ms que a A-T). Se ha observado que el sistema Mut L, S traslada
siempre T de los dos apareamientos incorrectos G-T y C-T.

Otra actividad reparadora identificada por mut Y, reemplaza la A en los errores C-A y G-A. Este
sistema funciona por el traslado directo de la base del DNA (reparacin por escisin de bases).

Es interesante el hecho de que la DNA pol tiene la tendencia a introducir equivocadamente A y

la desaminacin de 5-metil C es frecuente (conduce a C U T/G). Es decir el residuo de G
codifica frecuentemente la informacin correcta y parece que las funciones de la glicosilasa han
evolucionado de acuerdo con los errores celulares intrnsecos de la replicacin y la reparacin
del DNA.

Ejemplos de genes mutadores, relacionados

con la replicacin o reparacin del DNA

Reparacin inducida

Ante una cantidad masiva de daos en el DNA, se disparan, como respuesta, mecanismos de
emergencia que se caracterizan por tener niveles superiores de protenas implicadas en
reparacin y recombinacin. El ejemplo tpico es larespuesta SOS, si la cantidad de lesiones
que hay en E. coli es muy superior a lo normal, se induce la respuesta SOS.
En los casos de reparacin vistos hasta ahora, los daos estaban en una sola de las dos
bandas, con lo que bastaba replicar la complementaria, pero si tenemos mutaciones masivas,
se puede replicar la zona antes de que d tiempo a reparar la lesin. Por ejemplo cmo se
reparan los dmeros de timina una vez que la horquilla ha pasado? Ahora la zona daada est
en la banda molde. Hay dos maneras de hacerlo:

1) Por recombinacin, suministrando el molde correcto de un DNA homlogo:

2) Por replicacin errnea (error-prone). La polimerasa copia un molde defectuoso a costa de

introducir errores.

A nivel molecular la respuesta SOS consiste en la induccin de la expresin de una serie de

genes. Todos estos genes (la mayor parte de ellos implicados en reparacin), se encuentran
reprimidos por la protena lex A, forman lo que se llama un opern. Lex A se autorregula, es
decir, reprime su propia expresin, (cuando decimos que la expresin est reprimida, no es que
no haya nada, hay un estado basal, al dispararse la expresin no es de nada a todo sino de
"poco" a todo). El represor lex A se proteoliza debido a la presencia de Rec A activado (se
activa unindose a banda simple), por lo tanto con muchos daos en el DNA tenemos varias
zonas de banda simple a las que se une Rec A. El represor lex A se proteoliza por lo que se
induce la expresin de todos esos genes incluido el propio lex A. Una vez reparados los daos,
Rec A se inactiva y lex A reprime los genes del opern. Es un sistema reversible, que puede
representarse por el siguiente esquema:

En la respuesta SOS se induce la expresin de una serie de genes (ver Tabla 25.6 Lehninger):
 Uvr (reparacin por escisin de nucletidos).

RecA, protena con un papel fundamental en recombinacin, puede suministrar un

molde a la zona daada para que pueda ser reparada por los mecanismos
convencionales

UmuD/C, que hace que la DNA polimerasa replique moldes daados a costa de
introducir mutaciones. Rec A activa, rompe proteolticamente, adems de lex A, a Umu
D generando la forma activa de la protena. El conjunto de Umu C y Umu D hace
perder fidelidad a la DNA polimerasa III (que estaba parada como consecuencia de la
existencia de daos en el DNA) y que copie la cadena molde aunque est daada,
dndose una replicacin errnea y en definitiva, generando mutaciones.

El gen sfi A est implicado en divisin celular, hace que se pare la divisin celular y se
producen filamentos de clulas.

Otro efecto de la respuesta SOS es la induccin de lisgenos de , en donde el DNA de est

integrado en el DNA bacteriano; para el mantenimiento de la lisogenia se requiere el represor
del fago . En la respuesta SOS, Rec A activado degrada (adems de lexA y Umu D) el
represor del fago y como consecuencia se induce el estado ltico, la clula lisa y se liberan los
fagos. Qu significado fisiolgico tiene esto? Cuando el genoma bacteriano est daado y la
supervivencia de la bacteria est en peligro, se induce el ciclo ltico y el fago "busca otra
bacteria".

En clulas eucariotas, cuando hay un gran nmero de lesiones en el DNA, aumentan los
niveles y se activa la protenap53, factor de transcripcin que activa la expresin de p21. p21
bloquea la ciclina G1 / cdk y por lo tanto se para el ciclo celular en G1, de esta manera se
impide la replicacin del DNA, dando tiempo para que se reparen los errores (p21 adems
interacciona con PCNA y frena la replicacin en fase S). p53 activa mecanismos de reparacin
y tambin induce apoptosis. La apoptosis, muerte celular programada o suicidio celular, es un
proceso controlado genticamente y es fisiolgicamente distinto al proceso necrtico. En la
apoptosis la clula se deshidrata, se redondea, el ncleo se condensa, se parten los
cromosomas, y se degrada en vesculas que son engullidas por los macrfagos (ocurre sin
inflamacin, no como en necrosis).

La apoptosis es un proceso totalmente normal que se da en:

Clulas con gran cantidad de lesiones en el DNA; antes de seguir dividindose y acumulando
mutaciones que podran llevar a procesos tumorales, la clula se suicida.

El desarrollo (por ejemplo: las clulas que forman la cola de los renacuajos, clulas nerviosas
sobrantes, etc.)

En el proceso de seleccin de repertorio de los linfocitos.

p53, por tanto, acta por diversos mecanismos protegiendo el DNA de daos e impidiendo la
proliferacin de clulas defectuosas, se le ha llamado por eso "el ngel guardin del genoma".
Es un gen supresor de tumores (el 50% de los tumores tienen p53 mutado). Ratones knock-
out en p53 nacen normales pero desarrollan tumores a las pocas semanas, a los 6 meses la
mayora han muerto. En ratones knock-out en p53 no se induce apoptosis.

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