Cintica de fermentacin alcohlica utilizando como fuente de nitrgeno harina de semilla de guayaba Psidium guajava
Liliana Serna Cock 1*, Daniel Mera Ayala 1, Jorge Angulo Lpez 1, Ana Lucia Gmez 2
1*
Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira, Facultad de Ingeniera y Administracin, Carrera 32 va Candelaria, Palmira Valle, Colombia.
2
SUCROMILES S.A., Km. 14 Recta Cali-Palmira Valle, Colombia.
1. INTRODUCCIN
En la industria de las fermentaciones, el costo, la disponibilidad y la
estabilidad de los sustratos de fermentacin, son motivo de investigacin,
ya que pueden representar hasta el 68 % del costo de produccin de los
productos obtenidos por fermentacin [1, 2], siendo las materias primas
ms importantes las fuentes de carbono y de nitrgeno. En referencia a la
fuente de carbono, la melaza de caa de azcar es uno de los principales
subproductos de la industria azucarera, es buena fuente de azcares
fermentables y no requiere pretratamiento complejo [3]. Tradicionalmente
la urea es la principal fuente de nitrgeno, y el fsforo, es adicionado en la
forma de fosfato diamnico por su demostrada facilidad de absorcin por
parte de las clulas microbianas, favoreciendo, al igual que la fuente de
nitrgeno, el desarrollo celular [4]. La bsqueda de nuevas fuentes de
nitrgeno est dirigida a reemplazar suplementos costosos como son los
pptidos y algunos factores de crecimiento (Vitaminas del complejo B) los
cuales tienen gran importancia en la fermentacin [5].
De otro lado, estudios realizados por Steinhaus et al. [6], afirman que una
parte importante de la cosecha de guayaba se procesa en mermeladas,
sorbetes, pastas y barras de dulce llamadas bocadillos. Durante la
elaboracin de dichos productos se utiliza la pulpa quedando como
residuo una gran cantidad de semilla, la cual representa el 4.0 % del peso
de la guayaba y posee un contenido importante de protena [6,7]. Altaf et
al. [5], establecen una necesidad en la investigacin sobre materiales
renovables nitrogenados como alternativa de fuentes de nitrgeno de
menor costo, en fermentaciones industriales. El residuo agroindustrial
generado en la agroindustrializacin de la guayaba, pueden ser una fuente
alterna y potencial de alto inters en el estudio de posibles aplicaciones en
la industria de las fermentaciones.
Por lo anterior el objetivo de este trabajo fue evaluar la cintica de
fermentacin alcohlica utilizando como fuente de nitrgeno harina de
semilla de guayaba Psidium guajava. La cintica se midi en trminos de
conversin de sustrato, rendimiento en producto y productividad.
2. METODOLOGA
2.1 Material biolgico
Se trabaj con semilla de guayaba Psidium guajava suministrada por la
empresa Dulces San Antonio la Tentacin, del Municipio de Vlez
Santander, Colombia. La semilla se someti a un proceso de secado
(Binder ED 115-UL, Germany) y molienda (FRITSCH Pulverisette 14,
Germany) para la obtencin de la harina.
2.2 Determinacin del contenido de nitrgeno del material biolgico
Se determin el contenido de nitrgeno mediante el mtodo Kjeldahl [8].
2.3 Microorganismo
Se utiliz una cepa de Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red (Division of
S.I. Leaffre Group, France)
2.4 Fermentacin
Las cinticas se llevaron a cabo en 6 fermentaciones en discontinuo,
usando como sustrato, melaza ms urea y fosfato diamnico MUFA
(Azcares reductores 23 gL-1, urea 1.1 gL-1 y fosfato diamnico 0.67 gL-1)
y melaza ms harina de semilla de guayaba MHSG (Azcares reductores
23 gL-1 y harina de semilla de guayaba 51.42 gL-1). Los sustratos se
ajustaron a pH 4.6 utilizando cido sulfrico al 98 % y se esterilizaron a
121 C y 0.11 MPa por 15 min (Autoclave esterilizador Medical Essen
250 I, Colombia). Para la etapa de reproduccin se utiliz el 30 % (v/v) de
inculo con respecto al volumen del sustrato. Las fermentaciones se
realizaron en un bioreactor de 1500 mL, con un volumen de trabajo
efectivo de 1000 mL; en la etapa de reproduccin de la levadura,
permanecieron en un bao termosttico (Julabo 13A, Germany) a 34
0.5 C, con aireacin 5 L/min y agitacin a 270 rpm por 4 horas y durante
la etapa de fermentacin, permanecieron en el mismo bao termosttico a
32 0.5 C, sin aireacin y agitacin a 270 rpm por 24 horas.
2.5 Cintica de produccin de etanol, consumo de sustrato y
formacin de biomasa en fermentacin alcohlica
Para realizar las cinticas de produccin de etanol y consumo de sustrato,
en cada uno de los tiempos y para cada uno de los sustratos, se tomaron
aspticamente 10 mL de sustrato a las 0, 3, 6, 12, 18 y 24 horas de
fermentacin (El tiempo 0 correspondi a las condiciones finales de la
etapa de reproduccin celular), los cuales se centrifugaron a 4000 rpm por
10 minutos (Eppendorf Centrifuge 5804R, Germany); posteriormente se
filtraron en filtros de 0.45 m (Titan, USA). La produccin de etanol se
midi en los sobrenadantes mediante cromatografa gaseosa
(Cromatgrafo de gases Agilent technologies 7890A, USA) y el
consumo de sustrato (Azcares reductores) se determin por
espectrofotometra (Thermo Scientific Genesys 10 UV, USA) mediante
el mtodo DNS (cido 3,5- dinitrosalicilico) [9]. La cintica de formacin
de biomasa se determin por conteo en Cmara de Neubauer; el
seguimiento de la formacin de biomasa se llev a cabo durante 4 horas
con el fin de garantizar que el nmero de clulas inoculadas fuera superior
a 3x108 CelmL-1 acorde a la metodologa establecida por Caldern, [4]. Se
calcul la conversin de sustrato (CS), el rendimiento en producto (Yp/s) y
la productividad mediante las Ecuaciones 1, 2 y 3.
Donde, S0: Concentracin inicial de azcares reductores (gL-1), S:
Concentracin final de azcares reductores (gL-1), hasta el tiempo en que
P es mximo; P: Concentracin mxima de etanol (gL-1), mp: Masa de
etanol producida (g), VT: Volumen total de fermentacin (L) y t: Tiempo
de fermentacin (h).
2.6 Anlisis estadstico
Se us un diseo factorial de 2*6 con dos factores y tres replicas as:
Factor sustrato de fermentacin, con dos niveles: melaza ms urea y
fosfato diamnico (MUFA) y melaza ms harina de semilla de guayaba
(MHSG). Factor tiempo de fermentacin, con 6 niveles: 0, 3, 6, 12, 18 y
24 horas de fermentacin, donde el tiempo 0 correspondi a las
condiciones finales de la etapa de reproduccin celular. Las variables de
respuesta fueron: Conversin de sustrato, rendimiento en producto y
productividad. Los resultados se analizaron con el paquete estadstico
SAS 9.2 para Windows (SAS Institute Inc., Cary, NC., USA) [10]. La
comparacin entre promedios se llev a cabo a travs de la prueba DMS
(Diferencia Mnima Significativa) con una probabilidad de P < 0,05.
3. RESULTADOS Y DISCUSIN
La harina de semilla de guayaba present un contenido de nitrgeno del
1.23 % en base seca. El sustrato MHSG present el mayor rendimiento en
producto (Yp/s) y la mayor conversin de sustrato a las 18 y 24 horas de
fermentacin respectivamente (6.11 gg-1 y 47.58 %). La productividad a
las 24 horas de fermentacin en el sustrato MUFA fue mayor que la del
sustrato MHSG con valores de 2.59 y 2.50 gL-1h-1 respectivamente. Esto
indica que el sustrato MHSG al finalizar el proceso presenta la mayor
conversin de sustrato, pero el rendimiento en producto es mejor a las 18
horas de la fermentacin.
 sulfato de amonio, por lo cual, la harina de semilla de guayaba se puede
8,60 140,00 considerar una fuente de nitrgeno viable para la fermentacin alcohlica.

Azucares reductores (gL-1)

8,50 120,00
100,00
4. CONCLUSIONES
Log (CelmL-1)

8,40
80,00
8,30
60,00
8,20 La harina de semilla de guayaba es una buena alternativa como fuente de
40,00
8,10 20,00
nitrgeno en fermentaciones alcohlicas, cuando se utiliza como sustrato
8,00 0,00
MHSG, se pueden obtener mayor conversiones de sustrato y mejores
0 1 2 3 4 5 rendimientos en producto durante la etapa de fermentacin. El uso de esta
Tiempo (h) fuente de nitrgeno podra disminuir los costos operacionales alrededor
MUFA - Formacin de biomasa MHSG - Formacin de biomasa del 35 %, comparado con el uso de las fuentes habituales, generando
MUFA - Consumo de sustrato MHSG - Consumo de sustrato adems un valor agregado interesante a este residuo agroindustrial que
Figura 1: Cintica de formacin de biomasa y consumo de sustrato de puede perderse en la agroindustrializacin de la fruta.
Saccharomyces cerevisiae (Ethanol Red), durante la etapa de
reproduccin, utilizando sustratos: melaza ms urea y fosfato diamnico Agradecimientos
(MUFA) y melaza ms harina de semilla de guayaba (MHSG). Los autores expresamos los agradecimientos al Centro Internacional de
Agricultura Tropical (CIAT) y a las empresas SUCROMILES S.A. y
La figura 1 muestra que los azcares reductores mostraron un incremento Dulces San Antonio la Tentacin, por los aportes a sta investigacin.
en su concentracin durante la primera hora de reproduccin, lo anterior
se explica por la presencia de sacarosa en la melaza, la cual es catalizada 5. REFERENCIAS
por la enzima invertasa presente en la levadura [11]. La hidrlisis de la
sacarosa trae consigo un ligero aumento en las concentraciones de 1. Kwon, S., Lee, P.CH., Lee, E.G., Chang, Y.K., Chang, N. (2000).
fructosa y glucosa [12], y por ende un aumento en los azcares reductores. Production of lactic acid by Lactobacillus rhamnosuswith vitamin-
supplemented soybean hydrolysate. Enzyme and Microbial
8,80 300,00 Technology, 26: 209215.
Azcares reductores (gL-1)

8,70
8,60
250,00 2. Serna, L. and Rodrguez., A. (2007). Produccin econmica de cido
lctico utilizando residuos de cosecha y jugos de caa de azcar
Log (CelmL-1)

8,50 200,00
8,40 150,00 (Saccharum officinarum L.). Agricultura Tcnica, 67: 2938.
8,30 100,00 3. Caldern A., Evaluacin del uso de antibiticos como mecanismo
8,20
50,00 para el control de contaminantes bacterianos en la fermentacin para
8,10
8,00 0,00 la produccin de alcohol etlico. Bogot, 2007. Trabajo de grado
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 (Microbiloga Industrial). Pontificia Universidad Javeriana. Facultad
Tiempo (h)
de Ciencias.
MUFA - Formacin de biomasa MHSG - Formacin de biomasa 4. Acevedo A., Godoy R, and Bolaos G., (2003). Incremento de la
MUFA - Consumo de sustrato MHSG - Consumo de sustrato produccin de alcohol en fermentacin de melazas mediante la
Figura 2: Cintica de formacin de biomasa y consumo de sustrato de utilizacin del complejo enzimtico Rhyzozyme. XXII Congreso
Saccharomyces cerevisiae (Ethanol Red), durante la etapa de Colombiano de Ingeniera qumica. Bucaramanga. Agosto 1315.
fermentacin, utilizando sustratos: melaza ms urea y fosfato diamnico 5. Altaf, Md., Naveena, B.J., Reddy, G. (2005). Screening of
(MUFA) y melaza ms harina de semilla de guayaba (MHSG). Inexpensive Nitrogen Sources for Production of L (+) Lactic Acid
from Starch by Amylolytic Lactobacillus amylophilus GV6 in Single
En la figura 2 el incremento de los azcares reductores durante las 6 Step Fermentation. Food Technol. Biotechnol, 43 (3): 235239.
primeras horas, fue debido, al suministro de sustrato que se realiz cada 6. Steinhaus, M., Sinuco, D., Polster, J., Osorio, C., Schieberle, Peter.
hora durante este periodo. La formacin de biomasa disminuy por (2008). Characterization of the Aroma-Active Compounds in Pink
efectos de dilucin, ocasionada a su vez por el suministro de sustrato. Al Guava (Psidiumguajava, L.) by Application of the Aroma Extract
finalizar la etapa de fermentacin se presentaron diferencias Dilution Analysis. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56
estadsticamente significativas P < 0.05 entre los dos sustratos, tanto para (11): 41204127.
el consumo de sustrato, como para la formacin de biomasa. 7. Elizalde, M.P., Hernndez, V. (2009). Guava seed as an adsorbent and
as a precursor of carbon for the adsorption of acid dyes. Bioresource
9,00
Technology, 100: 21112117.
8,00
7,00 8. Kjeldah, J. (1883). Neue Methode zur Bestimmung der Stickstoffs in
Etanol (% v/v)

6,00 organischen Korpern. Z Anal Chem, 22: 366382.

5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0 2 4 6
Figura 3: Cintica de produccin de etanol de Saccharomyces cerevisiae
(Ethanol Red), durante la etapa de fermentacin, utilizando sustratos:
melaza ms urea y fosfato diamnico (MUFA) y melaza ms harina de
semilla de guayaba (MHSG).
La produccin de etanol (figura 3) mostr un comportamiento similar para
los dos sustratos, estos no presentaron diferencias estadsticamente
significativas P > 0.05 a las 24 horas de fermentacin, igual
comportamiento se present en estudios realizados por Turhan et al. [13],
quienes utilizaron extracto de levadura y extracto de algarroba con fuente
de nitrgeno. Mientras que Tang et al. [14], reportan una concentracin de
etanol del 8.50 % a las 48 horas de fermentacin utilizando melaza ms
9. Millar, G.L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for
determination of reducing sugar. Analyt. Chem, 31: 426429.
10. SAS INSTITUTE INC. (1993). SAS users guide. Statistics, version
6.03 Edition. SAS Institute Inc., Cary, NC.
11. Echegaray, O.F., Carvalho, J.C.M., Fernandes, A.N.R., Sato, S.,
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Aquarone, E., Vitolo, M. (2000). Fed-batch culture of Sacchoromyces
Tiempo (h) cerevisiae in sugar-cane blackstrap molasses: invertase activity of
MUFA MHSG intact cells in ethanol fermentation. Biomass and Bioenergy, 19: 39
50.
12. Kazuhiko, T. and Kozo, O. (1995). Factors Affecting the Ethanol
Productivity of Yeast in Molasse. Journal of fermentation and
bioengineering, 9 (5): 449452.
13. Turhan, I., Bialka, K.L., Demirci, A., Karhan, M. (2010). Ethanol
production from carob extract by using Saccharomyces cerevisiae.
Bioresource Technology, 101: 52905296.
14. Tang, Y., An M., Zhong, Y.L., Shigeru, M., Wu, X., Kida, K. (2010).
Continuous ethanol fermentation from non-sulfuric acid-washed
molasses using traditional stirred tank reactors and the flocculating
yeast strain KF-7. Journal of Bioscience and Bioengineering, 109 (1):
4146.