Diversidad y Funciones de Compuestos Orgánicos Volátiles Producidos Por

Diversidad y funciones de
compuestos orgnicos
voltiles producidos
por Streptomyces a partir
de un suelo supresor de
enfermedades
Viviane Cordovez 1,2
, Victor J. Carrin 1 , Desalegn W.
Etalo 1 , Roland Mumm 3,4
, Hua Zhu 5 , Gilles P. van
Wezel 1,5 y Jos M. Raaijmakers 1,5 *
1 Departamento de Ecologa Microbiana, Instituto Holands de Ecologa (NIOO-

KNAW), Wageningen, Pases Bajos
2 Laboratorio de Fitopatologa, Universidad de Wageningen, Wageningen, Pases Bajos
3 Plant Research International, Business Unit Bioscience, Universidad de Wageningen
y Centro de Investigacin, Wageningen, Pases Bajos

4 Centro de Biosistemas Genmica, Wageningen, Pases Bajos
5 Molecular Biotechnology, Instituto de Biologa, Universidad de Leiden, Leiden, Pases
Bajos
En suelos supresores de enfermedades, las plantas estn

protegidas de infecciones por patgenos especficos de las races
debido a las actividades antagnicas de los microorganismos del
suelo y de la rizsfera. Sin embargo, para la mayora de los
supresores de enfermedades, los microorganismos y mecanismos
implicados en el control de patgenos son en gran parte
desconocidos. Nuestros estudios recientes identificaron a
Actinobacteria como el phylum ms dinmico en un supresor del
suelo al patgeno fngico Rhizoctonia solani . Aqu aislamos y
caracterizamos 300 aislamientos de Actinobacterias rizsfricas
del suelo supresor de Rhizoctonia . Las especies
de Streptomyces fueron las ms abundantes, representando
aproximadamente el 70% de los aislamientos. Streptomyces son
reconocidos por la produccin de un nmero excepcionalmente
grande de metabolitos secundarios, Incluidos los compuestos
orgnicos voltiles (COV). La caracterizacin de VOC de 12 cepas
de Streptomycesrepresentativas por SPME-GC-MS permiti una
delineacin filogentica ms refinada de los aislados
de Streptomyces que la secuenciacin de 16S rRNA y los genes de
mantenimiento de la casa atpD y recA solamente. Los VOCs de
varios aislados de Streptomyces inhibieron el crecimiento de hifas
de R. solani y aumentaron significativamente la biomasa de
las ramas y de las plantas. El acoplamiento de los perfiles de
VOC de Streptomyces con sus efectos sobre el crecimiento de
hongos, apuntaba a COV potencialmente implicados en la
actividad antifngica. Los ensayos subsecuentes con cinco
anlogos sintticos de los VOCs identificados mostraron que el 2-
metilpentanoato de metilo, 1,3, 5-tricloro-2-metoxibenceno y la
mezcla de VOCs tienen actividad antifngica. En conclusin,
nuestros resultados apuntan a un papel potencial de
Streptomyces productores de VOC en supresiones de suelos y
muestran que el perfil VOC de Streptomyces rizsfrica se puede
utilizar como una herramienta de identificacin complementaria
para construir firmas metablicas especficas de la cepa.
Introduccin
Los suelos supresores de enfermedades son suelos en los que las plantas
estn efectivamente protegidas contra infecciones por patgenos
especficos de las races debido a las actividades antagnicas del suelo y de
los microorganismos de la rizsfera ( Hornby, 1983 ; Weller et al.,
2002 ). Este fenmeno ha sido descrito en todo el mundo, pero los
microorganismos responsables y los mecanismos subyacentes son en gran
parte desconocidos para la mayora de los suelos supresores ( Weller et
al., 2002 , Mendes et al., 2011, Chapelle et al., 2015 ). En estudios
recientes, identificamos el microbioma de un supresor de suelos
a Rhizoctonia solani , un patgeno fngico de importancia econmica en
el suelo de muchos cultivos, incluyendo la remolacha azucarera, la papa y
el arroz ( Mendes et al., 2011 ; Chapelle et al., 2015 ). La metagenmica
basada en PhyloChip detect ms de 33000 taxones bacterianos y
arcaicos en la rizsfera de plntulas de remolacha azucarera cultivadas en
el suelo supresor de Rhizoctonia y revel grupos bacterianos
consistentemente asociados con el estado supresor de la
enfermedad. Entre los 10% ms importantes de taxones ms dinmicos
(es decir, taxones relativamente ms abundantes en supresiones que en
suelos no supresores), las Actinobacterias fueron el phylum ms dinmico
encontrado en la rizosfera de plntulas de remolacha azucarera que
crecen en el suelo supresor. La metagenmica basada en PhyloChip
detect ms de 33000 taxones bacterianos y arcaicos en la rizsfera de
plntulas de remolacha azucarera cultivadas en el suelo supresor
de Rhizoctonia y revel grupos bacterianos consistentemente asociados
con el estado supresor de la enfermedad. Entre los 10% ms importantes
de taxones ms dinmicos (es decir, taxones relativamente ms
abundantes en supresiones que en suelos no supresores), las
Actinobacterias fueron el phylum ms dinmico encontrado en la
rizsfera de plntulas de remolacha azucarera que crecen en el suelo
supresor. La metagenmica basada en PhyloChip detect ms de 33000
taxones bacterianos y arcaicos en la rizsfera de plntulas de remolacha
azucarera cultivadas en el suelo supresor de Rhizoctonia y revel grupos
bacterianos consistentemente asociados con el estado supresor de la
enfermedad. Entre los 10% ms importantes de taxones ms dinmicos
(es decir, taxones relativamente ms abundantes en supresiones que en
suelos no supresores), las Actinobacterias fueron el phylum ms dinmico
encontrado en la rizosfera de plntulas de remolacha azucarera que
crecen en el suelo supresor.
Las bacterias Actinobacteria se encuentran ubicuos en la naturaleza y el
phylum comprende ms de 500 especies descritas formalmente
( Goodfellow, 2012 ; Labeda et al., 2012 ). Muchas Actinobacterias son
bacterias multicelulares con un ciclo de vida complejo y son reconocidas
por la produccin de un nmero excepcionalmente grande de metabolitos
bioactivos ( Claessen et al., 2014 ). Los miembros del
gnero Streptomyces producen ms de 10000 metabolitos secundarios,
incluyendo los compuestos orgnicos voltiles (COV) ( Brdy,
2005 ; Hopwood, 2007 ; van Wezel et al., 2009 ). Aproximadamente 1000
VOC microbianos han sido identificados hasta la fecha ( Piechulla y
Degenhardt, 2014 ). Aunque la produccin de COV por microorganismos
es conocida desde hace muchos aos ( Zoller y Clark, 1921 , Stotzky y
Schenck, 1976 ), es slo desde la ltima dcada que un nmero creciente
de estudios han informado sobre la diversidad y las funciones potenciales
de estos compuestos . La mezcla de COV liberados por los
microorganismos es diversa y compleja. Los COV microbianos pertenecen
a diferentes clases de compuestos tales como alquenos, alcoholes, cetonas,
terpenos, benzoides, aldehdos, pirazinas, cidos, steres y compuestos
que contienen azufre ( Effmert et al., 2012 ). Los mismos compuestos
orgnicos voltiles se pueden encontrar para diferentes, a menudo no
relacionados, microorganismos, pero algunos compuestos orgnicos
voltiles son nicos para microorganismos especficos ( Schulz y
Dickschat, 2007 ; Garbeva et al, 2014. ). VOCs microbianos muestran
funciones verstiles: inhiben el crecimiento de bacterias y hongos,
promover o inhibir crecimiento de las plantas, resistencia de la planta
gatillo y atraer otro micro y macro organismos ( . Ryu et al, 2003 , 2004 ; .
Vespermann et al, 2007 ; Kai et al., 2009 ; . Verhulst et al, 2009 ; Bailly y
Weisskopf, 2012 ; Hagai et al, 2014. ; Schmidt et al, 2015. ). Adems, se ha
propuesto que los COV funcionen como molculas de sealizacin en las
interacciones inter e intra-especficas y en la comunicacin de clula a
clula. Hasta la fecha, sin embargo, las funciones naturales de los VOC
microbianos y sus modos de accin siguen siendo ampliamente
desconocidas ( Kai et al., 2009 ; Kim et al., 2012 ; Schmidt et al., 2015 ).
Aqu estudiamos la diversidad y funciones de COV producidos por

diferentes Streptomyces a partir de la rizsfera de plantas de remolacha
azucarera cultivadas en un suelo supresor de Rhizoctonia . Primero
aislamos y caracterizamos 300 Actinobacterias. Debido a
que Streptomyces represent casi el 70% de todos los aislamientos, se
realizaron anlisis posteriores de COV, filogenia, actividad antifngica y
crecimiento de plantas con este grupo de Actinobacterias. Mediante el
acoplamiento de SPME-GC-MS y la agrupacin jerrquica de los perfiles
de VOC, identificamos VOCs potencialmente implicados en la actividad
antifngica.
Materiales y mtodos
Aislamiento selectivo de las Actinobacterias
Las actinobacterias se aislaron de la rizosfera (races con suelos
adheridos) de plantas de remolacha azucarera cultivadas en un suelo
supresor de R. solani . El suelo fue recogido previamente en 2003 y 2004
de un campo de remolacha azucarera agrcola cerca de la ciudad de
Hoeven, Pases Bajos (51 35'10 "N 4 34" 44'E). Para la recoleccin de
Actinobacteria de la rizosfera se sembraron semillas de remolacha
azucarera (cultivar Alligator) en macetas cuadradas de PVC con 250 g de
suelo de campo con un contenido inicial de humedad del 10% (v / w). Las
plantas se cultivaron en una cmara de crecimiento (24 C / 24 C da /
noche temperaturas, 180 mol luz m -2 s -1 a nivel de planta durante 16 h /
d, 70% de humedad relativa) y se riega semanalmente con Hoagland
solucin estndar (Slo macronutrientes). Despus de 3 semanas de
crecimiento de la planta, Se suspendieron 1 g de remolacha azucarera con
suciedad adherida en 5 ml de tampn potasio-fosfato (pH 7,0). Las
muestras se sometieron a vrtice y sonicadas durante 1 min. Para
enriquecer para diferentes gneros de Actinobacteria, se aplicaron varios
tratamientos a la suspensin del suelo (Tabla Suplementaria S1). Las
colonias individuales se recogieron basndose en la morfologa y se
purificaron en placas de agar frescas. Los aislamientos se almacenaron en
glicerol (20%, v / v) a -20C y -80C.
Caracterizacin de las Actinobacterias
Todos los 300 aislamientos Actinobacterial se caracterizaron por la
secuenciacin de genes 16S rRNA. Las amplificaciones por PCR se
realizaron usando los cebadores 8F (5 '- AGAGTTTGATC CTGGCTCAG -
3') y 1392R (5 '- ACGGGCGGT GTGTACA - 3') o 27F (5 '-
GAGTTTGATCCTG GCTCAG - 3') y 1492R (5'- ACCTTGTTACGACGACTT
- 3 ') ( Lane, 1991 , Deangelis et al., 2009 ). Para obtener el ADN, las
clulas bacterianas se interrumpieron calentando a 95 C durante 10
min. Para los aislamientos formadores de esporas, las clulas se
interrumpieron en el microondas a 650 W durante 30 s en tampn
TE. Las suspensiones se centrifugaron a 13000 rpm durante 10
min. Despus de la centrifugacin, se utilizaron 2 l de los sobrenadantes
para las reacciones de PCR. Los productos de PCR se purificaron y
secuenciaron en Macrogen Inc.
Acoplamiento de los aislados de Streptomyces a
OTU detectados por PhyloChip
16S rRNA secuencias de 173 Streptomyces aislamientos se compararon
con el 16S rRNA secuencias de genes de Streptomyces OTUs previamente
identificado por PhyloChip basado en el metagenomic anlisis como el
10% de los taxones ms abundantes asociados con la supresin de la
enfermedad ( Mendes et al., 2011 ). El anlisis filogentico se realiz con
el msculo en MEGA6 ( Tamura et al., 2013 ) y iTOL ( Letunic y Bork,
2011 ) ( http://itol.embl.de/ ). Se construy un rbol de consenso de
unin vecina ( Saitou y Nei, 1987 ) con 1000 repeticiones de bootstrap
( Felsenstein, 1985 ) usando el modelo Tamura-Nei ( Tamura y Nei, 1993 )
con distribucin gamma. Un total de 11 aislamientos, Que estaban
estrechamente relacionados con los aislamientos detectados por
PhyloChip, fueron seleccionados para estudiar la composicin de los COV
emitidos y sus efectos in vitro sobre el crecimiento de hongos y
plantas. Streptomyces lividans 1326 ( Cruz-Morales et al., 2013 ) se us
como cepa de referencia.
Caracterizacin de aislados seleccionados
de Streptomyces
Los 11 aislados de Streptomyces se caracterizaron basndose en la
morfologa de las colonias y mediante el anlisis secuencial de los genes
de mantenimiento de la casa recA (recombinase A) y atpD (subunidad B
de la ATP sintasa). Estos genes fueron amplificados y secuenciados como
se describi anteriormente ( Guo et al., 2008 ). Se
concatenaron secuencias parciales de los genes recA (500 pb), atpD (423
pb) y 16S rRNA (516 pb) de Streptomyces para producir una alineacin de
1439 sitios. Se construy un rbol filogentico concatenado suplementado
con secuencias de cepas de Streptomyces con un genoma secuenciado
(base de datos NCBI) utilizando UPGMA con el modelo de clculo de
parmetros Tamura-3 con distribucin gamma y 1. 000 rplicas de
arranque. Todas las secuencias se depositaron en GenBak y se han
asignado a los nmeros de acceso: KT60032-KT600042 (gen 16S rRNA),
KT600043-KT600053 ( gen recA ) y KT600054-KT600064 ( gen atpD ).
Recoleccin y anlisis de VOC de Streptomyces
Para atrapar los COV, los aislados de Streptomyces se inocularon
individualmente en frascos de vidrio estriles de 10 ml que contenan 2,5
ml de medio GA ( Zhang, 1990 ) con tres repeticiones cada uno. Los viales
que contenan medio solo sirvieron como controles. Todos los viales se
cerraron y se incubaron a 30 C. Despus de 7 das, se recogieron VOCs
del espacio de cabeza de cada vial mediante microextraccin en fase slida
(SPME) con una fibra de polidimetilsiloxano-divinilbenceno de 65 mm
(Supelco, Bellefonte, EE.UU.).
Streptomyces VOCs fueron analizados por GC-MS (Agilent GC7890A con

un cuadrupol MSD Agilent 5978C). Los COV se desorbitaron
trmicamente a 250C insertando la fibra durante 2 min en el puerto de
inyeccin de GC caliente. Los compuestos liberados se transfirieron a la
columna analtica (HP-5MS, 30 mx 0,25 mm ID, 0,25 \ mu m de espesor
de pelcula) en modo sin divisin. El programa de temperatura del horno
GC empez a 45 C (mantenimiento de 2 minutos) y se elev con 10 C
min -1 a 280 C (retencin de 3 minutos). El escaneo en masa se realiz de
33 a 300 m / z con un tiempo de escaneo de 2,8 scan s- 1 . Los datos
crudos de GC-MS fueron procesados por un enfoque de metabolmica no
dirigido. Se utiliz el software MetAlign ( Lommen y Kools, 2012 ) para
extraer y alinear las seales de masa (s / n = 3). MSClust se utiliz para
eliminar la redundancia de la seal por metabolito y para reconstruir los
espectros de masas de compuestos como se describi anteriormente (
Tikunov et al., 2012 ). Los COV se anotaron tentativamente comparando
sus espectros de masas con los de las bibliotecas comerciales (NIST08) y
de espectrometra de masa interna. Los ndices de retencin lineal (RI) de
los COV se calcularon como se describi anteriormente ( Strehmel et al.,
2008 ) y se compararon con los de la literatura. COV seleccionados
para ensayos antimicticos in vitro [butanoato de metilo (\ geq 98%), 2 -
metilpentanoato de metilo (\ geq 98%), 3 - metilpentanoato de metilo (\
geq 97%), 1,3,5 - tricloro - 2 - metoxibenceno %) Y 3-octanona (98%)]
con estndares de referencia autnticos obtenidos en Sigma-Aldrich. Los
datos de COV procesados se transformaron en registros y se escalonaron
automticamente usando el promedio como un desplazamiento y la
desviacin estndar como escala [valor-promedio bruto
(desplazamiento) / SD (escala)]. Los datos transformados log fueron
sometidos a anlisis estadstico multivariado. ANOVA de una va se
realiz con GeneMaths XT versin 2.11 (Applied Maths, Blgica) para
identificar VOCs significativamente diferente del control (slo medio) [
p <0,05; Con correccin de tasa de descubrimiento falso (FDR)]. Despus
de eso, se realiz el anlisis de agrupamiento jerrquico (HCA) utilizando
el coeficiente de correlacin de Pearson con el algoritmo
UPGMA. Blgica) para identificar VOCs significativamente diferentes
del control (slo medio) [ p <0,05; Con correccin de tasa de
descubrimiento falso (FDR)]. Despus de eso, se realiz el anlisis de
agrupamiento jerrquico (HCA) utilizando el coeficiente de correlacin de
Pearson con el algoritmo UPGMA. Blgica) para identificar VOCs
significativamente diferentes del control (slo medio) [ p <0,05; Con
correccin de tasa de descubrimiento falso (FDR)]. Despus de eso, se
realiz el anlisis de agrupamiento jerrquico (HCA) utilizando el
coeficiente de correlacin de Pearson con el algoritmo UPGMA.
Actividad Antifngica Mediada por VOC
El efecto de los VOC de Streptomyces sobre el crecimiento del hongo R.
solani se investig utilizando los fondos de dos placas de Petri de 90 mm
de dimetro que permitieron la separacin fsica entre las bacterias y el
hongo. Un fondo contena un aislado de Streptomyces en medio GA,
previamente incubado a 30 C durante 4 das. La otra parte inferior
contena un tapn de micelio de R. solani sobre 1/10 de triptomona soja
Agar (TSA, Oxoid). Se sellaron ambas placas de Petri una frente a otra y se
incubaron a 25 C con la placa de Petri que contena el Streptomyces en
el fondo para evitar las esporas que se transfirieron a la placa con el
hongo. Como control, la placa de Petri que contena R. solani se expuso a
una placa de Petri que contena solo medio GA. La inhibicin del
crecimiento fngico se calcul midiendo el crecimiento radial de las hifas
fngicas despus de 1, 2 y 3 das de incubacin. El porcentaje de
inhibicin se calcul como [(dimetro del hongo en el control - dimetro
del hongo expuesto a COV) * 100 / dimetro del hongo en control] para
cada una de las 3 repeticiones. Se realiz la prueba t de Student para
determinar diferencias estadsticamente significativas en comparacin
con el control ( p <0,05, n = 3).
Actividad antifngica de VOCs sintticos
El butanoato de metilo (\ geq 98%), 2 - metilpentanoato de metilo (\ geq
98%), 3 - metilpentanoato de metilo (\ geq 97%), 1,3,5 - tricloro - 2 -
metoxibenceno (99%) y 3 - octanona 98%) se obtuvieron en Sigma-
Aldrich. Todos los COV se disolvieron en metanol con concentraciones
finales que oscilaban entre 1 M y 1 nM (diluciones de 10 veces). Los
ensayos se realizaron utilizando una placa de Petri estndar de 90 mm de
dimetro con el tapn fngico sobre el medio TSA de 1/10 en la parte
superior y con un filtro de papel estril (1,5 x 1,5 cm) en el fondo. Se
aplicaron veinte microlitros de cada VOC disuelto en metanol en el filtro
de papel, se sellaron inmediatamente las placas y se incubaron a 25C. El
crecimiento de hifalos radiales del hongo se midi despus de 1 y 2 das de
exposicin a una sola o una mezcla de los 5 COV y se compar con el
control (tapa vaca de una placa de Petri). Para comprobar si el propio
disolvente tena algn efecto sobre el crecimiento del hongo, R.
solani tambin se expuso a metanol solo. De Student t -Test se realiz
para determinar diferencias estadsticamente significativas en
comparacin con el control ( p <0,05, n = 3 - 5).
Promocin del crecimiento de plantas mediada por
VOC
Para determinar si los VOC de Streptomyces tuvieron un efecto sobre el
crecimiento de las plantas, las plntulas de Arabidopsis thaliana fueron
expuestas a los COV emitidos por los diferentes aislamientos. Las semillas
de A. thaliana (Col-0 de tipo salvaje) se esterilizaron superficialmente
como se describi anteriormente ( van de Mortel et al., 2012 ) y se
sembraron en placas de Petri de 90 mm de dimetro que contenan 50 ml
de medio Murashige y Skoog 0.5X ( Murashige Y Skoog, 1962 )
suplementado con sacarosa al 0,5% (p / v). Los platos de 90 mm de
dimetro de Petri se colocan dentro de una placa de Petri de 145 mm de
dimetro, sellaron y se incubaron en una cmara climtica (temperaturas
da / noche 21 C / 21 C; 180? Mol luz m -2 s -1 en Nivel de la planta
durante 16 h / d, 70% de humedad relativa). Despus de 7 das, Se
aadieron placas de Petri de 35 mm de dimetro que
contenan aislamientos de Streptomyces que crecan en medio GA
(previamente incubadas a 30 C durante 1 semana) a las placas de Petri
de 145 mm con las plntulas de A. thaliana . Las placas se sellaron y se
mantuvieron a 21C. Despus de 14 das, se determin el peso fresco de la
planta. Adems, se midi el peso seco de la planta despus de secar los
brotes y las races durante la noche en una incubadora a 65C. De
Student t -Test se realiz para determinar diferencias estadsticamente
significativas en comparacin con el tratamiento control (plantas
expuestas a medio solamente). Las placas se sellaron y se mantuvieron a
21C. Despus de 14 das, se determin el peso fresco de la
brotes y las races durante la noche en una incubadora a 65C. Se realiz
la prueba t de Student para determinar diferencias estadsticamente
significativas en comparacin con el tratamiento de control (plantas
expuestas slo al medio). Las placas se sellaron y se mantuvieron a
21C. Despus de 14 das, se determin el peso fresco de la
brotes y las races durante la noche en una incubadora a 65C. Se realiz
la prueba t de Student para determinar diferencias estadsticamente
significativas en comparacin con el tratamiento de control (plantas
expuestas slo al medio).
Resultados
Diversidad de Actinobacterias aisladas de Suelo
Supresor
Utilizando los anlisis metagenmicos basados en PhyloChip, se describi
previamente la diversidad de la comunidad bacteriana asociada con la
rizsfera de plantas de remolacha azucarera cultivadas en un suelo
supresor de Rhizoctonia ( Mendes et al., 2011 ). Las actinobacterias
estaban ms prominentemente representadas en el suelo supresor que en
el suelo no supresor (propicio). La diversidad bacteriana detectada por el
PhyloChip utilizado en el estudio mencionado anteriormente se muestra
en la Figura 1A . Para seleccionar el mayor nmero posible de aislados de
Actinobacterial, se utilizaron varios pretratamientos del suelo rizosfrico y
diferentes medios selectivos para su aislamiento (Tabla Suplementaria
S1). Se obtuvieron un total de 300 aislamientos de Actinobacterial y se
caracterizaron por la secuenciacin del gen 16S rRNA. Sobre la base de las
similitudes de secuencia (95-100%) a las secuencias del gen 16S rRNA
disponibles en la base de datos Greengenes (usado como anlisis de
referencia en el PhyloChip), se identificaron 18 gneros diferentes de
Actinobacteria. Estos fueron Streptomyces, Microbacterium,
Rhodococcus, Micromonospora, Microbispora, Kribbella,
Pseudonocardia, Cellulomonas, Mycobacterium, Actinoplanes,
Arthrobacter, Actinomadura, Amycolaptosis, Nocardioides,
Nonomureae, Streptosporangium, Micrococcus , y Rothia (Figura 1B ). El
gnero Streptomyces fue el ms abundante, representando el 69% de
todos los aislamientos y al menos 25 especies diferentes basadas en
secuencias de genes 16S rRNA (Figura 1C ). Microbacterium,
Arthrobacter, Actinomadura, Amycolaptosis, Nocardioides, Nonomureae,
Streptosporangium, Micrococcus y Rothia (Figura 1B ). El
secuencias de genes 16S rRNA (Figura 1C ). Microbacterium,
Arthrobacter, Actinomadura, Amycolaptosis, Nocardioides, Nonomureae,
Streptosporangium, Micrococcus y Rothia (Figura 1B ). El
secuencias de genes 16S rRNA (Figura 1C ).
FIGURA 1
Figura 1. Filamento bacteriano (y arcaico) 10% ms dinmico

detectado por el anlisis de PhyloChip del microbioma de
rizsfera de plntulas de remolacha azucarera cultivadas
en suelo supresor de Rhizoctonia (grfico circular A, adaptado
de Mendes et al., 2011 ) . Diversidad de Actinobacterias (grfico B ) y
de especies de Streptomyces (grfico circular C ) aisladas de la rizsfera
de plntulas de remolacha azucarera cultivadas en suelo supresor
de Rhizoctonia (este estudio).
Anlisis filogentico de
los aislados de Streptomyces
Para seleccionar los aislamientos de Streptomyces para los anlisis
funcionales y de VOC, se compararon las secuencias del gen rRNA 16S de
los aislados de Streptomyces ( n = 173) obtenidas en este estudio con las
de las Streptomyces OTUs representativas ( n = 430) detectadas
originalmente por PhyloChip ( Mendes et al. , 2011 ). Un rbol filogentico
se construy utilizando estas secuencias y las secuencias de
diferentes Streptomyces tipo cepas (Figura 2 ]. Esta comparacin llev a
la seleccin de 11 aislados (Figura 3 ]. Luego construimos rboles
filogenticos con estos 11 aislamientos, sus cepas de tipo ms
cercano, Otras especies de Streptomyces con genomas secuenciados y la
cepa de referencia Streptomyces lividans1326 (Figura complementaria
S1A). Adems, hemos secuenciado la casa de mantenimiento
genes atpD y recA (Figura complementaria S1B). La concatenacin de
las secuencias atpD, recA y 16S permiti una mejor resolucin de los
diferentes aislados de Streptomyces que basada nicamente en las
secuencias 16S. Sin embargo, aislados estrechamente relacionados, pero
fenotpicamente diferentes, como Streptomycescepas W75.5 y W126
(Figura 3 ], no podra distinguirse sobre la base de estos tres marcadores
moleculares. Secuenciamos los genes de mantenimiento de la casa
atpD y recA (Figura complementaria S1B). La concatenacin de
fenotpicamente diferentes, como Streptomyces cepas W75.5 y W126
moleculares. Secuenciamos los genes de mantenimiento de la casa
atpD y recA (Figura complementaria S1B). La concatenacin de
fenotpicamente diferentes, como Streptomyces cepas W75.5 y W126
moleculares. Y 16S secuencias permiti una mejor resolucin de los
diferentes Streptomyces aislados de basadas en 16S secuencias slo. Sin
embargo, aislados estrechamente relacionados, pero fenotpicamente
diferentes, como Streptomyces cepas W75.5 y W126 (Figura 3 ], no podra
distinguirse sobre la base de estos tres marcadores moleculares. Y 16S
secuencias permiti una mejor resolucin de los diferentes
Streptomyces aislados de basadas en 16S secuencias slo. Sin embargo,
aislados estrechamente relacionados, pero fenotpicamente diferentes,
como Streptomyces cepas W75.5 y W126 (Figura 3 ], no podra
distinguirse sobre la base de estos tres marcadores moleculares.
FIGURA 2
Figura 2. rbol filogentico unido a vecinos basado en las

secuencias del gen rRNA 16S de
la coleccin Streptomyces obtenida en este estudio (en
azul), Streptomycesdetectado por anlisis Phylochip (en rosa)
y cepas de tipo Streptomyces (en verde) . Losaislados
de Streptomyces seleccionados para el anlisis de VOC se indican en
negrita.
FIGURA 3
Figura 3. Caracterizacin de Streptomyces aislamientos

utilizados en este estudio . Los nombres de las especies se basan en
16S rRNA secuencia de genes de comparacin utilizando la base de datos
Greengenes. Los cuadros representan aislados de 4-7 das de edad
cultivados en medio GA. * S. lividans 1326 se refiere al nmero de
coleccin John Innes Center y corresponde a S. lividans 66 ( Hopwood et
al., 1983 ).
Perfiles de VOC de aislados de Streptomyces
Para los 12 aislados de Streptomyces (11 cepas aisladas de rizosfera y cepa
de referencia S. lividans 1326) cultivadas en medio GA y el medio solo
(control), se detectaron un total de 536 COV en el espacio de cabeza. De
estos, 381 VOCs que fueron significativamente diferentes
(ANOVA, p <0,05) y detectados en intensidades al menos dos veces ms
alto que en el control se consideraron para los anlisis adicionales. La
diversidad de COV producidos por los diferentes aislados
de Streptomyces se muestra en la Tabla Suplementaria S2 y se destaca en
el mapa de calor (Figura 4 ]. Los COV detectados pertenecen a diversas
clases de compuestos tales como alcoholes, aldehdos, cidos carboxlicos,
steres, cetonas, compuestos de azufre y varios terpenos (Tabla
Suplementaria S2). Se descubri que la mayora de los COV eran
especficos para algunos aislados de Streptomyces y que se hallaba que 45
COV eran comnmente producidos por todos los aislados ensayados. La
geosmina (trans-1,10-dimetil-trans-9-decalol, RI 1423, Tabla
Suplementaria S2) era uno de estos COV comunes. HCA de los perfiles de
COV dio lugar a una agrupacin similar de los
12 aislados Streptomyces como el agrupamiento basado en los diferentes
marcadores moleculares (Figura 5 ]. En contraste con los marcadores
moleculares, sin embargo, el perfil VOC permiti la diferenciacin entre
estrechamente relacionados Streptomyces asla como Streptomycescepas
W75.5 y W126, as como Streptomyces cepas W47 y W214. RI 1423; Tabla
complementaria S2) fue uno de estos COV comunes. HCA de los perfiles
de COV dio lugar a una agrupacin similar de los 12
aislados Streptomyces como el agrupamiento basado en los diferentes
estrechamente relacionados Streptomyces asla como Streptomyces cepas
W75.5 y W126, as como Streptomyces cepas W47 y W214. RI 1423; Tabla
complementaria S2) fue uno de estos COV comunes. HCA de los perfiles
de COV dio lugar a una agrupacin similar de los 12
aislados Streptomyces como el agrupamiento basado en los diferentes
estrechamente relacionados Streptomyces asla como Streptomyces cepas
W75.5 y W126, as como Streptomyces cepas W47 y W214.
FIGURA 4
Figura 4. Anlisis jerrquico de los perfiles VOC de

los aislados seleccionados de Streptomyces . Las columnas
representan tres mediciones repetidas de VOC de cada uno de los 12
aislamientos y el medio solo (control). Las filas representan los diferentes
VOCs (verde, baja abundancia, rojo, alta abundancia), varios de los cuales
fueron putativamente anotados (vase la Tabla Suplementaria S2).
FIGURA 5
Figura 5. (A) rbol filogentico de secuencias parciales concatenadas de
16S rRNA, atpD y recAgenes de
11 Streptomyces aislamientos Rhizoctonia supresor de suelo y la cepa de
referencia S. lividans 1326. El rbol fue construido utilizando UPGMA
mtodo y Tamura-3 Modelo de clculo de parmetros con distribucin
gamma y 1000 repeticiones bootstrap. (B) Anlisis de agrupamiento
jerrquico (HCA) de VOC de Streptomyces con el mtodo UPGMA y el
coeficiente de correlacin de Pearson. Diferentes colores indican
diferentes grupos de aislamientos basados en perfiles VOC.
Efecto de los VOC de Streptomyces sobre el
crecimiento de hongos y plantas
Para probar la actividad antifngica de los COV producidos por
los aislados de Streptomyces de suelo supresor de la enfermedad, se
midi el crecimiento de hifas de R. solani durante la exposicin a COV de
cada uno de los aislamientos. En el control, las hifas fngicas alcanzaron
el borde de las placas de agar despus de 2 das de incubacin. Todas
las cepas de Streptomyces fueron capaces de retrasar significativamente
el crecimiento de R. solani . Streptomyces cepas W47 y W214 fueron las
ms inhibitorias. Cuando se expusieron durante 2 das a los COV
producidos por estos aislados, el crecimiento de hifas radiales se redujo
en 57 y 41%, respectivamente (Figura 6A ).
FIGURA 6
Figura 6. Inhibicin del crecimiento de hongos despus de 1 y 2
das de exposicin a Streptomyces VOCs (A) y crecimiento
de plntulas de Arabidopsis thaliana despus de 2 semanas de
exposicin a Streptomyces VOCs (B) . Los controles se muestran en
verde y aislados con la actividad antifngica ms fuerte en rojo. Las barras
representan errores estndar de la media de 3 repeticiones biolgicas
independientes. Los asteriscos indican una diferencia estadstica en
comparacin con los controles (expuestos slo al medio) usando el test t
de Student ( p <0,05, n = 3). Se realizaron fotos de actividad antifngica y
de crecimiento de plantas despus de 3 y 14 das de exposicin,
respectivamente.
Adems, hemos probado si Streptomyces COV podra promover el

crecimiento de las plantas. Para ello, expusimos plantas de 7 das de
edad A. thaliana a COV de cada uno de los aislamientos y determinamos
la biomasa de races y brotes. Despus de 2 semanas de exposicin a
los VOC de Streptomyces , no se observaron efectos negativos sobre el
crecimiento de las plantas. Diez de los 12 aislamientos aumentaron
significativamente la biomasa de los brotes y 8 aumentaron
significativamente la biomasa de las races en comparacin con el testigo
(Figura 6B ). S. lividans 1326 y Streptomyces W47 y W62 condujeron al
mayor aumento de la biomasa vegetal, mientras que
las cepas Streptomyces W214 y 3A41 no incrementaron la biomasa de las
ramas y las races.
Identificacin de los VOC de Streptomyces
que contribuyen a la actividad antifngica
Desde Streptomyces cepas W47 y W214 estn filogenticamente
estrechamente relacionados y ambos mostraron una fuerte actividad
antifngica, se seleccionaron estos aislados para identificar compuestos
orgnicos voltiles con actividad contra R. solani . El cribado de COV con
actividad antifngica potencial se calcul con ANOVA de una va
[ p <0,05; Con correccin de tasa de descubrimiento falso (FDR)] y un
cambio de pliegue> 2 utilizando la intensidad mxima de VOCs de W214 /
control y W47 / control. Para la seleccin de COV para la actividad
antifngica in vitro , se utilizaron tres criterios: (1) factor de coincidencia
y factor de coincidencia inversa superior a 850; (2) anotacin fiable
basada en ndices de retencin; y (3) disponibilidad de referencia pura
compuestos.
Una comparacin de los perfiles VOC de Streptomyces cepas W47 y W214

con el control (slo medio) seal COV potencialmente implicados en la
actividad antifngica (Figura 7A ]. Un total de 96 COV fueron
compartidos entre estos dos aislamientos; 65 y 7 fueron nicos
para Streptomyces cepas W47 y W214, respectivamente (Figuras 7A,
B ). Dado que ambas cepas Streptomyces W47 y W214 mostraron
actividad antifngica, examinamos los COV detectados para ambas
cepas. Se seleccionaron cinco COV comunes (metil butanoato, metil 2-
metilpentanoato, 3-metilpentanoato de metilo, 1,3,5-tricloro-2-
metoxibenceno, Y 3-octanona) que podran anotarse fiablemente
basndose en RI y similitud espectral de masas y que estaban
comercialmente disponibles como estndares de referencia autnticos. La
identidad de estos compuestos se verific mediante el anlisis de
patrones puros por la GC-MS y la comparacin de sus espectros de
masas y RI con los de los VOC detectado para Streptomyces cepas W47 y
W214. Posteriormente, se utilizaron diferentes concentraciones de estos
cinco COV para probar su efecto inhibidor sobre el crecimiento de hifas
de R. solani (Figura 7C ). El VOC 1,3,5-tricloro-2-metoxibenceno inhibi
completamente el crecimiento de hifas radiales de R. solani a
concentraciones de 1 M y 100 mM (Figura 7D ). La exposicin a este VOC
condujo a la melanizacin de R. Solani hyphae (Figura 7E ). El 2-
metilpentanoato de metilo de VOC redujo el crecimiento de hongos en 47
y 25% despus de 1 y 2 das de exposicin, respectivamente. Adems, una
mezcla de los 5 VOC sintticos, cada uno a una concentracin final de 200
mM, inhibi el crecimiento de hifas en 58 y 42% despus de 1 y 2 das de
exposicin, respectivamente.
FIGURA 7
Figura 7. (A) Perfiles VOC de las cepas W47 y W214 de Streptomyces

en comparacin con el control (slo medio). (B) diagrama de Venn para
VOCs comunes y nicas producidos por Streptomycescepas W47 y
W214. (C) Preparacin experimental para el ensayo de actividad
antifngica in vitro con VOC sintticos. (D) Actividad antifngica in
vitro con VOCs sintticos a 1 M [control, metanol, VOC1 (metil
butanoato), VOC2 (metil 2-metilpentanoato), VOC3 (metil 3-
metilpentanoato), VOC4 (1,3,5- tricloro- 2 - metoxibenceno), VOC _ {5}
(3 - octanona)]. Se utiliz metanol para diluir todos los COV. Las barras
representan errores estndar de la media de 3 repeticiones
independientes. Los asteriscos indican diferencias estadsticas en
comparacin con el control segn la prueba t de Student ( p <0,05, n =
3). (E) Crecimiento fngico despus de la exposicin al 1,3,5-tricloro-2-
metoxibenceno. (F)Abundancia de 1,3,5-tricloro-2-metoxibenceno
producida por diferentes cepas de Streptomyces basadas en intensidades
de pico de GC-MS. (G) Relacin no lineal entre la inhibicin del
crecimiento de hongos y la abundancia de 1,3,5-tricloro-2-
metoxibenceno. 5-tricloro-2-metoxibenceno producido por diferentes
cepas de Streptomyces basadas en intensidades de pico de GC-
MS. (G) Relacin no lineal entre la inhibicin del crecimiento de hongos y
la abundancia de 1,3,5-tricloro-2-metoxibenceno. 5-tricloro-2-
metoxibenceno producido por diferentes cepas de Streptomyces basadas
en intensidades de pico de GC-MS. (G)Relacin no lineal entre la
inhibicin del crecimiento de hongos y la abundancia de 1,3,5-tricloro-2-
metoxibenceno.
Para determinar si el VOC antimictico 1,3,5-tricloro-2-metoxibenceno se

encuentra tpicamente en los aislados de Streptomyces que inhiben el
crecimiento de hifas de R. solani , se determinaron las cantidades
relativas de este VOC producido por cada uno de los 12 aislamientos
de Streptomyces Probado en este estudio. Los resultados muestran que la
produccin de este COV est muy extendida entre los 12 aislados
de Streptomyces . Por otra parte, se encontr una correlacin positiva no
lineal entre el porcentaje de inhibicin del crecimiento de hifas y la
abundancia (intensidad mxima) del 1,3,5-tricloro-2-metoxibenceno
detectado para los 12 aislamientos (Figuras 7F, G ).
Discusin
La produccin de COV por microorganismos es conocida desde hace
varias dcadas. Slo recientemente un nmero creciente de estudios
inform sobre la diversidad qumica y las posibles funciones de este grupo
de compuestos microbianos ( Schmidt et al., 2015 ). En comparacin con
los COV vegetales, el conocimiento acerca de las funciones naturales de
los COV microbianos sigue siendo limitado ( Bitas et al., 2013 ). Aqu
estudiamos la diversidad y las actividades de los COV producidos por
diferentes estreptomicetos de un suelo supresor de Rhizoctonia .
El perfil de COV se ha utilizado ampliamente para aromatizar y
aromatizar los alimentos, as como indicadores del crecimiento de hongos
en edificios y en el manejo postcosecha ( Morath et al., 2012 ). Ms
recientemente, VOC chemotyping permitido no slo para identificar VOCs
especies y la cepa especfica, sino tambin para estudiar la actividad
microbiana del suelo y los cambios en las composiciones de la comunidad
microbiana ( McNeal y Herbert, 2009 ; Mller et al, 2013. ; Trefz et al,
2013. ). Se demostr que el perfil VOC se puede utilizar para la
quimiotipificacin de diferentes estreptomicetos. La mayora de los 381
COV detectados para los diferentes estreptomicetos del suelo supresor
de Rhizoctonia resultaron ser especficos para algunos aislados, mientras
que se encontr que menos COV era comnmente producido por todos los
aislamientos. Los VOCs mejor conocidos a partir de estreptomicetos son
2-metilisoborneol (MIB) y trans-1,10-dimetil-trans-9-decalol (geosmina)
que son responsables de la olor a humedad o terroso caracterstico de
suelos hmedos ( Gerber, 1968 ; Jiang et Al., 2007 ). Nuestros resultados
tambin muestran que estos COV son ampliamente producidos
por Streptomyces aislamientos de la rizsfera de plantas de remolacha
azucarera cultivadas en Rhizoctonia supresor de suelo. Se detect la
geosmina para todos los aislamientos, mientras que MIB se detect para
ocho aislamientos. Los miembros del gnero Streptomyces difieren
mucho en su morfologa, fisiologa y caractersticas bioqumicas
( Anderson y Wellington, 2001 ). La delimitacin taxonmica de este
gnero sigue siendo compleja y conduce a grupos sobre o sub-
clasificados. Los enfoques actuales para la clasificacin de
Streptomyces , as como otros procariotas se basan en caractersticas
genticas y fenotpicas, principalmente en 16S rRNA secuencias de
genes. Sin embargo, este marcador molecular no siempre es suficiente
para discriminar entre especies estrechamente relacionadas y entre cepas
de una especie dada ( Girard et al., 2013 ). Hemos demostrado que la
concatenacin de atpD, recA , y 16S rRNA secuencias de genes mostr
una mejor filogentica delineacin de los diferentes streptomycetes de 16S
rRNA secuencias del gen solo, aunque estrechamente relacionados
aislamientos no podra distinguirse.
El gnero Streptomyces es bien conocido por la produccin de varios

compuestos antifngicos y antivirales y representa el 80% de los
compuestos antibiticos actualmente disponibles ( Watve et al.,
2001). Streptomyces tambin produce compuestos orgnicos voltiles que
reducen la incidencia y / o gravedad de varias enfermedades de las
plantas causadas por hongos y causar anormalidades morfolgicas en
diferentes hongos ( Moore-Landecker y Stotzky, 1973 ; Wan et al.,
2008 ; Boukaew et al, 2013. ; Wang et al., 2013 , Wu et al., 2015 ). Los
COV producidos por los estreptomicetos ensayados aqu exhiban
propiedades antifngicas y promotoras del crecimiento de las
plantas. Varios aislados inhibieron el crecimiento de hifas, Con
cepas Streptomyces W47 y W214 que muestran el efecto inhibidor ms
fuerte. Dado que estos estreptomicetos se obtuvieron a partir de
un supresor de Rhizoctonia suelo sugiere que los COV pueden contribuir
a la supresin de la enfermedad. Esta sugerencia necesita ser investigada
ms in situ pero encaja bien con una de las hiptesis iniciales de
Lockwood ( Lockwood, 1977 ) para el papel potencial de los VOC
microbianos en la fungistasis del suelo. Para proporcionar una prueba
ms concluyente del papel de estos COV de Streptomyces en la supresin
de enfermedades en el ecosistema del suelo, se necesitan bioensayos
especficos del suelo donde los productores de COV y el patgeno estn
fsicamente separados. Sin embargo, hay varias limitaciones tcnicas para
lograr esto. Primero, Las cepas utilizadas aqu son bacterias rizosfricas
que necesitan ser posicionadas en su contexto ecolgico (la rizsfera) para
proporcionar resultados significativos. Dada la necesidad de la
localizacin de las cepas de Streptomyces en la rizosfera, donde tambin
el patgeno coloniza e infecta, no ha sido posible an separar fsicamente
las cepas de Streptomyces del patgeno fngico. Esto se debe en parte al
crecimiento prolfico de este hongo en particular. La separacin fsica in
situ es necesaria para excluir un posible papel de mecanismos distintos de
los COV. Un enfoque alternativo sera generar mutantes dirigidos al sitio
de las cepas de Streptomyces que no producen uno o ms de los VOC
especficos identificados en este estudio. La comparacin de la actividad
de estos mutantes con sus cepas de tipo salvaje entonces resolvera ms
conclusivamente el papel de los VOC especficos en la supresin de la
enfermedad in situ . Sin embargo, para este enfoque alternativo todava
no hemos sido capaces de generar mutantes ya que muchas especies /
cepas de Streptomyces medioambientales no son o muy difciles de
acceder para modificacin gentica.
Varios estudios han descrito actividad antifngica por VOCs bacterianos,

sin embargo, pocos han identificado una sola o mezclas de VOCs
responsables de la actividad antifngica ( Kai et al., 2007 ; Wang et al.,
2013 ). Para Pseudomonas , se encontr que seis COV (ciclohexanal,
decanal, 2-etil 1-hexanol, nonanal, benzotiazol y trisulfuro de dimetilo)
inhiban el crecimiento micelial y la germinacin esclertica
de Sclerotinia sclerotiorum a volmenes probados de 100 y 150 l
( Fernando et al. , 2005 ). Con respecto a los COV producidos por
las especies de Streptomyces , Butanona (metilvinilcetona) y disulfuro de
dimetilo para inhibir la germinacin de esporas en Cladosporium
cladosporioides y el crecimiento micelial de Fusarium moniliforme ,
respectivamente ( Herrington et al., 1987 ; Wang et al., 2013 ). Aqu
hemos demostrado que dos de cada cinco COV detectados
para Streptomyces cepas W47 y W214 (metil 2-metilpentanoato y 1,3,5-
tricloro-2-metoxibenceno), as como la mezcla de estos COVs exhibieron
actividad antifngica, aunque a alto Concentraciones. El VOC 1,3,5-
tricloro-2-metoxibenceno inhibi completamente el crecimiento de
hongos y caus la melanizacin de las hifas de hongos. El 1,3,5-tricloro-2-
metoxibenceno tambin se conoce como 2,4,6-tricloroanisol (TCA) y
provoca un sabor desagradable en el vino, Caf y agua ( Spadone et al.,
1990 , Jensen et al., 1994 ). El anisol producido por S. albulus ha sido
recientemente descrito para la actividad contra S. sclerotiorum y F.
oxysporum ( Wu et al., 2015 ). Derivados del anisol han sido descritos
como producidos por bacterias y hongos ( Mauriello et al., 2004 , Blom et
al., 2011 ), pero an no se ha atribuido ninguna funcin a este VOC
especfico. A nuestro entender, esta es la primera vez que se describe el
1,3,5-tricloro-2-metoxibenceno por su actividad antifngica. El 2-
metilpentanoato de metilo de VOC, que tambin exhiba actividad
antifngica, es conocido por otros estreptomicetos, Pero tambin para
este COV no se ha descrito hasta ahora ninguna funcin especfica (
Wilkins y Scholler, 2009 ; Dickschat et al., 2011 ). Tanto para 1,3,5-
tricloro-2-metoxibenceno como para 2-metilpentanoato de metilo, las
concentraciones necesarias para inhibir el crecimiento de hongos fueron
altas. Sin embargo, en la configuracin experimental utilizada aqu, no
sabemos cunto de los COV aplicados realmente contacto con las hifas de
hongos, que parte de las hifas de hongos son los ms sensibles a los COV y
cunto tiempo la exposicin de COV es necesario para ejercer la actividad
antifngica. Estos aspectos sern objeto de futuros estudios. Tambin, La
identificacin de StreptomycesCOV implicados en la promocin del
crecimiento de las plantas no se sigui ms en este estudio, pero un
posible candidato es la acetoin (3-hidroxi-2-butanona) que se detect
para varios aislamientos aqu probados. Acetoin y 2,3-butanediol fueron
los primeros VOCs bacterianos descritos para su papel en la promocin
del crecimiento de las plantas ( Ryu et al., 2003 ). Ms recientemente, se
han identificado otros COVs por su papel en la promocin del crecimiento
de plantas tales como indol, 1-hexanol, pentadecano, 13-tetradecadien-1-
ol, 2-butanona y 2-metil-n-1-trideceno ( Blom et Al., 2011 , Park et al.,
2015 ). Los efectos promotores del crecimiento de las plantas tambin
pueden ser, al menos parcialmente, Debido a la acumulacin de
CO 2 como productos del metabolismo microbiano cuando se utilizan
placas de Petri cerradas ( Kai y Piechulla, 2009 ). Sin embargo, en la
configuracin experimental utilizada en nuestro estudio, el CO 2 parece
tener un papel secundario, ya que dos aislamientos (3A41 y W214) de los
12 aislados no promovieron el crecimiento de las ramas y de las races, y
dos aislados (3A18 y W75.5) no promovieron el crecimiento de las races.
En conclusin, los COV producidos por los estreptomicetos asociados a la

rizsfera son qumicamente diversos y muestran propiedades antifngicas
y promotoras del crecimiento de las plantas. Por lo tanto, el perfil VOC
puede proporcionar un nuevo recurso de nuevos metabolitos y vas
bioqumicas implicadas en la actividad antifngica y la promocin del
crecimiento de las plantas por estreptomicetos. Se identificaron dos VOC
con actividad antifngica, pero queda por determinar si estos compuestos
se producen in situ a las concentraciones biolgicamente
relevantes. Nuestro trabajo demostr adems la utilidad del perfil VOC
para la caracterizacin de estreptomicetos, proporcionando una
herramienta adicional para la delimitacin filogentica de cepas
estrechamente relacionadas.
Contribuciones de autor
VC dise y realiz los experimentos y redact el manuscrito. GV y HZ
ayudado con el aislamiento de la Actinobacteria. VJC ayud con la
caracterizacin molecular de los aislados de Streptomyces . VC, RM y DE
analizaron los datos de GC-MS. JR supervis el trabajo y ayud con el
diseo experimental y la escritura. Todos los autores revisaron el
manuscrito y la presentacin aprobada.
Declaracion de conflicto de interes

Los autores declaran que la investigacin se realiz en ausencia de
relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un
posible conflicto de intereses.
Expresiones de gratitud
Damos las gracias a Jacques Davies por su ayuda con el GC-MS. Este
manuscrito es la publicacin nmero 5937 del Instituto Holands de
Ecologa (NIOO-KNAW). Los autores tambin reconocen el apoyo
financiero de la Organizacin Neerlandesa para la Investigacin Cientfica
(NWO) y el Consorcio de Rendimiento Mejorado de Plantas, que forma
parte de la Iniciativa de Genmica de los Pases Bajos (NGI).
Material suplementario
El material suplementario para este artculo se puede encontrar en lnea
en: http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01081
Referencias
Anderson, AS, y Wellington, EMH (2001). La taxonoma
de Streptomyces y gneros relacionados. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51,
797 - 814. Doi: 10.1099 / 00207713-51-3-797
PubMed Resumen | CrossRef Texto completo | Google Acadmico
Bailly, A., y Weisskopf, L. (2012). El efecto modulador de los voltiles

bacterianos sobre el crecimiento de las plantas: conocimientos actuales y
desafos futuros. Seal de planta. Behav. 7, 79 - 85. Doi: 10.4161 /
psb.7.1.18418
Brdy, J. (2005). Metabolitos microbianos bioactivos. J. Antibiot. 58, 1 -

26. Doi: 10.1038 / ja.2005.1

Bitas, V., Kim, HS, Bennett, JW, y Kang, S. (2013). Fumar los microbios:
diversos roles de los compuestos orgnicos voltiles microbianos en la
salud de las plantas. Mol. Planta Microbio Interact. 26, 835 - 843. Doi:
10.1094 / MPMI-10-12-0249-CR
Blom, D., Fabbri, C., Connor, EC, Schiestl, FP, Klauser, DR, Boller, T., et
al. (2011). La produccin de voltiles moduladores del crecimiento de las
plantas est generalizada entre las bacterias de la rizsfera y depende
fuertemente de las condiciones de cultivo. Reinar. Microbiol. 13, 3047 -
3058. Doi: 10.1111 / j.1462-2920.2011.02582.x
Boukaew, S., Plubrukam, A., y Prasertsan, P. (2013). Efecto de sustancias

voltiles de Streptomyces philanthi RM-1-138 sobre el crecimiento
de Rhizoctonia solani en hojas de arroz. BioControl 58, 471 - 482. Doi:
10.1007 / s10526-013-9510-6
CrossRef Texto completo | Google Acadmico
Chapelle, E., Mendes, R., Bakker, PA, y Raaijmakers, JM (2015). Invasin

fngica del microbioma de la rizsfera. ISME J . Doi: 10.1038 /
ismej.2015.82. [Epub delante de la impresin].
Claessen, D., Rozen, DE, Kuipers, OP, Sgaard-Andersen, L., y van Wezel,
GP (2014). Soluciones bacterianas para la multicelularidad: un cuento de
biofilms, filamentos y cuerpos fructferos. Nat. Rev. Microbiol. 12, 115 -
124. Doi: 10.1038 / nrmicro3178
Cruz-Morales, P., Vijgenboom, E., Iruegas-Bocardo, F., Girard, G., Yez-

Guerra, LA, Ramos-Aboites, HE, et al. (2013). La secuencia del genoma
de Streptomyces lividans 66 revela un nuevo sistema biosinttico de
pptido dependiente de tRNA dentro de una isla genmica relacionada
con el metal. Genome Biol. Evol. 5, 1165 - 1175. Doi: 10.1093 / gbe /
evt082
Deangelis, KM, Brodie, EL, Desantis, TZ, Andersen, GL, Lindow, SE y

Firestone, MK (2009). Respuesta progresiva selectiva de la comunidad
microbiana del suelo a races de avena silvestre. ISME J. 3, 168-178. Doi:
10.1038 / ismej.2008.103
Dickschat, JS, Bruns, H., y Riclea, R. (2011). Nuevos steres metlicos de

cidos grasos del actinomiceto Micromonospora aurantiaca . Beilstein J.
Org. Chem. 7, 1697 - 1712. Doi: 10.3762 / bjoc.7.200
Effmert, U., Kalders, J., Warnke, R., y Piechulla, B. (2012). Interacciones

mediadas voltiles entre bacterias y hongos en el suelo. J. Chem. Ecol. 38,
665 - 703. Doi: 10.1007 / s10886-012-0135-5
Felsenstein, J. (1985). Lmites de confianza en las filogenias: un enfoque

utilizando el bootstrap. Evolution 39, 783 - 791.
Google Acadmico
Fernando, WGD, Ramarathnam, R., Krishnamoorthy, AS, y Savchuk, SC

(2005). Identificacin y uso de potenciales compuestos orgnicos voltiles
antifngicos en el control biolgico. Soil Biol. Biochem. 37, 955 - 964. Doi:
10.1016 / j.soilbio.2004.10.021

Garbeva, P., Hordijk, C., Gerards, S., y de Boer, W. (2014). Voltiles
producidos por la bacteria mycfaga del suelo Collimonas. FEMS
Microbiol. Ecol. 87, 639 - 649. Doi: 10.1111 / 1574-6941.12252
Gerber, NN (1968). La geosmina, a partir de microorganismos, es -1, 10-

dimetil-9-decalol. Tetrahedron Lett. 25, 2971 - 2974. Doi: 10.1016 /
S0040-4039 (00) 89625-2
Girard, G., Traag, BA, Sangal, V., Mascini, N., Hoskisson, PA, Goodfellow,
M., et al. (2013). Un nuevo marcador taxonmico que discrimina entre los
actinomicetos morfolgicamente complejos. Abierto Biol. 3: 130073. Doi:
10.1098 / rsob.130073
Goodfellow, M. (2012). "Filo XXVI. Actinobacteria phyl. Nov., "En el

Manual de Bergey de Bacteriologa Sistemtica, 2da ed. , Eds M.
Goodfellow, P. Kmpfer, H.-J. Busse, ME Trujillo, K.-I. Suzuki, W.
Ludwig y WB Whitman (Nueva York, NY: Springer), 1-2083.
Guo, Y., Zheng, W., Rong, X. y Huang, Y. (2008). Home Idiomas Ingresar
a Epistemonikos Bsqueda avanzada Una filogenia multilocus de
la Streptomyces griseus 16S rRNA genes clado: el uso de multilocus
secuencia de anlisis para streptomycete sistemtica. Int. J.
Syst. Evol. Microbiol. 58, 149 - 159. Doi: 10.1099 / ijs.0.65224-0
Hagai, E., Dvora, R., Havkin-Blank, T., Zelinger, E., Porat, Z., Schulz, S.,
et al. (2014). La induccin de la motilidad superficial, la atraccin y el
autostop entre especies bacterianas promueven la dispersin en
superficies slidas. ISME J. 8, 1147 - 1151. Doi: 10.1038 / ismej.2013.218
Herrington, PR, Crakz, JT, y Sheridan, JE (1987). Metil vinil cetona: un

inhibidor fungisttico voltil de Streptomyces griseoruber . Oferta de
Suelo. Biochem. 19, 509 - 512. Doi: 10.1016 / 0038-0717 (87) 90092-7
Hopwood, DA (2007). Streptomyces en la naturaleza y la medicina: Los

fabricantes de antibiticos. Nueva York, NY: Oxford University Press.
Google Acadmico
Hopwood, DA, Kieser, T., Wright, HM y Bibb, MJ (1983). Plasmidos,

recombinacin y cartografa cromosmica en Streptomyces lividans 66. J.
Gen. Microbiol . 129, 2257 - 2269. Doi: 10.1099 / 00221287-129-7-2257
PubMed Resumen | CrossRef Texto completo
Hornby, D. (1983). Suelos supresores. Annu. Rev. Phytopatol. 21, 65 -

85. Doi: 10.1146 / annurev.py.21.090183.000433
Jensen, SE, Goatcher, LJ, Perley, T., Kenefick, S., y Hrudey, SE

(1994). Actinomicetos como un factor en los problemas del olor que
afectan el agua potable del ro Saskatchewan del norte. Agua Res. 28,
1393 - 1401. Doi: 10.1016 / 0043-1354 (94) 90306-9
Jiang, J., He, X. y Cane, DE (2007). Biosntesis de la geosmina odorante

terrosa por una enzima bifuncional Streptomyces
coelicolor . Nat. Chem. Biol. 3, 711 - 715. Doi: 10.1038 /
nchembio.2007.29

Kai, M., Effmert, U., Berg, G., y Piechulla, B. (2007). Los voltiles de los
antagonistas bacterianos inhiben el crecimiento micelial del patgeno de
la planta Rhizoctonia solani . Arco. Microbiol. 187, 351 - 360. Doi:
10.1007 / s00203-006-0199-0
Kai, M., Haustein, M., Molina, F., Petri, A., Scholz, B. y Piechulla, B.
(2009). Voltiles bacterianos y su potencial de
accin. Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 1001 - 1012. Doi: 10.1007 /
s00253-008-1760-3
Kai, M., y Piechulla, B. (2009). La promocin del crecimiento de las

plantas debido a los voltiles de las rizobacterias, un efecto del
CO2? FEBS Lett. 583, 3473 - 3477. Doi: 10.1016 / j.febslet.2009.09.053
Kim, Y.-C., Glick, BR, Bashan, Y. y Ryu, C.-M. (2012). "Mejora de la

tolerancia a la sequa de las plantas por los microbios", en Respuestas de
las plantas al estrs por sequa , ed R. Aroca (Berlin, Heidelberg:
Springer-Verlag), 383-413.
Labeda, DP, Goodfellow, M., Brown, R., Ward, AC, Lanoot, B.,
Vanncanneyt, M., et al. (2012). Estudio filogentico de las especies dentro
de la familia Streptomycetaceae. Antonie Van Leeuwenhoek 101, 73 -
104. Doi: 10.1007 / s10482-011-9656-0
Lane, DJ (1991). 16S / 23S rRNA Sequencing. Chichester: John Wiley &
Sons.
Google Acadmico
Letunic, I., y Bork, P. (2011). Interactive Tree Of Life v2: anotacin en
lnea y visualizacin de rboles filogenticos fcil. Nucleic Acids Res. 39,
W475 - W478. Doi: 10.1093 / nar / gkr201
Lockwood, JL (1977). Fungistasis en suelos. Biol. Rev. 52, 1-43. Doi:

10.1111 / j.1469-185X.1977.tb01344.x
Lommen, A., y Kools, HJ (2012). MetAlign 3.0: mejora del rendimiento

mediante el uso eficiente de los avances en hardware de la
computadora. Metabolomics 8, 719 - 726. Doi: 10.1007 / s11306-011-
0369-1
Mauriello, G., Marino, R., D'Auria, M., Cerone, G. y Rana, GL

(2004). Determinacin de compuestos orgnicos voltiles a partir de
trufas a travs de SPME-GC-MS. J. Chromatogr. Sci. 42, 299 - 305. Doi:
10.1093 / chromsci / 42.6.299
McDonald, D., Price, MN, Goodrich, J., Nawrocki, EP, Desantis, TZ,
Probst, A., et al. (2012). Una taxonoma de Greengenes mejorada con
rangos explcitos para anlisis ecolgicos y evolutivos de bacterias y
arqueas. ISME J. 6, 610 - 618. Doi: 10.1038 / ismej.2011.139
McNeal, KS, y Herbert, BE (2009). Los metabolitos orgnicos voltiles

como indicadores de la actividad microbiana del suelo y los cambios en la
composicin de la comunidad. Soil Sci. A.m. J. 73, 579. doi: 10.2136 /
sssaj2007.0245

Mendes, R., Kruijt, M., de Bruijn, I., Dekkers, E., van der Voort, M.,
Schneider, JH, et al. (2011). Descifrar el microbioma de la rizsfera para
las bacterias supresoras de la enfermedad. Science 332, 1097 - 1100. Doi:
10.1126 / science.1203980
Moore-Landecker, E., y Stotzky, G. (1973). Anomalas morfolgicas de

hongos inducidos por metabolitos microbianos voltiles. Mycologia 65,
519 - 530. Doi: 10.2307 / 3758256
Morath, SU, Hung, R., y Bennett, JW (2012). Compuestos orgnicos

voltiles fngicos: una revisin con nfasis en su potencial
biotecnolgico. Fungal Biol. Rev. 26, 73-83. Doi: 10.1016 /
j.fbr.2012.07.001
Mller, A., Faubert, P., Hagen, M., Zu Castell, W., Polle, A., Schnitzler, JP,
et al. (2013). Perfiles voltiles de hongos-quimiotipificacin de especies y
funciones ecolgicas. Genet Fungal. Biol. 54, 25 - 33. Doi: 10.1016 /
j.fgb.2013.02.005
Murashige, T., y Skoog, F. (1962). Un medio revisado para el crecimiento

rpido y bioensayos con cultivos de tejidos de tabaco. Physiol. Planta. 15,
473 - 497. Doi: 10.1111 / j.1399-3054.1962.tb08052.x
Park, YS, Dutta, S., Ann, M., Raaijmakers, JM, y Park, K.

(2015). Promocin del crecimiento de las plantas por la cepa SS101
de Pseudomonas fluorescens a travs de nuevos compuestos orgnicos
voltiles. Biochem. Biophys. Res. Comun. 461, 361 - 365. Doi: 10.1016 /
j.bbrc.2015.04.039
Piechulla, B., y Degenhardt, J. (2014). La importancia emergente de los

compuestos orgnicos voltiles microbianos. Cell Plant Environ. 37, 811 -
812. Doi: 10.1111 / pce.12254
Ryu, CM, Farag, MA, Hu, CH, Reddy, MS, Kloepper, JW y Pare, PW
(2004). Los voltiles bacterianos inducen resistencia sistmica en
Arabidopsis. Planta Physiol. 134, 1017 - 1026. Doi: 10.1104 /
pp.103.026583
Ryu, CM, Farag, MA, Hu, CH, Reddy, MS, Wei, HX, Pare, PW, et
al. (2003). Los voltiles bacterianos promueven el crecimiento en
Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 4927 - 4932. Doi: 10.1073 /
pnas.0730845100
Saitou, N., y Nei, M. (1987). El mtodo de unin vecina: un nuevo mtodo

para reconstruir rboles filogenticos. Mol. Biol. Evol. 4, 406 - 425.
PubMed Resumen | Google Acadmico
Schmidt, R., Cordovez, V., de Boer, W., Raaijmakers, J., y Garbeva, P.

(2015). Asuntos voltiles en las interacciones microbianas. ISME J. Doi:
10.1038 / ismej.2015.42. [Epub delante de la impresin].

Schulz, S., y Dickschat, JS (2007). Voltiles bacterianos: el olor de los
organismos pequeos. Nat. Pinchar. Rep. 24, 814 - 842. Doi: 10.1039 /
b507392h
Spadone, JC, Takeoka, G., y Liardon, R. (1990). Investigacin analtica de

off-sabor de ro en caf verde. J. Agric. Food Chem. 38, 226 - 233. Doi:
10.1021 / jf00091a050
Stotzky, G., y Schenck, S. (1976). Compuestos orgnicos voltiles y

microorganismos. CRC Crit. Rev. Microbiol. 4, 333 - 382. Doi: 10.3109 /
10408417609102303
Strehmel, N., Hummel, J., Erban, A., Strassburg, K. y Kopka, J.

(2008). Lmites del ndice de retencin para el ajuste de compuestos en el
perfilado de metabolitos GC-MS. J. Chromatogr. B
Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 871, 182 - 190. Doi: 10.1016 /
j.jchromb.2008.04.042
Tamura, K., y Nei, M. (1993). Estimacin del nmero de sustituciones de

nucletidos en la regin de control del ADN mitocondrial en humanos y
chimpancs. Mol. Biol. Evol. 10, 1073 - 1095.
PubMed Resumen | Google Acadmico
Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., y Kumar, S.

(2013). MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis versin
6.0. Mol. Biol. Evol. 30, 2725 - 2729. Doi: 10.1093 / molbev / mst197

Tikunov, YM, Laptenok, S., Hall, RD, Bovy, A., y de Vos, RC
(2012). MSClust: una herramienta para la extraccin no supervisada de
espectros de masas de datos de cromatografa-espectrometra de masas
con alineacin inica. Metabolomics 8, 714 - 718. Doi: 10.1007 / s11306-
011-0368-2
Trefz, P., Koehler, H., Klepik, K., Moebius, P., Reinhold, P., Schubert, JK,
et al. (2013). Las emisiones voltiles de Mycobacterium
aviumsubsp. Paratuberculosis reflejan el crecimiento bacteriano y
permiten la distincin de diferentes cepas. PLoS UNO 8: e76868. Doi:
10.1371 / journal.pone.0076868
Van de Mortel, JE, de Vos, RC, Dekkers, E., Pineda, A., Guillod, L.,
Bouwmeester, K. y col. (2012). Cambios metablicos y transcriptmicos
inducidos en Arabidopsis por la rizobacteria Pseudomonas
fluorescens SS101. Planta Physiol. 160, 2173 - 2188. Doi: 10.1104 /
pp.112.207324
Van Wezel, GP, McKenzie, NL, y Nodwell, JR (2009). Captulo 5.

Aplicacin de la gentica del metabolismo secundario en los
actinomicetos modelo al descubrimiento de nuevos antibiticos . Mtodos
Enzymol. 458, 117 - 141. Doi: 10.1016 / S0076-6879 (09) 04805-8
PubMed Resumen | CrossRef Texto completo
Verhulst, NO, Beijleveld, H., Knols, BG, Takken, W., Schraa, G.,
Bouwmeester, HJ, et al. (2009). La microbiota cutnea cultivada atrae a
los mosquitos de la malaria. Malar. J. 8: 302. Doi: 10.1186 / 1475-2875-8-
302
Vespermann, A., Kai, M., y Piechulla, B. (2007). Los voltiles de

Rhizobacterian afectan el crecimiento de hongos y Arabidopsis
thaliana. Appl. Reinar. Microbiol. 73, 5639 - 5641. Doi: 10.1128 /
AEM.01078-07
Wan, M., Li, G., Zhang, J., Jiang, D., y Huang, H.-C. (2008). Home
Idiomas Ingresar a Epistemonikos Bsqueda avanzada Efecto de las
sustancias voltiles de Streptomyces platensis F-1 en el control de
enfermedades fngicas de las plantas. Biol. Control 46, 552 - 559. Doi:
10.1016 / j.biocontrol.2008.05.015
Wang, Z., Wang, C., Li, F., Li, Z., Chen, M., Wang, Y., et
al. (2013). Actividad fumigante de voltiles de Streptomyces
alboflavus TD-1 contra Fusarium moniliforme Sheldon. J. Microbiol. 51,
477 - 483. Doi: 10.1007 / s12275-013-2586-y
Watve, MG, Tickoo, R., Jog, MM y Bhole, BD (2001). Cuntos

antibiticos se producen por el
gnero Streptomyces ? Arco. Microbiol. 176, 386 - 390. Doi: 10.1007 /
s002030100345
Weller, DM, Raaijmakers, JM, Gardener, BB y Thomashow, LS

(2002). Las poblaciones microbianas responsables de la supresin
especfica del suelo a los patgenos de las plantas. Annu. Rev.
Phytopathol. 40, 309 - 348. Doi: 10.1146 /
annurev.phyto.40.030402.110010
Wilkins, K., y Scholler, C. (2009). Volatalie metabolitos orgnicos de

cepas seleccionadas de streptomyces. Actinomycetologica 23, 27 -
33. Doi: 10.3209 / saj.SAJ230202
Wu, Y., Yuan, J., E, Y., Raza, W., Shen, Q. y Huang, Q. (2015). Efectos de
compuestos orgnicos voltiles de Streptomyces albulusNJZJSA2 en el
crecimiento de dos patgenos fngicos. J. Basic Microbiol . 55, 1104 -
1117. Doi: 10.1002 / jobm.201400906
Zhang, J. (1990). Taxonoma Microbiana. Shanghai: Prensa de la

Universidad de Fudan.
Zoller, HF, y Clark, WM (1921). La produccin de cidos grasos voltiles

por bacterias del grupo disentera. J. Gen. Physiol. 3, 325 - 330. Doi:
10.1085 / jgp.3.3.325

Palabras clave: Actinobacterias, SPME-GC-MS, actividad antifngica, promocin del
crecimiento de las plantas, suelo supresivo
Cita: Cordovez V, Carrion VJ, Etalo DW, Mumm R, Zhu H, van Wezel GP y Raaijmakers
JM (2015) Diversidad y funciones de compuestos orgnicos voltiles producidos por
Streptomyces de un suelo-supresor de la enfermedad. Frente. Microbiol . 6: 1081. Doi:
10.3389 / fmicb.2015.01081
Recibido el: 27 de julio de 2015; Aceptado: 22 de septiembre de 2015;
Publicada: 09 de octubre de 2015.
Editado por:
Stphane Hacquard , Instituto Max Planck para la Investigacin sobre Plantas, Alemania
Revisado por:
Mika Tapio Tarkka , Centro Helmholtz para la Investigacin Ambiental - UFZ,
Alemania
Tomislav Cernava , Universidad Tecnolgica de Graz, Austria
Copyright 2015 Cordovez, Carrin, Etalo, Mumm, Zhu, van Wezel y Raaijmakers. Este
es un artculo de acceso abierto distribuido bajo los trminos de la Licencia de Atribucin
de Creative Commons (CC BY) . Se permite el uso, la distribucin o la reproduccin en
otros foros, siempre que se acredite el autor original o licenciante y se cite la publicacin
original en esta revista, de acuerdo con la prctica acadmica aceptada. No se permite su
uso, distribucin o reproduccin que no cumpla con estos trminos.
* Correspondencia: Jos M. Raaijmakers, Departamento de Ecologa Microbiana, Instituto
Holands de Ecologa (NIOO-KNAW), Droevendaalsesteeg 10, 6708 PB Wageningen,
Pases Bajos, j.raaijmakers@nioo.knaw.nl

Diversidad y Funciones de Compuestos Orgánicos Volátiles Producidos Por

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Diversidad y Funciones de Compuestos Orgánicos Volátiles Producidos Por

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Diversidad y funciones de

1 Departamento de Ecologa Microbiana, Instituto Holands de Ecologa (NIOO-

3 Plant Research International, Business Unit Bioscience, Universidad de Wageningen

y Centro de Investigacin, Wageningen, Pases Bajos

5 Molecular Biotechnology, Instituto de Biologa, Universidad de Leiden, Leiden, Pases

En suelos supresores de enfermedades, las plantas estn

Aqu estudiamos la diversidad y funciones de COV producidos por

Streptomyces VOCs fueron analizados por GC-MS (Agilent GC7890A con

Figura 1. Filamento bacteriano (y arcaico) 10% ms dinmico

Figura 2. rbol filogentico unido a vecinos basado en las

Figura 3. Caracterizacin de Streptomyces aislamientos

Figura 4. Anlisis jerrquico de los perfiles VOC de

Adems, hemos probado si Streptomyces COV podra promover el

Una comparacin de los perfiles VOC de Streptomyces cepas W47 y W214

Figura 7. (A) Perfiles VOC de las cepas W47 y W214 de Streptomyces

Para determinar si el VOC antimictico 1,3,5-tricloro-2-metoxibenceno se

El gnero Streptomyces es bien conocido por la produccin de varios

Varios estudios han descrito actividad antifngica por VOCs bacterianos,

En conclusin, los COV producidos por los estreptomicetos asociados a la

Declaracion de conflicto de interes

PubMed Resumen | CrossRef Texto completo | Google Acadmico

Bailly, A., y Weisskopf, L. (2012). El efecto modulador de los voltiles

PubMed Resumen | CrossRef Texto completo | Google Acadmico

Brdy, J. (2005). Metabolitos microbianos bioactivos. J. Antibiot. 58, 1 -

PubMed Resumen | CrossRef Texto completo | Google Acadmico

PubMed Resumen | CrossRef Texto completo | Google Acadmico

PubMed Resumen | CrossRef Texto completo | Google Acadmico

Boukaew, S., Plubrukam, A., y Prasertsan, P. (2013). Efecto de sustancias

CrossRef Texto completo | Google Acadmico

Chapelle, E., Mendes, R., Bakker, PA, y Raaijmakers, JM (2015). Invasin

PubMed Resumen | CrossRef Texto completo | Google Acadmico

PubMed Resumen | CrossRef Texto completo | Google Acadmico

Cruz-Morales, P., Vijgenboom, E., Iruegas-Bocardo, F., Girard, G., Yez-

PubMed Resumen | CrossRef Texto completo | Google Acadmico

Deangelis, KM, Brodie, EL, Desantis, TZ, Andersen, GL, Lindow, SE y

PubMed Resumen | CrossRef Texto completo | Google Acadmico

Dickschat, JS, Bruns, H., y Riclea, R. (2011). Nuevos steres metlicos de

PubMed Resumen | CrossRef Texto completo | Google Acadmico

Effmert, U., Kalders, J., Warnke, R., y Piechulla, B. (2012). Interacciones

PubMed Resumen | CrossRef Texto completo | Google Acadmico

Felsenstein, J. (1985). Lmites de confianza en las filogenias: un enfoque

Fernando, WGD, Ramarathnam, R., Krishnamoorthy, AS, y Savchuk, SC

CrossRef Texto completo | Google Acadmico

PubMed Resumen | CrossRef Texto completo | Google Acadmico

Gerber, NN (1968). La geosmina, a partir de microorganismos, es -1, 10-

CrossRef Texto completo | Google Acadmico

PubMed Resumen | CrossRef Texto completo | Google Acadmico

Goodfellow, M. (2012). "Filo XXVI. Actinobacteria phyl. Nov., "En el

PubMed Resumen | CrossRef Texto completo | Google Acadmico

Herrington, PR, Crakz, JT, y Sheridan, JE (1987). Metil vinil cetona: un

CrossRef Texto completo | Google Acadmico

Hopwood, DA (2007). Streptomyces en la naturaleza y la medicina: Los

Hopwood, DA, Kieser, T., Wright, HM y Bibb, MJ (1983). Plasmidos,

PubMed Resumen | CrossRef Texto completo

Hornby, D. (1983). Suelos supresores. Annu. Rev. Phytopatol. 21, 65 -

CrossRef Texto completo | Google Acadmico

Jensen, SE, Goatcher, LJ, Perley, T., Kenefick, S., y Hrudey, SE

CrossRef Texto completo | Google Acadmico

Jiang, J., He, X. y Cane, DE (2007). Biosntesis de la geosmina odorante

PubMed Resumen | CrossRef Texto completo | Google Acadmico

PubMed Resumen | CrossRef Texto completo | Google Acadmico

PubMed Resumen | CrossRef Texto completo | Google Acadmico

Kai, M., y Piechulla, B. (2009). La promocin del crecimiento de las

PubMed Resumen | CrossRef Texto completo | Google Acadmico