Guia de Practicas de Microbiologia 2017

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA
DEPARTAMENTO ACADMICO
DE CIENCIAS BSICAS
GUA DE PRCTICAS
DE
MICROBIOLOGA
SEGUNDO AO
SEGUNDO SEMESTRE ACADMICO
2017 - II
CHICLAYO - PER
1
Introduccin
El Manual de Prcticas de Microbiologa tiene como objetivo orientar a los alumnos a un

mejor conocimiento y aplicacin de los procedimientos de identificacin y aislamiento de la
variada flora microbiana de importancia en medicina humana. La microbiologa es una
disciplina que estudia la biologa de los microorganismos capaces de producir enfermedad.
Desde que se describiera por primera vez la morfologa de las bacterias (Leeuwenhoek
.Siglo XVII), luego el aislamiento y diagnstico de distintos microorganismos sobre todo en las
dos ltimas dcadas del Siglo pasado en la que se inicia la denominada poca dorada de la
bacteriologa , sta ha evolucionado tremendamente. Continuamente se describen procesos
infecciosos as como situaciones nuevas en los pacientes motivando ello la disponibilidad de
informacin cientfica relacionada con la microbiologa clnica y la infectologa.
Los avances tecnolgicos con aumento de la automatizacin, el desarrollo de la biologa

molecular, la qumica de los cidos nucleicos, los avances en inmunologa clnica y los
conocimientos de la patogenicidad microbiana hacen necesario la revisin continua de los
textos de microbiologa.
Tenemos el convencimiento que sta orientacin acadmica proporcionar a los alumnos

de la Asignatura de Microbiologa los recursos para preveer el inicio del padecimiento , as
como la base para la orientacin teraputica y la prevencin de las enfermedades infecciosas.
Se da una relacin concisa de los mtodos de laboratorio empleados en el estudio de las

bacterias, hongos, rickettsias y virus. Con tal motivo sern expuestos conceptos y ejercicios
fundamentales, con lo que esperamos uniformar criterios acorde con la actualizada tecnologa.
Los trabajos de laboratorio se han ordenado metodolgicamente a fin de facilitar la

aplicacin de los conceptos bsicos y as llegar al diagnstico de los diferentes procesos
infecciosos en humanos.
El objetivo de estas prcticas consiste en familiarizar al alumno con algunas de las tcnicas
ms comnmente utilizadas en los laboratorios de Microbiologa y permitir la observacin
experimental de los conceptos aprendidos durante las clases tericas.
Debemos dejar establecido que el presente Manual de Prcticas , no es una compilacin

amplia del tema, sino un Manual que contiene los requerimientos bsicos y orientacin,
adecuando los recursos y procedimientos que contribuirn a cimentar la formacin integral del
mdico humano.
Como docentes, nos sentiremos satisfechos si al final del curso se han cumplido los
objetivos, utilizando los elementos y procedimientos de diagnstico en el proceso enseanza
aprendizaje.
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Generalidades
El estudio de las bacterias y de su estructura es particularmente difcil, debido al tamao

que presentan, siendo ste entre 1 y 6 micras. Para su observacin se requiere el empleo del
microscopio de luz , el cual , no proporciona el suficiente poder de resolucin que permite
observar las diferentes estructuras de las bacterias lo que hace necesario el uso del
microscopio electrnico.
Para la observacin y estudio de las bacterias se utilizan diversos mtodos. El ms simple

de ellos consiste en la observacin en fresco, de esta manera se visualizan caractersticas
someras que proporcionan una idea del tamao, forma y en ciertas especies la movilidad;
estos aspectos pueden mejorarse con el empleo del microscopio de contraste de fase.
Otra tecnologa que permite observar con mayor claridad a las bacterias, lo constituyen los
mtodos tintoriales , que facilitan el estudio de la forma , agrupamiento, y afinidad a diversos
colorantes. Entre las tcnicas de mayor utilidad destaca la tincin de Gram, la cual permite
clasificar a las bacterias segn su afinidad tintorial en Gram positivas y Gram negativas.
Existen grupos bacterianos que para su observacin requieren otras tcnicas como la de
Ziehl-Neelsen, la cual identifica a las bacterias cido-alcohol resistente. Algunas bacterias
poseen ciertas estructuras importantes que pueden ser evidenciadas mediante tcnicas de
coloracin especial como por ejemplo, para observar cpsula, esporas, flagelos .
Para realizar el diagnstico de hongos y virus existen tcnicas particulares, las mismas
que sern descritas en los captulos correspondientes.
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CRONOGRAMA DE PRCTICAS
SEMANA FECHA TEMA

Prctica de Laboratorio N 1:
1ra 10 agosto
Bioseguridad Practica
2da 17 agosto
Obtencin y manejo de muestras clnicas
3ra 24 agosto Preparacin, fijacin y coloraciones bacterianas (coloracin simple y
coloracin diferencial: Gram y Ziehl Neelsen )
4ta 31 agosto
Medios de Cultivo, Mtodos de siembra y aislamiento bacteriano
5ta 07 septiembre
Pruebas bioqumicas para bacterias grampositivas
6ta 14 septiembre
Actividad antimicrobiana in vitro: Antibiograma
7ma 21 septiembre
Pruebas bioqumicas para bacterias gramnegativas (enterobacterias)
8va 28 septiembre SEMANA DE EXAMENES PARCIALES
9na 05 octubre Suspensin de prcticas por Semana de la Medicina
10ma 12 octubre Cultivo de muestras clnicas: Urocultivo, Coprocultivo
Prctica de Laboratorio N 9: Identificacin y aislamiento de
Mycobaterium.
11va 19 octubre
Coloracin de Ziehl- Neelsen y Aislamiento de Bacterias Anaerobias
Prctica de laboratorio N10:

Diagnstico micolgico: hongos ambientales.
12va 26 octubre Prctica de Laboratorio N11:
Tcnicas de diagnstico micolgico: Diagnstico de micosis
superficiales y cutneas.
13va 02 noviembre Tcnicas de diagnstico micolgico: Diagnstico de micosis
subcutneas, sistmicas y oportunistas.
14va 09 noviembre Diagnstico virolgico
15 va 16 noviembre Revisin y repaso de prcticas de microbiologa
16 va 23 noviembre SEMANA DE EXAMENES FINALES
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PRCTICA N 1
Normas de Bioseguridad
Disposiciones Generales
En general en todo laboratorio deben seguirse normas que garanticen la calidad de las
tcnicas y asimismo, la seguridad en el trabajo. En el caso particular del Laboratorio de
Microbiologa donde se trabaja con materiales susceptibles de contaminacin accidental, se
recomienda la adopcin rigurosa de normas de seguridad e higiene a fin de evitar el riesgo de
infeccin de las personas que en l laboran.
Con tal motivo, en el Laboratorio de Microbiologa se consideran cuatro niveles de seguridad

biolgica, segn los microorganismos con los que se trabaja :
Nivel 1 : Microorganismos no patgenos y patgenos oportunistas

Nivel 2 : Microorganismos o muestras con un potencial de riesgo moderado
Nivel 3 : Microorganismos y muestras de alto riesgo; los trabajos se realizan en cabinas de
seguridad , nunca en las mesas.
Nivel 4 : Microorganismos de altsimo riesgo , solo se hacen en laboratorios de
experimentacin y no en laboratorios de microbiologa clnica . Se requiere este nivel cuando
se maneja microorganismos de riesgo, especialmente virus, tambin con algunas bacterias y
hongos.
De toda forma durante las prcticas se deben cumplir las siguientes recomendaciones :
1. Los alumnos ingresarn a la Sala de Prcticas solamente con el uniforme obligatorio y el

mandil . No est permitido el ingreso con otras prendas de vestir o cualquier otro objeto
diferente al material asignado para el ejercicio.
2. Observar en todo momento las medidas de asepsia con el material de trabajo . Los
profesores de cada grupo les indicarn la metodologa a seguir.
3. Est prohibido comer, beber y/o fumar durante las clases prcticas, as como llevarse los
dedos , el lpiz o cualquier otro objeto a las proximidades de la boca y ojos.
4.La evaluacin de los alumnos de las asignaturas correspondientes al Departamento de

Ciencias Bsicas se regir segn el Reglamento de Evaluacin de Estudiantes de Pregrado ,
Perodo Lectivo 2013.
5. Por razones de seguridad, ningn material de prcticas saldr de la sala de trabajo. En

caso que se rompa algn material de vidrio con cultivo microbiano , avisar de inmediato al
profesor para que disponga la inmediata desinfeccin y limpieza.
6. Uno de los instrumentos de trabajo , el asa o mango de Kolle , terminado el ejercicio

programado deber ser esterilizado mediante flameado , de acuerdo con las instrucciones
dadas por el profesor.
7. Todo material de trabajo como son: lminas portaobjetos, laminillas o pipetas, debern ser
depositadas en los bocales de vidrio con solucin desinfectante, los que estarn a la vista en
cada mesa. Si fuera material de desecho , como restos de algodn , papel, etc. , depositarlos
en los recipientes para la basura, nunca en la mesa de trabajo o en el suelo . Los tubos,
placas de Petri o frascos de cultivo se dejarn en canastillas o depsitos destinados para ser
esterilizados.
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8. Los profesores estarn en todo momento atentos para orientar y/o resolver cualquier duda
que se presente en el desarrollo de las prcticas.
9. Cada alumno debe disponer obligatoriamente del Manual de Prcticas, el que deber ser
estudiado con anterioridad a cada ejercicio, de forma tal que tenga conocimiento previo de los
ejercicios que se van a presentar.
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Material y Equipo bsico en las prcticas de Microbiologa
En el campo de la microbiologa mdica se requieren de conocimientos bsicos,

indispensables para facilitar el estudio de los diferentes microorganismos ; por tal motivo es
necesario que el alumno se familiarice desde el principio con el material y equipos empleados
en el aislamiento e identificacin de los microorganismos
(bacterias, hongos y virus) . Ellos deben ser debidamente preparados y posteriormente
esterilizados para asegurar que los ejercicios renan los requisitos exigidos para el trabajo
microbiolgico. A continuacin se describen algunos de ellos:
Asa y aguja de siembra : Muy usada en la prctica microbiolgica, hecha de alambre de

platino o de otro material , se inserta en un mango que facilita su manejo. El alambre puede
ser recto o terminar en forma de pequeo anillo.
Autoclave : Aparato para esterilizacin por vapor bajo presin , provisto de manmetro y una
llave que regula la presin y la temperatura a la que desea esterilizar.
Cabina de Flujo laminar : Equipo que proporciona rea estril , para los trabajos
microbiolgicos, en especial en cultivos , evitando la interferencia de los microorganismos de
contaminacin ambiental.
Centrfuga : Aparato diseado para acelerar la separacin de partculas slidas suspendidas

en lquidos.
Contador de colonias : Sirve para contar electrnicamente y de forma exacta las colonias de
microorganismos.
Crioviales : Pequeos tubos cnicos de polipropileno resistentes a muy bajas temperatura

(- 4C). Usados para guardar muestras en la congeladora. Ejemplo: suero, cepas virales.
Estufa : Aparato de dimensiones diversas , donde se incuban los cultivos, generalmente a

37C.
Filtros esterilizantes : Para dejar libre de contenido microbiano a productos en estado lquido,
los que por su naturaleza no pueden ser sometidos a la accin del calor en sus diferentes
modalidades.
Gradilla : Soporte para tubos de ensayo.
Jarra de anaerobiosis : Instrumento til para el aislamiento de bacterias anaerobias ya que

permite un cierre hermtico no dejando ingresar oxgeno.
Lmina portaobjetos : Lmina de vidrio que se utiliza para preparar frotis bacterianos.
Matraces y balones : Recipientes volumtricos de gran utilidad para la preparacin y

almacenamiento de soluciones, colorantes , reactivos , medios de cultivo , etc. Los balones se
diferencian de los matraces por tener una base esfrica con fondo plano. En ambos los cuellos
terminan en un discreto reborde lo que les confiere resistencia.
Mechero de Bunsen : Mechero de gas , en el que ste se mezcla con aire antes de producir
la flama. Se utiliza para esterilizar el asa de siembra.
Medios de cultivo : Mezcla de nutrientes esenciales para el crecimiento de microorganismos

.En su composicin se incluye un nmero balanceado de nutrientes y un determinado volumen
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de agua. De acuerdo con su consistencia pueden ser lquidos, semislidos y slidos. Se
presentan en forma deshidratada.
Microscopio : Instrumento ptico utilizado para la observacin de microorganismos que no

son visibles a simple vista.
Pipetas : Son tubos cilndricos de diversos materiales, pueden ser graduadas y sirven para
medir volumen conocido de lquido. Otras no son graduadas y se utilizan para la transferencia
de lquidos.
Pipetas Pasteur : Varillas de vidrio de 4 mm de dimetro y de 20 a30 cm de longitud. Se les

emplea para la toma de pequeos inculos de siembra.
Pipeteadoresautomticos : Pipetas que absorben de forma automtica sin necesidad de uno

aspirar, pequeos volmenes (1l a 1 000 l ) de muestras.
Placa de Petri : recipiente de vidrio o plstico que , en general se usa para contener medio
de cultivo y proporciona una suficiente rea para el crecimiento bacteriano.
Autoclave Cabina de Flujo laminar
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PRCTICA N 2
OBTENCIN Y MANEJO DE MUESTRAS CLNICAS
OBJETIVOS
Realizar los procedimientos adecuados para asegurar las medidas de bioseguridad

apropiadas.
Conocer las tcnicas de toma de muestra y manejo de las diferentes muestras clnicas para
su ptimo procesamiento.
Conocer las precauciones para el manejo y transporte de muestras clnicas.
INTRODUCCIN
En trminos de la efectividad del Laboratorio de Microbiologa , nada es ms importante que la

apropiada seleccin , coleccin y transporte de las muestras clnicas. Estos procedimientos
quedan inutilizados muchas veces por falta de cuidado y mtodos defectuosos usados en la
recoleccin y manejo de las muestras.
Independientemente del hecho que algunos tipos de muestras requieren metodologa de
recoleccin muy especiales, podemos enumerar algunos aspectos generales que deben ser
tenidos en cuenta al coleccionar las muestras clnicas :
La muestra debe ser representativa del proceso infeccioso.
Cuando se va a proceder a tomar un espcimen clnico, es importante evitar la

contaminacin con microorganismos saprofitos del rea. Esta flora normal puede interferir con
la interpretacin del cultivo y enmascarar la presencia del verdadero agente etiolgico de la
enfermedad.
Seleccionar el lugar anatmico correcto de donde se obtendr el espcimen y utilizar la

tcnica apropiada y los instrumentos o elementos adecuados para su obtencin .
Especialmente en el caso de investigar microorganismos anaerobios.
Nunca refrigerar una muestra por anaerobios.
Coleccionar un apropiado volumen de la muestra.

Insuficiente material puede ser causa de resultados falsos negativos.
Junto con la muestra se debe enviar una solicitud de anlisis en la que debe figurar el
nombre del paciente, nmero de identificacin personal, procedencia, tipo de muestra, fecha y
hora de coleccin, especificar regin anatmica, diagnstico clnico, duracin de la
enfermedad, terapia antibitica , prueba requerida e iniciales del funcionario que tom la
muestra.
El paciente debe ser informado en forma clara y sencilla de acuerdo a su grado de

instruccin sobre los procedimientos a realizar.
Obtener en lo posible muestras antes de administrar antibiticos o agentes antimicrobianos.

Si se han administrado, informar de ello al laboratorio. A menudo un lquido cefalorraqudeo no
revela patgenos bacterianos en frotis ni cultivo, cuando se ha tomado un antibitico en las 24
horas anteriores.
Colocar la muestra en un recipiente estril y adecuado para su transporte como cajas,

gradillas, bandejas, llevando en la base papel absorbente embebido en desinfectante , con el
fin de asegurar la sobrevivencia del posible agente infeccioso, evitar derrame del espcimen y
mantener medidas de bioseguridad apropiadas.
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Ordenar siempre un frotis para tincin o coloracin de Gram, para los especmenes que
procedan de cavidades aspticas y anotar su inters en determinado microorganismo.
CRITERIOS DE RECHAZO DE UNA MUESTRA
Hoja de solicitud de anlisis no llenada correctamente

Muestras sin rotular o inadecuadamente rotuladas
Muestras sin medios de transporte adecuado, en contenedores quebrados, rotos o
con derrames
Muestras secas o con contaminacin obvia
Muestras sin preservacin adecuada
Las muestras ms frecuentes en los estudios microbiolgicos son :
ORINA :
En las muestras de orina se pueden realizar diferentes anlisis como : examen microscpico
de orina, urocultivo, determinacin de algunos residuos de medicamento (doping) e
investigacin de microorganismos especiales como Leptospira. El xito de estos exmenes
depender de la tcnica con que se tome la muestra y sobre todo del tiempo transcurrido entre
la toma de la muestra y el anlisis, ya que el proceso de descomposicin que se sucede en la
orina por accin de las bacterias all presentes , modifica el parmetro de los componentes y
muy especialmente altera la carga microbiana.
Procedimiento
Lavarse las manos

Las pacientes mujeres deben realizar previamente el lavado de los genitales externos con
agua y jabn y de adelante hacia atrs, mientras que los hombres solo lo realizarn en el caso
de solicitarse cultivos.
Secarse con un apsito estril
Las muestras deben colocarse en un frasco de boca ancha y tapa de rosca estriles,
depositar aproximadamente entre 30 y 40 ml de preferencia la primera muestra de la maana
a travs del chorro medio (miccionar una buena cantidad en el inodoro y luego en el envase).
En mujeres la miccin debe ser separando los labios mayores de la vulva.
En hombres se hace la retraccin del prepucio de manera que el chorro de orina salga
directamente .
Tapar el frasco con precaucin , evitando contaminar la muestra y/o derramarla.
En casos de nios pequeos utilizar bolsas colectoras adheridas a los genitales.
La muestra debe ser enviada inmediatamente al laboratorio. En caso de no ser posible
refrigerarla no ms de 4 horas.
HECES :
Las muestras de heces se solicitan para examen bacteriolgico, virolgico, bioqumico y para
la bsqueda de parsitos.
Las muestras de heces de un paciente sospechoso de enfermedades diarreicas deben
colectarse antes de la administracin de cualquier antibitico.
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Procedimiento
Muestra evacuada : La persona debe defecar en un recipiente limpio y seco, teniendo

cuidado de no miccionar para que sta no se mezcle con orina.
Hisopado rectal : La muestra se obtiene con un hisopo de algodn estril , el cual se
desenvuelve y se lubrica antes de su uso, introducindolo en el medio de transporte , de
preferencia Cary Blair, y luego se introduce en el recto , unos 3 cm, mediante movimientos de
rotacin.
El hisopo con la muestra se introduce hasta el fondo del tubo que contiene el medio de
transporte (Cary Blair o Amies).
El frasco con la muestra o tubo con el medio de transporte se pueden conservar a temperatura
ambiente hasta su procesamiento o envo al laboratorio, no ms de 12 horas.
No se debe refrigerar la muestra.
HEMOCULTIVO:
La sangre de los individuos sanos es estril. Una presencia repentina de bacterias

habitualmente es eliminada del torrente circulatorio en un perodo de tiempo corto de minutos
a horas, excepto cuando existe una infeccin masiva o est presente un foco intravascular
infectado. Bsicamente cuando las bacterias se multiplican a tasas que exceden el sistema
retculoendotelial para eliminarlas , se habla de BACTERIEMIA. El trmino FUNGEMIA se
utiliza para designar la presencia de hogos en sangre.
Siempre que exista una razn para sospechar de una bacteriemia se debe practicar el cultivo
de la sangre o hemocultivo.
Procedimiento
Los hemocultivos se obtendrn antes de iniciar la terapia antibitica, el incumplimiento de

este punto puede dar lugar a resultados falsamente negativos, pudiendo comprometer la vida
del paciente.
Los microorganismos de la piel pueden contaminar la sangre durante la extraccin,
dificultando la interpretacin de los resultados. Adems algunos contaminantes actan como
patgenos oportunistas , por lo que se debe ser muy cuidadoso durante la extraccin.
La toma debe realizarse por venopuncin y para ello debe hacerse :
Lavado de manos y utilizacin de guantes estriles
Limpiar con jabn lquido o alcohol el lugar de la puncin
Aplicar durante un minuto povidona yodada, dejar secar
Desinfectar los tapones de los frascos
Efectuar la extraccin
No airear los frascos
Nunca debe hacerse la extraccin a travs de catteres , salvo en aquellas
circunstancias en que se indica especficamente.
Cuando la extraccin se realice con adaptador , se debe esterilizar o ser de un slo
uso.
MUESTRAS FARINGEAS Y AMIGDALARES :
Ms del 70 % de procesos estn ocasionados por virus : rinovirus , coronavirus,

adenovirus(3,4,7,14,21), parainfluenza, virus de la gripe, virus coxsakie A y otros enterovirus,
virus Epstein-Barr y virus herpes simple tipo I
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Entre el 10 y 20 % de casos de faringitis agudas en nios de 5 a 10 aos, estn ocasionados
por Streptoccoccuspyogenes. Otras bacterias patgenas son :Streptococcusgrupos C o G,
Corynebacteriumdiphteriae, Neisseriagonorrhoeae, Haemophilusinfluenzae .
Procedimiento
Las muestras de exudado faringo-amigdalar se obtienen con la ayuda de un depresor lingual,

tocando con la torunda todas las partes con exudados, membranas o zonas de inflamacin. Se
deben frotar las criptas tonsilares y la faringe posterior.
No se requieren medidas especiales para su transporte y conservacin.
La toma de muestra de la epiglotitis , debido al riesgo de complicaciones, se hace por un
especialista en las condiciones adecuadas.
Es recomendable realizar hemocultivos.
MUESTRAS NASALES :
Procedimiento
La muestra se obtiene introduciendo una torunda para cultivo, previamente embebida en suero
fisiolgico estril, unos 2 cm en la nariz y girando suavemente contra la mucosa de la
superficie nasal.
CATTERES :
El estudio bacteriolgico de los catteres , nos va a permitir en ocasiones conocer el agente

causal de una bacteriemia relacionada con el catter y prevenir que aparezca dicha
bacteriemia. Para valorar su importancia podemos decir que de una u otra forma el 82 % de
las bacteriemias nosocomiales se relacionan con la presencia de catteres.
Vas de infeccin : a. Piel y catter : en los catteres perifricos y de corta duracin
b. Endoluminal : en las vas centrales tunelizadas.
Procedimiento
Desinfectar con alcohol al 70 % una zona de la piel de unos 10 cm correspondientes

a la zona de entrada del catter
Retirar el catter con la mxima asepsia, con la ayuda de pinzas y tijeras estriles,
cortar los 5 cm distales del catter que corresponde a la porcin intravascular.
Introducir el segmento del catter en un recipiente estril correctamente identificado
La muestra debe ser enviada al laboratorio en un perodo de tiempo menor de 30
minutos. Cuando no sea posible deber ser guardada en refrigeracin a 4 C
LQUIDOS ESTRILES :
El fundamento es la bsqueda de agentes patgenos u oportunistas, que pueden estar

presentes en los lquidos o fluidos orgnicos . En este grupo incluimos lquidos producidos , ya
sea de forma espontnea o bien provocada a nivel de las serosas, en las que habitualmente
no existen microorganismos y son presumiblemente estriles. Su buen manejo presenta un
triple inters por :
La trascendencia de esta patologa por su elevada morbilidad o mortalidad
Dificultad de diferenciar patgenos y oportunistas como consecuencia de cuidados
teraputicos instaurados o prtesis aplicadas previamente.
Posibilidad de contaminacin exgena, sea en la obtencin o en su manipulacin,
siendo por ello muy importante extremar las medidas de asepsia, de recogida y
procesamiento.
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Muestras
Lquido asctico o peritoneal
Lquido articular o sinovial
Lquido pericrdico
Lquido pleural
Procedimiento
La obtencin de estos lquidos es un procedimiento mdico

La toma se realiza por puncin percutnea (toracocentesis, paracentesis, puncin
pericrdica o puncin articular)
Para el estudio bacteriano se requerir de 1 a 10 ml; para lquido de dilisis
peritoneal se requerir de un volumen superior a 100 ml.
Para evitar la coagulacin de algunos lquidos se utilizar heparina sin
conservantes, ya que otros anticoagulantes podran tener accin antibacteriana.
Los recipientes idneos son los viales de transporte para anaerobios
Los frascos de hemocultivo tambin son tiles para cultivar lquidos biolgicos
estriles. Si se sospecha de anaerobios colocar la muestra luego de ser extrada en
un frasco para anaerobios.
LQUIDO CFALORRAQUIDEO (LCR)

La meningitis es un proceso inflamatorio del Sistema Nervioso Central, que afecta a las
leptomeninges y al lquido cefalorraqudeo . Se trata de una urgencia mdica y requiere un
diagnstico y tratamiento precoz . Su morbimortalidad , en meningitis agudas bacterianas , se
relaciona directamente con el retraso en el inicio de la teraputica.
Los casos espordicos de meningitis agudas bacterianas , se relacionan directamente con el
retraso en el inicio de la teraputica, aparecen en edades extremas de la vida, ocurriendo el 75
% de los casos en menores de 1 ao.
Muestra
La toma de la muestra la realiza el mdico tratante o el patlogo clnico del

laboratorio.
Se obtendr antes de instaurar cualquier terapia antimicrobiana , siempre que las
condiciones lo permitan.
LCR se obtiene por puncin lumbar
Generalmente se obtendrn dos tubos, el primero se enviar para el estudio
bioqumico, el segundo para el estudio microbiolgico con el mayor volumen
posible.
El tubo ms turbio se enviar a Microbiologa.
Se debe solicitar simultneamente hemocultivos, porque las meninges suelen ir
acompaadas de un proceso bacterimico
El volumen mnimo para el estudio bacteriolgico rutinario es 1 ml, aunque es
preferible disponer de volmenes superiores. Para hongos o micobacterias se
necesitarn al menos 2 ml adicionales por cada uno de los estudios, siendo deseable
llegar a los 10 ml.
La muestra debe enviarse inmediatamente al laboratorio, pues algunos agentes
etiolgicos como Streptococcuspneumoniae pueden lisarse rpidamente a partir de
la primera hora de su recogida
Si no fuera posible se mantendr en estufa entre 35 a37C y una parte se incubar
en frasco de hemocultivo, que se mantendr en idnticas condiciones.
Si no se dispone de estufa se mantendr a temperatura ambiente. Nunca se
refrigerar pues se afectar la viabilidad de Neisseriameningitidis y H. influenzae.
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Procesamiento del lquido cefalorraqudeo
Centrifugar a 1 500 hasta 3 000 revoluciones durante 15 a 20 minutos.

En caso de lquidos muy purulentos no ser necesario centrifugar.
Recoger el sobrenadante con pipeta de Pasteur estril y conservarlo a 4C en
refrigeracin.
Sembrar el sedimento con pipeta de Pasteur en : agar Sangre a 35 - 37C, atmsfera
de CO2 ,agar Chocolate a 35 - 37C atmsfera de CO2 ,caldoTioglicolato o caldo
Infusin Cerebro Corazn BHI a 35 - 37C por 72 horas.
Se realizarn tres extensiones para tincin : tincin de Gram, Azul de metileno,
Wright.
EXTRACCIN DE SANGRE PERIFRICA :
1. Colocar sobre la mesa de trabajo todo el material que se necesitar para ejecutar la
obtencin de la muestra.
2. Lavarse las manos previamente a la extraccin de la sangre y si es preciso
colocarse guantes.
3. El paciente deber sentarse cmodamente de manera que el brazo quede colocado
paralelamente a la mesa de trabajo , donde se realizar la extraccin se sangre.
4. Apoyar el brazo del paciente sobre un pequeo cojn bajo el codo. Con la palma de
la mano hacia arriba.
5. Con la mano izquierda tirar del extremo de la ligadura, cruzndolo y a
continuacin introducir este extremo por debajo de la parte principal de la ligadura
aproximadamente dos dedos por encima de la flexin del codo. sta se deber
ajustar solo lo suficiente para aminorar la corriente sangunea y dilatar la vena ,
sin apretar tanto que reduzca el paso de la sangre por las arterias.
6. Pedir al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para favorecer la
dilatacin de las venas.
7. Con el dedo ndice de la mano izquierda palpar la vena en la que se introducir la
aguja.
8. Desinfectar la zona de la piel donde se realizar la puncin con un pedazo de
algodn embebido en alcohol yodado.
9. Tomar la jeringa con la mano derecha, colocar la yema del dedo ndice sobre la
base de la aguja.
10. Colocar la aguja sobre la vena con el bisel hacia arriba, introducir la aguja en el
centro de la vena sin titubeos., de 1 a1,5 cm aproximadamente.
11. Luego de extraer la sangre por puncin venosa, retirar la aguja de la jeringa y
colocarla en un depsito de metal ( para autoclavar o incinerar); verter lentamente
la sangre en un tubo o en el caldo de cultivo.
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EVALUACIN
1. Por qu una muestra de lquido cefalorraqudeo no debe ser refrigerada , si no se enva de

inmediato al laboratorio?
2. Cules son los agentes etiolgicos de la meningitis aguda en neonatos, nios y adultos?
3. En qu casos se debe tomar una muestra de aspirado bronquial?
4. Cul es el volumen se sangre requerido para realizar un hemocultivo en un neonato, nio y

en un adulto?, cules son los agentes etiolgicos ms frecuentes de una septicemia en cada
caso?
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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PRCTICA N 3
COLORACIONES BACTERIANAS SIMPLES
OBJETIVOS
Explicar la coloracin Azul de metileno.

Identificar la diferencia entre coloracin simple y coloracin diferencial
INTRODUCCIN
Debido al pequeo tamao de los microorganismos , se requiere de un microscopio ptico, ya

sea de campo claro (lo ms usado) o de campo oscuro, para hacer la descripcin morfolgica
de estos. La observacin de los frotis teidos es lo ms recomendable. El frotis se prepara
haciendo una extensin de los microorganismos sobre una superficie transparente, en la cual
se fijan y se tien los microorganismos.
Las coloraciones son tcnicas que permiten observar microorganismos en funcin de la

capacidad de los mismos para retener (o no), determinadas sustancias colorantes, lo que
depende de la carga de la clula y del colorante. Estos colorantes pueden ser de distintos
tipos:
Catinicos : sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las
clulas y las tien. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina.
Aninicos : Con carga negativa, no penetran en el interior de la clula, de modo que
no tien las clulas sino el entorno. En este caso se habla de tincin negativa.
Ejemplos: Eosina, Nigrosina.
Liposolubles: se mezclan con los lpidos celulares y los tien. Ejemplo: Negro sudn.
Los colorantes aumentan el contraste combinndose qumicamente con el protoplasma

microbiano y permiten localizar estructuras especficas del microorganismo y diferenciarlos en
su forma, tamao, agrupacin y afinidad a ciertos colorantes . Las bacterias pueden presentar
las siguientes formas esfricas (cocos), estos a su vez disponerse en cadenas (estreptococos)
, en pares (diplococos), o en racimos (estafilococos), sarcinas, en forma alargadas cilndricas
(bacilos) y espirales (espiroquetas y espirilos).
De acuerdo al nmero de soluciones colorantes y a los objetivos de estudio se pueden realizar
diferentes tipos de tinciones como son :
Simples : Utiliza un slo colorante. Las clulas presentan una composicin qumica
diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma distinta
frente a un colorante . El colorante tie las clulas como en el caso de : Azul de
metileno, Safranina o no la tie : Nigrosina.
Diferenciales : Los diferentes tipos de clulas presentan distinta composicin
qumica y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tincin, lo que
permite clasificar a los microorganismos en diferentes grupos, segn su capacidad de
tincin. Ejemplos: tincin de Gram y Ziehl-Neelsen, ambas utilizan ms de un
colorante.
Selectivas: Distintas estructuras celulares tienen diferente composicin qumica de
modo que se tien selectivamente con ciertos colorantes. Ejemplos: tincin de
esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpsculos metacromticos. Pueden
utilizar uno o ms colorantes.
16
COLORACIN AZUL DE METILENO
Es una coloracin simple que permite observar presencia o ausencia de microorganismos y

distinguir algunas formas bacterianas : cocos, bacilos , espirilos.
Se utiliza el Azul de metileno, el cual se agrega sobre la extensin por un minuto , luego del
cual se enjuaga , se deja secar a temperatura ambiente y se observa al microscopio con la
lente de mayor aumento.
MATERIALES
Guantes
Hisopos estriles
Lminas portaobjetos
Mechero de alcohol
Jeringa de 10 cc
Algodn y alcohol yodado
Ligadura
METODOLOGA
HISOPADO FARNGEO
1. El profesor, con la colaboracin de un alumno, ensear a tomar una muestra de

exudado farngeo. El paciente ( en este caso el alumno), se sentar cmodamente
de frente al profesor , el rea debe tener buena iluminacin para que permita
visualizar adecuadamente el sitio anatmico a examinar.
2. Indicar abrir la boca y con ayuda del bajalengua deprimir la lengua para favorecer
que la faringe quede expuesta, con un hisopo estril frotar firmemente la pared
posterior de la faringe y las amgdalas, particularmente en donde existan puntos
blancos o reas que presenten signos de inflamacin o sangrado.
3. Cuando el paciente no tenga amgdalas, la muestra se obtendr del fondo de las
fosas amigdalinas. Al retirar el hisopo tener la precaucin de no hacer contacto con
ninguna otra rea de la boca.
4. A partir de la muestra tomada, se realizar la siembra por el mtodo de
aislamiento en estra en placa, se utilizarn placas de agar sangre , agar chocolate
y agar manitol salado.
5. Antes de eliminar el hisopo , realizar una extensin para preparar un frotis, fijar la
muestra y teir con una tincin simple (Azul de metileno) para observar :
Morfologa de la bacteria
Agregacin o tipo de distribucin bacteriana.
17
RESULTADOS
Frotis de hisopado farngeo :
Hisopo
Lmina
portaobjetos
Aislamiento en estra
Coloracin simple : Azul de Metileno
Cubrir el frotis con colorante Azul de metileno por un minuto

Lavar con agua corriente
Dejar secar a temperatura ambiente
1. Cubrir con Azul 2. Lavar con agua

de metileno
Graficar lo observado al microscopio
18
EVALUACIN
1. Cules son las estructuras celulares o molculas que pueden ser observadas cuando se
emplea la tincin simple?. Ejemplos de dos (2) colorantes que podran utilizarse para realizar
una tincin simple.
2. Grafique cada una de las formas bacterianas que se pueden observar al emplear la tincin
simple.
3. Ejemplos de dos (2) colorantes que se podran utilizar en la realizacin de una tincin
simple.
4. Cules son las desventajas o limitaciones de la tincin simple ?
19
COLORACIONES BACTERIANAS COMPUESTAS
COLORACIN DE GRAM
OBJETIVOS
Explicar el fundamento de la coloracin de Gram.

Ejecutar la tcnica de coloracin ms usada en bacteriologa : coloracin de Gram.
Establecer la diferencia entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas.
INTRODUCCIN
Descrita por Christian Gram en 1884, permitiendo dividir a las bacterias en dos grupos
taxonmicos : Gram positivas y Gram negativas.
En esta tcnica se deben tener en cuenta tres aspectos fundamentales:
Las bacterias Gram positivas retienen firmemente el colorante inicial
Al aadir el mordiente se forma un complejo molecular de gran tamao
La penetracin est condicionada por la permeabilidad de la pared celular.
Los mecanismos antes mencionados se relacionan con la composicin qumica de la pared de

las bacterias. Las bacterias Gram positivas contienen una mayor cantidad de murena, cido
tecoico, pocas protenas y algunas contienen polisacridos.
Las bacterias Gram negativas poseen poca murena, una elevada cantidad de lpidos,
protenas y polisacridos y no contienen cido tecoico.
La murena en las bacterias Gram positivas impide que el complejo cristal violeta-yodo sea
eliminado por el decolorante alcoholacetona, ya que es insoluble en alcohol. El alto contenido
de lpidos en la pared de las bacterias Gram negativas ocasiona que el complejo cristal violeta
yodo sea eliminado o disuelto por el decolorante.
Al finalizar la coloracin las bacterias Gram positivas quedan teidas con el cristal violeta:
morado y la bacterias Gram negativas quedan teidas con el colorante de contraste :safranina
: rojo.
MATERIALES
Cultivos en medio lquido de Escherichiacoli y Staphylococcussp.
Asa bacteriolgica
Equipos de coloracin para tincin de Gram
Mechero, portaobjetos y puentes para tincin
Microscopio
METODOLOGA
Preparar un frotis de cada uno de los cultivos de Escherichiacoli y Staphylococcussp
Preparacin del frotis para la tincin

Trabajar en un rea aproximadamente de 10 cm de distancia de la llama del
mechero ( zona considerada estril ), flamear el asa, hasta el rojo vivo y dejarla
enfriar por 30 segundos
Con un lpiz graso identificar cada una de las lminas portaobjetos donde se van a
realizar las preparaciones.
Destapar el tubo con el cultivo, empleando para el propsito los dedos anular y
meique , introducir el asa, tomar una pequea muestra de cultivo.
Depositar el material en el centro de una lmina portaobjetos y extenderlo en un
rea aproximadamente de 0,5 cm.
Cuando se trata de cultivos de medio slido , colocar una gota de agua destilada
sobre la superficie , descargar la muestra y homogeneizar. Dejar que la preparacin
20
seque espontneamente al aire libre.
Fijar la preparacin pasndola rpidamente sobre la llama del mechero , evitando
un calentamiento excesivo para evitar que el material se carbonice.
Con un lpiz graso identificar cada una de las preparaciones.
Para la realizacin de un buen frotis se deben cumplir las siguientes condiciones :

Utilizar lminas limpias y en perfecto estado, libre de rayones y de manchas, deben ser
previamente pasadas por la llama del mechero para eliminar trazas de grasa y no se deben
tocar con las yemas de los dedos .
Debe ser delgado, translcido y homogneo para que, durante el proceso de tincin, reciba
en toda su superficie el mismo tratamiento con las diferentes sustancias qumicas y se debe
usar para la preparacin la tcnica asptica.
Utilizar un mnimo de cultivo cuando es un medio slido.
Cuando se trabaja a partir de un medio lquido debe tomarse suficiente cantidad : una
muestra con el asa de siembra.
Tcnica de coloracin de Gram :

Cubrir las preparaciones con cristal violeta , durante un minuto, lavar ligeramente con agua
corriente.
Cubrir con lugol durante un minuto, lavar ligeramente con agua corriente.
Decolorar con la mezcla alcohol acetona , escurrir de 5 a 6 gotas y lavar con agua
corriente
Cubrir con safranina durante 30 segundos , lavar con agua corriente y dejar secar.
Colocar sobre la coloracin una gota de aceite de inmersin .
Observar al microscopio con la lente de mayor aumento.
1. Cubrir con
cristal violeta 2. Lavar con agua
(1 minuto) corriente
3. Cubrir con lugol 4. Lavar con agua

(1 minuto) corriente
21
5. Decolorar con 6. Lavar con agua
alcohol acetona corriente
(5 a 6 gotas)
7. Cubrir con
safranina 8. Lavar con agua
(30 segundos) corriente
Bacteria Gram
positiva
22
Bacteria Gram
negativa
RESULTADOS
Graficar lo observado al microscopio
EVALUACIN
1. Cules son las principales precauciones del manejo del microscopio ?
23

2. Por qu se debe utilizar el aceite de inmersin al realizar el estudio microscpico

bacteriano ?
3. Factores que pueden afectar a una tincin.
24
PRCTICA N 4
MEDIOS DE CULTIVO
MTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO BACTERIANO
OBJETIVOS
Comprender la utilidad de los medios de cultivo en el trabajo microbiolgico.

Diferenciar los distintos medios de cultivo de acuerdo a su consistencia y funcin.
INTRODUCCIN
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros

componentes, que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. Debido a que la diversidad metablica de los microorganismos es muy
amplia, la variedad de los medios de cultivo tambin lo es. La mayora de los medios de cultivo
se comercializan en forma de liofilizados , que es preciso rehidratar . La preparacin de un
medio de cultivo se reduce a pesar la cantidad del medio y disolverlo en agua destilada ( libre
de inhibidores de crecimiento), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias
termolbiles se esterilizan por filtracin y se aaden al resto de los componentes previamente
esterilizados en la autoclave.
CONDICIONES GENERALES
Presentar todos los elementos necesarios, en sus proporciones y/o cantidades

necesarias.
pH adecuado
Condiciones osmticas adecuadas
Estril y preservado de cualquier contaminacin.
Medio fresco ya que se desecan y pierden humedad, concentrndose el resto de los
componentes.
COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE CUTIVO
Agua : destilada o desionizada

Agar : se utiliza como agente solidificante. Es un polisacrido que se obtiene de
ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo.
Azcares : son una fuente de carbono para los microorganismos. Los ms
empleados son : glucosa, lactosa y sacarosa.
Extractos : son preparados de ciertos rganos o tejidos animales o vegetales,
obtenidos con agua y calor. Ejemplo : extracto de carne , de levadura, de
malta.
Peptonas : son protenas hidrolizadas , se obtienen por digestin qumica o
enzimtica de protenas animales o vegetales.
Fluidos corporales : sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero
sanguneo, son aadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos
microorganismos patgenos.
Sistemas amortiguadores : son sales que se aaden al medio para mantener el pH
dentro del rango ptimo del crecimiento bacteriano. Ejemplo : fosfatos bisdicos o
bipotsicos.
Indicadores de pH : son indicadores cido-base que se aaden para detectar
25
cambios de pH en el medio.
Agentes reductores : sustancias que se aaden al medio para crear condiciones que
permitan el desarrollo de los grmenes microaerfilos o anaerobios. Ejemplo :
cistena, tioglicolato.
CLASIFICACIN
Por su consistencia
Medio de cultivo lquido: caldo Nutritivo, caldo Selenito, caldo Peptonado

Medio de cultivo semislido: agar Sulfuro, Indol y Movilidad (SIM), agar Movilidad,
Indol y Ornitina (MIO)
Medio de cultivo slido: agar Sangre, agar Mac Conkey, agar Manitol salado.
Por su funcin o fines especiales
Medios nutritivos (simples): con nutrientes mnimos para que las bacterias poco
exigentes desarrollen . Ejemplo: caldo y agar Nutritivo.
Medios nutritivos enriquecidos: son medios simples a los que se aaden ciertos
productos a manera de suplemento nutritivo que permiten el aporte de factores de
crecimiento. Ejemplo: agar Sangre, agar Chocolate.
Medios de enriquecimiento: son medios lquidos que por su composicin qumica

favorecen o permiten la multiplicacin de unos microorganismos, inhibiendo
parcialmente la de otros. Ejemplo: caldo Selenito, caldo Peptonado alcalino.
Medios selectivos: permiten el crecimiento slo de la especie que se desea aislar,

para lo cual se les agrega colorantes bacteriostticos: Azul de metileno, Verde
malaquita, Verde brillante. Ejemplos: agar Mac Conkey, agar Salmonella-Shigella
(SS), agar Manitol salado.
Medios diferenciales: contienen sustancias nutritivas y un indicador de pH que

permite detectar las reacciones bioqumicas especficas de los microorganismos.
Ejemplo: agar Triple azcar (TSI),agarrea, agar Citrato de Simmons.
Medios de transporte: permite mantener viables a los microorganismos durante el

traslado al laboratorio. Ejemplo: caldo Hafna, Cary Blair, Stuard.
MATERIALES
Caldo nutritivo : en matraz y tubos

Agar nutritivo en matraz ,placas y tubos
Agar Mac Conkey, agar Salmonella-Shigella, agar Manitol salado, agar Chocolate,
agar Triple Azcar (TSI), agar rea, agar Citrato de Simmons, agar SIM.
26
METODOLOGA
Observar y diferenciar los medios de cultivo proporcionados en la prctica.
Medios Simples:
Medios Enriquecidos:
27
Medios Selectivos:
Medios Diferenciales:
28
EVALUACIN
1. Qu precauciones se deben tener antes de sembrar en medios para anaerobios?
2. Qu medios de cultivo se utilizan cuando se sospecha de : ?
Vibrio cholerae:
Clostridium botulinum:
Brucella spp:
Campylobacter jejuni:
29
MTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO BACTERIANO
OBJETIVOS
Conocer y realizar las diferentes tcnicas de siembra y aislamiento bacteriano.

Observar el desarrollo de bacterias aisladas a partir de un cultivo puro.
INTRODUCCIN
En Microbiologa se entiende como siembra al proceso mediante el cual se lleva una porcin
de una poblacin de microorganismos (inculo), de un cultivo crecido a un medio nutritivo para
su crecimiento. Todo este proceso hay que llevarlo a cabo con instrumentos y medios
previamente esterilizados y siguiendo las instrucciones de los profesores de prctica. La
principal advertencia consiste en trabajar siempre prximos a la llama del mechero que ,
debido a las corrientes de conveccin verticales que genera es capaz de crear un ambiente
estril en la zona inmediatamente alrededor y debajo de la llama.
Para realizar un cultivo de microorganismos es necesario que el nmero de clulas

bacterianas (inculo) sea transferido (inoculado) a un medio de cultivo estril. Al querer aislar
una especie en particular a partir de una mezcla de microorganismos deben emplearse
tcnicas de aislamiento lo que permite, obtenerlas en forma pura. Esto implica la utilizacin de
medios tanto simples como especiales , mayormente slidos de acuerdo a la naturaleza del
microorganismo.
Las tcnicas de cultivo se realizan por siembra o diluciones sucesivas :
Por siembra : es el procedimiento por el cual se pone en contacto al microorganismo

con un medio de cultivo, para que en condiciones ptimas de temperatura y tiempo
de incubacin , pueda desarrollar y multiplicarse in vitro. La finalidad es el
aislamiento para tener un cultivo puro de bacterias a partir de una muestra
problema (orina, heces, secreciones, agua servida).
La siembra puede ser :

Por inoculacin
Por estras simples
Por dispersin o agotamiento
Por puntura
Por diluciones sucesivas : consiste en hacer diluciones seriadas de la muestra o del

inculo, sta se utiliza cuando se tienen muestras lquidas ( orina, agua ) , se realiza
haciendo diluciones a las muestras : 1 :100, 1:1 000, 1:10 000 etc. Luego se
siembra cada dilucin en placas de Petri con medios de cultivo.
Una vez obtenidos los cultivos, se puede proceder al examen macroscpico :
morfologa de las colonias, actividades bioqumicas o caractersticas inmunolgicas
de los microorganismos aislados.
30
Tomado de Microbiologa Tomo II de Granados 2 edicin
Tcnica de siembra por diluciones sucesivas
MATERIALES
Asa de siembra en aro y en punta

Tubos de vidrio de 16 x150mm
Tubos de caldo Nutritivo con cultivo mixto bacteriano :Staphylococcusaureus y
Escherichiacoli
Placas con agar Nutritivo, agar Sangre y agar Manitol salado
Tubos con caldo y agar Nutritivo
Suero fisiolgico estril
Mechero de Bunsen
METODOLOGA
Manejo del asa bacteriolgica o de siembra :

El profesor demostrar el manejo adecuado del asa y explicar las precauciones que se deben
tener en la toma de la muestra :
Esterilizar el asa y dejarla enfriar para evitar quemar a las bacterias
Sumergir el asa hasta el fondo del cultivo lquido, ya que en este lugar se encuentra
una mayor concentracin de microorganismos.
Observar que al retirar el asa del tubo est cubierta por una pelcula lquida.
31
El asa de siembra se
toma del
mango como si fuera un
lpiz
El tapn del tubo se

toma
con el dedo meique
de la mano derecha
La boca del tubo se

flamea despus de
abrirlo
y antes de cerrarlo
Mtodo de siembra por agotamiento : aislamiento a partir de un cultivo mixto
Con un lpiz graso marcar por detrs de la placa que contiene el agar , las lneas
como est indicado en la figura N 1, por lo que quedarn tres sectores : el sector
uno (1) el ms pequeo de los otros dos , servir para descargar el asa.
Esterilizar el asa y obtener una asada de cultivo del medio lquido , cerrar el tubo y
colocarlo en la gradilla.
Con la mano izquierda levantar parcialmente la tapa de la placa de Petri y sembrar
trazando una serie de lneas en zigzag muy cerradas a todo lo ancho del sector uno
(1) . Esto mismo se puede hacer colocando la placa de Petri sobre la mesa y con la
palma de la mano , hacer un movimiento rpido para levantar el fondo que contiene
el medio de cultivo, como lo indicar el profesor.
Esterilizar el asa en el mechero. Girar la caja 90 grados , hasta que el sector uno (1)
quede a la izquierda y el sector dos (2) hacia arriba. Sin volver a tomar el inculo,
trazar un zigzag un poco ms abierto en el sector dos (2), invadiendo el sector uno
(1) en las primeras lneas del zigzag , pero no en las ltimas.
Girar nuevamente la placa 90 grados , ahora el sector dos (2) estar a la izquierda y
el sector tres (3) hacia la derecha.
Hacer un nuevo zigzag en el sector tres (3), invadiendo el sector dos (2) . Este paso
puede repetirse sembrando un cuarto sector.
Incubar las placas a 37 C durante 24 horas. Las placas ya sembradas debern
colocarse con la tapa hacia abajo y la parte que contiene el agar sembrado hacia
arriba.
32
1 1
2
2 3
3
Figura N 1 Figura N 2
Mtodo de siembra en caldo de cultivo
Coger el asa de siembra en aro , esterilizarla al mechero al rojo vivo y dejarla enfriar
por unos segundos.
Abrir la placa que contiene el agar con el crecimiento bacteriano y con la ayuda del
asa de siembra coger una colonia bien aislada (figura N 1) .
Luego destapar un tubo con caldo de cultivo (figura N 2), coger la torunda, que est
dentro de este con el dedo meique de la mano con que se est cogiendo el asa de
siembra con la colonia
Introducir el asa de siembra en el tubo y agitar suavemente hasta que se desprenda
la colonia del asa de siembra.
Introducir la torunda, tapar el tubo, llevar a esterilizar el asa de siembra y
homogeneizar bien el caldo.
Llevar a incubar a 37 C por 12 horas.
Figura N1
Figura N2
Transcurrido el tiempo de incubacin, observar el desarrollo bacteriano en los medios de

cultivo lquido y slido
Medio lquido : la turbidez indica desarrollo

Medio slido : presencia de colonias
33
RESULTADOS
Realizar la lectura, observar y graficar los resultados.
Staphylococcusaureus
Agar Nutritivo Agar Sangre Agar Manitol

Salado
Escherichiacoli
Agar Nutritivo Agar Sangre Agar Mac

Conkey
34
EVALUACIN
1. Por qu el agar Nutritivo es un medio de uso general para el cultivo bacteriano? Qu

sustancia se le puede agregar para hacerlo enriquecido para bacterias Gram positivas?
2. Cul es la importancia de un cultivo puro?
35
PRCTICA N5
DIFERENCIACIN BIOQUMICA DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS
OBJETIVOS
Reconocer las caractersticas morfolgicas y en los cultivos de las bacterias Gram

positivas
Identificar bioqumicamente las diferentes bacterias Gram positivas de importancia
clnica.
INTRODUCCIN
Existen una gran variedad de bacterias Gram positivas de importancia clnica con forma de
cocos como Staphylococcusaureus, especies de Streptococcus , principalmente S.
pneumoniae y cocos anaerobios : Peptostreptococcus.
Entre los bacilos Gram positivos patgenos ms comunes tenemos Bacillusanthracis,

Clostridium, Gardnerella, Listeria ,Corynebacterium.
Todas esta bacterias se encuentran causando procesos infecciosos en los seres humanos y
en algunos casos estas se encuentran colonizando alguna parte del cuerpo junto con bacterias
de la flora normal. Por eso se hace necesario para su aislamiento e identificacin realizar toma
de muestras y procesamiento bacteriolgicos correctos.
Dentro de los Gram positivos, los cocos y en especial las especies de Streptococcus y los
Staphylococcusson los ms fciles de aislar e identificar mediante observacin de hemlisis,
pruebas bioqumicas o diferenciales especficas como la prueba de catalasa para diferenciar
Staphylococcusde Streptococcus , la prueba de coagulasa para diferenciar Staphylococcus
patgenos de los no patgenos, la reaccin de Quellung para distinguir neumococos etc.
MATERIALES
Cultivos de Streptococcuspneumoniae en agar Sangre

Cultivo de Staphylococcusaureus en agar Manitol salado y agar Sangre
Tubos con plasma (1ml ) y pipetas graduadas de 1 ml estriles
Reactivo de perxido de hidrgeno
Equipo para la coloracin de Gram
Lminas portaobjetos
Asas bacteriolgicas
Mecheros
Microscopios
METODOLOGA
Pruebas bioqumicas para Staphylococcusy Streptococcus

Observar el tipo de hemlisis que presentan las placas de agar Sangre
Realizar la prueba de catalasa con una colonia de la placa de agar Sangre y con una
de Manitol salado.
Para la prueba de coagulasa , en dos tubos con un ml de plasma cada uno,
depositar en uno 0,5 ml del cultivo de Staphylococcusaureus y en otro un ml de
Streptococcusepidermidis . Incubar 30 minutos a 37 C.
Preparar un frotis con las colonias que han desarrollado en el agar Sangre y en agar Manitol
salado.
36
Preparacin de Frotis :
1. Con el asa de siembra

tomar una colonia de la placa
de Petri 2. Extender la muestra sobre la
lmina portaobjetos
3. Fijar el extendido con la

llama del mechero
METODOLOGA
La identificacin de Staphylococcus y Streptococcus, se basa en la morfologa de las colonias

que se observan en los cultivos primarios y en el tipo de hemlisis en agar Sangre. Sin
embargo para evitar errores de interpretacin , se emplean pruebas bioqumicas como :
Prueba de Catalasa
La catalasa es una enzima que cataliza la descomposicin de perxido de hidrgeno en agua

y oxgeno. Se encuentra presente en la mayora de los microorganismos aerobios y
anaerobios facultativos excluyendo los estreptococos.
La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rpida con
desprendimiento de burbujas : la enzima catalasa convierte el perxido de hidrgeno , en agua
y oxgeno molecular. Esta prueba se emplea para diferenciar los gneros Micrococcus y
Staphylococcus : catalasa positivo del gnero Streptococcus : catalasa negativo.
37
negativo.
Con el asa de siembra se toma una
colonia del cultivo del
microorganismo y se coloca en la
lmina
Perxido de
hidrgeno
Figura N 1
Figura N 2
(+)BURBUJEO :Staphylococcus
(-) NO BURBUJEO :Streptococcus
Figura N 3
Tomado de Diagnstico Microbiolgico de Bailey y Scott 11 edicin
POSITIVO NEGATIVO
Fermentacin del manitol
El agar Manitol salado es un medio altamente selectivo para el aislamiento de Staphylococcus

patgenos en cultivos mixtos, ya que se aprovecha la capacidad de los Staphylococcus de
desarrollar en presencia de Cloruro de sodio (Na Cl) al 7,5 % y la de fermentar manitol, en
este caso se observar la formacin de un halo amarillo en el agar circundante a las colonias.
38
Coagulacin del plasma
Staphylococcusaureus produce una protena llamada coagulasa , capaz de aglutinar el plasma

tratado con oxalato, citrato o heparina en presencia de un factor contenido en el suero.
Este factor srico reacciona con la coagulasa , activando el fibringeno y produciendo un
cogulo o trombo de fibrina. La coagulasa se presenta en forma unida (adherida a la clula) y
en forma libre. El estudio de la actividad coagulasa se puede llevar a cabo en un tubo de
ensayo (para coagulasa libre) y en portaobjetos (coagulasa nido), tambin llamado factor de
agregacin , la prueba en tubo se hace poniendo un ml de plasma al que se le agrega una
asada de un cultivo nocturno de S. aureus. Se incuba la mezcla a 37 C durante 4 horas y se
considera positivo ante cualquier grado de
coagulacin.
(+) PRUEBA POSITIVA

Formacin de cogulo
(-) PRUEBA NEGATIVA

No hay formacin de cogulo No se forma
Cogulo Staphylococcusepidermidis cogulo
Tomado de Diagnstico Microbiolgico de Bailey y Scott 11 edicin
POSITIVO NEGATIVO
39
RESULTADOS DE LAS PRUEBAS BIOQUMICAS
Streptococcus
Hemlisis Prueba de
catalasa
Fermentacin Prueba de Prueba de

del manitol catalasa coagulasa
40
Staphylococcusepidermidis
Fermentacin Prueba de Prueba de

del manitol catalasa coagulasa
EVALUACIN
1. Pruebas bioqumicas ( dos) que permitan diferenciar:
Streptococcuspneumoniae:
Streptococcuspyogenes:
Describir cada una de ellas.
2. Realizar un flujograma para la identificacin de bacteria Gram positivas
41
PRCTICA N6
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO : ANTIBIOGRAMA
OBJETIVOS
Entender el fundamento del antibiograma , el modo en que se realiza y las

principales fuentes de error.
Conocer los principales mtodos de susceptibilidad a un antimicrobiano.
Evaluar la sensibilidad o resistencia a diversos antibiticos de una bacteria de
crecimiento rpido aislada en prcticas anteriores. El mtodo utilizado es el de
difusin en agar o de Kirby-Bauer.
INTRODUCCIN
La actividad de los antimicrobianos (antibiticos y quimioterpicos) debe ser evaluada in vitro

para obtener la informacin que permitir decir si un microorganismo es susceptible o
resistente a determinado producto.
Los antimicrobianos actan produciendo toxicidad selectiva , no actan directamente sobre el
husped, sino que se combinan qumicamente con determinados sistemas de los
microorganismos , enfocando as la accin sobre los microorganismos ms que sobre el
husped.
La determinacin de la mnima concentracin inhibitoria (MIC) nos proporciona la dosis
mnima necesaria del quimioterpico para impedir el desarrollo bacteriano, lo que permite
hacer estudios de uso clnico y detectar mutantes resistentes.
Dos son los procedimientos empleados para conocer sta informacin, el mtodo del tubo
dilucin y el del disco difusin en agar, a ste ltimo se le denomina : antibiograma.
Accin de los antibiticos

La actividad antimicrobiana in vitro determina:
a. La potencia de un agente antibacteriano en solucin
b. Su concentracin en los lquidos del cuerpo o en los tejidos
c. La sensibilidad de un microorganismo a concentraciones conocidas del
medicamento.
Inhibicin de sntesis de pared celular: Penicilina, Cefalosporinas, Bacitracina,
Vancomicina, Novobiocina.
Alteracin de la permeabilidad de la membrana celular: Anfotericina B, Colistina,
Nistatina, Polimixina.
Inhibicin de la sntesis proteica :Aminoglucsidos ( Kanamicina, Amikacina ,
Estreptomicina ), Tetraciclinas, Cloramfenicol, Macrlidos ( Eritromicina ),
Lincomicinas.
Inhibicin de sntesis de cidos nucleicos : cido Nalidxico, Novobiocina,
Sulfonamidas, Trimetropin, Rifampicina.
Medicin de la actividad antimicrobiana

Esta se determina mediante los mtodos de dilucin o difusin, utilizando un microorganismo
standard y una cantidad conocida del antimicrobiano. Para ello se utilizan las pruebas de
dilucin en tubos y el mtodo de difusin.
Prueba de dilucin
En ste ensayo se incorporan cantidades conocidas de antimicrobianos en medios lquidos, se
inoculan despus con las bacterias en prueba y se incuban. El punto final se toma cuando la
cantidad de sustancias antimicrobiana es capaz de inhibir el crecimiento o de matar a las
bacterias en prueba.
Mtodo de difusin
42
Preparacin del inculo
La tcnica del antibiograma slo es aplicable a especies bacterianas en cultivo puro. Por ello
previamente se proceder, si es preciso, a hacer un aislamiento en placa.
Cultivar la bacteria aislada en un tubo con medio lquido apropiado (caldo Nutritivo, Infusin
cerebro corazn) o preparar una suspensin directa a partir del cultivo en placa usando el
siguiente mtodo:
a. Tomar una colonia aislada con el asa y resuspender en el tubo de solucin salina frotando
en la pared del tubo.
b. Homogeneizar bien y ajustar la densidad ptica con un patrn de turbidez N 0,5 de Mac
Farland : 0,5 ml de cloruro de bario 0,048 M a 99,5 ml de cido sulfrico 0,36 N 0,18 M. Esto
equivale a 108 clulas/ml . Diluir si es necesario la suspensin o aadir ms inculo.
c. Dentro de los 15 minutos siguientes al ajuste de la turbidez, sumergir una torunda estril en
la suspensin, rotar la torunda estril varias veces. Presionando firmemente sobre la pared
interior del tubo por encima del nivel del lquido, para remover el exceso de inculo.
d. Inocular la superficie seca de la placa con agar MellerHinton estriando con una torunda en
tres direcciones mediante rotacin de la placa, para asegurar una distribucin uniforme del
inculo, dejar secar la placa a temperatura ambiente por 3 a 5 minutos para que cualquier
exceso de humedad superficial sea absorbido.
e. Colocar los discos sobre la superficie del agar con la ayuda de una pinza estril (o con un
aplicador automtico) presionando suavemente sobre cada disco para asegurar un contacto
completo son la superficie del agar.
Distribuir los discos uniformemente de modo que estn a una distancia de 15 mm del borde de
la placa y a 25 mm uno del otro (el dimetro de los discos segn las normas de la
Organizacin Mundial de la Salud debe ser de 6 mm), no deben colocarse ms de 6 discos en
una placa.
La dificultad de ste mtodo est en las diferentes velocidades de crecimiento para los
diversos microorganismos.
El uso de un disco para cada antibitico estandarizado , permite dar el informe de S (sensible),
I (intermedio) y R (resistente)
Factores que pueden afectar la actividad antimicrobiana in vitro :

El pH del medio, ya que algunos antibiticos son ms activos a pH cido
(Nitrofurantona), otros a pH alcalino (Aminoglucsidos , Sulfonamidas)
Los componentes del medio, en este caso las protenas sricas fijan a las penicilinas desde
40 % para la Meticilina y 98 % para la Dicloxacilina.
Estabilidad de los medicamentos , a la temperatura de la incubadora varios agentes
antimicrobianos pierden su actividad.
Cuanto ms grande sea el inculo bacteriano, ms baja ser la sensibilidad del
microorganismo.
Cuanto ms tiempo se prolonga la incubacin, mayor es la oportunidad de presentarse las
mutantes resistentes , igualmente los microorganismos que crecen rpido y activamente son
ms sensibles a la accin de los antibacterianos que aquellos que se encuentran en fase de
reposo.
Dilucin en tubo
Se obtiene un resultado cuantitativo , destacando dos caractersticas importantes :
Concentracin mnima inhibitoria (CMI) : es la concentracin mnima de

antimicrobiano que inhibe el crecimiento de un microorganismo.
Concentracin mnima bactericida (CMB) : es la concentracin que mata a los
microorganismos.
Normalmente la CMI es suficiente para combatir una determinada infeccin, ya que los
mecanismos inmunitarios se encargan de eliminar al microorganismo.
MATERIALES
43
Caldo de cultivo con suspensin bacteriana a la escala de turbidez de N 0,5 de Mc
Farland
Placas de Petri con agar MellerHinton
Torundas estriles
Discos impregnados con diferentes antibiticos
Pinzas estriles.
METODOLOGA
Sumergir la torunda en caldo tripticasa de soya con cepa bacteriana , presionar

firme sobre las paredes del tubo y extender uniformemente en la superficie de la
placa de agar MuellerHinton.
Colocar con la ayuda de pinzas, los discos impregnados con diferentes antibitico
sobre la superficie del agar.
Los discos deben quedar a una distancia de 25 mm entre ellos.
Incubar a 37C durante 24 horas.
Realizar la lectura, observar y anotar los resultados.
Lectura de los discos de sensibilidad

El dimetro de la zona de inhibicin se mide con una regla milimetrada, colocada debajo de la
placas de Petri.
El lmite del rea de inhibicin est dado por la inhibicin completa del desarrollo, tal como se
puede apreciar a simple vista.Los milmetros de la lectura sern llevados a la tabla
correspondiente para traducir su interpretacin en los trminos :Sensible ( S ), Intermedio ( I ) ,
Resistente ( R ).
44
Tomado del Manual de laboratorio para
la identificacin y prueba de
susceptibilidad a los antimicrobianos de
patgenos bacterianos de importancia
para la salud pblica en el mundo en
desarrollo. Organizacin Mundial de la
Salud 2004.
Sensible
Resistente
Lectura de los halos de Inhibicin de los discos de sensibilidad
Quimioterpico Concentracin del Halo de Inhibicin

Disco mcg Sensible Intermedio Resistente
Ampicilina AM 10 ug +17 14-16 -13
Amikacina AK 30 ug +17 -15
Ac. Nalidxico AN 30 ug +19 14-18 -13
Cefalotina CF 30 ug +18 15-17 -14
Cefoxitina CTX 30 ug +21 16-10 -15
Ceftriaxona CRO 30 ug +21 14-20 -13
Cloranfenicol C 30 ug +18 15-18 -14
Kanamicina K 30 ug +18 14-17 -13
Nitrofurantoina FD 300 ug +17 15-16 -14
Sulfatrimetoprim SXT 231,2 ug +16 11-15 -10
Ciprofloxacino CIP 5 ug +21 16-20 -15
Antibitico S I R
45
Antibitico S I R
EVALUACIN
1. Qu importancia clnica tiene el antibiograma?
2. Posibles causas de error (cuatro) en el procesamiento o lectura del antibiograma.
3. En qu casos es necesario realizar la concentracin mnima inhibitoria?
46
4. Defina : Halo
5. Defina : Inhibicin
47
PRCTICA N 7
IDENTIFICACIN DE ENTEROBACTERIAS.
PSEUDOMONA
OBJETIVOS
Conocer los procedimientos de identificacin bioqumica de las principales bacteria

Gram negativas.
Interpretar los resultados de las pruebas bioqumicas y correlacionarlas con la
diferentes especies de bacterias Gram negativas.
INTRODUCCIN
Las bacterias Gram negativas pueden presentarse como bacilos o cocos siendo los primeros
los ms abundantes tanto en el hombre como en los animales. Varios de estos
microorganismos pertenecen a la flora intestinal normal , algunos estn asociados a
infecciones entricas y a procesos infecciosos (especialmente cuando stas bacterias invaden
otros rganos o sistemas).
Es posible que las infecciones procedan de un reservorio animal , de un portador sano o de la
diseminacin endgena de la bacteria en una persona susceptible, pudindose ver afectado
cualquier rgano del cuerpo.
Familia de bacilos entricos
Esta familia Enterobacteriaceae, incluye a varios patgenos que causan sndromes diarreicos .
Un gran nmero de ensayos han sido desarrollados a manera de identificar rpidamente al
patgeno, para que posteriormente el mdico, con base en el reporte, indique el tratamiento
adecuado o para que los epidemilogos puedan localizar la fuente de infeccin. Dentro de los
bacilos Gram negativos , las enterobacterias son responsables del 30 a 35 % de todas las
septicemias, ms del
70 % de todas las infecciones del tracto urinario y muchas infecciones intestinales.
Dentro de las especies de enterobacterias que son los agentes etiolgicos de infecciones
entricas tenemos :Salmonella , Shigella, y Escherichiacoli. Estas pueden producir cuadros
diarreicos e infeccin sistmica , que son procesos infecciosos que se diseminan
generalmente por va sangunea o linftica.
Medios de aislamiento primario
Son medios selectivos porque permiten el desarrollo de algunas bacterias e inhiben el

desarrollo de otras. Esta capacidad puede ser moderada (agar Eosina azul de metileno (EMB)
y Mac Conkey) y alta (agar Salmonella-Shigella, Desoxicolato y Citrato) o completamente
especfica (Sulfato de bismuto y Verde brillante).
Algunos de los medios selectivos contienen lactosa y un indicador de pH, lo que permite desde
el principio tener colonias aisladas de bacterias fermentadoras como Escherichiacoli y no
fermentadoras de la lactosa :Salmonella, Shigella.
Medios diferenciales : Pruebas Bioqumicas
Son aquellos en los que se pone de manifiesto las propiedades metablicas de los
microorganismos frente a diferentes sustratos. Existen medios que permiten observar una, dos
o ms caractersticas metablicas de la bacteria inoculada . Entre los ms utilizados estn :
48
Agar Triple Azcar (TSI): medio slido que contiene glucosa, sales de hierro
y un indicador de pH. Permite conocer la capacidad de la bacteria para fermentar los
carbohidratos. Se detecta la produccin de sulfuro de hidrgeno (H2S), as como de gas. El
tubo se siembra por picadura y en estra por lo que se debe observar tanto
el fondo como la superficie del medio
Agar Lisina Hierro (LIA) : medio slido que contiene lisina, sales de hierro, glucosa y un
indicador de pH. Se determina la descarboxilacin y desaminacin oxidativa de la lisina, la
produccin de cido sulfhdrico o sulfuro de hidrgeno (H2S) y la fermentacin de glucosa. Se
siembra por picadura y estra.
Medio para Sulfuro ,Indol y Movilidad (SIM) : medio semislido, se utiliza en la produccin
de sulfuro de hidrgeno, la formacin de Indol y movilidad. Se inocula con una nica puncin
con asa de siembra recta a travs del centro, hasta una profundidad de unos dos tercios del
medio.
Agar Citrato de Simmons : medio slido que contiene citrato de sodio, compuesto que
puede ser utilizado como nica fuente de carbono, por algunas bacterias. Se siembra por
picadura y estra
Agar rea (Mtodo de Christensen) : medio slido, se utiliza para determinar la capacidad
de un organismo para producir la enzima ureasa, que hidroliza la rea . La hidrlisis de la rea
produce amonaco y anhdrido carbnico. La formacin de amonaco alcaliniza el medio y el
cambio de pH se detecta por el cambio de color del rojo fenol de naranja plido a magenta.
Existen ms pruebas bioqumicas que pueden utilizarse como complemento a las ya descritas
como son : rojo de metilo, VogesProskawer, utilizacin de malonato, las cuales ayudan a
determinar la especie del microorganismo aislado. En ocasiones a pesar de recurrir a diversas
pruebas metablicas, no se consigue la identificacin , siendo necesario realizar reacciones
inmunolgicas para llegar al diagnstico definitivo.
BACTERIAS PIGENAS GRAM NEGATIVAS
Otro grupo menos abundantes en especies pero de gran importancia clnica son las bacterias
pigenas Gram negativas, que pueden ser cocos o cocobacilos . Las enfermedades que
producen por lo general incluyen la acumulacin de abundantes cantidades de pus y afectan
frecuentemente el aparato genital o respiratorio. Dichas enfermedades comprenden : uretritis
purulenta (gonococo) , meningitis , neumonas , bronquitis, sinusitis, otitis media, conjuntivitis,
epiglotitis etc.
Las bacterias pigenas Gram negativas patgenas en humanos son :Neisseria, Haemophilus,
Bordetella, Moraxella.
Las bacterias del gnero Neisseria son diplococos Gram negativos inmviles, cuyos lados
adyacentes son aplanados y ligeramente cncavos. Slo dos especies de este gnero son
patgenas exclusivamente de humanos :Neisseriagonorroheae o gonococo, agente causal de
la enfermedad de transmisin sexual, la gonorrea y la
N .meningitidis o meningococo productos comensales para el hombre y que habitan
principalmente el tracto respiratorio superior.
Espordicamente se pueden comportar como patgenos oportunistas N. sicca y
N. mucosa.
El diagnstico definitivo de una infeccin gonoccica se hace por el aislamiento en cultivo de

N. gonorrhoeae.
Para el diagnstico del gonococo, el lugar de la toma de la muestra depender de la edad,
sexo y de las caractersticas de la infeccin.
49
La tincin de Gram es el mtodo de eleccin para el examen directo de las muestras. Son
oxidasa positiva.
Para los cultivos , el medio debe ser de preparacin reciente, bien hidratado y precalentados.
Se utilizan medios selectivos como agar Thayer Martin modificado. Se debe utilizar un medio
no selectivo ya que algunas cepas pueden inhibirse por los antimicrobianos contenidos en los
medios selectivos. Debe estar adems en una atmsfera que contenga de 3 a 5 % de CO2.
El diagnstico de la infeccin meningoccica, se hace con el aislamiento de N. meningitidis a
partir de lquido cefalorraqudeo, sangre, lquido sinovial, pleural o pericrdico. Las ms
utilizadas son las dos primeras.
Con la tincin de Gram se observan como diplococos Gram negativos, crecen en los medios
de cultivo enriquecidos y su crecimiento se favorece con una atmsfera de CO2. Son oxidasa
positivo y fermentan los carbohidratos.
MATERIALES
Placas con agar Eosina azul de metileno sembradas con cepas problemas.
Placas con medio Mac Conkey, Eosina azul de metileno (EMB) y Salmonella-Shigella
Tubos con medio TSI, Citrato de Simmons, LIA, REA, SIM, sin sembrar y
sembrados con cepa problema
Asas de siembra
Reactivo de Kovacs
Lminas fijadas con frotis de lquido cefalorraqudeo con tincin de Gram.
Microscopio
Aceite de inmersin
Placas de cultivo con agar Chocolate.
METODOLOGA
Enterobacterias
En las prcticas se harn los trabajos de laboratorio que nos permitan observar las
caractersticas de cultivo y con ello su identificacin
A partir de uno de los tubos problema, tomar con el asa de siembra previamente
esterilizada una muestra y sembrar por estras en los medios Eosina azul de
metileno y Salmonella Shigella. Incubar a 37C por 24 horas.
Transcurrido el tiempo de incubacin , observar la morfologa de las colonias de las
placas sembradas (Mac Conkey, EMB y S-S).
Seleccionar una colonia y realizar cultivos en los tubos de TSI, Citrato de Simmons,
LIA y SIM. Esto se hace por puntura en los medios y luego en estras en la parte de
inclinacin (pico de flauta) como lo indicar el profesor en cada medio. Llevar a
incubar a 37C por 18 a 24 horas.
Hacer la lectura de las pruebas bioqumicas, interpretar y realizar la identificacin
del microorganismo proporcionado.
Interpretacin Bioqumica
Agar Triple Azcar (TSI):

Fermentacin de glucosa : en la picadura (fondo del tubo) el medio vira a color
amarillo. Es una reaccin dbil.
Fermentacin de sacarosa : en todo el tubo el medio cambia a amarillo,
principalmente en el fondo, donde se intensifica el color debido a la reaccin de la
glucosa.
50
Fermentacin de lactosa : en la superficie el medio vira a amarillo.
Debido a la fermentacin puede hacer produccin de gas, lo que se manifiesta por la
presencia de burbujas en el medio.
Produccin de cido sulfhdrico o sulfuro de hidrgeno (H2S): por degradacin
enzimtica de aminocidos que contienen azufre originan un precipitado de color
negro. La produccin de H2S tiene lugar en ambiente cido, de ah que el precipitado
negro se concentre en el fondo del tubo, donde se generan cidos a partir de la
glucosa. As , un fondo negro indica que existe acidez en el fondo del tubo, aunque
el color amarillo se haya enmascarado con el precipitado negro.
Agar Lisina Hierro (LIA) :

Descarboxilacin de lisina : el medio se alcaliniza y se observa lila o ligeramente
morado en la superficie.
Fermentacin de la glucosa : en el fondo del tubo el medio vira a amarillo.
Desaminacin de la lisina : vira a color rojizo en la superficie del medio. Es
caracterstico de Proteus y Providencia.
Produccin de H2S : precipitado de color negro ( por el mecanismo citado
anteriormente).
Agar Citrato de Simmons :

Utilizacin de citrato como fuente de carbono : el medio vira a color azul.
Agar rea:
Los microorganismos que hidrolizan la rea producen un cambio de color en el pico
de flauta de naranja plido a magenta.
Medio para Sulfuro, Indol y Movilidad (SIM) :

Motilidad: Los cultivos mviles muestran un crecimiento difuso o turbidez lejos de la
lnea de inoculacin , por lo que observando si el crecimiento est solo en la
picadura o se extiende a los lados de ella, se puede determinar si el microorganismo
es inmvil o mvil.
Indol : la aparicin transcurridos unos segundos, de un anillo de color rojo en la
interfase entre el reactivo y el cultivo indica la presencia de indol y, por lo tanto , la
prueba se considera positiva. El indol es capaz de reaccionar con el grupo aldehdo
del reactivo originando un complejo de color rojo.
Produccin de H2S: precipitado de color negro ( por el mecanismo citado
anteriormente).
Escherichia
coli
51
Klebsiella
Salmonella
Shigella
52
RESULTADOS
Realizar la lectura e identificacin de los microorganismos, observar y anotar los resultados.
Escherichia coli :
TSI LIA Citrato de rea SIM

Simmons
Klebsiellasp

Simmons
53
Proteussp

Simmons
Salmonella sp

Simmons
Shigellasp

Simmons
54
PSEUDOMONA
Las especies pertenecientes al gnero Pseudomonas son ubicuos, se encuentran en la

tierra, materia orgnica en descomposicin, en la vegetacin, en el agua. Tambin podemos
encontrar estos microorganismos en el ambiente hospitalario, en lugares hmedos, como
comida, baos, respiradores. No forman parte de la flora normal del ser humano con
excepcin de los pacientes hospitalizados y en pacientes ambulatorios inmunodeprimidos.
Debido a las sencillas necesidades de crecimiento y a la versatilidad nutricional , se logra su
amplia distribucin ambiental, siendo capaces de utilizar un gran nmero de compuestos
orgnicos como fuentes de carbono y nitrgeno.
Son bacilos Gram negativos mviles rectos o ligeramente curvos, que son aerobios
estrictos, la mayora de las cepas son mviles por medio de uno o ms flagelos polares;
utilizan glucosa y otros hidratos de carbono de manera oxidativa; y suelen ser citocromo
oxidasa positivos
El gnero Pseudomonasse divide en cuatro grupos : Grupo fluorescente, Grupo Stutzeri,
Grupo Alcalgenes y Grupo con pigmento amarillo.
Grupo fluorescente : Pertenecen a este grupo las especies : Pseudomonaaeruginosa,
Pseudomonafluorescens y Pseudomonaputida , las cuales se caracterizan por la produccin
de un pigmento pioverdina hidrosoluble que da fluorescencia blanca a verde azulada bajo luz
ultravioleta de longitud de onda larga (400 nm). Slo una especie, Pseudomonaaeruginosa ,
produce el pigmento hidrosoluble azul llamado piocianina.
Pseudomonaaeruginosa produce un aspecto caracterstico cuando crece en una placa de agar
sangre , se pueden observar grandes colonias grises y presenta beta hemlisis. Las colonias
tienen un aspecto de piel de caimn y con brillo metlico.
La exudacin de pus azulado, con olor similar a las uvas , por la produccin de piocianina es
caracterstico en las heridas infectadas por este microorganismo. La piocianina es un
antibitico que puede permitir que la Pseudomonaaeruginosa exista en la naturaleza, tambin
puede desempear un papel en la nutricin , al funcionar como una forma de adquirir fosfatos
inorgnicos. Se puede realizar una
identificacin rpida de Pseudomonaaeruginosa si se observan las siguientes caractersticas :
morfologa tpica de las colonias, produccin de pigmentos difusibles, olor a fruta y positividad
en la prueba de oxidasa.
CARACTERSTICAS DEL GRUPO FLUORESCENTE:
PRUEBA Pseudomonaaeruginosa Pseudomonafluorescens Pseudomonaputida

PIOVERDINA + + +
PIOCIANINA + - -
MATERIALES
Placas con agar Nutritivo sembrada con cepa problema.

Asas de siembra
55
Pseudomona
aeruginosa
piocianina
RESULTADOS
EVALUACIN
1.Cules son las principales enterobacterias causantes de cuadros diarreico?
2. Realizar un flujograma para la identificacin de bacterias Gram negativas.
56
PRCTICA N 8
CULTIVO DE MUESTRAS CLNICAS: UROCULTIVO Y COPROCULTIVO
OBJETIVOS
Conocer el procedimiento para el cultivo de una muestra clnica.
Identificar los microorganismos ms frecuentes causantes de patologas clnicas.
Conocer las condiciones para una adecuada toma de muestra para cultivo de una
muestra clnica.
CULTIVO DE ORINA: UROCULTIVO
La infeccin del tracto urinario (ITU) , se define como la presencia y multiplicacin de

microorganismos en el tracto urinario con invasin de tejidos adyacentes. La presencia de
leucocitos en la orina , indica una respuesta inflamatoria del tracto urinario, la mayora de las
veces debido a una invasin tisular por bacterias. Por lo general la piuria, est presente en las
ITU , por lo que se le considera un criterio diagnstico para sta enfermedad.
La mayora de las ITU son causadas por bacilos Gram negativos de las enterobacterias ,
siendo la Escherichiacoli y Klebsiellasp, los ms frecuentemente aislados , en infecciones no
complicadas. Tambin pueden ser causa de ITU otros bacilos Gram negativos como
Proteussp ,Enterobactersp y Pseudomonaaeruginosa sobre todo en pacientes sometidos a
instrumentacin, portadores de catteres urinarios, con anomalas anatmicas o funcionales
del tracto urinario y en pacientes hospitalizados.
Entre las bacterias Gram positivas pueden estar Staphylococcusepidermidis y

Enterococcussp. En la mayora de las ITU , se recupera un nico microorganismo en la orina.
La presencia de ms de una especie bacteriana puede deberse a una contaminacin de la
muestra o pacientes con infecciones complicadas como por ejemplo litiasis , abscesos renales
o sondaje prolongado.
El diagnstico definitivo de la ITU se hace mediante el cultivo de orina :urocultivo . Hay que
considerar que por cuidadosa que sea la tcnica de toma de muestra ( salvo puncin
suprapbica) , es difcil excluir la contaminacin de la orina con las bacterias del tramo distal
de la uretra , lo que puede causar interpretaciones erradas.
La orina de miccin media es la ms recomendable para el urocultivo. En pacientes femeninas

es recomendable el lavado de genitales externos, en el paciente masculino retraer la piel del
prepucio. La primera parte de la miccin casi siempre ests contaminada con la flora
bacteriana uretral, por lo cual se debe descartar . La miccin media debe recogerse en un
envase estril. Se recomienda obtener la primera muestra de orina de la maana , donde se
encuentra mayor nmero de bacterias.
El cultivo de orina se realizar para identificar y cuantificar el nmero de bacterias presentes

por mililitro en la orina, lo que se expresa en unidades formadoras de colonias (UFC) . La
muestra de orina debe enviarse el laboratorio en el plazo mximo de 2 horas a temperatura
ambiente, puesto que la orina es un buen medio de cultivo para muchas bacterias y la
multiplicacin de los grmenes
entre el momento de la toma de muestra y el cultivo, alterar los resultados.
Es recomendable que en todas las muestras de orina para urocultivo , se realice un examen
microscpico cuantitativo , para determinar el nmero de leucocitos por milmetro cbico.
57
MATERIALES
Frasco estril de 100 ml

Asa de siembra calibrada 0,01ml
Pipetas graduadas de 1ml estriles
Placas con agar Mac Conkey y Eosina azul de metileno
Lminas portaobjetos , laminilla
Equipos de coloracin para tincin de Gram
Centrfuga y microscopio
METODOLOGA
Evitar la contaminacin de la muestra, utilizando equipos estriles: frascos, pipetas,

placas de Petri, tubos de pruebas estriles.
Examen directo:
Centrifugar aproximadamente 10 ml de orina por tres (3) minutos a 3 000 rpm y
luego decantar el sobrenadante y observar el sedimento al microscopio a lente de
40X
Cultivo
Con el asa de siembra calibrada : 0,01 ml, previa agitacin de la muestra , tomar
una muestra con el asa y sembrar por estras en agar Mac Conkey, previamente
dividida en cuatro cuadrantes , empezando las estras por el primer cuadrante y
sin esterilizar el asa continuar la siembra en el segundo, tercer y cuarto
cuadrante.
Rotular la placa e incubar 24 horas a 37 C.
RESULTADOS
Realizar la lectura de la placa y a partir de una colonia bien aislada realizar las pruebas
bioqumicas para la diferenciacin.
Realizar el contaje de colonias para obtener el recuento total de UFC/ml.
58
Sedimento urinario Agar Mac Conkey

Simmons
CULTIVO DE HECES: COPROCULTIVO
La diarrea puede definirse como el proceso de eliminacin frecuente de heces, disminucin de

su consistencia o ambas cosas. El diagnstico etiolgico se realiza mediante el cultivo de los
microorganismos presentes en la materia fecal : Coprocultivo , realizndose primero el
aislamiento y luego la identificacin de las bacteria presentes en las heces.
Las bacterias causantes de diarreas ms frecuentes son :Salmonella, Shigella y
Escherichiacolienteropatgena .Tambin puede producirse cuadros diarreicos por :
Campylobactersp, Yersiniaenterocoltica ,Vibrio cholerae, Staphylococcusaureus y
Clostridiumdifficile.
59
Para realizar este procedimiento se requiere que la muestra se colecte en el curso de la
enfermedad, antes de iniciar tratamiento y que se deposite en un frasco estril, procurando no
mezclarla con la orina. Si esto no es posible es conveniente conservar la muestra en un medio
de transporte adecuado manteniendo en refrigeracin hasta su siembra.
Muestras inaceptables:
Muestras no conservadas de ms de 4 a 6 horas.
Muestras mltiples el mismo da
Muestras contaminadas con orina.
METODOLOGA
Examen Directo
El examen microscpico directo de las heces permite la observacin de polimorfonucleares, lo
que sugiere la infeccin de por un patgeno invasivo.
Examen en fresco y/o tincin de Azul de metileno de Loeffler.
Tincin de Gram : permite observar polimorfonucleares y flora predominante.
Inoculacin
El coprocultivo se realiza a partir de muestras recin emitidas de preferencia, de las cuales se
inoculan los medios de cultivo.
Medios diferenciales
Para diferenciar a los bacilos entricos fermentadores de lactosa (L+) de los no fermentadores
de lactosa (L -), e inhibir el crecimiento de la flora Gram positiva aerobia: agar Mac Conkey,
agar Eosina azul de metileno, agar Endo.
Medios selectivos
Para inhibir el crecimiento de la mayora de las enterobacterias y permitir el crecimiento de
Salmonella spp y Shigellaspp : agar Xilosa-lisina-desoxicolato (XLD) y agar Salmonella
Shigella (SS)
Medio lquido
Utilizar medio Selenito F para suprimir el crecimiento de la flora normal durante las horas
iniciales de incubacin. Se resiembran en medio slido a partir de las 6 horas. Este medio de
cultivo es fundamental para el estudio de portadores asintomticos.
Medios especiales
Vibrio spp
Medio de enriquecimiento: agua peptonada alcalina a partir de 6 horas ,subcultivar en agar
Tiosulfato-Citrato-Bilis-Sucrosa (TCBS)
Medio selectivo :TCBS
Campylobacter medio selectivo : medio CAMP
MATERIALES
Muestra de heces
Placas de Petri con agar SS, EMB
Tubos con caldo Selenito
Lminas portaobjetos y laminillas
Asas de siembra
Tubos con medios diferenciales o bioqumicos.
60
RESULTADOS
Realizar la lectura de los medios de cultivo y las colonias sospechosas , realizar las pruebas
bioqumicas para diferenciar las especies de enterobacterias.

Simmons
CULTIVO DE SANGRE: HEMOCULTIVO
La deteccin de microorganismos viales en muestras de sangre tiene gran importancia

diagnstica.
Cuando bacterias u hongos se multiplican a una razn que supera la capacidad del sistema
retculoendotelial del torrente sanguneo , se produce bacteriemia y fungemia. Bacteriemia
61
persistente o crnica ocurre cuando no se ha podido localizar o drenar adecuadamente, el
foco de la infeccin.
La entrada directa de bacteria al torrente sanguneo ocurre en infecciones

intravascularescomo : endocarditis, fstulas arteriovenosas, aneurismas micticos, flebitis
supurativas, catteres intravenosos infectados y arteriales permanentes. Es importante
comprender las circunstancias en que puede desarrollar una bacteriemia para planificar los
mtodos de diagnstico as como la interpretacin de los resultados. Las fuentes de
bacteriemias son : sistema genitourinario 25 %, sistema respiratorio 20 % , abscesos 10%,
heridas quirrgicas5 % , otros sitios conocidos 10 % y sitios desconocidos 25 %.
Siempre que exista una razn para sospechar de bacteriemia se debe practicar el cultivo de la
sangre, perifrica o medular. Ya que en muchas ocasiones solo se puede establecer el
diagnstico mediante este procedimiento. El aislamiento de un microorganismo de los
hemocultivos es transcendente porque establece el diagnstico etiolgico de la bacteriemia y
permite la eleccin del tratamiento.
Sepsis agudas, osteomielitis, meningitis , neumona , pielonefritis: en estos casos el

hemocultivo debe considerarse un procedimiento de urgencia.
Bacteriemia continua de origen intravascular como endocarditis, infecciones asociadas a
catteres , de origen desconocido, con sospecha de fungemia e inmunodeprimidos, la muestra
se puede tomar en cualquier momento.
Bacteriemias intermitentes: lo ideal es realizar la prueba cuando el paciente presenta
escalofros o poco despus o durante del pico febril. Entre el 14 y 25 % de los pacientes
hospitalizados, tienen sospecha de bacteriemia y en un 14 % de los casos esta prueba
establece el diagnstico.
INDICACIONES
Fiebre alta aunque en neonatos y ancianos la bacteriemia puede cursar con
hipotermia y deterioro general, shock no explicado, infecciones localizadas,
leucopenia, leucocitosis o trombopenia no relacionada con procesos hematolgicos .
Siempre se deben realizar en un mnimo de dos (2) horas.
Nunca debe refrigerarse antes de su envo , puede conservarse en estufa.
MATERIALES
Cultivos en medios Ruz -Castaeda
METODOLOGA
Se observarn los medios usados para hemocultivo.
RESULTADOS
Grafique lo observado en la prctica.
EXUDADOS VAGINALES (exocervicales)

La mucosa vaginal tiene una flora microbiana normal , cuyo crecimiento y consideracin son
importantes para el estudio microbiolgico de las infecciones vaginales. Se pueden considerar
tres situaciones :
Conocer cuando se altera el equilibrio de esta flora colonizante
Bsqueda de agentes exgenos , trasmitidos normalmente por va sexual
Deteccin de portadoras de determinados microorganismos
La mayora de las situaciones clnicas que pueden ser objeto de estudios microbiolgicos para
el aislamiento o visualizacin del agente etiolgico son :
62
Vulvovaginitis : agentes etiolgicos ms frecuentes : Cndida spp , principalmente C.
albicans; Trichomonasvaginalis y virus Herpes simple.
La presencia de un cultivo puro de otros microorganismos observados en tincin de Gram con
leucocitos , puede tener significacin.
Vaginosis : desde el punto de vista microbiolgico se caracteriza por la ausencia o

disminucin de la flora mixta compuesta por Gardnerellavaginalis, anaerobios (Mobilluncus,
Bacteroides, cocos anaerobios) y Mycoplasmahominis.
Infeccin gonoccica : la endocervicitis gonoccica cursa con leucorrea , el exudado vaginal

no es la muestra adecuada para el diagnstico por lo que se recomienda la obtencin de
exudado endocervical.
Tipos de estudios microbiolgicos

Cultivo bacteriano
Cultivo de levaduras
Despistaje de Streptococcusagalactiae
Cultivo de virus Herpes simple ya que requiere de toma de muestra y medio de transporte y
cultivos especiales, se realiza por peticin expresa del clnico.
Toma de muestra
No debe usarse antisptico previo a la toma de la muestra . Si se utiliza espculo,

lubricar con agua caliente.
Se recomienda tomar dos (2) hisopados .
Se introduce un hisopo estril en la vagina y se recoge la muestra de la zona de
mayor exudado o en su defecto del fondo del saco vaginal posterior. Se introduce el
hisopo en el medio de transporte.
El envo de la muestra al laboratorio debe de ser de inmediato siempre que sea
posible. Cuando no se pueda procesar la muestra de inmediato, se mantendr en
refrigeracin o a temperatura ambiente.
Si se sospecha de infeccin gonoccica, no refrigerar la muestra.
Tiempo mximo de procesamiento con medio de transporte : 24 horas.
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
Uno de los hisopos se emplear para el examen microscpico y el otro para el cultivo.
Examen microscpico : es el nico mtodo aceptado para el diagnstico microbiolgico de la

vaginosis bacteriana. Se har una extensin del hisopo en lmina y tincin de Gram.
Cultivo : se pueden establecer diferentes combinaciones de medios en funcin de la

orientacin diagnstica : agar Sangre en atmsfera de CO2 , agar Chocolate en atmsfera de
CO2, MacConkey, agar Thayer Martin en atmsfera de CO2, medio para Gardnerella en
atmsfera de CO2 , Sabouraud con antibitico u otro medio para Cndida, caldo para cultivo de
Trichomonavaginalis.
Examen de la muestra
Examen microscpico : en el exudado vaginal normal se observar flora regional con

predominio de morfotipoLactobacillussp y clulas epiteliales
Presencia de leucocitos
Presencia de levaduras o pseudohifas
Presencia nica o abundante , de cualquier otro microorganismo
63
Exudado caracterstico de vaginosis bacteriana
Presencia de clulas clue : clulas epiteliales recubiertas por bacilos o cocobacilos Gram
variables.
Ausencia o escasos leucocitos.
Flora mixta alterada.
Examen en medios de cultivo
El examen en medios de cultivo : examinar todos los medios a las 18 y 24 horas. Si no hay
crecimiento de patgenos , incubar hasta la 48 horas , a excepcin del cultivo en agar Mac
Conkey que se descarta a las 18 horas. El agar Thayer Martin se incubar hasta 72 horas si
es negativo.
Agar Sangre : presencia de microorganismos en cantidad variable , en especial

Streptococcuspyogenes o Streptococcuspneumoniae.
Agar Chocolate : presencia de microorganismos en cantidad variable , en especial
Haemophilussp.
Agar Mac Conkey : presencia de enterobacterias.
Agar Thayer Martin : presencia de colonias grises brillantes de distintos tamaos,
oxidasa positivo, compatibles con gonococo.
Medio Gardnerella : presencia de colonias hemolticas puntiformes en gran
cantidad posiblemente Gardnerellavaginalis.
Agar Sabouraud : presencia de levaduras.
SECRECIN URETRAL
La uretritis es el sndrome ms comn dentro de las Enfermedades de Transmisin Sexual

(ETS), aunque muestra un claro descenso en las ltimas dcadas en relacin con otras ETS,
tanto en Espaa como en otros pases desarrollados. Atendiendo a su etiologa se clasifican
en uretritis gonoccica y no gonoccica (UNG) , siendo estas ltimas las ms frecuentes en
pases desarrollados.
N. gonorrhoeae es responsable en nuestro medio de menos del 25 % de todos los episodios

de uretritis. Los restantes son causados por C. trachomatis, Ureaplasmaurealyticum y por un
nmero variable de otros potenciales patgenos en los que la asociacin causa-efecto con la
uretritis est menos aclarada . La asociacin de ms de un patgeno como causa de la
uretritis es ms que anecdtica y la ms frecuente de ellas es la asociacin de C. trachomatis
y N. gonorrhoeae. Un dato significativo es la presencia de T. vaginales como nico agente
encontrado hasta en un 4 % de las
uretritis no gonoccicas. Cuadros de uretritis pueden estar causados por la presencia de
condilomas intrauretrales.
La gonorrea usualmente se desarrolla a los 2 a 6 das tras la exposicin, en tanto que la UNG
es variable, desde 1 a 5 semanas. Tanto las uretritis gonoccicas como las no gonoccicas
producen supuracin uretral, disuria y escozor.
El diagnstico de uretritis se establece si al menos se dan de los siguientes supuestos
Sntomas : historia de secrecin uretral y/o disuria
Demostracin con tincin Gram : ms de 5 leucocitos polimorfonucleares por
campo de 1 000 aumentos en el examen directo de la secrecin uretral.
Los pacientes con sntomas de uretritis, sin secrecin, visible, deben ser
64
examinados, pidindoles que no miccionen en las 4 a 8 horas previas a la toma de muestra .
Se obtienen los 5 a 10 primeros ml de orina y tras la centrifugacin a 400 rpm se examinan al
microscopio de 400 aumentos. La presencia de ms de 15 leucocitos polimorfonucleares por
campo confirma el diagnstico de uretritis.
Los sntomas de la uretritis gonoccica puede permanecer hasta ms de 7 das, por ello la
uretritis postgonoccica se suele diagnosticar despus de transcurrido este perodo. En el
examen con tincin de Gram, la presencia de diplococos Gram negativos (DGN) intracelulares
, establece el diagnstico de uretritis gonoccica. La presencia de clulas inflamatorias en el
exudado uretral en ausencia de diplococos Gram negativos y cultivo negativo para establecer
el diagnstico de UNG.
El xito del diagnstico microbiolgico de la uretritis gonoccica depende de la correcta

obtencin, transporte y procesamiento de muestras. En cada muestra deben emplearse dos
hisopos, uno para el cultivo y otro para la extensin del exudado uretral para realizar la tincin
de Gram. Las muestra para cultivo debern inocularse en medios selectivos (Thayer Martin
modificado, Martin- Lewis ) e incubarse de modo inmediato a 35 a 37C durante 72 horas en
una atmsfera de 3 a 10 % de CO2 y humedad. Cuando esto no sea posible , es necesario
inocular las muestras en medio de transporte (Stuart o Amies ) .
Examen microscpico : en la secrecin uretral se debe observar presencia de clulas y

bacterias, en especial diplococos Gram negativos intra y extracelulares.
Evaluar : presencia de leucocitos polimorfonucleares.
Examen en medios de cultivo : examinar, todos los medios a las 18 y 24 horas. Si no hay
crecimiento de patgenos , incubar hasta la 48 horas. El agar Thayer Martin se incubar hasta
72 horas si es negativo.
Agar Sangre :Streptococcuspyogeneso Streptococcuspneumoniae
Agar Chocolate :Haemophilus sp, Thayer Martin : gonococo.
Pruebas bioqumicas : a las colonias sospechosas realizar las pruebas bioqumicas : Prueba
de oxidasa y fermentacin de carbohidrato para Neisseria.
EVALUACIN
1. Realizar un flujograma de urocultivo
2. Realizar un flujograma de secrecin de herida.
65
PRCTICA N 9
IDENTIFICACIN Y AISLAMIENTO DE MYCOBACTERIUM
COLORACIN DE ZIEHL-NEELSEN.
BACTERIAS ANAEROBIAS
OBJETIVOS
Conocer los riesgo y precauciones durante el procesamiento de muestras con

micobacterias.
Conocer el procesamiento de las muestra para el estudio de micobacterias.
Explicar el fundamento de la coloracin de Ziehl-Neelsen.
Ejecutar la tcnica de coloracin de Ziehl-Neelsen.
INTRODUCCIN
El gnero Mycobacterium est integrado por ms de 100 especies, presentan alto contenido
de cidos miclicos en su pared que retienen las anilinas utilizadas como colorantes : fucsina ,
auramina, aun despus de ser tratadas con alcohol-cido de modo que todas las especies se
presentan como cido-alcohol resistentes (BAAR).
El complejo Mycobacteriumtuberculosis comprende varios agentes etiolgicos de tuberculosis
M.tuberculosis ,M.africanum y M.canetti, los cuales son primariamente patgenos en el
hombre.
M.tuberculosis y M.africanumson las especies de micobacterias ms importantes por ser
altamente patgenas para el hombre y muy transmisibles de persona a persona por aerosoles
expulsados por la tos de pacientes con lesin pulmonar.
La muestra ms examinada en la investigacin de Mycobacteriumtuberculosis es la de esputo

debido a que la tuberculosis pulmonar es la ms frecuente, sin embargo dado que la
enfermedad puede manifestarse en cualquier rgano , con menor frecuencia puede requerirse
la investigacin de muestras como orina, lquido cefalorraqudeo, lquido pleural, lquido
asctico, sangre, pus de cavidades abiertas, biopsias, las cuales deben procesarse tambin
para cultivo.
La muestra de esputo mucopurulenta proveniente del rbol bronquial que se obtiene despus
de un esfuerzo de tos, es la que asegura mayor probabilidad de que se puedan observar
bacilos, debe tener un volumen aproximado de 3 a 5 ml .Se recomienda analizar 2 3
muestras de cada sintomtico respiratorio. La primera muestra debe obtenerse en el momento
de la consulta y la segunda al da siguiente al despertar por la maana. Puede obtenerse una
tercera muestra al momento de entregar al laboratorio la segunda muestra. El envase debe ser
de boca ancha y con tapa de rosca.
Si la muestra de esputo no va a ser procesada el mismo da, se debe introducir cada envase
en una bolsa de polietileno y anudar la bolsa por encima de la tapa , se conservarn en
refrigeracin a 4 C, para impedir la proliferacin de la flora secundaria, preferentemente
dentro de una caja de plstico.
Para manipular las muestras y sobre todo los pasajes a otros medios de cultivo es importante
hacerlos en la cabina de seguridad.
Para que la baciloscopa sea positiva es preciso que la muestra contenga entre 5 000 y 10 000
bacilos por ml de muestra.
Las micobacterias se multiplican con ms lentitud que otras bacterias patgenas para el
hombre a causa de su pared celular hidrfoba, que las hace agruparse e inhibe la
permeabilidad celular a los nutrientes
66
El medio de cultivo ms conocido es el Lwenstein-Jensen. La temperatura ptima de
crecimiento es de 37C. Los cultivos se revisarn diariamente hasta un total de 60 das ,
pasados los cuales si no hay crecimiento se considerarn negativos.
Lectura de los extendidos

Observar cada campo microscpico en superficie y profundidad , moviendo el tornillo
micromtrico antes de desplazarse al siguiente campo; seguir un recorrido en lneas rectas,
para recorrer el extendido evitando repetir la lectura de los campos , ejemplo : de izquierda a
derecha. El nmero mnimo de campos a examinar es de 100 , los cuales pueden ser ledos
por un microscopista experimentado en cinco .
Los bacilos se observarn como bastoncillo delgados , ligeramente curvos, rojo fucsia,
destacndose claramente contra en fondo azul. Pueden presentarse aislados, apareados o
agrupados.
Escala semicuantitativa para los extendidos examinados por tincin Ziehl-Neelsen
Resultado del examen microscpico Informe

No se encuentran BAAR en 100 campos observados No se observan bacilos cido-alcohol
Se observan de 1 a 9 BAAR en 100 campos resistentes
observados N exacto de bacilos en 100 campos
Se observan entre 10 y 99 BAAR en 100 campos
observados Positivo (+)
Se observan de 1 a 10 BAAR en 50 campos
observados Positivo (++)
Se observan ms de 10 BAAR en 20 campos
observados Positivo (+++)
Tincin de Ziehl-Neelsen
La cido-alcohol resistencia es la propiedad que tienen las micobacterias de captar en su

pared fucsina fenicada y retenerla aun con la accin de los decolorantes como la mezcla de
cido y alcohol . Esta caracterstica se debe al alto contenido lipdico fundamentalmente
fosfolpidos, ceras y cidos miclicos.
MATERIALES
Muestras de esputo inactivadas (autoclavadas) de pacientes Bk positivos
Frotis fijos de Mycobacteriumtuberculosis a partir de esputos
Tubos con medios de cultivo Lwestein-Jensen mostrando colonias de micobacterias
Equipo de coloracin para tincin de Ziehl-Neelsen
Mecheros
Lminas portaobjetos
Microscopios
METODOLOGA
Preparacin y fijacin del extendido
1. Ordenar las muestras

2. Numerar las lminas portaobjetos
3. Tomar la muestra y la lmina portaobjetos y colocarlas por detrs del mechero, de
manera que la llama quede entre el operador y el frasco
4. Destapar con cuidado el envase
5. Partir un aplicador en dos. Tomar una parte del aplicador con la mano izquierda y
la otra con la mano derecha entre el pulgar y el ndice y con los extremos
67
irregulares seleccionar la partcula ms densa o purulenta de la muestra
6. Colocar las partculas seleccionadas sobre la lmina portaobjetos y extenderla con
movimientos suaves . Dejar secar el extendido a temperatura ambiente
7. Desechar el aplicador en un frasco que contenga una solucin de hipoclorito de
sodio al 1 %.
8. Cerrar el envase de la muestra
9. Cuando el extendido haya secado, pasarlo sobre la llama del mechero por tres (3) o
cuatro (4) veces para fijarlo.
Tincin de Ziehl-Neelsen
1. Cubrir totalmente la superficie del extendido con fucsina bsica fenicada

2. Con la llama de un hisopo embebido de alcohol calentar suavemente por debajo de
los extendidos, con movimientos de vaivn, hasta observar que se desprenden los
primeros vapores blancos
3. En el trmino de 5 minutos calentar tres veces hasta la emisin de vapores.
No dejar hervir la fucsina porque la pared de los bacilos puede destruirse y
colorearse mal.
4. Dejar enfriar y enjuagar con abundante agua
5. Cubrir todo el extendido con la solucin decolorante y dejar actuar por tres
minutos. Enjuagar con abundante agua
6. Cubrir todo el extendido con solucin de Azul de metileno, dejar actuar por un
minuto
7. Enjuagar con abundante agua
8. Dejar secar al medio ambiente
1. Cubrir con fucsina 2. Calentar suavemente con

bsica fenicada ayuda del hisopo (5 minutos)
68
4. Cubrir con solucin
3. Enjuagar con decolorante (3 minutos)
abundante agua
5. Enjuagar con 6. Cubrir con Azul de

abundante agua metileno (1 minuto)
7. Enjuagar con
abundante agua
69
bacilos cido-alcohol
resistentes
Medio de cultivo
Lwenstein-Jensen
Crecimiento de
Mycobacteriumtuberculosis
RESULTADOS
Realizar la observacin microscpica de las lminas y graficar los resultados.
70
BACTERIAS ANAEROBIAS
Las bacterias anaerobias han sido encontradas en infecciones que comprometen todos
los rganos y regiones anatmicas del cuerpo. Los abscesos ms profundos y las lesiones
necrosantes que involucran anaerobios son polimicrobianos y pueden incluir aerobios
obligados, anaerobios facultativos, microaerfilos como microorganismos acompaantes.
Estos microorganismos, de forma conjunta con el trauma, la stasis vascular o la necrosis
tisular, reducen la tensin de oxgeno y el potencial de oxidoreduccin en los tejidos y proveen
las condiciones favorables para la multiplicacin de los anaerobios obligados.
En las ltimas dcadas , las infecciones anaerobias se han vuelto ms comunes, para lo cual
existen dos probables explicaciones : a) el aislamiento por parte del laboratorio de las
bacterias anaerobias ha mejorado de modo que las infecciones endgenas no son ms mal
diagnosticadas o pasan inadvertidas , b) una proporcin mayor de pacientes est recibiendo
frmacos inmunosupresores por neoplasias u otras enfermedades , lo que deriva en la
resistencia del husped inmunodeprimido. Las infecciones anaerobias primarias se establecen
fcilmente en reas de tejido daado y la bacteriemia, diseminacin metastsica de las
bacterias con formacin de abscesos distantes y una cadena progresiva de eventos , pueden
suceder a veces con un desenlace mortal. Es importante el aislamiento e identificacin de las
bacterias anaerobias debido a que estas se asocian a una elevada morbimortalidad y a que el
tratamiento vara segn la especie implicada.
Aislamiento de bacterias anaerobias
Seleccin de las muestras para el cultivo :

Debido a que los anaerobios residentes a menudo
estn presentes en grandes cantidades como flora normal en las superficies de las mucosas ,
incluso la contaminacin mnima de una muestra puede dar resultados errneos. Todos los
materiales recogidos de lugares que carecen de flora natural como lquidos corporales que no
sea orina, exudados de abscesos profundos, aspirados con aguja fina y biopsias de tejidos
pueden ser cultivados para bacterias anaerobias.
Recoleccin y transporte de las muestras:

Al tomar muestras de piel o mucosas, se debe se
descontaminar la superficie, para lo cual se debe utilizar jabn , alcohol etlico al 70 % y tintura
de yodo por un minuto ( en crculos concntricos comenzando por el centro), tambin se
puede utilizar yodopovidona al 10 % , luego de lo cual se espera al menos 2 minutos antes de
la extraccin de la muestra . El material para el cultivo anaerobio se obtiene mejor por biopsia
de tejidos o por puncin y aspiracin . El empleo de hisopos no es una alternativa adecuada
debido a la exposicin excesiva de la muestra a los efectos de la desecacin , la posibilidad de
contaminacin durante la recoleccin y a que los microorganismos pueden quedar retenidos
dentro de las fibras del hisopo. Si se utiliza un hisopo, este debe provenir de un sistema de
transporte exento de oxgeno.
Un factor crucial para la viabilidad de los cultivos anaerobios es el transporte de las
muestras; el efecto letal del oxgeno atmosfrico debe ser nulo hasta que la muestra pueda
procesarse en el laboratorio. Ya no se acepta tapar de nuevo una jeringa ni el transporte de la
aguja y la jeringa al laboratorio debido a los problemas secundarios a lesiones por puncin .
Por lo tanto incluso los aspirados deben inocularse en el mismo tipo de tubo o frasco ampolla
libre de oxgeno. La muestra (pus, lquidos corporales u otro material lquido) se inocula a
travs del tapn de goma despus de extraer todo el aire de la jeringa y la aguja. Si slo se
puede obtener una muestra con hisopo, se requiere de un dispositivo especial para la
recoleccin con una atmsfera libre de oxgeno. Cuando se reinserta el hisopo, debe de
tenerse cuidado de no inclinar el recipiente , lo que provocara la salida y el desplazamiento
del anhdrido carbnico o el nitrgeno libre de oxgeno al aire ambiental.
El tejido puede colocarse en una pequea cantidad de lquido para preservarlo de la
desecacin y luego colocarlo en una bolsa para anaerobiosis.
71
Todas las muestras deben mantenerse a temperatura ambiente hasta su procesamiento en el
laboratorio, dado a que la refrigeracin puede oxigenar la muestra. Todas las muestras deben
ser remitidas al laboratorio lo antes posible.
Examen directo de los materiales clnicos:

El anlisis macroscpico de las muestras es
importante para establecer la presencia de anaerobios, datos orientadores sern el hallazgo
de un olor ftido, el aspecto purulento de muestras lquidas as como el hallazgo de tejido
necrtico y gas.
En los portaobjetos preparados para la tincin de Gram, es ms til la fijacin con metanol que
el calor; se deben observar caractersticas celulares y el fondo del frotis y en la tincin de
Gram , observar la forma, tamao, disposicin de las bacterias y registrar el nmero de
microorganismos presentes . Observar caractersticas morfolgicas distintivas como :
presencia de esporas, ramificaciones, filamentos con corpsculos esfricos, formas
granulares. La tincin de Gram permite determinar caractersticas celulares, las tinciones de
Wright y Giemsa a veces pueden revelar informacin adicional. Las tinciones de naranja de
acridina son las ms tiles para detectar bacterias en hemocultivos, lquido cefalorraqudeo,
lquido pleural, lquido articular y exudados.
Procesamiento de las muestras

Las muestras para cultivos anaerobios pueden procesarse en la mesa de trabajo
comn con incubacin en jarras o bolsas para anaerobiosis o en una cmara anaerobia.
Jarras para anaerobiosis : el sistema que ms se utiliza para crear una atmsfera anaerobia
es la jarra para anaerobiosis; para lo cual se utiliza una jarra plstica transparente ( disponible
en el comercio) con una tapa que se cierra para hacerla hermtica. Las condiciones de
anaerobiosis pueden obtenerse mediante el uso de un sobre que se adquiere en el comercio,
generador de hidrgeno y CO2, que se activa con el agregado de agua o con la humedad
proveniente de las placas de agar. La anaerobiosis se alcanza luego de 1 a 2 horas.
Bolsas plsticas anaerobias : Es una bolsa de plstico transparente , de varios tamaos,

con capacidad para una a tres placas de Petri de 100 mm de dimetro, un generador de gas
H2-CO2 que produce una atmsfera cuando se le agrega agua, partculas de catalizador de
paladio fro y resazurina como indicador. La bolsa se sella con calor luego de la activacin del
generador para permitir el mantenimiento de las condiciones anaerobias.
Incubacin de los cultivos

En la mayora de los casos, la temperatura adecuada es de 35 a 37C, para el aislamiento
primario de bacterias anaerobias a partir de muestras clnicas. Las placas inoculadas en las
mesas de trabajo y colocadas en las jarras de anaerobiosis deben incubarse al menos 48
horas y reincubarse por otros 2 a 4 das para permitir que los microorganismos de crecimiento
lento formen colonias; algunos anaerobios como ciertas especies de Actinomyces y
Eubacterium, crecen ms lentamente y las colonias no pueden detectarse si las jarras se
abren antes. Si las jarras se abren pronto, algunos de los microorganismos de crecimiento
lento pueden morir debido a la exposicin de oxgeno. Debe evitarse la exposicin prolongada
de las placas recin inoculadas al aire ambiental, ciertos anaerobios encontrados en muestras
clnicas como Peptostreptococcusanaerobius , pueden no crecer o mostrar un retraso
prolongado en el desarrollo cuando las placas recin inoculadas se mantienen en el aire
ambiental.
CUADRO N1 : Incidencia de anaerobios como flora normal de los seres humanos
72
GNERO Piel Tracto Intestino Genitales Uretra Vagina
Respiratorio externos
Superior
BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
Bacteroides 0 +/- 2 +/- +/- +/-
Prevotella 0 2 2 1 +/- 1
Porphyromonas 0 1 1 D D +/-
Fusobacterium 0 2 1 D D +/-
Veillonella 0 2 1 0 D 1
BACTERIAS GRAM POSITIVAS
Finegoldia magna 1 2 2 1 +/- 1
Micromonas 1 2 2 1 +/- 1
micros
Clostridium +/- +/- 2 +/- +/- +/-
Actinomices 0 1 1 0 0 +/-
Bifidobacterium 0 1 2 0 0 +/-
Eubacterium 0 1 2 D D 1
Lactobacillus 0 1 1 0 +/- 2
Propionibacterium 2 1 +/- +/- +/- 1
D:Desconocido; 0: No se encuentra o raro; +/-: irregular; 1: por lo comn presente; 2 :
Presente en grandes cantidades
CUADRO N2: Muestras que no deben cultivarse en medios para anaerobios
HISOPADOS FARNGEOS O NASOFARNGEOS

Hisopados gingivales
Muestras broncoscpicas o esputo
Contenido gstrico, contenido de intestino delgado, heces, hisopados rectales, fstulas
colonocutneas
Superficies de lceras por decbito, hisopados de muestras de costras de
abscesos,revestimientos mucosos
Materiales adyacentes a la piel o las mucosas
Orina de miccin espontnea
Hisopados cervicales o vaginales
MATERIALES
Placas con agar Chocolate
Jarra anaerobia
RESULTADOS
73
EVALUACIN
1. Qu personas son ms susceptibles a la contaminacin con Mycobacterium tuberculosis?
2. Defina :Multidrogorresistente
3. En qu casos se hace necesario realizar una prueba de susceptibilidad antibitica a los

pacientes con tuberculosis?
4. Realizar un flujograma para la identificacin de bacterias anaerobias.
...............
74
PRCTICA N 10
DIAGNSTICO MICOLGICO: HONGOS AMBIENTALES
OBJETIVOS
Conocer las tcnicas para la toma de muestra en el diagnstico micolgico.

Identificar los productos patolgicos de donde se pueden aislar los agentes
etiolgicos de las micosis humanas.
Conocer las caractersticas de los exmenes directos, como de los cultivos de
hongos.
INTRODUCCIN
La mayora de los hongos tienen un hbitat saproftico, presentan una variedad de morfologa,
desde las levaduras hasta los hongos filamentosos. Los hay comestibles, de inters para la
industria alimentaria, qumica farmacutica y los venenosos. Del gran nmero de especies
estudiadas hasta la fecha (ms de 250 000) muy pocas son capaces de colonizar al ser
humano inmunocompetente, produciendo en stos casos las enfermedades denominadas
micosis.
Los hongos que producen micosis en el ser humano se encuentran en dos estados
morfolgicos bsicos: levaduras y mohos.
Levadura
Puede definirse como un hongo unicelular, redondo u ovalado que se reproduce por gemacin
o fisin binaria. Una levadura tambin puede ser el estadio morfolgico en el ciclo biolgico de
una especie filamentosa , se denomina a esto dimorfismo.
Mohos
Son hongos multicelulares cuya estructura filamentosa se forma por el crecimiento continuo a
partir de una espora .El elemento tubular que emerge de denomina hifa, el que sigue
creciendo y ramificndose llegando a formar un conjunto entrelazado al que se denomina
micelio o talo. Parte de las hifas se introducen en el sustrato y forman el micelio vegetativo
y las que se proyectan hacia el exterior constituyen el micelio areo, muchas levaduras en
determinadas circunstancias y dependiendo de la especie , pueden producir pseudohifas.
El micelio areo muestra macroscpicamente diferentes caractersticas, lo cual contribuye a la

identificacin primaria; puede ser algodonoso, velloso, arrugado, polvoriento, cerebriforme,
pigmentado o no, etc. En l se producen los elementos de propagacin, las esporas y los
conidios. Los micelios tienen la capacidad de germinar un nuevo sustrato y as producir un
nuevo elemento. Este conjunto de caractersticas observadas sobre el medio de cultivo se
denomina colonia.
Los hongos como clulas eucariticas poseen ncleo, nucleolo, retculo endoplasmtico,
ribosomas, mitocondrias, vacuolas, cuerpos lipdicos y otras inclusiones. Rodeando el
citoplasma existe una membrana y una pared celular con caractersticas muy definidas. Se
multiplican a travs de estructuras
que pueden ser asexuales o sexuales previa fusin del protoplasma y ncleo de clulas
distintas. Tambin lo hacen mediante crecimiento vegetativo expansivo como ocurre de rutina
en el laboratorio con levaduras o fragmentos de micelio.
Como en otras enfermedades infecciosas , las micosis se diagnostican en el laboratorio

siguiendo el esquema clsico : examen directo, cultivos e inmunodiagnstico.
75
Examen directo
Se realizar un estudio directo (pelo, escama, ua ,sangre, gota de pus. exudado, etc )
colocando la muestra entre un portaobjetos y un cubreobjetos, y luego observndola al
microscopio
Se puede realizar una preparacin en fresco en lmina portaobjetos adicionando una gota de
hidrxido de potasio al 10% (KOH al 10 %). Para la visualizacin de la cpsula de
Criptococcusneoformans (LCR), se puede adicionar una gota de tinta china. En los exudados
purulentos se recomienda realizar una tincin de Gram, Giemsa, y tambin Wright. Si se trata
de cortes histolgicos hacer una preparacin con hematoxilina y eosina.
Cultivos
El medio ms utilizado en micologa clnica es el descrito por Sabouraud. A este medio base
se le aade una cantidad superior de glucosa (40 X 100), denominndose as agar glucosado
de Sabouraud (SGA) , al cual posteriormente se le han adicionado antibiticos con el fin de
evitar la contaminacin bacteriana y cicloheximida (actidiona) , para inhibir los hongos
saprofitos.
La incubacin en micologa mdica es siempre en aerobiosis, oscilando el tiempo desde 2 a 3

das para levaduras y especies saprofitas. La temperatura de incubacin es 32 C ; los
dermatofitos y otros causantes de micosis cutneas a 25 a 30 grados centgrados
(temperatura ambiental)
El producto patolgico y la tcnica de toma de muestra se elegir de acuerdo con el tipo de

micosis por investigar.
MATERIALES
Tubos de prueba conteniendo agar glucosado de Sabouraud (SGA)
Cultivos de especies ambientales :Penicillum , Alternaria , Aspergillus,
Hormodendrum
Frasco con KOH al 10 %
Asa de siembra
METODOLOGA
Observar macroscpicamente y realizar preparaciones con Azul de lactofenol para su
observacin microscpica.
Penicillum
76
Aspergillus
fumigatus
Aspergillus
niger
Rhizopus
77
RESULTADOS
Observar al microscopio (10X y 40X) las muestras directas.
78
79
EVALUACIN
1. Elaborar un cuadro comparativo de caractersticas morfolgicas , nutricionales y sensibilidad

a antibiticos de hongos y bacterias.
2. Explicar las tcnicas de diagnstico directas e indirectas para hongos.
80
PRCTICA N 11
DIAGNSTICO DE LAS MICOSIS SUPERFICIALES Y CUTNEAS
OBJETIVOS
Describir las caractersticas de las colonias de hongos causantes de las micosis
superficiales y cutneas en cultivos con agar glucosado de Sabouraud y
microscpicamente.
INTRODUCCIN
La colonizacin e invasin en mayor o menor grado de una especie fngica se denomina

micosis. Dentro de las micosis superficiales se incluyen las causadas por hongos que
colonizan la superficie queratinizada de la piel o pelo. Varios son los agentes etiolgicos que
pueden colonizar la piel.
Las infecciones cutneas incluyen una variedad de procesos en los que se encuentran
afectados piel y anexos (pelo y uas). La infeccin puede estar limitado a la capa crnea o
llegar a los estratos ms profundos , sin invasin linftica. Producidos por los hongos
denominados dermatofitos y las enfermedades por ellos producidas dermatofitosis. La
dermatomicosis incluye a cualquier proceso mictico de la piel y el de dermatofitosis se
reserva para los producidos por hongos dermatofitos.
MICOSIS SUPERFICALES
Piedra Negra
Se caracteriza por la presencia de ndulos en la porcin extrafolicular del pelo, ptreos y de
color negro. El agente causal es Piedra hortae
Piedra blanca
Muestra ndulos blanco-grisceos , que son masas agrupadas de hifas y pueden encontrarse
en la parte distal o central de pelo axilar , pubiano y crural. Agente causal
:Trichosporumcutaneo o T. beigelii.
Tia negra
Es una infeccin superficial de la piel debido a la colonizacin de Hortaeawerneckii. Se
caracteriza por la presencia de manchas negro-marronceas, no descamativas e indoloras ,
frecuente en las palmas , dedos y plantas , que en otro lugar de la piel.
Pitiriasis versicolor
Caracteriza lesiones furfurceas a veces papulomatosas o eritematosas, confluentes con
pigmento variable (hipo o hiperpigmentadas). Tiene como agente causal a Malasseziafurfur, se
localiza preferente en el tronco sobre todo hombros y espalda . Al examen microscpico
detectan los grupos de levaduras con hifas
MICOSIS CUTNEAS
Dermatomicosis
Micosis producida por Cndida albicans, hongo oportunista. Agente causal de intertrigos
(submamario o inguinal) , eczema de paales, onicomicosis con paroniquia y granuloma
candidisico., Adems de C. albicans tambin pueden presentar onicomicosisCndida
stellatoidea, C.tropicalis, C. guillermondi y C. parapsilosis.
Las preparaciones teidas con Gram , muestran levaduras Gram positivas redondas u ovales ,
con brotes de blastosporas de 3 a 4 m acompaadas de pseudohifas de 3 a 10 micras de
longitud.
81
La mayora de los medios de cultivo bacterianos son satisfactorios para el aislamiento de
Cndida; de todas las formas se recomienda efectuar la siembra en medio de Sabouraud con
antibiticos (cloranfenicol).Los medios que contienen actidiona (cicloheximida) inhiben el
crecimiento de algunas especies .
La incubacin se realiza a temperatura ambiente (25 a 30 C) cuando se trata de medios con

inhibidores y a 37C en el caso de medios enriquecidos exentos de sustancias inhibidoras. Al
cabo de 24 a 48 horas se puede observar las colonias
caractersticas de color blanco o crema, opacas, elevadas, lisas, brillantes o mates de 1 a3
mm de dimetro. La prueba de filamentacin y produccin de clamidosporascaractersticas ,
son muy sencillas y tiles para la identificacin de C. albicans.
Dermatofitosis
Es una infeccin fngica de los tejidos queratinizados (piel, pelo, uas) que ocurre en los seres
humanos y animales producida por un grupo de hongos estrechamente relacionados
denominados dermatofitos.
Los agentes etiolgicos de las dermatofitosis se clasifican en tres gneros :Epidermophyton ,

Microsporum y Trichophyton. El diagnstico se puede hacer mediante :
Examen directo
Para el estudio micolgico se procede a tomar la muestra, que en este caso sera , pelos,
escamas de la piel o muestras ungueales que se toman con pinzas o bistur estril del centro o
borde de la lesin y se colocan en una lmina. Se transportan entre dos lminas portaobjetos
limpias y se observan directamente al microscopio, con una gota de hidrxido de potasio al 10
% (KOH ) cubierto con una laminilla.
Al microscopio se pueden observar las artroconidias dentro del pelo (endotrix) o en forma de
vaina alrededor del pelo (ectotrix).
Cultivo
Las muestras se siembran en SGA adicionando cicloheximida, que inhiben los hongos
saprofitos. La identificacin se hace sobre la base del aspecto macroscpico de las colonias
entre ellos la produccin de pigmento. Luego las caractersticas microscpicas , observacin
de macroconidias y microconidias y elementos accesorios sirven para definir cada gnero y
especie.
Observar el desarrollo de los hongos en estudio y anotar las caractersticas de sus colonias
desarrolladas en SGA.
MATERIALES
Tubos sellados de SGA con cultivos de :
Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans
Microsporum gypseum, Microsporum canis
Preparaciones en lminas portaobjetos coloreadas con azul de lactofenol.
82
Cndida
albicans
Trichophytonm
entagrophytes
Trichophytonr
ubrum
Trichophyton
tonsurans
Microsporum
gypseum
83
METODOLOGA
Examinar al microscopio las lminas preparadas y esquematizar sus observaciones.
84
EVALUACIN
1. Qu caractersticas morfolgicas en los cultivos presentan los siguientes hongos?
Epidermophytonflocosum:
Trichoporumcutaneum :
2. Cules son las manifestaciones clnicas de las micosis producidas por :
Malasseziafurfur:
Piedra hortae:
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.
85
PRCTICA N 12
DIAGNSTICO DE LAS MICOSIS SUBCUTNEAS, SISTMICAS Y OPORTUNISTAS
DIAGNSTICO DE LAS MICOSIS SUBCUTNEAS
OBJETIVOS
Identificar microscpicamente los agentes etiolgicos de las micosis subcutneas

Describir las caractersticas morfolgicas de las colonias de los hongos causantes de
las micosis subcutneas.
INTRODUCCIN
Se consideran en este grupo las infecciones fngicas que afectan el tejido subcutneo, dermis
y epidermis, causadas por hongos exgenos, saprofitos , cuyo hbitat es el suelo y las plantas.
Las infecciones ms frecuentes son :
La esporotricosis debida al Sporotrixschencki, que se produce habitualmente por la

penetracin en la piel de astillas, espinas o tierra contaminada; una vez establecida la
infeccin tiende a permanecer localizada en el tejido subcutneo y a ser muy persistente. Se
caracteriza por una lesin ulcerada en el punto de inoculacin , que va seguida de la
formacin de ndulos y abscesos mltiples que siguen las vas de drenaje de los linfticos
superficiales.
La cromomicosis (cromoblastomicosis), debido a Fonsecaeapedrosoi, Cladosporiumcarrioniiy

Phialophoraverrucosum, que se caracteriza por el desarrollo de una ppula en el sitio de la
inoculacin, que ms tarde se extiende formando lesiones verrugosas o tumorales ,
semejantes a una coliflor, puede haber infeccin secundaria y ulceracin . Las lesiones , por lo
general, estn limitadas a los pies y las piernas, pero pueden afectar la cabeza, la cara, el
cuello y otras superficies del cuerpo; tambin puede haber abscesos cerebrales.
El micetoma (maduromicosis), debido a Nocardia y Streptomyces, que se caracteriza por

lesiones destructivas localizadas, granulomatosas y supuradas, que habitualmente se
localizan en los pies y las manos. Las lesiones se caracterizan por edema, coloracin
purprea y deformacin tumoral del tejido subcutneo, con la presencia de surcos sinusales
que drenan pus, que contiene grnulos amarillentos o negros. La infeccin progresa
gradualmente, atacando los huesos , los msculos y otros tejidos adyacentes, hasta que por
ltimo obliga a la amputacin, a veces se produce la invasin ms extensa afectando el
cerebro y otros rganos internos .
MATERIALES
Tubos sellados de SGA con cultivos de:
Sporotrixschenki
Phialophoraverrucosum
Preparaciones en lminas coloreadas con azul de lactofenol.
Microscopio
86
METODOLOGA
Examinar al microscopio las lminas preparadas y esquematizar sus observaciones.
87
DIAGNSTICO DE LAS MICOSIS SISTMICAS Y OPORTUNISTAS
OBJETIVOS
Identificar microscpicamente los agentes etiolgicos de las micosis sistmicas y
oportunistas.
Describir las caractersticas morfolgicas de las colonias de los hongos causantes de
las micosis sistmicas y oportunistas.
INTRODUCCIN
Las micosis sistmicas, son infecciones fngicas que afectan varios rganos y tejidos. Se
dividen en dos grupos :
las producidas por especies consideradas patgenas con carcter endmico, este
tipo de micosis se transmite por inhalacin, ingesta o traumatismos . Blastomicosis
yParacoccidioidomicosis
las producidas por especies oportunistas . Estas patologas se dan en huspedes
inmunodeprimidos (con transtornos endocrinos, inmunodefiencias, enfermedades
oncohematolgicas, alteraciones metablicas y anatmicas ,
drogadictos endovenosos, pacientes bajo tratamiento prolongado con corticoides o
citostticos , sometidos a ciruga, dializados , quemados transplantados y
cateterizados) , son causadas por hongos saprofitos del ambiente o comensales del
cuerpo humano. Por ejemplo Cndida y Criptococcus
La infeccin se adquiere por inhalacin de conidios en la fase micelial , desarrollndose en el

husped un foco pulmonar primario. En
caso del que paciente presente inmunodeficiencia puede producirse una diseminacin
sistmica.
El diagnstico de laboratorio se realiza mediante la observacin de la fase levaduriforme en

los siguientes productos : expectoracin, secrecin de lesiones mucocutneas y material de
biopsia. La fase levaduriforme se puede obtener en cultivos enriquecidos, incubados a 37C.
Estas pueden ser:
Blastomicosis :Blastomyces dermatitis

La infeccin comienza habitualmente en los pulmones y se difunde por va
hematgena causando lesiones destructivas focales en los huesos, piel, prstata y
vsceras, en general no se afecta el tubo digestivo.
Las lesiones cutneas son particularmente manifiestas , parecen originarse como

metstasis a partir de las lesiones pulmonares primarias que se abren a la superficie
cutnea causando lesiones ulceradas y encostradas. Las lesiones se caracterizan por
inflamacin granulomatosa, microabcesos y progresiva destruccin de los tejidos,
las calcificaciones son raras.
Paracoccidioidomicosis o blastomicosis sudamericana (Paracoccidioidesbrasilensis)

Las primeras lesiones aparecen en las mucosa de la boca, o de la nariz y se difunden
por expansin directa, es decir a travs de los lmites cutneo-mucosos, afectan la
cara, en ocasiones , la diseminacin se produce a travs de los tejidos linfticos
incluyendo el bazo.
88
En el tubo digestivo las lesiones comienza en el tejido linfoide submucoso y puede
originar formacin de lceras e incluso perforaciones; pueden formarse abscesos
subcutneos que por extensin a la superficie cutnea , puede producir lesiones
deformantes de gran tamao, encrostadas o ulceradas. Las lesiones cutneas
constituyen abscesos pigenos y lesiones inflamatorias granulomatosas.
Histoplasmosis :Histoplasmacapsulatum
Causada por la inhalacin de esporas que lo conduce a una infeccin pulmonar,
aparecen lesiones miliares distribuidas por todo el parnquima pulmonar y aumento
de tamao de los ganglios linfticos. La infeccin inicial es benigna puede pasar
completamente inadvertida o manifestarse como un infeccin respiratoria
autolimitada.
En un pequeo nmero de individuos la enfermedad progresa se disemina y causa

lesiones en prcticamente todos los tejidos y rganos, aparece fiebre y postracin,
as como el aumento del tamao de hgado , bazo y ganglios linfticos simulando
tuberculosis miliar ; en ocasiones puede evolucionar como una enfermedad
pulmonar crnica con cavitacin, simulando la tuberculosis pulmonar crnica. Las
lesiones de los tejidos se caracterizan por la existencia de una inflamacin
granulomatosa.
Coccidiomicosis :Coccidioidesimmitis
La infeccin se establece por inhalacin de esporas transmitidas por el aire
aproximadamente el 60 % se pone de manifiesto nicamente por la adquisicin de
una hipersensibilidad de tipo retardado frente a los antgenos del hongo, en un 40 %
se produce neumonitis aguda, acompaada con frecuencia de pleuresa y varias
erupciones cutneas, alrededor del 5 % desarrollan una enfermedad pulmonar
crnica con cavitacin que se asemeja a la tuberculosis pulmonar y conduce
ocasionalmente a la calcificacin; en menos del 1 % aparece una diseminacin con
lesiones granulomatosas aspticas en muchos rganos y tejidos, entre ellos, la piel,
huesos articulaciones y meninges.
Las lesiones de la neumonitis aguda son histolgicamente semejantes a las

causadas por bacterias pigenas , pero en la enfermedad pulmonar crnica y en las
formas diseminadas , la inflamacin es granulomatosa.
Criptococosis
Esto ocurre en particular en sujetos con inmunodeficiencia de las clulas T y se
debe a Criptococusneoformans , este hongo se caracteriza por ser una levadura
encapsulada. Su hbitat es el suelo contaminado con materia fecal de aves.
La criptococosis es una de las enfermedades que sirve para definir el estadio SIDA
en la enfermedad del virus de Inmunodeficiencia Humana. Dentro de las formas
clnicas existe : Criptococosis pulmonar, del SNC, diseminada , cutnea y
mucocutnea.
El producto ms frecuente de analizar es el LCR , en el que se observan las tpicas

levaduras capsuladas que se destacan por contraste negativo mediante emulsin
con tinta china.
Candidiasis :Cndida spp

Las infecciones caudadas por Cndida son muy variadas, este hongo de tipo
levaduriforme puede llegar a ser patgeno en humanos y animales en los cuales vive
en estado saproftico . La cavidad bucal y es resto del tracto gastrointestinal son los
territorios preferentes donde C. albicans se encuentra en el 20 % de las personas y
89
en menor proporcin otras especies de Cndida.
Por lo menos cinco condiciones favorecen el surgimiento de candidiasis :
Cambios fisiolgicos como diabetes y embarazo

Uso prolongado de antibiticos o frmacos antitumorales e inmunosupresores
Maniobras diagnsticas y teraputicas agresivas : cateterismo, sondajes
Debilidad general y/o desnutricin
Infeccin por el virus de la Inmunodeficiencia Humana y drogodependencia.
El diagnstico de la Candidiasis en el laboratorio incluye la demostracin directa de Cndida

mediante coloraciones Giemsa ,Gram en muestras clnicas y cultivo
MATERIALES
Tubos de SGA con cultivos de :
Histoplasmacapsulatum
Cndida albicans
Preparaciones en lminas con azul de lactofenol
Microscopio
METODOLOGA
Observar de las muestras macroscpicamente

Realizar preparaciones en lminas con azul de lactofenol y observar al microscopio
(10x y 40x)
90
Tomado de Microbiologa Tomo II de Granados 2 edicin
Tomado de Micologa Mdica Ilustrada Arenas 2 edicin
91
92
93
Tomado de Diagnstico Microbiolgico de
Bailey y Scott 11 edicin
94
PRCTICA N 13
DIAGNSTICO VIROLGICO
OBJETIVOS
Familiarizar al estudiante con las diferentes tcnicas de aislamiento de virus

aprovechando las propiedades que presentan
Observar y caracteriza morfolgicamente clulas cultivadas
Explicar la importancia de las tcnicas de cultivo de tejidos en virologa y en otras
disciplinas cientficas.
La demanda de los servicios de los laboratorios de virologa clnica, han aumentado en las
ltimas dos dcadas debido a la disponibilidad comercial de reactivos de alta calidad, el uso
por parte de los mdicos de frmacos antivirales especficos, el desarrollo de tcnicas de
diagnstico rpido y la aplicacin de los procedimientos de cultivo celular para virologa al
diagnstico de otras enfermedades como infeccin genital por Chlamydia.
Las enfermedadesvirales que requieren diagnstico de laboratorio son las enfermedades
de transmisin sexual, las diarreas, las enfermedades respiratorias en nios y adultos, las
meningitis aspticas, las enfermedades congnitas y las infecciones en huspedes
inmunodeprimidos.
CULTIVO CELULAR
Los cultivos celulares comenzaron a principio del siglo XX, con cultivos de rganos
completos y luego con mtodos de clulas individualizadas : cultivos de clulas primarias
(clulas somticas de un animal de experimentacin o tomadas de un paciente humano (que
pueden mantenerse en cultivo durante un perodo breve de tiempo) o lneas celulares
inmortalizadas, las cuales en condiciones adecuadas pueden continuar creciendo en cultivo
indefinidamente.
En 1952 Renato Dulbecco fue el primero que cuantific virus animales, utilizando un ensayo
de placas de lisis, tcnica para la cual se preparan diluciones del virus con las que se infectan
clulas crecidas en monocapas, que luego se recubren con agar blando para impedir la
difusin del virus. ste destruye las clulas en focos localizados que se observan al teirse la
monocapa.
MECANISMOS DE LESIN CELULAR
La infeccin viral origina una variedad de cambios que se detectan mediante el examen
visual o bioqumico de las clulas infectadas, estos cambios se deben a la produccin de
protenas y cidos nucleicos vricos, y a las alteraciones biosintticas de las clulas. En las
clulas infectadas por virus se reconocen cambios fenotpicos comunes, denominados efectos
citopticos del virus , los cuales son :
Forma alterada : las clulas adherentes que normalmente estn pegadas a otras clulas ( in
vivo ) o a un sustrato artificial ( in vitro ) pueden adoptar una morfologa redondeada diferente
de su apariencia aplanada normal . Se eliminan de la clulas los procesos de ampliacin
implicados en la adhesin y la movilidad.
Despegamiento del sustrato : para las clulas adherentes , esta fase de dao celular sigue
de la anterior. Ambos efectos son causados por la degradacin parcial o la disrupcin del
citoesqueleto, el cual se encarga de mantener la forma de la clula.
Lisis : es el caso ms extremo, la clula entera se rompe, se pierde la integridad de la

membrana y la clula se puede hinchar por la absorcin de lquidos extracelulares y
95
finalmente estalla. ste es un caso extremo de dao celular, no todos los virus causan este
efecto, aunque pueden causar otros efectos citopticos.
La lisis es beneficiosa para un virus ya que constituye un mtodo para liberar nuevas
partculas vricas de una clula infectada.
Fusin de membranas : las membranas de las clulas adyacentes se fusionan originando

una masa de citoplasma que contiene ms de un ncleo : sincitio, o dependiendo del nmero
de clulas que se fusionan : clula gigante. Las clulas fusionadas tienen vida corta y luego se
lisan.
Permeabilidad de membranas : diversos virus causan un aumento en la permeabilidad de

membranas, permitiendo la entrada de iones extracelulares como el sodio. La traduccin de
algunos ARNm vricos es resstente a altas concentraciones de iones de sodio , permitiendo la
expresin de genes vricos a expensas de mensajeros celulares.
Cuerpos de inclusin : son reas de la clulas en las que se han acumulado componentes
vricos. Se trata frecuentemente de sitios de ensamblaje de viriones y algunas inclusiones
celulares consisten en acmulos cristalinos de partculas vricas. No est claro si estas
estructuras daan a la clula, pero frecuentemente estn asociadas a virus que causan lisis
celular , como los herpesvirus.
Apoptosis : la infeccin vrica puede activar la apoptosis ( muerte clular programada ),

mecanismo implicado en el crecimiento normal y el desarrollo de los organismos.
INMUNODIAGNSTICO
ENSAYO INMUNOENZIMTICO
La prueba de inmunoabsorcin ligada a enzimas (ELISA) o inmunoensayos ligados a

enzimas (EIAs) en la cual el antgeno o anticuerpo est adsorbido a una fase slida ,
constituye uno de los primeros inmunoensayos enzimticos primeramente descritos por
Engvall y Perlmann en 1971 y luego aplicados al diagnstico microbiolgico por Voller y
colaboradores. ELISA tiene la ventaja sobre las tcnicas de inmunofluorescencia (IF) de su
mayor sensibilidad ya que , la enzima acta catalticamente y de forma objetivable , por lo que
es posible medir la densidad ptica de la coloracin final. Las enzimas son seguras, de bajo
costo y estables, si se comparan con los radio-istopos utilizados en radioinmunoensayo
(RIA).
En la actualidad estas pruebas estn tomando un rol importante en los laboratorios
mdicos y de investigacin, porque brindan una alternativa viable, mediante la cual es posible
realizar la identificacin de muchos virus a nivel de gnero. Estn reemplazando a los RIA en
muchos laboratorios, por su comparable sensibilidad sin los problemas de manejo, eliminacin
y corto tiempo de vida de los materiales radioactivos .
Debido a su objetividad, facilidad de automatizacin y posibilidad de trabajar con un gran
nmero de muestras, estos ensayos inmunoenzimticos estn reemplazando parcialmente a
tcnicas en el laboratorio como :inmunofluorescencia y aglutinacin.
Estos ensayos presentan tres piezas constantes que originan distintos tipos de EIA en
funcin de cmo se combinen : el analito (antgeno {Ag} o anticuerpo {Ac} ), el conjugado (de
antgeno o de anticuerpo) y el sustrato. Utilizan enzimas como marcadores inmunoqumicos
que permiten valorar las uniones antgeno-anticuerpo que se producen tras un periodo de
incubacin, con la adicin posterior de un sustrato.
Fundamento
La prueba de ELISA se basa en la reaccin antgeno-anticuerpo, uno de los cuales debe ser
de reactividad conocida. El color se genera por la interaccin de un sustrato cromognico y
una enzima que ha sido acoplada al anticuerpo detector. Si debe medirse el anticuerpo, se
coloca el antgeno en la fase slida, como una capa de captura. Despus de la reaccin del
96
antgeno con el suero del paciente, la capa de deteccin puede ser un reactivo
antiinmunoglobulina clase especfica (IgM o IgG) para detectar respuesta de anticuerpos clase
especficos
Dentro de los parmetros fisicoqumicos que intervienen en la unin del antgeno con el
anticuerpo tenemos:
Fuerzas de Van der Walls producidas por el movimiento de tomos en la superficie de

las molculas generado por un cambio elctrico. Son fuerzas dbiles presentes cuando la
proximidad del Ag y el Ac es grande.
Fuerzas electrostticas originadas por la fuerza de atraccin entre molculas de carga

inica opuesta, como sucede con los grupos NH3+ (amonaco)que reaccionan vidamente con
el grupo COOH- (grupo carboxilo).
Uniones por puentes de hidrgeno son de carga energtica baja entre tomos
electropositivos de hidrgeno y tomos electronegativos de oxgeno o nitrgeno.
Metodologa
Los mtodos de ELISA se dividen en :
ELISA directo : ensayo ELISA simple de dos capas

Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se
sospecha se encuentra el antgeno. Se incuban con anticuerpos marcados e indican la
presencia de antgeno en la solucin analizada. Se debe incluir controles negativos que sern
muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina) pero en las que se tenga la certeza
de la ausencia del antgeno buscado y controles positivos (soluciones donde se encuentra el
antgeno buscado, o bien se le ha aadido).
ELISA indirectoLas placas ELISA se preparan de igual forma que en el mtodo directo, los
controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de deteccin emplea dos
anticuerpos : uno primario contra el antgeno, y uno secundario marcado contra el primario. La
deteccin tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificacin de seal debida a la unin
de dos o ms anticuerpo secundarios por cada primario.
ELISA sndwich : ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante inmunocomplejos

Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo
anti-antgeno. Despus de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la
que se encuentra el antgeno, que ser retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer
anticuerpo. Despus de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una
solucin con un segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As pues cada molcula de
antgeno estar unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al
menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la
amplificacin de seal que permite el segundo anticuerpo.
Fijacin del Antgeno a la fase slida :

La reaccin inmunolgica tiene lugar en la fase slida, sta puede ser de plstico, vidrio o
nitrocelulosa. Los ms usados son los de plstico, dentro de stos los de
poliestirenogammairradiados y los de cloruro de polivinilo ya que tienen mayor capacidad para
formar enlaces estables que los de poliestireno no tratados.
El antgeno diluido en buffer es adherido a la fase slida por enlaces electrostticos entre los
97
sitios activos del plstico y regiones de la protena responsables de esta interaccin. El buffer
puede ser carbonato a pH 9,6 o buffer fosfato salino ( PBS 1X ) a pH 7,4.
La estabilidad de los enlaces electrostticos, el tiempo de incubacin y la temperatura son

factores importantes a tener en cuenta para evitar prdidas de las protenas y que pueden
afectar la sensibilidad del ensayo.
Reaccin con anticuerpo :
La reaccin del antgeno con el anticuerpo se debe realizar en condiciones similares a las
fisiolgicas : pH 7,4, temperatura de 37C y concentracin salina equivalente a 0.15M de
cloruro de sodio (NaCl). El tiempo puede variar entre 1 a 3 horas.
Molculas no especficas en solucin pueden adherirse a la fase slida afectando el resultado

final del ensayo, para disminuir este riesgo se suele agregar al medio de reaccin un exceso
(0,1% a 1%) de una protena inerte para que compita eficientemente por los sitios de unin
inespecficos en la fase slida. Esta protena puede ser seroalbmina bovina, casena, suero
entero, gelatina u otros.
Tambin es necesario aadir al medio Tween 20 (Monolaurato de polioxietilenosorbitn{

surfactante } )para evitar uniones inespecficas de macromolcula. Por este motivo es
agregado en los tampones de dilucin y de lavado.
Adicin del conjugado enzimtico :
El conjugado enzimtico se prepara por unin covalente de una enzima con el anticuerpo; esta
enzima puede ser peroxidasa de rbano (Horseradishperoxidase
{ HRP } ), fosfatasa alcalina (AlcalinePhosphatase { AP } ) o beta-galactosidasa. Los criterios a
tomar en cuenta en la seleccin de la enzima apropiada son su toxicidad, estabilidad,
disponibilidad, viabilidad de conjugarla eficazmente con el anticuerpo elegido, sensibilidad y
costo.
Las condiciones de reaccin entre el conjugado y el complejo formado por la unin antgeno-
anticuerpo son similares a las descritas en la etapa anterior.
Adicin del sustrato:
La eleccin del sustrato va de acuerdo con el tipo de enzima presente en el conjugado. El

sistema AP hidroliza al p-nitrofenil fosfato o p-nitrofenol generando un producto soluble de
color amarillo. El sistema HRP reduce al sustrato perxido de hidrgeno produciendo oxgeno
que oxida a otros compuestos cromgenos tales como:
Tetrametilbenzidina (TMB) : la oxidacin genera un producto de color azul oscuro.
o-phenylenediamine (OPD): es oxidado a un producto coloreado que puede variar de color

naranja a pardo oscuro.
cido azino-(3-etil)-benzo-sulfnico (ABTS) : la oxidacin genera un producto que puede

variar del color al azul.
La intensidad del color desarrollado es de acuerdo con la cantidad de enzima presente en la
reaccin.
La lectura se realiza en un espectrofotmetro a 405 nanmetros
98
PRUEBA RPIDA PARA VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA
Uno de los pilares bsicos de la lucha contra el Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida
(SIDA) es la deteccin precoz de las personas infectadas por el virus de la inmunodeficiencia
humana (VIH). El diagnstico precoz ofrece la posibilidad de beneficiarse de la terapia
antirretroviral en las etapas precoces de la infeccin, as como intentar modificar las conductas
que favorecen la transmisin del virus a otras personas.
Descripcin de las pruebas de deteccin rpida del VIH
Son ensayos de lectura visual que pueden realizarse con equipamiento mnimo y generan un
resultado en menos de 15 minutos en comparacin con la prueba estndar de cribado con
tcnicas de EIA, de las cuales no se dispone del resultado hasta al cabo de unas horas o das.
Tanto la prueba de deteccin rpida como el EIA detectan anticuerpos especficos del VIH.
Se han establecido los diferentes criterios que debera cumplir una prueba de deteccin rpida
del VIH:
Presentar alta sensibilidad y especificidad (>99%)

Ser reproducible
Ser fcil de aprender, realizar e interpretar
Ser precisa
Ser de fcil almacenamiento
No requerir equipamiento adicional
No tener carcter invasivo
Durante la realizacin de las pruebas de deteccin rpida, se recomienda que los pacientes
reciban informacin y asesoramiento sobre la enfermedad y la infeccin. Si la prueba es
negativa, se considera un negativo definitivo a no ser que haya posibilidades de que se
encuentre en el perodo ventana de exposicin (primeros 3 a 6 meses de post exposicin) . Si
el resultado es positivo, se considera un resultado preliminar que debe confirmarse con
tcnicas de EIA y con la prueba Western blot .
Los resultados indeterminados se deberan repetir en un mes. La mayora de las pruebas de
deteccin rpida del VIH se comercializan con un equipo o kit que incluye todo lo necesario
para realizar la prueba y no requiere un equipamiento especializado. En general, disponen de
un control de procedimiento incorporado en el equipo o kit. Para la muestra, se puede utilizar
sangre entera (ms fcil de realizar), plasma o suero, y los resultados se interpretan
visualmente.
Capacidad diagnstica de las pruebas de deteccin rpida del VIH
Es difcil realizar una comparacin de la capacidad diagnstica de las numerosas

pruebas de deteccin rpida comercializadas ya que son, muy distintas entre ellas. Los
principios de accin ms frecuentes en estas pruebas son la aglutinacin, la
inmunoconcentracin(flowthrough), la inmunocromatografa(lateral flow) y la fase slida
(solidphase).
El mtodo de produccin y de combinacin especfica de los antgenos vara entre las distintas
pruebas de deteccin. La mayora incluye uno o ms antgenos del virus VIH-1 (gp41, gp120,
gp160) y VIH-2 (gp36). Otros incorporan el antgeno core (p24).
Actualmente, existe controversia en la duracin del perodo ventana entre 3 6 meses. En
general, se recomienda el alta mdica a los 6 meses despus de una actividad de riesgo de
infeccin.
PRUEBA DE INMUNOFIJACIN DE DOT-BLOT
99
Prueba para la deteccin del VIH en la cual los antgenos virales se encuentran unidos a una
membrana de nitrocelulosa dentro de un contenedor plstico. Los antgenos utilizados son
recombinantes o sintticos. Se utilizan conjugados de anti-inmunoglobulina ligados a una
enzima que se fija al anticuerpo del paciente. La adicin del sustrato permite la visualizacin
del color en el papel.
Su ventaja y principal indicacin es la posibilidad de identificacin entre los dos tipos de virus .
Las pruebas son rpidas y fciles de realizar, pero son costosas. Muchas producen resultados
en 5 15 minutos.
TCNICAS DE INOCULACIN EN ANIMALES DE LABORATORIO

Este fue el primer mtodo que se utiliz para el aislamiento de virus , demostrndose la
reaccin positiva por la muerte y los cambios histolgicos o clnicos. Existen factores negativos
en el uso de animales de laboratorio : el confinamiento de los mismos de tal manera que no se
pueda impedir una infeccin cruzada a otros animales y al personal de laboratorio, la
presencia de enfermedades vricas latentes en los animales de experimentacin que pueden
activarse por el mismo trauma que supone la inoculacin con la consiguiente interferencia a la
hora de la interpretacin de los resultados .
Debe elegirse cuidadosamente el tipo y la edad del animal que va a utilizarse , as como la va
de inoculacin, ya que cada especie tiene su propia sensibilidad y cada virus sus propios
requerimientos respecto a un tipo de clulas . El animal ms utilizado es el ratn de menos de
dos das de edad especialmente como animal de rutina con fines diagnstico siendo el que
proporciona el principal mtodo de aislamiento de los virus Coxsakie A.
el ratn lactante se utiliza en virologa para :
Inocular por va intracerebral (0,06 ml) :Herpes simple
Inocular por va subcutnea (0,06 ml) : infeccin por Coxsakie, Arbovirus y
Reovirus
Inocular por va intradrmica (0,02ml) virus Coxsakie
el ratn adulto se utiliza :
Inocular por va intracerebral (0,03ml) o intraperitoneal hasta 2 ml de
encefalitis
Inocular por va intracerebral : rabia, coriomeningitis linfocitaria
Inocular por va intranasal( 0,05 ml): Influenza A,B y C
Inocular por va intraperitoneal o intracerebral para obtencin de
inmunosueros.
la cobaya se utiliza para :
Inocular por va intraperitoneal hasta 5 ml de coriomeningitis linfocitaria
Inocular por va intraperitoneal o intramuscular para obtencin de
inmunosueros hasta un ml.
el conejo se utiliza para :
Inocular por va intradrmica Herpes tipo B
Inocular por va intradrmica para la obtencin de vacunas
Inocular por va intravenosa hasta 2 ml o intramuscular hasta 2 ml o
intraperitoneal hasta 2 ml para la obtencin de inmunosueros.
Materiales : jeringa con aguja de 1 ml, embudo de cristal, tubos de ensayo, algodn.
Reactivos : alcohol etlico de 70, ter etlico, solucin de inoculacin

Tcnica :
a) Anestesiar al ratn con un algodn empapado de ter etlico colocado en el interior
de un embudo invertido , introducir en l el ratn.
b) rasurar la zona a inyectar e inyectar la solucin de inoculacin en el lugar de
inoculacin que puede ser : IC intracraneal, IM intramuscular, IN intranasal, SC
subcutnea, ID intradrmica, IV intravenosa, IP intraperitoneal.
100
Interpretacin de los resultados : Se manifiesta la infeccin en el ratn ,se observar sta por
la sintomatologa , la muerte o la elevacin del ttulo de anticuerpos. Se observar durante dos
o ms semanas el animal inoculado
Tomado de Microbiologa Granados 1aedicin
TCNICAS DE INOCULACIN EN EMBRIN DE POLLO

Existen varios mtodos de inoculacin de huevos frtiles , dependiendo del virus que desea
cultivarse. Una vez inoculados, los huevos se incuban a temperaturas entre 35 y 38C (
dependiendo del virus). Antes
de proceder a la inoculacin de un huevo debe limpiarse cuidadosamente su superficie con
alcohol.
Inoculacin corio-alantoidea
Edad del embrin : 10 a 12 das
Mtodo :
Examinar el huevo en ovoscopio provisto de lmpara de 100 vatios . sta tcnica llamada de
iluminacin permite apreciar los vasos sanguneos del embrin , la cmara de aire con claridad
a travs de la cscara. Con un lpiz se delimitar la cmara de aire as como tambin el punto
en que el corio-alantoides es bien notorio y desarrollado. Practicar una cmara de aire artificial
de la siguiente manera:
a) Quitar un pequeo tringulo de cscara de encima del corio-alantoides sin daar la
frfara
b) Utilizando una aguja de diseccin incidir cuidadosamente la frfara sin daar la
membranacorio-alantoidea que est debajo.
c) Realizar una pequea abertura en la cmara de aire y valindose de un gotero
realizar una succin suave en el agujero hecho anteriormente. La membrana corio-
alantoidea se separa de la frfara efectundose entonces la inoculacin a travs de
la hendidura de la misma.
Sellar la abertura e incubar durante 2 a 4 das examinando diariamente
Inoculacin en saco amnitico

Edad del embrin: 7 a 14 das
Mtodo
Proceder como para la inoculacin corio-alantoidea. Cuando la membrana corio-alantoidea
aparezca se aumenta el tamao del orificio . A travs de la membrana corio-alantoidea y
utilizando unas pinzas estriles se extrae una parte de la membrana amnitica. Inocular en la
cavidad amnitica, sellar e incubar.
101
Inoculacin de saco alantoideo
Edad del embrin : 10 das
Mtodo
Se procede como en la inoculacin corio-alantoidea pero sin extraer la membrana. Inocular
directamente en la cavidad alantoidea . Con el agujero realizado en la cmara de aire se evita
el reflujo del inculo motivado por la presin. Sellar e incubar.
Inoculacin en saco vitelino
Edad del embrin: 3 a 8 das
Mtodo
Se efectuar la inoculacin directa a travs de la cmara de aire, puesto que a la edad
sealada el saco vitelino rellena casi por completo el huevo. Sellar e incubar.
Examen
Colocar el huevo en una placa de Petri, sobre algodn empapado en desinfectante.
Utilizando tijeras y pinzas estriles eliminar la cscara de encima de la cmara de aire. Extraer
la membrana interna (frfara) y colocarla en agua destilada estril.
Examinarla para apreciar lesiones.
La identificacin de virus aislados en huevos puede hacerse por tcnicas de neutralizacin
o de fijacin del complemento con sueros especficos. Es posible neutralizar tanto el efecto
particular producido por el virus como la formacin de placas o muerte del embrin, como en el
caso de los myxovirus, neutralizar o inhibir la propiedad de estos virus de aglutinar los
hemates. Las pruebas de fijacin de complemento tienden a dar reacciones de grupo ms
que especficas de tipo.
Tomado de Manual de Tcnicas de Microbiologa Mdica Baker
Fuentes de Informacin
Arenas R. Micologa Mdica Ilustrada.2 edicin.2005. Editorial McGraw Hill

Bailey & Scott.Diagnstico Microbiolgico .11 edicin 2004.Editorial Mdica
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Jawetz, Melnick y Adelberg. Microbiologa Mdica 18 edicin 2005 Editorial
Manual Moderno
Koneman Diagnstico Microbiolgico 6 edicin .2008.Editorial Mdica
Panamericana
Murray P. Microbiologa Mdica.5 edicin 2008.Editorial Elsevier
Sherris Microbiologa Mdica. 4 edicin.2005.Editorial Mc Graw Hill
Baker F.J, Breach M.R. Manual de Tcnicas de Microbiologa Mdica.1990.Editorial
Acribia
102
Cann A Principios de Virologa Molecular. 4 edicin.2005. Editorial
Acribia
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N 42
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Inmunoenzimtico para la deteccin de anticuerpos IgG en sueros humanos para
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Moura AC Diversidade gentica, densidadepopulacional e potencial de promoo de
crescimento de rizobactriasassociadasaocacaueiro [Tesis Maestra].Bahia :
Universidade Federal do Renccavo ; 2007.
Chaves L Aspectos bioqumicos e moleculares de bacterias isoladas de terrapreta
antropognica (TPA) naregio da Amaznia Brasileira.[Tesis Maestra] Piracicaba :
Universidade de So Paulo; 2007
103

Guia de Practicas de Microbiologia 2017

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FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

SEGUNDO SEMESTRE ACADMICO

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Crioviales : Pequeos tubos cnicos de polipropileno resistentes a muy bajas temperatura

Estufa : Aparato de dimensiones diversas , donde se incuban los cultivos, generalmente a

Gradilla : Soporte para tubos de ensayo.

Jarra de anaerobiosis : Instrumento til para el aislamiento de bacterias anaerobias ya que

Matraces y balones : Recipientes volumtricos de gran utilidad para la preparacin y

Medios de cultivo : Mezcla de nutrientes esenciales para el crecimiento de microorganismos

Microscopio : Instrumento ptico utilizado para la observacin de microorganismos que no

Pipetas Pasteur : Varillas de vidrio de 4 mm de dimetro y de 20 a30 cm de longitud. Se les

Pipeteadoresautomticos : Pipetas que absorben de forma automtica sin necesidad de uno

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