FUNDAMENTOS. ESPECTROFOTOMETRIA 4.

0 / M4 / FISICA

FUNDAMENTOS. ESPECTROFOTOMETRA/
Versin 4.0/
MODULO 4/
CTEDRA DE FSICA/
FFYB/
UBA/

Ctedra de Fsica-FFYB-UBA [1]

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Para profundizar los contenidos tericos que se abordan en sta gua es aconsejable que
consulten la Bibliografa indicada en el campus.
Ir

Dentro de la misma y tambin en el campus, se encuentran los Anexos sobre

Espectrofotometra y Espectrometra UV, visible e IR. Ambas guas complementan la
informacin descripta a continuacin.
Ir Ir

El trmino espectrofotometra hace referencia a una serie de tcnicas analticas que se fundamentan en la
espectroscopa atmica y molecular. Permiten obtener informacin a partir del anlisis de las distintas
interacciones de las radiaciones electromagnticas con la materia.
En la qumica analtica, una manera prctica y precisa de conocer la concentracin de una solucin consiste
en medir el efecto que dicha concentracin tiene sobre la intensidad de un haz de luz luminoso que incide
sobre ella.
Para comprender que ocurre en el seno de una solucin cuando un haz de luz la atraviesa, consideremos
una cubeta de material transparente y no absorbente que contiene la solucin con el analito cuya
concentracin se desea conocer. Si se ilumina la solucin con luz monocromtica (luz de una sola longitud de
onda) ocurrir que parte de la intensidad de esa luz (Io) ser absorbida por las molculas que estn en dicha
solucin (Ia), parte se reflejar (Ir) y parte ser transmitida (It).
Podemos representarlo esquemticamente como se muestra en la figura 1:

Figura 1: Luz que incide sobre un tubo conteniendo una solucin coloreada

Para que se cumpla el principio de conservacin de la energa, la suma de stas tres ltimas ser igual a Io:

Io = Ir + Ia + It Ecuacin 1

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Si la incidencia del haz de luz es normal a la pared del tubo que contiene la solucin, la luz reflejada ser
despreciable y la ecuacin se reduce a:

Io = Ia + It Ecuacin 2

Si se divide esta expresin por Io, y se llama absorcin ( S ) a la relacin Ia / Io y transmitancia ( T ) a la

relacin It / Io, se obtiene la expresin:
1= S+T Ecuacin 3
Esta es la expresin matemtica de la ley de Grotthus - Draper.
Cmo resultar la intensidad transmitida con respecto a la incidente si aumenta o disminuye la intensidad
de la fuente? Y si se aumenta o disminuye el espesor de la cubeta que contiene a la solucin?
La expresin matemtica que involucra a estos parmetros es la siguiente:

dI dI
- = k. l reordenando: = - k. l Ecuacin 4
I I

Lo que significa que la variacin (disminucin) de la intensidad es directamente proporcional al espesor del
material interpuesto ( l ) y a una constante k propia de cada material, llamada coeficiente de absorcin.
Si procedemos a integrar la ecuacin anterior entre ciertos lmites se obtiene:

It dI l
= - k dl Ecuacin 5
I0 I 0

Resolviendo
It It
-(k.l)
ln = - k . l Ecuacin 6 = e Ecuacin 7
I0 Io

Despejando It
-(k.l)
It = Io . e Ecuacin 8

Esta frmula es una expresin matemtica de la ley de Lambert, que dice que la intensidad de la luz
monocromtica transmitida decrece en forma geomtrica cuando el espesor del medio absorbente crece en
forma aritmtica.
Qu ocurre si mantenindose constante la intensidad incidente y el espesor, se aumenta o disminuye la
concentracin de la solucin atravesada por la luz?

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Un desarrollo matemtico anlogo, sustituyendo a dl por dc (variacin de la concentracin), lleva a la

siguiente expresin matemtica:
- (k.c)
It = Io . e Ecuacin 9

La intensidad de luz monocromtica transmitida por la solucin de una sustancia determinada decrece en
forma geomtrica cuando su concentracin aumenta en forma aritmtica.
Si se repite la experiencia variando a la vez el espesor bajo el cual se observa y la concentracin de la
solucin, cambiando adems la base e a base decimal, se llega a la siguiente expresin:

-a.c.l Ecuacin 10
It = Io . 10

Esta expresin se conoce con el nombre de Ley de Lambert - Beer, donde a es una constante denominada
absortividad. Esta ley se cumple trabajando a bajas concentraciones y en presencia de luz monocromtica.
Reordenando y reemplazando obtenemos una relacin entre transmitancia ( T ) y concentracin ( c ):

It
-a.c.l
T = = 10 Ecuacin 11
Io

Segn la ecuacin no existe una relacin lineal entre ambas, sino que se observa que la transmitancia decae
en forma exponencial con la concentracin. La misma relacin se mantiene para T% (que es la T expresada
en porcentaje) y concentracin segn se muestra abajo, en el grfico de la figura2.

Figura 2: T% en funcin de la concentracin

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Recordando que a es una constante, la misma es propia de cada sustancia y depende de la longitud de onda,
la temperatura y el solvente con que se trabaje. Para comprender mejor su significado, a partir de la ley de
Lambert Beer (ecuacin 10) aplicando logaritmos y reordenando a queda expresada como:

- log It / I0 - log T
a = = Ecuacin 12
l.c l.c
A partir de la ecuacin 12 surge un nuevo parmetro: la absorbancia (Abs) que es logaritmo T (o bien,-
log It /I0 ).
Entonces, reordenando y reemplazando:

- log It / I0 = Abs = a . c . l Ecuacin 13

Reordenando la ecuacin anterior la absortividad (a) se puede definir como la absorbancia (Abs) que
presenta una solucin de concentracin unitaria de una sustancia, observada bajo un espesor unitario.

a = Abs / ( l . c ) Ecuacin 14

El valor numrico de a depende de las unidades de concentracin empleadas. Si c se expresa en g/mL, se

-1
obtiene la absortividad especfica (ao) y a = mL . (gr . cm) . Si c se expresa en moles por litro, se obtiene
-1
absortividad molar o coeficiente de extincin molar , y sus unidades sern L . (mol . cm) . Notar adems

que Abs es una magnitud adimensional.

Relacionando las ecuaciones anteriores se obtienen:

Abs = a . l . c = - log T = - log It / I0 Ecuacin 15

y T = 10-Abs Ecuacin 16

Segn la Ecuacin 15, si se representa grficamente Abs = f ( c ) en teora, el grfico mostrar una relacin
lineal entre las dos variables, siempre que se trabaje con luz monocromtica y a bajas concentraciones. Esto
sin embargo, puede cumplirse para algunas sustancias pero no para otras. Si se trabaja con una sustancia
determinada y midiendo la absorbancia de distintas concentraciones de la misma se obtiene una
representacin lineal entre las absorbancias medidas y las correspondientes concentraciones, entonces esa
sustancia cumple la Ley de Lambert Beer en el rango de concentraciones usadas.

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Es importante recalcar que la variable fsica real es la transmitancia y no la Absorbancia. El instrumento de

medida, que es el espectrofotmetro, determina Transmitancia a partir de la medida de Intensidad
transmitida comparndola con la intensidad Incidente. El parmetro Absorbancia es creado a partir de una
relacin matemtica para simplificar el tratamiento. Como vimos sta, a diferencia de la transmitancia,
presentar una relacin directamente proporcional con la concentracin de una sustancia que cumpla con la
ley.

Valores lmites de absorbancia y transmitancia:

Analizando las ecuaciones anteriores podemos establecer los lmites de estos parmetros:

Si no hay absorcin It = Io, entonces T = 1 y Abs = 0

Si hay absorcin total It = 0, entonces T = 0 y Abs =

T vara entre 0y1T% vara entre 0 y 100 %.

Abs vara entre 0 e .

El espectrofotmetro posee dos tipos de tipos de escalas: la escala de transmitancia %, que es lineal y

abarca de 0 a 100% y la escala de absorbancia que es logartmica y abarca de 0 a . Si bien en los

espectrofotmetros analgicos stas se pueden visualizar, en nuestros instrumentos de medida como el
display es digital, muestra directamente el valor de T% de Abs, segn se seleccione. Ver ms en anexo Ir
de espectrofotometra.
Antes de introducirnos en la instrumentacin, es importante recordar que a partir de la ley de Lambert-Beer
se pueden estudiar sustancias coloreadas en el visible aportando mucha informacin acerca de ellas
(tambin se pueden estudiar compuestos que absorban en el UV y en el IR). Para esto una de las primeras
herramientas es la realizacin de un barrido espectral. El mismo se obtiene trabajando con una misma
solucin coloreada (de concentracin constante) y midiendo los valores de Absorbancias correspondientes
a distintas longitudes de onda seleccionadas dentro de un determinado rango de trabajo. El grfico de
Absorbancia en funcin de longitud de onda constituye el espectro de absorcin de la sustancia y es
caracterstico de cada sustancia. En general cuando no se sabe nada de la sustancia coloreada en estudio se
realiza un barrido a lo largo de todo el visible es decir de 400 a 700 nm.

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Dicho espectro podr presentar uno o varios picos de mxima absorcin, propios de cada sustancia en
particular. En el TP lo analizarn por ejemplo, con el azul de Metileno y el Paranitrofenol. El espectro de una
sustancia puede utilizarse tambin como criterio de identificacin. Para ello se debe disponer de antemano
de un espectro de la supuesta sustancia con el cual se pueda comparar el barrido espectral realizado con
sustancia en estudio. Adems, como nos permite visualizar la variacin de la Abs y de la absortividad (dado
que la concentracin es constante) con la longitud de onda, ello puede ser aplicado para decidir una
longitud ptima de trabajo en el caso que por ejemplo, se quiera realizar la cuantificacin de una sustancia.
(Ver ms adelante en Eleccin de la longitud ptima de trabajo). Ir
Otra aplicacin consiste en utilizar un barrido espectral de una sustancia en particular, para evaluar el
comportamiento de parte del instrumental. En este caso se debe conocer previamente el espectro de la
sustancia elegida y en el mismo deben aparecer picos bien definidos de mxima absorbancia.
Especficamente lo trabajarn en el TP cuando realicen el control de centro de banda que se ver en el
apartado de controles espectrofotomtricos.
Ir

Instrumentacin
Para comprender el funcionamiento del espectrofotmetro se puede analizar el siguiente esquema bsico:

Fuente de Ranura de Sistema de Ranura de Cubeta Detector

luz entrada monocromacin/ salida con
selector de muestra

Figura 3: Esquema de un espectrofotmetro

La fuente de luz proporciona un haz policromtico que es colimado al atravesar la ranura de entrada.
Este haz llega a un sistema de monocromacin y despus con el selector de longitud de onda, se asla un
haz monocromtico de la longitud de onda deseada. Luego, el rayo de luz monocromtico incide
perpendicularmente sobre la pared de la cubeta, la cual contiene la muestra. El haz de luz transmitido al salir
de la muestra impacta sobre el detector, donde la intensidad luminosa se convierte en intensidad elctrica,
mediante un proceso electrnico. Luego, dicha seal se transforma en una lectura de transmitancia
porcentual o absorbancia que aparece en el display.

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El espectrofotmetro es una herramienta importante del laboratorio y de su buen funcionamiento depende

la calidad de los resultados que se obtienen. Para informar un resultado confiable es necesario estar seguros
de que el equipo utilizado funcione correctamente, por ello se realizan los controles espectrofotomtricos.
stos permiten controlar y analizar determinados parmetros y verificar si se encuentran dentro de los
rangos de aceptabilidad establecidos, o bien en caso contrario, proceder a calibrar o a reparar. A su vez, la
realizacin de los controles espectrofotomtricos deben efectuarse con cierta periodicidad que depender
de cada control en particular.

A- CONTROLES ESPECTROFOTOMTRICOS

1. Control de luz espuria accidental

La luz espuria accidental o errtica es toda luz que llega al detector sin haber atravesado la muestra cuya
absorbancia se quiere medir, pudiendo ser de la misma o de diferente longitud de onda que la seleccionada.
Se puede ver esquemticamente en figura 4.

Figura 4: Luz espuria. 1: reflexiones internas, dentro del tubo;

2: luz que pasa por arriba del menisco de la solucin;
3: luz que llega por los costados del tubo sin atravesar la muestra

Observando la figura, la luz que llega al detector puede provenir de reflexiones internas dentro del tubo o
cubeta (1). En otros casos puede pasar por arriba del menisco de la solucin a medir (2), por ejemplo
cuando se trabaja con un volumen inferior al volumen mnimo. Tambin puede pasar por los costados del
tubo o cubeta por afuera (3), cuando el espesor del tubo o cubeta es menor al que le corresponde de
acuerdo al portatubo o portacubetas del instrumento. Otra situacin donde hay luz espuria accidental,
ocurre cuando hay un inapropiado cierre del compartimento donde se ubica el tubo con la muestra.
Tambin puede deberse a la presencia de goteras en el del aparato (orificios en la carcasa del aparato por
donde entra luz) que pueden detectarse iluminando el instrumento desde el exterior con una linterna,
cuando el mismo est siendo usado en la zona del visible. La gotera puede corregirse tapndola con cinta
negra. Otra causa de produccin de luz espuria accidental puede ser el mal alineamiento de la cubeta o del
sistema porta cubeta o de la fuente de luz.

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La luz espuria se mide en porcentaje de transmitancia y es importante que dicho porcentaje sea bajo. De lo
contrario, se pueden producir desviaciones de la linealidad instrumental, dado que llega al detector ms luz
de la que debera. El porcentaje mximo aceptado de luz espuria es del 1 %.
Los mtodos para detectar la luz espuria accidental incluyen filtros o soluciones que son opacos en los
rangos habituales de trabajo. As se puede utilizar una cubeta de obstruccin de paso de luz (que es una
cubeta pintada de negro o sea un cuerpo negro) o bien una solucin hiperconcentrada de colorante. En
todos los casos se leer la transmitancia contra una cubeta con agua, a la seleccionada dentro del visible. El
valor ledo representa directamente el % de luz espuria accidental.
Adems de la luz espuria accidental existe la luz espuria parsita, que es la radiacin electromagntica de
longitud de onda distinta a la seleccionada con el selector de que llega al detector, pasando o no por la
muestra. Es decir es luz de distinta (luz de distinto color) que la nominal. Como consecuencia de ello,
hay un aumento no deseado de transmitancia (o, una disminucin de la absorbancia), dado que la luz
espuria parsita no es absorbida por la solucin en la misma proporcin que la nominal. Como este
fenmeno es ms frecuente en los extremos del espectro visible, es comn utilizar para su deteccin
paranitrofenol, que es un colorante que tiene su pico de absorcin en uno del los extremos del visible (405
nm) donde se supone que la luz parsita se observa en mayor proporcin. Este control de luz parsita debe
hacerse con una solucin hiperconcentrada en una zona de mxima sensibilidad y el detector debe recibir
luz, o sea que la solucin contenida en el tubo debe permitir el pasaje de luz. Por ello no puede emplearse
un cuerpo opaco (cubeta negra) pues obstruira el pasaje de luz al detector de cualquier tipo de luz espuria
(parsita o accidental). La luz parsita est relacionada con fallas en el sistema de monocromacin,
especialmente cuando se utilizan redes de difraccin donde la calidad de la misma puede variar segn su
construccin (ver redes de difraccin en anexo espectrofotometra) Ir
Este control debe realizarse trimestralmente.

2. Control de volumen mnimo

Se considera como volumen mnimo, al mnimo volumen contenido en una cubeta a partir del cual la lectura
se estabiliza y no vara con el agregado de ms lquido. Dicho control nos asegura que toda la luz pase por la
solucin y no pase por arriba o por el menisco, lo que producira resultados errneos.
Este control es importante tambin desde el punto de vista econmico, pues cuanto menor sea el volumen
mnimo, ms economa se puede lograr en el uso de reactivos. Es fundamental realizarlo cuando se lo utiliza
por primera vez y sobre todo cuando el aparato es nuevo pues muchas veces el fabricante indica un valor
mnimo inferior al real, lo que puede acarrear serios errores en las determinaciones.

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Ahora en la prctica, no se coloca en la cubeta un volumen igual al volumen mnimo, sino que se utiliza un
volumen superior a ste en un 20% que se denomina volumen de trabajo. Esto se hace pues muchas veces
al realizar el trasvasado desde el tubo primario (donde por ejemplo, se realiza la reaccin colorimtrica) a la
cubeta de lectura, puede que quede una pequea porcin del volumen en el tubo de reaccin. Como
consecuencia si el volumen en el tubo primario corresponde al volumen mnimo calculado, el volumen que
llegue a la cubeta de lectura puede que sea menor a ste. Por esta razn, al usar el volumen de trabajo nos
asegurarnos que en la cubeta de lectura, el volumen siga siendo apropiado para leer correctamente.

3. Control de cubetas
Se realiza para comprobar las cualidades pticas y de construccin de las cubetas de medida. Se mide la T %
de las cubetas llenas de agua o solucin diluida de colorante, tomando una de las cubetas cargadas como
referencia y verificando las desviaciones de las dems. Para poder usarlas entre la cubeta de referencia y
cada una de testeadas no debera existir una variacin superior al 1% de T, que se deber corregir como
error sistemtico, siempre que la diferencia sea pequea.
La finalidad de tener varias cubetas de iguales caractersticas es agilizar el proceso de medida, sobre todo
cuando son varias las muestras a analizar. Para trabajar la idea es conseguir al menos dos o tres cubetas que
cumplan con el control. En el caso de no conseguir cubetas que renan esta condicin se deber trabajar
siempre con la misma cubeta y mantenindola en la misma posicin de lectura.
Este control se debe realizar cada vez que se usen las cubetas.

4. Control de centro de banda:

Este control tiene como finalidad verificar la concordancia entre la longitud de onda fijada con el selector del
instrumento (la leda en el display) y la real que es la que llega efectivamente a la muestra, en aparatos de
rango continuo.
Para realizar este control debe hacerse un barrido espectral con una sustancia conocida tomada como
referencia y de espectro conocido. Estas sustancias deben presentar en su espectro uno o ms picos de
absorcin que deben ser estrechos y estar bien definidos. Esto implica que deben conocerse las longitudes
de onda mxima, que son las longitudes de onda correspondientes al valor de mxima absorcin de cada
uno de los picos, con un alto grado de confianza. Adems, los picos deben estar
distribuidos dentro de todo el intervalo espectral del instrumento (recordar que abarcan las zonas del visible
y parte del UV e IR). As son ideales los filtros de cristales de holmio que presentan varios picos
caractersticos a: 333, 418, 453, 536 y 636 nm. Tambin los filtros de didimio y las soluciones de dicromato

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de potasio cumplen con estos requisitos. Sin embargo, muchas veces por una cuestin econmica o de
complejidad en la preparacin, no se dispone de sustancias de referencia que abarquen todo el rango
espectral, entonces puede recurrirse a sustancias que abarquen un rango ms estrecho y que sern tiles
para un determinado rango de trabajo. Supongamos que se realiza el barrido espectral con una sustancia de
referencia que presenta un solo pico en el visible y del cual se conoce su correspondiente longitud de onda
mxima. Si luego de haber realizado la medicin el valor de la longitud de onda correspondiente al valor de
mxima absorbancia ledo, coincide con el valor de longitud de onda de referencia de dicho pico, podremos
asegurar que en esa zona el aparato trabaja a las longitudes de onda indicadas por el selector pudiendo
trabajar con confianza en ese intervalo. Ahora bien, esto no asegura que en otros rangos de longitud de
onda exista igual correlacin, por ello se utilizan otras sustancias con mximos en otras zonas para poder
complementar el control.
Otro mtodo de control de centro de banda es el mtodo del punto isosbstico. El punto isosbstico se
define como la longitud de onda a la cual las formas cida y bsica de una misma sustancia, en
concentraciones equivalentes, tienen igual absorbancia. Las sustancias que cumplen esta condicin son
algunos indicadores colorimtricos de pH como el rojo congo, rojo fenol, azul de bromofenol, entre otros. La
importancia del mtodo radica en que el punto isosbstico es independiente de la concentracin de la
sustancia y de la temperatura entre 4 y 45 C. Se deben realizar los espectros de absorcin de alguna de las
sustancias mencionadas en sus formas cida y alcalina en igual concentracin, y a partir de ellos determinar
grficamente el punto isosbstico (ver figura 5). Obsrvese que tambin es un control zonal.

1,2

0,8
Absorbancia

S. Alcalina
0,6
S. cida

0,4

0,2

0
400 450 500 550 600
Longitu de onda (nm)

Punto Isosbstico

Figura 5. Espectros de un colorante en sus formas cida y bsica

para determinar el punto isosbstico

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Luego de realizado el control, el resultado puede indicar que la real y la leda coincidan o bien puede haber
una diferencia entre ambas. Esa diferencia se la conoce como desplazamiento o corrimiento de la longitud
de onda y se mide en nm. Si sta es pequea y entra dentro del rango de aceptabilidad estipulado se la pude
considerar como error sistemtico y corregir. En caso contrario de debe realizar un ajuste de la escala de
longitudes de onda por parte del servicio tcnico.
El control de centro de banda debe realizarse al instalar o reinstalar el aparato, al cambiarlo de ubicacin, al
cambiar la lmpara y por lo menos semestralmente.
Por ltimo, hay que tener presente que en muchas de las determinaciones colorimtricas utilizadas en la
prctica profesional, se conoce de antemano la longitud de onda ptima de trabajo (ver apartado ms Ir
adelante), como Uds. lo vern en el TP en la determinacin de protenas por el mtodo de Biuret. Esto es til
Ir
pues conociendo dicho valor, se evita realizar un barrido espectral y se ahorra tiempo. Teniendo en cuenta
que la longitud de onda ptima de trabajo seleccionada se corresponde con un mximo de absorcin del
cromgeno en la mayora de los casos, si sta por corrimiento del selector, no coincide con la estipulada, lo
ms probable es que se pierda sensibilidad al realizar las medidas. Si adems, el pico es muy estrecho, la
bajada de absorbancia alrededor de dicha longitud ptima ser muy abrupta y al variarse mnimamente la
longitud de onda con el selector se producir un error muy significativo en el valor de la lectura (ver el
apartado desviaciones de la ley en Anexo de Espectrofotometra). En otros casos, para calcular la actividad
Ir
de una enzima, la tcnica directamente incluye el uso de un factor a aplicar a las lecturas para conocer
directamente dicha actividad. Si la longitud de onda no es la correcta el resultado no ser vlido, pues
estaramos cometiendo error en la medida de absorbancia al trabajar a otra longitud de onda.

5. Control de linealidad fotomtrica:

Indica la linealidad de respuesta del sistema de deteccin, y por ende el rango de utilidad de medida del
instrumento. En espectrofotmetros de alta calidad se obtienen respuestas lineales hasta valores cercanos a
2,000 de absorbancia.
Para este control se debe trabajar por ejemplo con algn colorante en solucin, que se sabe que cumple con
la Ley de Lambert-Beer, es decir que presenta un comportamiento lineal entre absorbancia y concentracin
en el rango de trabajo utilizado.
Para realizarlo, se debern medir las absorbancias de soluciones de concentraciones crecientes del colorante
utilizado y contrastar dichos valores con las absorbancias de referencia certificadas (que figuran en el inserto
que viene con las soluciones o en el rtulo de los envases de las soluciones de referencia). Si el equipo

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cumple con el control, el grfico de absorbancia experimental en funcin de absorbancia de referencia ser
lineal hasta el ltimo valor de absorbancia experimental y ste ltimo valor ser el mximo valor de
absorbancia aceptable para cualquier otra medida. En el caso de que el equipo testeado no presente
linealidad en todo el rango, se deber informar hasta que valor de absorbancia experimental hay linealidad.
Para realizar este control, cuando no se dispone de los valores de referencia de absorbancias y s se conocen
las concentraciones de las soluciones a medir, se puede realizar un grfico de absorbancia en funcin de
concentracin a partir del cual tambin se podr evaluar la linealidad fotomtrica. Por cualquiera de los dos
procedimientos empleados, el valor mximo de absorbancia obtenido si bien es medido a una determinada
, ser tambin el mximo valor aceptable a cualquier otra del espectro visible.
La baja linealidad puede ser debida a problemas electrnicos, presencia elevada de luz espuria (mayor al 1%
de T) entre otros factores y debe ser corregida por el servicio tcnico del equipo. Este control se debe
realizar trimestralmente.
Por otra parte, es importante no confundir linealidad fotomtrica, que es la que se verifica con este control,
con el cumplimiento de la Ley de Lambert-Beer por parte de una sustancia dentro de un determinado rango
de concentraciones. Con este control se ve si efectivamente el instrumento responde linealmente. Por
esto es que se debe elegir una sustancia que sepamos de antemano que cumple con Lambert-Beer en los
rangos de concentracin utilizados.
Supongamos ahora que disponemos de un instrumento que responde correctamente al control de linealidad
fotomtrica en todo el rango de trabajo medido y que con l queremos estudiar una sustancia cuyo
comportamiento es desconocido. Si luego de realizadas las medidas de absorbancia correspondientes a
distintas concentraciones de la sustancia, el resultado indica que la relacin no es lineal, esto nos permitir
afirmar con seguridad el no cumplimiento de Lambert-Beer por parte de esta sustancia, aseveracin que no
podramos mantener si nuestro aparato no hubiese respondido linealmente.

6. Control de veracidad fotomtrica:

A travs de ste control se verifica la concordancia entre la absorbancia de referencia, obtenida con una
solucin estndar de referencia certificada medida en un equipo calibrado, y la absorbancia de la misma
solucin medida en el equipo que se est controlando. Por lo tanto el control permite analizar la veracidad
de los resultados obtenidos con el equipo controlado.
La veracidad fotomtrica se calcula mediante el clculo del error fotomtrico porcentual (EF%) segn la
siguiente expresin
(Abs exp Abs ref) . 100
EF % = +/- Ecuacin 17
Abs ref

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Donde la Abs exp corresponde al promedio de la serie de medidas realizadas de la solucin de referencia con
el instrumento a controlar.
En la prctica el valor ledo de absorbancia no debe variar significativamente del valor de referencia, pues a
partir de una absorbancia leda se puede determinar, como comentamos anteriormente, la concentracin un
analito o una actividad enzimtica. En sta ltima muchas veces aplicando solo un factor de clculo y de
acuerdo a los valores informados a veces implica cambiar el rumbo en una investigacin o en otros casos,
una toma de decisin por parte del mdico en cuanto a resolver un diagnstico, medicar o suprimir la
medicacin del paciente. De all la importancia de este control en los aparatos de medida. Luego, ese valor
ser confiable solo en el caso de que haya veracidad fotomtrica.
Estos controles deben realizarse con estndares que cumplan ciertos requisitos tales como tener un valor de
absorbancia estable a la longitud de onda de trabajo, presentar un pico ancho de absorcin, un alto
coeficiente de extincin molar, ser mnimamente sensible a las variaciones de geometra del haz de luz,
como as tambin a la variacin del coeficiente de extincin con la temperatura. Se utilizan como patrones
filtros de vidrio neutros que poseen absorbancia conocidas a distintas longitud de onda, tambin soluciones
de dicromato de potasio en medio cido para UV, y soluciones como la cianmetahemoglobina, sales de
cobalto o de cobre, en medio cido.
Algunas de las fallas por las que el instrumento pueda no cumplir satisfactoriamente con este control
pueden ser: el envejecimiento de la lmpara, el agotamiento del fototubo, un defecto en la calibracin de la
longitud de onda, el compartimento de muestra mal centrado con respecto al sistema ptico del
instrumento, una elevada absorcin por parte de las cubetas, si no estn hechas del material adecuado (por
ejemplo, en UV se trabaja con cubetas de cuarzo pues el vidrio absorbe significativamente).
Este control se debe realizar mensualmente.

7. Control de la precisin fotomtrica

Este control tiene como finalidad evaluar la repetitibilidad de una serie de medidas de Absorbancia
obtenidas al realizar varias medidas de una misma solucin. A mayor repetitibilidad en la serie de datos,
habr mayor precisin o bien menor dispersin.
El resultado del control se expresa a travs de una medida de la dispersin mediante el clculo del
coeficiente de variacin porcentual (CV%), que relaciona la desviacin estndar (S) con la media de la serie
de medidas (Abs exp) expresada en forma porcentual segn indica la ecuacin:

S . 100
CV% = Ecuacin 18
Absexp

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Para realizar el control se puede utilizar una solucin coloreada cuyo requisito bsico es que su valor de
absorbancia sea estable a travs del tiempo. Se utilizan por ejemplo, soluciones de sulfato cprico o cloruro
de cobalto en medio cido. No es necesario emplear una solucin de referencia certificada.

Algunas consideraciones generales para tener en cuenta en el trabajo espectrofotomtrico:

Rango ptimo de lectura en las medidas de transmitancia y absorbancia:

Cuando realizamos medidas de absorbancia o de transmitancia existe un rango de medidas recomendable.
ste es el comprendido entre 0.100 y 1.000 para Abs y su equivalente en T, que es entre el 80% y 10%
respectivamente. Esto es as ya que en esta regin es donde el error espectrofotomtrico debido a la
Ir
medida de T es menor (Ver el apartado Errores analticos en la medida de Transmitancia y Absorbancia en
Anexo de Espectrofotometra).

Eleccin de longitud de onda ptima de trabajo:

Si disponemos de una sustancia de la cual ya conocemos su espectro y queremos trabajar con ella a una
determinada longitud de onda para ver si cumple con la ley de Lambert-Beer o realizar una cuantificacin, la
pregunta que surge es cul ser la longitud de onda adecuada para trabajar? La respuesta tendr que ver
Ir
con el anlisis del espectro obtenido. (Ver el apartado desviaciones de la ley en Anexo de
Espectrofotometra). Este podr presentar distintos picos de mxima absorcin que podremos identificar,
adems de individualizar las correspondientes longitudes de onda mxima para cada uno de ellos. Tambin
podremos encontrar zonas de absorbancias estables dentro de un rango de longitudes de onda ms menos
amplio. Para elegir la longitud de onda ptima de trabajo se utilizarn los siguientes criterios:
Se prefiere un mximo de absorbancia, dado que as se obtiene mayor sensibilidad en las lecturas,
siempre que ste se encuentre dentro del rango de absorbancias recomendadas en el apartado anterior.
Hay que evitar en lo posible, trabajar en regiones del espectro donde hay cambios bruscos de
absorbancia, ya que un pequeo desplazamiento en la longitud de onda puede causar un error grande
en la correspondiente lectura.

Muestra, Testigo y Blanco:

En el trabajo prctico se realizar una reaccin colorimtrica para determinar la concentracin de protenas
totales presentes en una muestra (o solucin incgnita), midiendo su absorbancia y la de soluciones

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Testigos, siendo el testigo una solucin que contiene el mismo analito a dosar en la muestra y cuya
concentracin es conocida.
Para determinar la concentracin de un analito en una muestra, el valor de absorbancia de la misma debe
ser la correspondiente exclusivamente a dicho analito. En la prctica cuando el analito no es coloreado se
usa una reaccin qumica, donde el color generado se debe a la reaccin del analito (contenido en la
muestra) con el reactivo (tal es el caso para protenas con la reaccin del Biuret). Si en un tubo, al que
llamaremos el tubo de muestra, colocamos la muestra y el reactivo (estando ste ltimo en exceso) al
reaccionar generarn color dando como resultado un valor de absorbancia. La absorbancia medida se
deber a la contribucin de todos los componentes presentes. Es decir a la muestra y al exceso de reactivo,
en el caso de que este ltimo absorba. En el caso del Biuret el reactivo presenta color a simple vista y
absorber a la longitud de onda elegida para medir la absorbancia debida a la reaccin colorimtrica. En
otros casos la presencia de un solvente o sustancias presentes en la muestra que no sean especficamente el
analito pueden absorber a la longitud de onda de trabajo y por lo tanto contribuir a la absorbancia leda de
dicho tubo. Por ello se deben preparar otros tubos que contengan a stos para descontar dicha/s
absorbancia/s ya que no corresponde/n al analito que se quiere medir. Estos tubos adicionales pueden ser:
Tubo de referencia o blanco de solvente: este tubo puede contener agua o el solvente que se utilice en la
reaccin y que estar presente en todos los tubos. Contra este tubo se leern todos los dems tubos, es
decir con l se llevar a cero de absorbancia y ser la referencia.
Tubo de blanco de reactivo: este tubo se denomina as pues contiene todos los reactivos necesarios para
que se realice la reaccin, pero no contiene a la muestra o al testigo. Por lo tanto la medida de absorbancia
de ste ser descontada a la del tubo de muestra y a la del tubo de testigo para obtener por diferencia el
valor de la absorbancia debida solamente a la muestra o al testigo, segn corresponda.
Tubo de blanco de muestra: este tubo contiene a la muestra pero no al reactivo. Se utiliza para medir la
contribucin de otros analitos o sustancias interferentes que estn presentes en la muestra y que no son el
analito a procesar y que pueden absorber a la longitud de onda de trabajo y por lo tanto contribuir a la
absorbancia final del tubo de medida. La medida de absorbancia de este tubo tambin ser descontada del
tubo de muestra.
Tubo de blanco de testigo: contiene al testigo pero no al reactivo y tiene la misma finalidad y tratamiento
que el blanco de muestra pero se utiliza el testigo en vez de la muestra y su absorbancia ser descontado al
tubo testigo.
En todos los casos se reemplaza el volumen de reactivo, muestra o testigo, por un volumen igual de solvente
en el tubo segn corresponda.

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B- DETERMINACIN DE PROTENAS POR UN MTODO ESPECTROFOTOMTRICO

Una de las tantas aplicaciones que tiene la espectrofotometra es la deteccin y cuantificacin de sustancias
detectables mediante una reaccin colorimtrica. Como comentamos, en el trabajo prctico determinarn la
concentracin de protenas totales presentes en una solucin utilizando la tcnica del Biuret.
El reactivo de Biuret contiene sulfato de cobre en medio alcalino y permite la cuantificacin de protenas por
la formacin de un complejo coloreado. Esto se debe a que los enlaces peptdicos de las protenas
reaccionan con el in cprico, en medio alcalino y dan un complejo coloreado con un mximo de absorcin a
540 nm. La absorbancia de esta solucin coloreada es proporcional a la concentracin de protenas totales
presentes en la muestra, en un rango comprendido entre 0,1 y 100,0 g de protena por L de solucin.
Para determinar el valor de las protenas en una muestra desconocida mediante esta tcnica, adems de
procesarla segn indica el protocolo (ver gua de TP), se debe realizar una curva de calibracin. Para esto una
serie de testigos de distintas concentraciones, se procesarn de la misma forma que la muestra. Luego de
registrar sus absorbancias se graficarn dichos valores en funcin de sus correspondientes concentraciones,
obteniendo as el grfico de calibracin. Esta relacin deber ser lineal, pues las concentraciones de los
testigos utilizados, estn comprendidos dentro del rango de validez de la ley. Si luego el valor de absorbancia
correspondiente a la muestra se encuentra dentro de dicho rango se podr obtener desde la ecuacin de
calibracin, el valor de la concentracin la muestra.
Importante: recordar que las absorbancias de las soluciones incgnita y testigo sern las calculadas luego de
descontar las contribuciones de los blancos correspondientes y debern estar comprendidas dentro del
rango de linealidad de la reaccin.
La curva de calibracin se puede realizar con testigos certificados (de origen comercial) que se denominan
calibradores y que presentan un bajo rango de incertidumbre.
Otras veces, cuando por ejemplo se deben procesar muchas muestras en un mismo da y se dispone de la
curva de calibracin realizada con anterioridad pueden surgir las siguientes preguntas se debe volver a
calibrar de para determinar la concentracin de protenas de cada muestra? o se puede seguir utilizando la
ecuacin provista por la calibracin? Para responderlas, adems de procesar las muestras se debe procesar
siempre uno o ms testigos que funcionen testeando el proceso de medida en ese momento. Estos
testigos se conocen como controles de calidad y son tambin certificados como los calibradores aunque ms
econmicos, lo que permite utilizarlos en cada medicin (si bien presentan un rango un poco mayor de
incertidumbre que los calibradores, esto no va en detrimento de su funcin). Entonces, si luego de procesar
este control, utilizando la ecuacin de calibracin, se obtiene un valor de concentracin dentro de un rango

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aceptable (segn los valores indicados por el proveedor), entonces ser vlido mantener la calibracin y
obtener los resultados de las muestras a partir de ella. En caso contrario, se deber volver a calibrar
nuevamente para obtener el resultado de cada muestra.

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