2.1.2.

REGULACIN DEL INICIO DE TRANSCRIPCIN POR PROTENAS REGULADORAS

Como ya apuntamos, podemos encontrar dos tipos de fenmenos:

induccin: el desencadenante del ajuste se denomina inductor;

represin: el desencadenante del ajuste se denomina correpresor.

En general, los desencadenantes de la respuesta se llaman efectores, y suelen ser molculas de

pequeo tamao. Si estamos tratando con respuestas adaptativas metablicas, podemos hacer la
siguiente generalizacin:

El inductor suele ser el sustrato de una ruta catablica, o una molcula muy semejante al
sustrato natural.

El correpresor suele ser el producto de una ruta biosinttica, o una molcula parecida.

El funcionamiento de estas molculas en su papel de efectores no depende de su interaccin metablica

en la ruta correspondiente. Lo que hacen los efectores es interactuar con protenas reguladoras
especficas para cada sistema (de cada opern o de cada grupo de operones). Y, a su vez, las protenas
reguladoras interactan con una zona del opern cercana al promotor Es frecuente que muchas
protenas reguladoras compartan un dominio tridimensional caracterstico denominado hlice-giro-
hlice, que las capacita para reconocer determinadas secuencias del ADN.

Tanto la induccin como la represin gnicas de funciones pueden deberse a su vez a:

controles positivos;

controles negativos.

As pues, en la regulacin del sistema tenemos varios tipos de elementos:

a. efectores: pequeas molculas que informan del ambiente exterior;

b. un elemento regulatorio que acta en trans (a distancia): un gen regulador que codifica una
protena cuya nica funcin consiste en controlar la expresin (a nivel de inicio de transcripcin)
de un opern de genes estructurales.

c. genes estructurales (normalmente agrupados en operones, donde los genes se contranscriben

en forma de ARNm policistrnico). Estos genes pueden codificar protenas estructurales, o
protenas enzimticas o simplemente transcribirse a ARNr o ARNt.

La funcin controladora de la protena reguladora se ejerce por su interaccin con secuencias especficas
al comienzo del opern, cerca del promotor. Estas secuencias son, pues, elementos que actan
en cis dentro del circuito regulatorio: esto significa que su efecto depende de que estn ligadas
genticamente con los genes estructurales que van a ser sometidos a control gentico. Son secuencias
que no codifican productos difusibles que pudieran actuar a distancia.

Cmo se puede distinguir y discriminar entre las funciones de un regulador que acta en trans (a
distancia) de una secuencia en cis? Esto se puede lograr a partir de la observacin de los efectos
fenotpicos de sus respectivas mutaciones y de los tests de complementacin (aunque las bacterias son
haploides, se pueden realizar ensayos de complementacin gentica en diploides parciales por medio de
algn sistema de transferencia gentica, como por ejemplo el uso de conjugacin con factores F-primas
(F'): vase tema 27):

1. La mutacin inactivante de un gen regulador tiene efectos recesivos en trans y pleiotrpicos,

que varan segn que el control sea de tipo positivo o negativo:

a. en el caso de control negativo, la mutacin tiene efectos constitutivos;

b. en el caso de control positivo, la mutacin tiene efectos ininducibles.

2. La mutacin de un operador tiene efectos dominantes en cis.

3. Por otro lado, la inactivacin mutacional de un gen estructural simplemente priva a la clula de
la funcin correspondiente.

Comparemos ahora las regulaciones genticas de tipo positivo y negativo:

1. Control negativo:el sistema se expresa a menos que sea desconectado por la accin de una
protena reguladora, a la que se denomina represor. Dentro de este control podemos distinguir,
a su vez:

a. Control negativo con efectos inductores (ej: en el opern lac): el represor, per se es
activo, pero se inactiva en presencia del inductor.

b. Control negativo con efectos represores (ej: en el opern trp):el represor, per se es
inactivo (aporrepresor), pero en presencia del correpresor se activa (adquiere su
capacidad funcional), y es entonces cuando reprime al opern estructural.

2. Control positivo: los genes estructurales no se transcriben (o en todo caso lo hacen a un nivel
basal bajo) a no ser que exista una protena reguladora activa llamada apoinductor o activador.
Tambin aqu puede haber dos categoras:

a. Control positivo por induccin: la protena activadora, por s misma es inactiva, pero
queda activada cuando se le une el inductor.

b. Control positivo por represin: la protena activadora, per se, es activa, pero se inactiva
cuando se le une el correpresor.

Obsrvese, pues, que el estado activo del opern vara segn que se trate de un sistema inducible o
reprimible:

en los sistemas inducibles, el estado activo es el inducido;

en los sistemas reprimibles, el estado activo es el desreprimido.

2.1.2.1. EJEMPLO DE CONTROL NEGATIVO E INDUCIBLE: Regulacin del opern lac deE. coli

Iniciamos ahora el estudio de los controles genticos en un sistema paradigmtico: el

opern lac(metabolismo de la lactosa) del colibacilo (Escherichia coli), que histricamente fue el primero
en investigarse (por Jacob y Monod, aos 50, y que les hizo ganar el premio Nobel en 1965). En este
epgrafe abordaremos el comportamiento de este opern bajo regulacin negativa (incorporando
detalles ulteriores al trabajo de Jacob y Monod). Ms adelante (2.1.2.3), veremos que el
opern lactambin posee un control positivo.

El opern lac, est constituido por:

tres genes estructurales:

o Gen lacZ: codifica la -galactosidasa (tetrmero de un polipptido de 116 kDa);

o Gen lacY: determina la -galactsido permeasa (46 KdA); protena de membrana que
realiza el simporte de H+ y lactosa.

o GenlacA: determina -galactsido acetilasa, prescindible y de papel desconocido.

un promotor para la unin de la holoenzima de la ARN polimerasa

un elemento regulador en cis: el operador, parcialmente superpuesto con el promotor

y est controlado por el producto de un gen situado cerca del opern (pero que no forma parte de l;
este es el elemento regulatorio en trans): el gen lacI, que codifica un represor que por s mismo es activo
como tal. El polipptido de 38 kDa producido por este gen se agrega espontneamente formando
tetrmeros, que son la forma funcional del represor.

Veamos el funcionamiento del sistema:

Mientras en el medio no exista lactosa, el tetrmero del represor presenta una alta afinidad de
unin hacia las secuencias del operador, y as impide que la ARN polimerasa reconozca y se una
al promotor; por lo tanto, no existe apenas transcripcin del opern de la lactosa. La actividad
de unin al operador reside en el extremo N-terminal, que presenta un diseo caracterstica en
hlice-bucle-hlice. El operador al que se une presenta una secuencia palindrmica imperfecta.

Si en el medio existe lactosa (u otro azcar de tipo -galactsido) como nica fuente de C, dicho
azcar acta como inductor del opern: se une a una zona de las subunidades del tetrmero del
represor (codificado por lacI), con lo que se produce un cambio conformacional alostrico del
represor; con ello disminuye la afinidad del tetrmero hacia la secuencia del operador, por lo
que ahora la ARN polimerasa puede iniciar la transcripcin. El represor inactivo "emigra" a zonas
inespecficas y aleatorias del ADN, distintas del operador.

Algunas ideas adicionales

En realidad el inductor natural no es exactamente la lactosa, sino el ismero alolactosa, que se

origina nada ms entrar aquella a la clula.

En el laboratorio se suelen denominar los llamados inductores gratuitos: se trata de molculas

artificiales (aunque b -galactsidos) que si bien pueden interaccionar con el represor, no pueden
ser metabolizadas (a diferencia de la lactosa). Un ejemplo es el llamado IPTG (isopropil-b -D-
tiogalactsido).

Se ha visto que el opern lac tiene de hecho tres secuencias de tipo operador. La denominada
O1 es la "clsica", parcialmente superpuesta con el promotor, pero tambin hay que contar con
la O2, centrada hacia la coordenada +440 del ARNm, y la O3, bastante aguas arriba respecto del
 promotor (centrada hacia -82). Se ha propuesto que los tetrmeros del represor reconocen
simultneamente dos de estas secuencias, obligando al ADN a curvarse de modo pronunciado,
evitando as que pueda actuar la ARN-polimerasa.

En Ingeniera gentica se suele usar a menudo componente del opern lac. Por ejemplo, se
puede recurrir al promotor lac (bien sea en su versin silvestre o en algn mutante) para lograr
la expresin de ciertos genes. Uno de los usos ms extendidos es el del gen lacZ, determinante
de la b -galactosidasa. Cuando las clulas de Escherichia coli silvestres respecto de lacZcrecen en
presencia del X-gal (un galactsido artificial), las colonias tiene un aspecto azul, debido a que
la b -galactosidasa transforma dicho X-gal en una sustancia de color azul. Pero si el gen lacZ est
inactivado (p. ej., porque tenga una deleccin o una insercin), las colonias son de color blanco.

Este tipo de dispositivo regulador es propio de rutas catablicas, donde el principio de economa debe
garantizar que las enzimas de la ruta slo se induzcan en presencia del sustrato adecuado.

Como ya apuntamos ms arriba, varios operones distintos pueden estar sometidos al mismo tipo de
regulacin por un determinado estmulo ambiental, constituyendo una unidad de regulacin
denominada reguln. Por lo tanto un mismo tipo de protenas represoras (y en general, un mismo tipo
de protenas reguladoras) pueden interactuar sobre operadores correspondientes a diferentes
operones, situados en lugares muy distintos del cromosoma. Cada tipo de molcula reguladura (ya sea
represor o -en el caso de la regulacin positiva- ya sea activador) reconoce un tipo de secuencia
caracterstica en el ADN, situada por lo general cerca del promotor.

Los operadores pueden estar situados de forma distinta en relacin con los correspondientes
promotores sobre los que influyen:

en posicin 3' respecto del promotor;

en posicin 5' respecto del promotor;

superpuestos parcialmente con el promotor;

incluso algunos forman parte de la regin inicial de ADN que se llega a transcribir.

Algunos operones, como el gal de Escherichia coli poseen dos promotores, dos operadores, y estn
sometidos a dos protenas represoras diferentes

2.1.2.2. EJEMPLO DE CONTROL NEGATIVO Y REPRIMIBLE: el caso del opern trp de E. coli

La regulacin negativa y reprimible es muy apropiada y econmica para "desconectar" la transcripcin

de los genes de rutas biosintticas de intermediarios metablicos (como aminocidos, bases
nitrogenadas y vitaminas) cuando los productos finales de estas rutas estn disponibles a la bacteria a
partir del medio de crecimiento. En estos sistemas, a diferencia de la regulacin de operones
catablicos, la protena reguladora es inactiva en s misma, por lo que recibe el nombre deaporrepresor.
El efector que desencadena la represin se denomina correpresor, y suele ser la sustancia del medio
equivalente al producto final de la ruta biosinttica. La unin del correpresor con el aporrepresor genera
un complejo denominado represor activo.
El opern trp ded Escherichia coli est compuesto por:

Cinco genes estructurales en la secuencia trpEDCBA. Codifican cinco polipptidos que a su vez
constituyen tres enzimas implicadas en el paso de corsmico a triptfano.

Promotor

Operador (superpuesto al promotor).

A la zona del operador se pueden unir dmeros del elemento regulatorio en trans: un represor
codificado por el gen trpR (que est lejos del opern estructural).

Entre el promotor y el inicio del primer gen estructural existe una zona regulatoria compleja (lder ms
atenuador) que interviene en un tipo de regulacin distinta que estudiaremos ms adelante. Como ya
dijimos, son muy frecuentes los sistemas genticos sometidos a varios niveles de regulacin. La
biosntesis del triptfano posee tres niveles distintos:

inhibicin metablica feed-back (alostrica) de los enzimas por parte del producto final de la
ruta (el triptfano);

el triptfano procedente del medio acta como correpresor que activa al apo-represor,
originalmente inactivo, producido por el gen regulador (trpR);

atenuacin (que veremos ms adelante), consistente en la terminacin prematura de la

transcripcin a nivel de la secuencia lder del ARNm.

As pues, en esta apartado consideraremos slo el funcionamiento del sistema trp en cuanto al
mecanismo de represin-desrepresin:

En un medio pobre en aminocido triptfano: el gen trpR se expresa: se sintetiza el

aporrepresor inactivo, por lo que la ARN polimerasa puede transcribir el opern de genes
estructurales (trpEDCBA). Hay sntesis de las enzimas del opern a sus niveles desreprimidos.

En un medio rico en triptfano: el gen trpR se expresa igualmente: se sintetiza aporrepresor

inactivo, pero al unirse a dos molculas de triptfano que la bacteria ha captado del medio se
produce un cambio de conformacin que genera el represor activo (aporrepresor +
correpresor): ahora reconoce y se une a la secuencia del "operador" (que est solapado con el
promotor). As se impide la transcripcin del opern, aunque no totalmente. Esto da lugar al
nivel de expresin basal o reprimido (que en el caso de este opern representa 1/60 del nivel
desreprimido).

Adems, en medio rico en triptfano, el gen regulador trpR se ve reprimido por su propio producto
(aporrepresor + triptfano). Estamos ante un ejemplo de regulacin autgena: el nivel de represor est
autocontrolado:

Si existe demasiado represor, se impide la sntesis de ms represor;

Si existe poco represor se posibilita la transcripcin del gen trpR.

2.1.2.3. CONTROLES POSITIVOS

Algunos operones bacterianos poseen promotores tales que no pueden ser usados eficientemente por
la ARN polimerasa de forma directa para el inicio de la transcripcin, sino que adems, requieren
protenas auxiliares activadoras. Es decir, la transcripcin de estos operones no ocurre (o en todo caso
ocurre a un nivel basal bajo), a no ser que la protena activadora se una a zonas del ADN cercanas al
promotor (normalmente al lado 5' respecto del promotor). Este tipo de promotores carecen de las
secuencias tpicas -35 y -10 a las que ya hemos aludido anteriormente

Como ejemplo de regulacin positiva del inicio de transcripcin estudiaremos la que existe en el
opern lac de E. coli:

Para comenzar, recordemos el comportamiento de una poblacin de esta bacteria cuando en su medio
de cultivo existen dos fuentes de carbono: glucosa y lactosa. Como ya sabemos, se da un crecimiento en
dos fases llamado crecimiento diuxico: durante una primera fase, las bacterias aprovechan solamente
la fuente ms rica de carbono (la glucosa), creciendo de modo exponencial durante unas cuantas
generaciones, hasta que agotan esta glucosa. A continuacin se entra en una corta fase de tipo
estacionario, que conduce a una nueva fase de crecimiento exponencial (aunque con un
coeficiente m menor que el de la fase exponencial anterior) debido a que en sta las bacterias han
pasado a metabolizar la lactosa.

Mientras exista glucosa en el medio de cultivo, no se degrada la lactosa, debido al fenmeno conocido
como "represin catablica": el catabolismo de la glucosa "impide" de alguna manera que se expresen
los genes del opern de la lactosa. Pero una vez que la glucosa se agota, el opern lac se activa y se
expresa: se sintetizan las enzimas que permiten metabolizar la lactosa. La fase estacionaria representa el
tiempo que tardan las bacterias en "conectar" y expresar los genes del catabolismo de la lactosa.

El nombre de "represin catablica" se puso en un momento en el que se desconoca la base molecular

de su funcionamiento. A pesar de que sigamos usando este nombre por motivos histricos, hoy
sabemos que este fenmeno es la manifestacin de un proceso de regulacin gentica positiva. A
continuacin pasamos a describirlo a nivel molecular (consultar esquema):

En breves palabras, lo que ocurre es que en presencia de una fuente rica de carbono (como es la
glucosa) el mecanismo de regulacin positiva del opern lac se inactiva. Por contra, en ausencia de
glucosa y en presencia de la lactosa, este mecanismo es funcional, lo que permite la estimulacin del
inicio de la transcripcin del opern.

Elementos del circuito regulatorio:

gen crp: codifica la protena regulatoria: sintetiza un polipptido que forma espontneamente
dmeros, constituyendo la denominada protena relacionada con la represin catablica (CRP),
tambin conocida como protena que une AMPc (CAP). Tal como es sintetizada por el gen crp, la
protena CAP es inactiva (apoinductor inactivo). Pero cuando la bacteria posee niveles
adecuados de AMPc (que acta como inductor), ste se une a la CAP, lo que conduce a que el
dmero cambie de conformacin: en esta nueva configuracin el complejo CAP-AMPc reconoce
una secuencia palindrmica cercana al promotor del opern lac (hacia su lado 5'), y acta como
activador del inicio de transcripcin de este opern.
 gen cya: codifica la adenilato-ciclasa, enzima que convierte el ATP en AMPc.

opern lac: a la descripcin que ya dimos, solamente aadir que a la izquierda (o sea, al lado 5'o
"aguas arriba") del promotor existe una secuencia palindrmica caracterstica, que como
acabamos de ver es el lugar de reconocimiento del complejo activador CAP-AMPc.

Veamos, pues, el funcionamiento del circuito regulatorio:

Ante todo, hay que tener presente que el nivel intracelular de AMPc est en relacin inversa con la
velocidad de crecimiento de la bacteria. A su vez, la velocidad de crecimiento est en relacin directa
con la "riqueza" de la fuente de C.

En presencia de glucosa (fuente rica de C): como se recordar, en Enterobacterias la glucosa es

transportada por el sistema de fosfotransferasa (sistema PTSGLC, un ejemplo tpico de transporte
activo acoplado a translocacin de grupos). Como es sabido, en este sistema hay dos enzimas
especficas del azcar a nivel de membrana, que reciben secuencialmente el fosfato (P), que a su
vez ser transferido a la glucosa, que de esta forma entra al citoplasma. Mientras exista glucosa,
el sistema PTSGLC estar funcionando, de modo que apenas habr nivel de E-IIAGLC fosforilada,
porque rpidamente el fosfato es transferido a la glucosa en su trnsito por la membrana (bajo
E-IIGLC~P). Ello supone una seal que inhibe a la enzima adenilato-ciclasa. Esto supone que en
presencia de glucosa, los niveles de AMPc son bajos. Por lo tanto, el apoinductor CAP, aunque se
est sintetizando, permanece inactivo, ya que al no haber apenas AMPc no puede cambiar de
conformacin. Esta es la base molecular del fenmeno de "represin catablica": obsrvese que
en realidad no es una autntica represin, sino que se trata de la no activacin de la protena
activadora, debida en ltima instancia al catabolismo de la glucosa. Adems, la presencia de E-
IIA sin fosforilar inhibe directamente a la b-galactsido permeasa que pueda haber en la
membrana, por lo que tampoco la lactosa externa puede entrar a la clula.

En ausencia de glucosa: el sistema PTSGLC no est transportando glucosa, por lo que ahora s hay
altos niveles de E-IIAGLC (y bajos de la versin fosforilada). El sistema ahora no enva la seal
inhibidora de la actividad adenil-ciclasa : se sintetizan niveles elevados de AMPc. ste se une a
los dmeros de CAP (=CRP); el concomitante cambio de conformacin permite al complejo CAP-
AMPc reconocer su secuencia-diana palindrmica cerca del promotor de lac. En esta interaccin
con su secuencia-diana, la CAP obliga al ADN a curvarse unos 90o Ahora la CAP interacciona con
las subunidades a de la ARN polimerasa, de modo que ahora s puede efectuar el inicio de la
transcripcin con gran eficiencia.

As pues, hemos completado el estudio de la regulacin del opern lac. En resumidas cuentas, cabe
resaltar que se trata de un opern sometido a dos tipos de controles del inicio de la transcripcin:

regulacin negativa, con induccin en presencia de lactosa

regulacin positiva, por activacin

Por lo tanto, el opern lac, para que pueda transcribirse a pleno rendimiento requiere que se
cumplandos condiciones simultneamente:
 1. No debe haber en el medio una fuente ms rica de azcar, como la glucosa (que libera la
"represin catablica" por el mecanismo de regulacin positiva a travs de CAP)

2. Debe existir el inductor exgeno (la lactosa), que inactiva el mecanismo de regulacin negativa.

En Enterobacterias, lo que acabamos de describir para el opern lac lo podemos hacer extensivo a otros
operones correspondientes al catabolismo de otras fuentes de C ms pobres que la glucosa. Es decir,
mientras exista glucosa en el ambiente de la bacteria, sta ser usada en primer lugar, de modo que
mientras se metaboliza est operando el fenmeno de "represin catablica". Pero una vez agotada, y
suponiendo que exista una fuente alternativa de C, sta pasar a ser usada, merced a la activacin
gentica mediada por el complejo CAP-AMPc.

Ejemplos de otros operones controlados positivamente por CAP-AMPc:

opern ara (del catabolismo de la arabinosa);

opern gal (del catabolismo de la galactosa);

opern mal (del catabolismos de la maltosa).

Este conjunto de operones diferentes que estn regulados por la protena CAP se denomina reguln
CAP.

En otras bacterias el fenmeno de represin catablica no depende de AMPc-CAP, sino que la

regulacin positiva de operones catablicos de azcares distintos de la glucosa est mediada por
protenas activadoras diferentes.

Concluiremos nuestro estudio de los controles genticos del inicio de la transcripcin aludiendo
brevemente a algunas de las variantes que podemos encontrar en los modelos de operones bacterianos:

operones con ms de un promotor o/y operador, cada uno de los cuales funciona en respuesta a
un tipo de estmulo o situacin ambiental diferente, mediatizado a su vez por distintos tipos de
protenas reguladoras.

operones con promotores internos, situados dentro de la porcin transcribible, y que responden
a una regulacin diferente del promotor principal (colocado al inicio del opern).

operones con terminadores de transcripcin en las regiones intercistrnicas. Permiten

"dosificar" la proporcin relativa de los productos codificados por cada gen del opern, cuando
esta dosis no tiene por qu ser equimolecular.

pares de operones que se transcriben en sentidos opuestos entre s, y que usan un mismo
promotor divergente.

protenas reguladoras que pueden actuar como activadoras o como represoras, dependiendo de
las condiciones ambientales. Ejemplo: el reguln mal (del catabolismo de la maltosa) consta de
cuatro operones que estn controlados por el producto del gen malT. En ausencia de maltosa, el
 producto acta como represor de los operones mal. En presencia de maltosa, la protena MalT
cambia de conformacin y se convierte en activador de la transcripcin de esos operones.

No podemos olvidar aqu un tipo de operones transcribibles por holoenzimas de la ARN-polimerasa con
subunidades s alternativas a la "estndar" s70 que requieren para su transcripcin eficiente la
colaboracin de protenas activadoras especiales que reconocen secuencias de ADN situadas a bastante
distancia aguas arriba respecto del respectivo promotor. Por ejemplo, en muchas bacterias Gram-
negativas hay operones con un tipo de promotor especial (cuyas secuencias conservadas, centradas em
-24 y -12 son diferentes a las citadas hasta ahora) reconocido slo por la versin de la ARN-polimerasa
provista de la subunidad s54. Pues bien, para la transcripcin de este tipo de operones (llamados ntr) se
requiere la concurrencia de la protena reguladora NtrC fosforilada, que reconoce una secuencia
palindrmica a unas 100 pb aguas arriba del promotor. Al parecer, la unin de oligmeros de NtrC~P a
sus secuencias de reconociemiento hace que el ADN se curve, de modo que esas NtrC~P hacen contacto
con la ARN-polimerasa, y tras gastar ATP ayudan en el inicio de la transcripcin.