You are on page 1of 60

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA

SELVA

FACULTAD DE ZOOTECNIA

DEPARTAMENTO ACADMICO DE CIENCIAS PECUARIAS

MICROBIOLOGA ANIMAL

VIROLOGA BSICA

AUTOR

M.V. JORGE TURUPO CALCINA

Tingo Mara Per.

2016
Caractersticas generales, estructura y taxonoma viral

Generalidades

Los virus son mucho ms pequeos que las clulas procariontes o


eucariontes En general, a diferencia de las clulas, los virus tienen una
estructura simple y esttica, son microorganismos acelulares.
No tienen un sistema metablico propio.
Dependen de la maquinaria de la clula hospedera para su replicacin
(parsitos intracelulares estrictos)
Tienen genomas de ADN o ARN, pero carecen de ribosomas y otros
factores necesarios para la traduccin de protenas. As pues, dependen
de la clula hospedera para la produccin de protenas virales.
Sus genomas codifican informacin mnima para asegurar lo siguiente:
1). replicacin del genoma y empaquetamiento; 2) produccin de
protenas virales; y 3) subvertir funciones celulares para permitir la
produccin de viriones.
Algunos virus (bacterifagos) infectan clulas procariontes, mientras que
otros infectan clulas eucariontes.
Algunos virus destruyen las clulas, produciendo enfermedad; otros
persisten en estado latente o persistente en la clula infectada; y otros
pueden causar transformacin maligna (cncer) de las clulas a las que
infecta.

Estructura viral

Los virus se componen, al menos, de un genoma de cido nucleico ADN o ARN


y una cubierta de protenas. Muchos virus tienen adems una membrana
externa llamada envoltura.

La cubierta proteica o cpside de un virin (virus completamente


ensamblado o partcula viral) est compuesta de mltiples copias de uno
o ms tipos de protenas. Estas protenas se ensamblan, formando
unidades estructurales llamadas capsmeros.
Al cido nucleico ms la cubierta o cpside de una partcula viral es
frecuentemente llamada nucleocpside
Los virus ms simples son aquellos que carecen de envoltura y tienen
ADN o ARN de cadena sencilla (Figura 1).
Los virus envueltos contienen una membrana externa que rodea a la
nucleocpside (Figura 3). La envoltura viral se deriva de membranas de
la clula hospedera (nuclear, de aparato de Golgi, de retculo
endoplsmico o membrana plasmtica). Tal como estas membranas, la
envoltura viral se compone de una bicapa lipdica con protenas
insertadas en ella, protenas que son codificadas por el virus.
Algunos virus, como los bacterifagos, tienen colas proteicas complejas
que se requieren para el anclaje y/o la penetracin del ADN viral en la
clula hospedera susceptible.

Figura 1. Virin no envuelto con cpside icosahdrica. El cido nucleico est en


el interior de la cpside.
Figura 2. Virin envuelto con cpside helicoidal. El cido nucleico se localiza en el interior del
virin como indica la lnea punteada en forma de espiral. Las lneas en la superficie exterior de
la envoltura representan espculas glicoproticas.

Genoma viral

El genoma viral est compuesto por ADN o ARN. Un virus no contiene ADN y
ARN simultneamente. El ADN puede ser de una sola cadena (ss por sus
siglas en ingls) (parvovirus y circovirus), de doble cadena (ds por sus siglas en
ingls) (polyomavirus, adenovirus, herpesvirus), o parcialmente de doble
cadena (hepadnavirus). El genoma de ADN puede tener sus extremos
covalentemente ligados el uno al otro (circular = polyomavirus, circovirus) o no
estar unido por sus extremos (lineal = adenovirus, herpesvirus, parvovirus). El
genoma de los virus de viruela (poxvirus) es ssADN cuyos extremos estn
covalentemente unidos uno al otro.

Todos los genomas virales de ARN son lineales. La mayora de estos son
cadena sencilla y unos pocos son de cadena doble (reovirus, bornavirus). La
mayora de los virus de ARN tienes sus genomas en una sola pieza
(monopartita) mientras que otros lo tienen dividido en 10 segmentos (reovirus),
7 u 8 segmentos (ortomyxovirus), tres segmentos (bunyavirus) y dos
segmentos (arenavirus). En cuanto a ssARNs, hay dos posibilidades
importantes de secuencia:

Si el ssARN funciona como mensajero para la traduccin de protenas


(tiene la misma orientacin que el mARN), se le llama sentido positivo.
En contraste, si el ARN viral es antisense (o complementario) a ese
mARN - y entonces no puede ser traducido directamente - se dice que
es sentido negativo.
En algunos virus (Arenavirus y Bunyavirus) se transcriben porciones del
genoma de ARN, generando ARNs mensajeros que son entonces
traducidos. La copia de estos mARNs (complementaria, supuestamente
ARNs sentido negativo) puede ser tambin traducida. Este arreglo es
nico entre los virus, y se dice que es ambos sentidos (ambisense).

Los genes contenidos dentro del genoma pueden codificar desde unos pocos
productos gnicos diferentes (Polyomavirus, 6 - 7 genes, 5000 nucletidos de
longitud) hasta ms de 70 - 100 productos gnicos diferentes (Herpesviridae,
60 a 120 genes, 120,000-220,000 pares de bases de nucletidos de longitud).
En general, los genomas de los virus ARN son ms pequeos, con un tamao
mximo de 30,000 nucletidos como se ve en los Coronavirus. Una hiptesis
para esto es que las polimerasas ARN virales tienden a cometer ms errores
que las polimerasas ADN. As, la fidelidad de la replicacin puede limitar el
tamao. En contraste, los genomas de virus de ADN pueden alcanzar un
tamao de hasta 300,000 nucletidos, como se ve en algunas especies de
Herpesvirus.

La cpside

La funcin de la cpside es proteger el genoma viral durante su transferencia


de clula a clula. La cpside puede estar hecha de mltiples copias de una
sola protena o de una asociacin de varias protenas diferentes. Las cpsides
hechas de mltiples copias de una sola protena representan un buen ejemplo
de economa, ya que un solo gene puede codificar los productos necesarios
para cubrir con la cpside el genoma completo.

La cpside de un virus puede tener diferentes formas geomtricas que


son caractersticas de varias familias virales. Estas incluyen:
icosadrico desnudo (picornavirus, polyomavirus); o envuelto
(herpesvirus). Esta figura geomtrica tiene varias caras triangulares y
esquinas (ver Fig. 1); el nmero de caras y esquinas puede variar de
acuerdo al nmero y tipo de asociacin entre las protenas estructurales
(unidades).
estructura helicoidal, desnudo (virus del mosaico del tabaco) o envuelto
(virus de la rabia), (ver Fig. 1 y Fig. 2).
complejos, que tienen una mezcla de arreglos (por ejemplo,
bacterifagos, virus de viruela).
Los virus varan en tamao, desde los circovirus con 17 - 22 nm de
dimetro, hasta los virus de viruela o poxvirus que alcanzan los 300 nm.
Estos virus tienen forma de ladrillo u ovoide y son suficientemente
grandes como para ser vistos con microscopio ptico, no como los otros
virus para cuya visualizacin es necesario el uso de microscopio
electrnico.
Se han utilizado varias tcnicas para la visualizacin de los virus. La
cristalografa de rayos X es un medio para determinar su estructura
fsica, as como las dimensiones de las protenas individuales y
componentes virales. La informacin obtenida por esta tcnica se usa
luego para "construir" (un modelo) de la estructura total de la partcula
viral. La microscopa electrnica se usa para generar informacin en
torno a la forma general de los virus, y se usa tambin con fines
diagnsticos a travs de la deteccin de partculas virales en
especimenes o muestras clnicas.

Estructurales bsicas

De acuerdo a su morfologa bsica, y tal como se mencion anteriormente, hay


cinco estructuras virales bsicas diferentes. Estas formas, con ejemplos, se
enlistan a continuacin:

Icosadrico desnudo - adenovirus y picornavirus.


Helicoidal desnudo - virus del mosaico del tabaco; no se conocen virus
de humanos o de animales que tengan esta estructura.
Icosadrico envuelto - togavirus y flavivirus.
Helicoidal envuelto - rhabdovirus y paramyxovirus.
Complejos - bacterifagos y virus de viruela.

Envolturas virales

La envoltura viral, caracterstica de algunas familias virales, se deriva de


membranas de la clula hospedera por protrusin de yemas, lo cual ocurre
durante la liberacin de viriones de la clula (infectada). Esta membrana es
frecuentemente una porcin de la membrana plasmtica, sin embargo puede
ser parte del aparato de Golgi, del retculo endoplsmico o de la membrana
nuclear, dependiendo del tipo de virus y del compartimiento celular donde la
replicacin se lleva a cabo. Independientemente de su origen, la membrana se
compone de una bicapa lipdica - de origen celular - con protenas asociadas.
Estas protenas asociadas con la bicapa lipdica son principalmente de origen
viral (codificadas por el virus) y son en su mayora glicoprotenas. El nmero de
protenas virales en la envoltura puede variar desde una hasta ms de diez,
dependiendo del virus. Las glicoprotenas de la envoltura viral llevan a cabo
varias funciones, incluyendo el anclaje inicial del virin a la clula blanco,
penetracin, fusin y diseminacin de una clula a otra, entre otros. El anclaje
del virin a la superficie celular requiere que la envoltura est intacta y las
glicoprotenas tengan su conformacin nativa. Los frmacos antivirales estn
dirigidos contra las protenas de la envoltura y pueden disminuir la habilidad del
virus para anclarse e iniciar la infeccin, disminuyendo as la infectividad.
El proceso de protrusin de yemas, y la consecuente adquisicin de la
envoltura por los viriones recin formados, puede o puede no resultar en la
muerte de la clula hospedera. Si son liberados muchos viriones
simultneamente, la integridad de la membrana celular puede estar
suficientemente comprometida como para conducir a la muerte celular. De
manera alternativa, la liberacin de los viriones puede ser lenta, resultando en
una excrecin crnica e infecciones persistentes. De hecho, a diferencia de la
liberacin de virus no envueltos, que se lleva a cabo principalmente a travs de
la lisis y muerte celular; el egreso de virus envueltos frecuentemente es
compatible con la supervivencia de la clula. Por tanto, el fenmeno de
protrusin de yemas provee de un medio de liberacin viral sin conducir a la
muerte celular.

Protenas Virales

Hay dos tipos bsicos de protenas codificadas por los virus: estructurales y no
estructurales. Las protenas estructurales son aquellas que son parte de la
estructura fsica del virin (cpside, envoltura), mientras que las protenas no
estructurales se producen dentro de la clula infectada y juegan diferentes
papeles en los pasos de replicacin viral. El nmero de protenas codificadas
por los genomas virales vara enormemente, desde tan pocas como dos
protenas, hasta cientos de ellas. Tpicamente las protenas estructurales son
aquellas que componen la cpside y que empaquetan el cido nucleico del
genoma viral. En algunos virus envueltos hay una capa proteica entre la
cpside y la envoltura (el tegumento). Las protenas que forman el tegumento
tambin son protenas estructurales. Las protenas de la estructura externa de
la cpside o envoltura son ligandos, que interactan con receptores en la
superficie de la clula blanco. Algunas de estas protenas (glicoprotenas) se
procesan en el lumen del retculo endoplsmico rugoso, donde se aaden
oligosacridos a la cadena polipeptdica. Estas protenas son enviadas al
aparato de Golgi, a las vesculas secretoras, y finalmente se fusionan con la
membrana plasmtica hacindose presentes sobre la superficie de la clula
infectada. Esto es especialmente importante para los virus envueltos. Las
glicoprotenas de la envoltura juegan papeles en la mediacin de la interaccin
entre los viriones y las clulas (anclaje, penetracin, fusin, diseminacin de
una clula a otra) y son los blancos principales de los anticuerpos
neutralizantes.

Las protenas no estructurales son principalmente, pero no exclusivamente,


enzimas como aquellas asociadas con el proceso de transcripcin del genoma,
replicacin y procesamiento de protenas. Un ejemplo de protenas no
estructurales es la trancriptasa reversa de los retrovirus, que hace copias de
ADN a partir de un molde de ARN. Este paso es una caracterstica importante
de los retrovirus cuyo ARN necesita ser convertido a ADN para ser incorporado
al cromosoma del hospedero. Algunos virus codifican varias protenas no
estructurales que juegan diversos papeles accesorios en la regulacin de la
expresin gentica celular y viral, regulacin de diferentes pasos del ciclo viral,
neutralizacin de la defensa del hospedero, transformacin celular, etctera.

Otros componentes virales

Lpidos

Los lpidos de los virus se derivan de las membranas celulares de la clula


hospedera. stos son en su mayora fosfolpidos (50 - 60%) y el resto es
colesterol. Como consecuencia de que se derivan de la clula hospedera, su
composicin lipdica vara. La bicapa lipdica de la membrana de la clula
hospedera que rodea al virin de los virus envueltos, tambin posee protenas
virales y glicoprotenas, como las espculas caractersticas de algunos virus
envueltos. La composicin lipdica global de los virus envueltos representa
aproximadamente el 25 - 30% de su peso seco. El resto se divide entre la
porcin del cido nucleico y la porcin proteica.

Carbohidratos

Los carbohidratos virales estn presentes tpicamente como los residuos de


oligosacridos de las glicoprotenas, glicolpidos y mucopolisacaridos. La
composicin de los carbohidratos corresponde a aquella de la clula
hospedera. Sin embargo las glicoprotenas frecuentemente tienen un enlace N-
u O- glucosdico. Los carbohidratos virales se encuentran principalmente en la
envoltura. Algunos de los virus ms grandes y complejos contienen
glicoprotenas internas o protenas glicosiladas en la cpside.

Taxonoma viral

Los virus constituyen un grupo numeroso y heterogneo. Se clasifican en


categoras taxonmicas jerrquicas basadas en muchas caractersticas. La
clasificacin es dinmica ya que continuamente se van descubriendo nuevos
virus y se acumula nueva informacin sobre virus ya conocidos. La clasificacin
y nomenclatura usadas en este libro estaba actualizada hasta el momento de
ser escrito. Los cambios ms recientes aparecen en informes del Comit
Internacional de Taxonoma Viral (ICTV por sus siglas en ingls), El esquema
bsico de clasificacin jerrquica es: Orden - Familia - Subfamilia -Gnero -
Especie - Cepa / Tipo. Ciertas caractersticas virales, referidas ms adelante,
definen cada una de estas categoras taxonmicas. Las rdenes tienen el
sufijo -virales, las familias tienen el sufijo -viridae, mientras que los gneros
contienen el sufijo -virus. Una especie viral est constituida por un linaje
replicante que ocupa un nicho ecolgico, por ejemplo una enfermedad en
particular.

Los virus se clasifican en familias con base en muchas caractersticas. Una


caracterstica bsica es el tipo de cido nucleico (ADN o ARN) y la morfologa,
esto es, el tamao y forma del virin as como la presencia o ausencia de una
envoltura. Tambin se usan el rango de hospederos y las propiedades
inmunolgicas del virus (serotipos). Tambin se usan en la clasificacin las
propiedades fsicas y fisicoqumicas como masa molecular, densidad de
flotacin, inactivacin trmica, estabilidad al pH y sensibilidad a varios
solventes.

Algunos aspectos importantes de la taxonoma actual de los virus son si su


material gentico es ADNA o ARN, si es de cadena sencilla o doble, la
organizacin de su genoma y la presencia de ciertos genes. Todo lo anterior se
utiliza para ubicar a los virus en rdenes o familias particulares. Por ejemplo, el
orden Mononegavirales est compuesto por aquellos virus que poseen genoma
de cadena sencilla de ARN con orientacin negativa. Finalmente, la
clasificacin se basa en las macromolculas producidas (protenas
estructurales y enzimas), propiedades antignicas y propiedades biolgicas
(por ejemplo, acumulacin de viriones en las clulas, infectividad,
hemoaglutinacin).
Las Familias virales se enlistan en la tabla de contenidos bajo varias categoras
de sus cidos nucleicos. Las familias se presentan en el libro usando el mismo
orden en el que aparecen en esta lista
.Cuadro 1. Proporciona informacin bsica acerca de cada una de las
principales categoras taxonmicas virales.

Cuadro 1. Clasificacin y algunas caractersticas bsicas de virus de vertebrados.

Virus de ADN de cadena sencilla

Simetra de la cpside
Familia y tamao del virin Subfamilia Gneros Especies representativas
(nm)

Virus de la enfermedad del


Circovirus
pico y la pluma
Circoviridae Icosahdrica; 17-25
Anemia infecciosa de los
Gyrovirus
pollos

Parvovirus Parvovirus canino y felino

Erythrovirus Virus B19

Dependovirus Virus 2 Adeno-asociado


Parvoviridae Icosahdrica; 18-26 Parvovirinae

Virus de la enfermedad del


Virus ADMV-like
visn de las Aleutianas

Virus BPV-like Parvovirus bovino

Virus de ADN de cadena doble

Simetra de la cpside
Familia y tamao del virin Subfamilia Gneros Especies representativas
(nm)

Poxviridae Compleja; Cordopoxvirinae Virus de la vacuna de la


Orthopoxvirus
140-260 viruela
a
220-450
Parapoxvirus Orf virus
Cuadro 1. Clasificacin y algunas caractersticas bsicas de virus de vertebrados.

Virus de ADN de cadena sencilla

Simetra de la cpside
Familia y tamao del virin Subfamilia Gneros Especies representativas
(nm)

Virus de la enfermedad del


Circovirus
pico y la pluma
Circoviridae Icosahdrica; 17-25
Anemia infecciosa de los
Gyrovirus
pollos

Avipoxvirus Virus de la viruela aviar

Virus de la viruela de la
Capripoxvirus
oveja

Leporipoxvirus Virus del myxoma

Virus de la viruela del


Suipoxvirus
cerdo

Virus del molusco


Molluscipox-virus
contagioso

Virus tumoral del mono de


Yatapoxvirus
Yaba

Herpesviridae Icosadrica; 120-200 Simplexvirus Herpesvirus humano 1

Varicellovirus Herpesvirus humano 3

Alfaherpes-virinae
Mareks disease-like
Gallid herpesvirus 2
viruses

Infectious laryngo-
Gallid herpesvirus 1
tracheitis-like viruses

Betaherpesvirinae Cytomegalovirus Herpesvirus humano 5


Cuadro 1. Clasificacin y algunas caractersticas bsicas de virus de vertebrados.

Virus de ADN de cadena sencilla

Simetra de la cpside
Familia y tamao del virin Subfamilia Gneros Especies representativas
(nm)

Virus de la enfermedad del


Circovirus
pico y la pluma
Circoviridae Icosahdrica; 17-25
Anemia infecciosa de los
Gyrovirus
pollos

Muromegalovirus Cytomegalovirus M1

Roseolovirus Herpesvirus humano 6

Lymphocryptovirus Virus Epstein-Barr


Gammaherpesvirinae
Rhadinovirus Herpesvirus ovino 2

Polyomaviridae Icosadrica; 40-45 Polyomavirus Virus SV 40

Papillomaviridae Icosadrica; 52-55 Papillomavirus Papilomavirus bovino 1

Mastadenovirus Adenovirus bovino

Aviadenovirus Adenovirus aviar A

Adenoviridae Icosadrica; 80-110


Atadenovirus Adenovirus ovino D

Virus de la enteritis
Siadenovirus
hemorrgica del pavo

Virus de la fiebre africana


Asfarviridae Compleja; 175-215 Asfivirus
de los cerdos

Iridoviridae Icosadrica; 125-300 Ranavirus Virus de las ranas 3


Cuadro 1. Clasificacin y algunas caractersticas bsicas de virus de vertebrados.

Virus de ADN de cadena sencilla

Simetra de la cpside
Familia y tamao del virin Subfamilia Gneros Especies representativas
(nm)

Virus de la enfermedad del


Circovirus
pico y la pluma
Circoviridae Icosahdrica; 17-25
Anemia infecciosa de los
Gyrovirus
pollos

Lymphocystisvirus Virus de la enfer. linf

Virus de ADN y ARN con transcriptasa reversa

Simetra de la cpside y
Familia Subfamilia Gneros Especies representativas
tamao del virin (nm)

Orthohepadnavirus Virus de la hepatitis B

Hepadnaviridae Icosadrica; 42-47


Virus de la hepatitis B de los
Avihepadnavirus
patos

Retroviridae Icosadrica; 80-100 Alpharetrovirus Virus de la leucosis aviar

Virus del adenocarcinoma


Betaretrovirus
pulmonar ovino

Gammaretrovirus Virus de la leucemia felina

Deltaretrovirus Virus de la leucemia bovina

Epsilonretrovirus Virus del sarcoma drmico de


Walley
Virus de ADN y ARN con transcriptasa reversa

Simetra de la cpside y
Familia Subfamilia Gneros Especies representativas
tamao del virin (nm)

Virus de la inmunodeficiencia
Lentivirus
felina

Spumavirus Virus espumoso de los bvidos

Virus de ARN de cadena doble

Simetra de la cpside y tamao


Familia Subfamilia Gneros Especies representativas
del virin (nm)

Orthoreovirus Ortoreovirus de los mamferos

Virus de la (enfermedad de) la


Obivirus
lengua azul

Reoviridae Icosadrica; 60-80 Rotavirus Rotavirus A

Virus de la fiebre de garrapatas de


Coltivirus
Colorado

Aquareovirus Aquareovirus A

Virus de la necrosis pancretica


Aquabirnavirus
infecciosa
Birnaviridae Icosadrica; 60-70
Virus de la infeccin de la bolsa de
Avibirnavirus
Fabricio
Virus RNA de cadena sencilla, sentido negativo

Simetra de la cpside y
Familia Subfamilia Gneros Especies representativas
tamao del virin (nm)

Respirovirus Virus de la influenza bovina 3

Rubulavirus porcino; Virus de


Rubulavirus
las paperas

Virus del moquillo canino;


Paramyxovirinae Morbillivirus
virus del sarampin

Helicoidal;
150-200
Paramyxoviridae Henipavirus Virus Hendra
a
1000-10,000

Virus de la enfermedad de
Avulavirus
Newcastle

Virus sincitial respiratorio


Pneumovirus
bovina
Pneumovirinae

Metapneumovirus Pneumovirus aviar

Virus de la estomatitis
Vesiculovirus
vesicular de Indiana

Lyssavirus Virus de la rabia


Helicoidal;
45-100
Rhabdoviridae
a
100-430 Virus de la fiebre efmera
Ephemerovirus
bovina

Virus de la hematopoyesis
Novirhabdovirus
necrtica infecciosa

Orthomyxoviridae Helicoidal; Influenzavirus A Virus de la influenza tipo A


80-129
hasta
2000 Influenzavirus B Virus de la influenza tipo B

Influenzavirus C Virus de la influenza tipo C


Virus RNA de cadena sencilla, sentido negativo

Simetra de la cpside y
Familia Subfamilia Gneros Especies representativas
tamao del virin (nm)

Thogotovirus Virus Thogoto

Virus de la anemia infecciosa


Isavirus
del salmn

Orthobunyavirus Virus de Akabane

Hantavirus Virus Hantaan

Helicoidal;
Bunyaviridae
80-100 Virus de la enfermedad de las
Nairovirus
ovejas de Nairobi

Virus de la fiebre del valle de


Phlebovirus
Rift

Icosadrica; Virus de la enfermedad de


Bornaviridae Bornavirus
100-130 Borna

Virus de la coriomeningitis
Arenavirus
linfoctica
Arenaviridae Helicoidal; 50-300
Virus de la hepatitis humana
Deltavirus
D

Marburg-like viruses Virus de Marburg


Helicoidal;
Filoviridae
80 a 1400
Ebola-like viruses Virus del bola
Virus RNA de cadena sencilla, sentido positivo

Simetra de la cpside y
Familia Subfamilia Gneros Especies representativas
tamao del virin (nm)

Enterovirus Virus de la polio

Rhinovirus Rinovirus humano A

Cardiovirus Virus de la encefalomiocarditis

Aphthovirus Virus de la fiebre aftosa

Picornaviridae Icosadrica; 22-30 Hepatovirus Virus de la hepatitis A

Parechovirus Parechovirus humano

Erbovirus Virus de la rinitis equina B

Kobuvirus Virus Aichi

Teschovirus Teschovirus porcino

Virus de la enfermedad hemorrgica


Lagovirus
de los conejos

Norovirus Virus Norwalk


Calciviridae Icosadrica; 35-39

Sapovirus Calicivirus porcino

Vesivirus Virus del exantema vesicular porcino

Mamastrovirus Astrovirus humano


Astroviridae Icosadrica; 27-30
Avastrovirus Astrovirus del pavo

Coronavirus Virus de la bronquitis infecciosa


Coronaviridae Helicoidal; 60-220
Torovirus Torovirus equino
Virus RNA de cadena sencilla, sentido positivo

Simetra de la cpside y
Familia Subfamilia Gneros Especies representativas
tamao del virin (nm)

Arteriviridae Icosadrica; 40-60 Arterivirus Virus de la arteritis equina

Alphavirus Virus Sindibis


Togaviridae Icosadrica; 70
Rubivirus Virus de la rubeola

Flavivirus Virus de la fiebre amarilla

Flaviviridae Icosadrica; 40-60 Pestivirus Virus de la diarrea viral bovina 1

Hepacivirus Virus de la hepatitis C

Virus nervioso de la necrosis del gato


Nodaviridae Icosadrica; 29-32 Betanodavirus
rayado

Partculas atpicas asociadas con infecciones

Virus defectuosos

Los virus defectuosos son aquellos cuyo genoma carece de un gen o genes
especficos, debido a mutacin. Como resultado de lo anterior, los virus
defectuosos no son capaces de llevar a cabo un ciclo de vida productivo en las
clulas. Sin embargo, si la clula infectada con el virus defectuoso est co-
infectada con un "virus ayudante" el producto del gen que carece el virus
defectuoso es complementado por el virus ayudante, y el virus defectuoso
puede replicarse. Es interesante que, para algunos virus, durante la infeccin
se produce una mayor cantidad de viriones defectuosos que de viriones
infecciosos (tanto como 100:1). La produccin de partculas defectuosas es
caracterstica de algunas especies virales y se cree que modera la severidad
de la infeccin/enfermedad in vivo. Los virusoides, que son ejemplo de virus
defectuosos, se discutirn ms adelante en esta seccin.

Pseudoviriones

Los pseudoviriones pueden ser producidos durante la replicacin viral cuando


el genoma del hospedero se fragmenta. Como resultado de este proceso
algunos fragmentos del ADN del hospedero se incorporan en la cpside en
lugar del ADN viral. Entonces, los pseudoviriones poseen la cpside viral a la
cual los anticuerpos pueden unirse y facilitar el anclaje y penetracin en la
clula hospedera, pero no pueden replicarse una vez que logran el acceso a la
clula, debido a que no tienen ninguno de los genes virales esenciales para el
proceso de replicacin.

Priones

Aunque no son virales, los priones son partculas proteicas infecciosas


asociadas con encefalopatas espongiformes transmisibles (TSE por sus siglas
en ingls) de humanos y de animales. TSE incluye la enfermedad de
Creutzfeldt-Jacob en humanos, "scrapie" en ovejas y encefalopata
espongiforme bovina. Priones y TSEs en animales se discuten detalladamente
en el captulo 29. En el anlisis a la necropsia, el cerebro presenta grandes
vacuolas en las regiones de la corteza y del cerebelo, por lo que la enfermedad
causada por priones se llama "encefalopatas espongiformes". Una
examinacin ms detallada del tejido cerebral revela la acumulacin de fibrillas
y placas amiloideas asociadas con protenas de priones. Estas enfermedades
se caracterizan por la prdida del control motor, demencia, parlisis, desgaste y
eventualmente la muerte. Los detalles de la patogenia son en su mayora
desconocidos.

Viroides

Los viroides son cidos nucleicos de bajo peso molecular, desnudos,


extremadamente resistentes al calor, a la radiacin ultravioleta y la radiacin
ionizante. Estas partculas se componen exclusivamente de una pieza de ARN
circular de cadena sencilla, con algunas regiones de cadena doble. Los viroides
causan en su mayora enfermedades de plantas, como la enfermedad del
tubrculo ahusado de la papa.

Virusoides

Los virusoides (tambin llamados ARN satlites) son similares a los viroides en
el sentido de que son cidos nucleicos desnudos, de bajo peso molecular,
extremadamente resistentes al calor y a las radiaciones ultravioletas y
ionizantes. Sin embargo, dependen de un virus ayudante para la replicacin.
Los virusoides se replican en el citoplasma de la clula a travs de una
polimerasa ARN dependiente de ARN.

Nueva familia viral - Mimiviridae

Mimiviridae es una familia viral que contiene un miembro, Mimivirus. El nombre


de Mimivirus se deriva de "microbio imitador". Fue descubierto en 1992 dentro
de un protozoario y, a la fecha, es el virus conocido de mayor tamao,
alrededor de 400 nm de dimetro. La cpside es de forma icosahdrica, el
virin carece de envoltura y su genoma es de ADN circular de cadena doble
(dsADN), de 1.2 Mb de longitud y con 1,260 genes. La secuencia del genoma
de Mimivirus fue publicada en el ao 2004.

Glosario

Bacterifago:
Un virus que infecta clulas procariontes y tiene muchos de los atributos
de los virus de plantas y animales. Requiere una bacteria viva para llevar
a cabo su ciclo reproductivo.
Protrusin de yemas:
A travs de este proceso los virus envueltos adquieren su envoltura. Es
precedido por la insercin de glicoprotenas virus-especficas en la
membrana celular del hospedero. Este proceso ocurre ms
frecuentemente en la membrana plasmtica y confiere infectividad.
Mucopolisacrido:
Una clase de polisacrido (glucoaminoglicanos) como heparina, cido
hialurnico y sulfato de condroitina, que absorben agua para formar un
material espeso mucoide, gelatinoso.
Oligosacrido:
Una azcar que contiene un nmero pequeo y conocido de unidades
de monosacridos.

Replicacin y gentica viral

Replicacin viral

La replicacin viral es un proceso muy complejo y variado. La mecnica de la


replicacin depende fundamentalmente del tipo de cido nucleico y de
organizacin gentica de cada virus en particular. A pesar de la variacin que
existe en las estrategias de replicacin, hay concordancia en varios pasos de la
rplica viral. Todos los esquemas de replicacin contienen los siguientes pasos
bsicos: anclaje, penetracin, descapsidacin o desnudamiento (si es
necesario), sntesis de protenas (o expresin gentica), replicacin del
genoma, ensamblaje (morfognesis), y liberacin.

El anclaje depende de la interaccin fsica entre el virion y la superficie


de la clula hospedera /blanco. Tpicamente esta interaccin es de tipo
receptor-ligando, lo que determina especificidad de especie o
especificidad de tipo celular. Sin el anclaje la infeccin viral no puede
ocurrir, sin embargo no todos los anclajes resultan en infeccin
productiva. En otras palabras, el anclaje es necesario pero no asegura
que la replicacin va a continuar.
La penetracin se refiere a la introduccin del cido nucleico viral dentro
de la clula, a la internalizacin de la nucleocpside va endocitosis
mediada por receptores, o a la fusin de la envoltura viral con la
membrana plasmtica. Como resultado inmediato, el cido nucleico
(viral) se localiza ya sea en el citosol o dentro de una vesicula
endocitada..
La descapsidacin o desnudamiento del cido nucleico de la
nucleocpside puede requerir la participacin de protenas hospederas u
otros factores. La descapsidacin es un prerrequisito para la expresin
del genoma viral. Despus de la descapsidacin, el cido nucleico viral
puede seguir alguna de dos alternativas: continuar hacia el ciclo de
replicacin o que una copia de ste se integre al genoma de la clula
hospedera y permanezca quiescente hasta que sea activado (retrovirus).
En la sntesis de protenas (expresin gentica) se produce ARN
mensajero (ARNm) y ste es traducido a protenas virales.
Independientemente de si el virus tiene genoma de ADN o de ARN, si es
de una sola o de doble cadena, segmentado o monopartita, el genoma
tiene que producir ARNm que puedan ser reconocidos y traducidos por
la maquinaria de la clula hospedera.
Tal como ser descrito para cada uno de los grupos virales, hay un
mecanismo nico a travs del cual la maquinaria de la clula hospedera
llega a dedicarse principalmente a la sntesis de productos virales, y no
de productos celulares.
Replicacin del genoma: El mecanismo de replicacin genmica vara
de acuerdo al tipo de cido nucleico, su estructura y topologa. Para los
virus ms simples este proceso lo realizan las enzimas de la clula
hospedera; sin embargo la mayora de los virus codifican sus propias
enzimas de replicacin.
La maduracin es el ensamblaje de partculas virales completas. La
maduracin de virus desnudos es principalmente el ensamblaje del
genoma + protenas de la cpside para formar la nucleocpside. Esto
ocurre espontneamente a travs de interacciones protena-protena y
protena-cido nucleico. En la maduracin de los viriones envueltos, la
nucleocpside adquiere una envoltura externa formada por membranas
de la clula hospedera (membrana nuclear, de aparato de golgi, de
retculo endoplsmico o de membrana plasmtica), la cual contiene una
bicapa lipdica de origen celular con protenas codificadas por el virus.
La membrana es adquirida a travs de un proceso conocido como
protrusin de yemas.
Liberacin de los viriones. En el caso de los virus desnudos o sin
envoltura, son liberados miles de viriones progenie a travs de la muerte
y la lisis celular. En el caso de los virus envueltos los viriones progenie
son liberados por protrusin de yemas hacia el exterior de la clula. Este
proceso no necesariamente provoca la muerte celular, aunque algunos
virus envueltos tambin pueden ser liberados a travs de lisis celular.

Replicacin de virus de ADN

En general, los virus de ADN se replican dentro del ncleo. Son


excepciones los virus de la viruela y los iridovirus (virus de insectos y de
peces), que usan "fbricas" citoplsmicas.
Aquellos virus de ADN que se multiplican dentro del ncleo utilizan la
polimerasa ARN dependiente de ADN del hospedero para la
transcripcin. La mayora de los virus de viruela y de los iridovirus tienen
transcriptasas codificadas por el virion que les permite replicarse en el
citoplasma.
La replicacin del ADN viral es semiconservativa y simtrica, con
replicacin de ambas cadenas. En los virus con ADN de doble cadena
(ADNds) como los adenovirus, la replicacin de ambas cadenas hijas no
necesariamente sigue el mismo mecanismo.
Las polimerasas del hospedero pueden estar involucradas en la
replicacin de genomas de tamao pequeo a moderado (papilomavirus,
poliomavirus), mientras que los virus con genomas grandes
generalmente codifican para sus propias polimerasas (adenovirus,
herpesvirus y virus de viruela).
La maduracin de los virus de ADN, con excepcin de los virus de
viruela e iridovirus, ocurre en el ncleo.
Las protenas estructurales son transportadas desde el citoplasma hasta
el ncleo, donde interactan unas con otras y con el genoma viral,
ensamblando la cpside que rodea al cido nucleico.
Los virus envueltos completan su maduracin por protrusin de yemas a
travs de la membrana nuclear (iridovirus) o de la membrana plasmtica.

Replicacin de virus ADN de doble cadena

Estos incluyen las siguientes familias virales asociadas con animales:


Asfarviridae, Poxviridae, Iridoviridae, Herpesviridae, Poliomaviridae,
Papillomaviridae, y la Adenoviridae (Fig. 3).

El tamao de los genomas vara desde 5 - 8 kb (Polyomaviridae) hasta


ms de 300 kb (Poxviridae e Iridoviridae).
En general la replicacin se lleva a cabo en el ncleo por enzimas del
hospedero (para virus pequeos como polioma y papilomavirus) o por
replicasas codificadas por el virus (adenovirus, herpesvirus). La
replicacin de virus de viruela y de algunos iridovirus se lleva a cabo en
el citoplasma, provocando la formacin de cuerpos de inclusin que
contienen las enzimas necesarias de origen viral asociadas con la
replicacin, como las polimerasas de ADN dependientes de ADN viral.
El ADN de cadena doble (ADNds) puede estar en forma circular, lineal,
permutada circularmente o lineal con extremos cerrados
covalentemente.
Los genomas circulares pequeos se replican bidireccionalmente de
manera similar a los plsmidos. Se postula que la replicacin del ADN de
los poliomavirus (cerrado, circular y de doble cadena) se lleva a cabo
mediante un "mecanismo de manivela" que incluye endonucleasa y
ligasa. La endonucleasa "corta" una cadena, permitiendo que se replique
una regin pequea, y luego el corte es reparado por una ligasa.
Figura 3. Esquema general de la replicacin de virus de ADN de cadena doble.

Replicacin de virus de ADN de cadena sencilla

Incluye las siguientes familias de virus asociadas con animales: Circoviridae y


Parvoviridae.

El tamao del genoma vara de 3 kb a 6 kb.


Se piensa que el ADN circular de cadena sencilla de los circovirus se
replica mediante el mecanismo de crculo rodante.
La replicacin ocurre en el ncleo e involucra la generacin de una
cadena de ADN sentido negativo, que sirve como molde o patrn para el
genoma de ADN sentido positivo de la progenie viral. Esto involucra la
produccin de un intermediario de ADNds, conocido como la forma
replicativa.
La entrada del ADNss al ncleo estimula su "reparacin" a la forma
replicativa por las enzimas del hospedero. En el caso de las formas
circulares, la forma replicativa se asocia con las histonas del hospedero
y otras protenas nucleares, siendo "tratado" entonces como un
cromosoma del hospedero. Las formas lineales han desarrollado
mecanismos que permiten que el genoma sea replicado sin la prdida
de ADN despus de cada replicacin.
El ADNss puede estar en forma de un solo componente lineal
(parvoviridae), o de un solo componente circular (circovirus).
Figura 3-2. Esquema general de replicacin de virus ADNss.

Virus ADN de doble cadena con transcriptasa reversa

Incluye la familia Hepadnaviridae.


Su genoma est organizado como un ADN parcialmente de doble
cadena, circular, cerrado no covalentemente, de 3.2 kb.
Despus del anclaje, la penetracin y la descapsidacin parcial del
virion, el ADNds parcial entra al ncleo y es completado por polimerasa
viral y/o enzimas celulares. Una vez completada, la doble cadena es
sellada por la accin de una ligasa del hospedero.
En el ncleo, el ADN viral acta como un "mini-cromosoma", despus de
su asociacin con histonas del hospedero, etc. Sin embargo, la
polimerasa ADN del hospedero no puede replicarlo.
En el ciclo de replicacin se produce un ARNm grande (ARN mensajero)
llamado ARNpg (ARN pre-genmico), el cul es ms largo que el ADN
molde a partir del cual se transcribi, debido a la adicin de una cola poli
A (poli-adenina). Es este ARN intermedio el que sirve como molde para
el ADN del virin. Tambin se producen ARNs mensajeros ms
pequeos, que abandonan el ncleo y sirven como molde para
traduccin, dando origen a la polimerasa viral y protenas de la cpside.
A continuacin se da un ensamblaje parcial de la cpside.
Parte del ARNpg es encapsidado en estos viriones inmaduros
recientemente ensamblados. Dentro de la cpside se hace una copia de
ADNc del ARNpg por la transcriptasa encapsidada (polimerasa viral).
Despus de la sntesis de la primera cadena complementaria de ADNc,
la polimerasa viral degrada el ARNpg molde y empieza a sintetizar la
segunda cadena de ADN. Los viriones son entonces liberados de la
clula por protrusin de yemas, conteniendo genoma de ADN que es
cadena doble slo parcialmente.

Replicacin de virus ARN

La replicacin de la mayora de los virus ARN ocurre estrictamente en el


citoplasma de las clulas y es independiente de la maquinaria nuclear.
Son excepciones los ortomixovirus (bunyavirus), que requieren factores
de transcripcin de ADN del hospedero; y los retrovirus, que se replican
va un intermediario de ADN.
El anclaje es una interaccin electrosttica entre los viriones y los
receptores celulares especficos.
Los virus entran entonces por endocitosis mediada por receptores o por
fusin con la membrana celular o con la vescula endoctica (virus
envueltos).
La descapsidacin ocurre en el citoplasma o durante el paso a travs de
la membrana celular (translocacin), como parece que es el caso de los
picornavirus. Sin embargo el ARN de los reovirus, nunca se descapsida
completamente, pero permanece en centros virales durante la expresin
gentica y la replicacin.
El genoma de algunos virus ARN es una sola molcula de ARN
(monopartita); en otros el genoma est segmentado (multipartita).
El ARN de algunos virus animales funciona como ARNm (sentido +) y
puede ser traducido directamente, mientras que el genoma de otros es
antisense (sentido -) y debe ser transcrito primero a ARN+ por una
polimerasa ARN dependiente codificada por el virus (transcriptasa).
Los retrovirus tienen la enzima transcriptasa reversa (ADN polimerasa
dependiente de ARN) que permite la formacin de un intermediario de
ADNds (ADN provirus), el cual se incorpora al genoma del hospedero, y
posteriormente es transcrito en ARNm por la ARN polimerasa ADN
dependiente del hospedero.
En general, la replicacin del ARN viral es semiconservativa y se lleva a
cabo va un intermediario replicativo (R1). El R1 consiste en ARN viral
parental que sirve como molde para la transcripcin de muchas cadenas
de ARN, que eventualmente se "desprenden" y sirven como molde para
la sntesis de ARN viral.
La replicacin del ARN de doble cadena de los reovirus es conservadora
y asimtrica; solo una de las cadenas se replica, a diferencia del ADN de
doble cadena. El proceso de replicacin requiere ARN polimerasas
dependientes de ARN (replicasas) que son codificadas por el virus.
La maduracin ocurre en el citoplasma con la asociacin de ARN viral
con las protenas de la cpside, formando la nucleocpside. Los virus
envueltos terminan su maduracin por protrusin de yemas a travs del
retculo endoplsmico, el aparato de Golgi o la membrana plasmtica.

Virus ARN de doble cadena

Incluye las siguientes familias de virus asociadas a animales: Reoviridae


y Birnaviridae.
El tamao del genoma de estos virus va desde 4 kb hasta 20 - 27 kb de
longitud.
El anclaje es a travs de endocitosis mediada por receptores. El virion
se descapsida parcialmente y la partcula central permanece en la
vescula endoctica.
La replicacin se lleva a cabo por un mecanismo conservador, el ARNds
sirve como molde para la produccin de ARNm por la ARN polimerasa
ARN dependiente. A la fecha, gran parte del resto del mecanismo de
replicacin est mal entendido.
La replicacin no involucra la formacin de intermediarios R1. En el
citoplasma de la clula hospedera no hay formacin de ARNds libres.
Todos tienen genomas lineales segmentados. Cada segmento
corresponde a un ARNm monocistrnico.
Todos los genomas son lineales, pero pueden ser de dos componentes
(Birnaviridae), o de mltiples componentes (los reovirus tienen 10 - 12
componentes).

Figura 3-3. Esquema general de replicacin de virus ARN de doble cadena.

Virus ARN de una sola cadena con sentido positivo

Incluye las siguientes familias de virus asociada a animales:


Caliciviridae, Picornaviridae, Astroviridae, HEV-like viruses, Nodaviridae,
Flavivirus, Coronaviridae, Togaviridae, y Arteriviridae.
El tamao del genoma vara desde menos de 5kb hasta 20 - 30 kb.
El anclaje es mediante endocitosis mediada por receptores. Una vez ah,
el virin pierde la cpside y el ARNss es liberado hacia el citoplasma.
Los genomas virales que tienen el mismo sentido que los mensajeros
son traducidos total o parcialmente a protenas, como primer paso de la
replicacin viral.
Los Picornavirus y Flavivirus poseen como genoma uno de ARN sentido
positivo que se comporta como un ARNm policistrnico. El genoma es
traducido directamente en un gran polipptido, que al mismo tiempo que
es traducido es escindido en varias protenas por proteasas codificadas
por el virus o proteasas de la clula hospedera.
Los Coronavirus tienen un patrn complejo de transcripcin, que
involucra varias rondas de traduccin para completar el ciclo de
replicacin.
Son posibles diferentes formas lineales de lo siguiente: un solo
componente con un solo marco de lectura abierto (ORF por sus siglas
en ingls) (picornavirus), un solo componente con mltiples ORFs
(togavirus y calicivirus), y dos componentes con un solo ORF
(nodavirus).
Figura 3-4. Esquema de replicacin de virus ARNss sentido positivo.

Virus ARN de una sola cadena con sentido negativo

Incluye las siguientes familias virales asociadas a animales:


Orthomyxoviridae, Rhabdoviridae, Paramyxoviridae, Bornaviridae,
Filoviridae, Deltavirus, Arenaviridae, y Bunyaviridae.
El tamao del genoma vara desde 10 - 14 kb hasta 11 - 20 kb. Como los
genomas son sentido negativo, no son traducidos. Entonces estos virus
tienen que incluir sus replicasas en el virin, para proceder con la
transcripcin y replicacin del genoma.
Los orthomyxovirus tienen genomas segmentados. El primer paso en el
proceso de replicacin es la transcripcin del ARN sentido negativo por
una ARN polimerasa dependiente de ARN codificada por el virus.
Los rhabdovirus tienen genomas no segmentados. La replicacin
requiere transcripcin va ARN polimerasa viral dependiente de ARN.
En el caso de los virus ambisence, la transcriptasa est codificada
dentro de la porcin sentido positivo y va a mediar, eventualmente, la
transcripcin de las regiones sentido negativo.
Los siguientes arreglos lineares de genoma incluyen un componente con
mltiples ORFs (marco de lectura abierto, por sus siglas en ingls)
(filovirus, paramyxovirus, y rhabidovirus), dos componentes ambisense
(arenaviruses), tres componentes sentido negativo o ambisense
(bunyavirus), y seis a ocho componentes (orthomyxovirus).

Figura 3-5. Esquema de replicacin de ARNss sentido negativo.


Virus ARN de una sola cadena, sentido positivo, con transcriptasa reversa

Incluye los virus asociados a vertebrados de la familia Retroviridae.


El arreglo del genoma viral consta de ARNss diploide lineal que se
mantiene unido por protenas. Tiene un casquete en 5', una cola poly-A
3', y cuatro regiones codificadoras caractersticas (gag-pro-pol-env).
Estas regiones son: genes gag (antgeno grupo especfico: protena de
matriz, nucleoprotena, cpside); gen pro (proteasa); genes pol
(transcriptasa reversa y ARNasa-H); y genes env (envoltura, unin de
receptores).
La conversin de ARN a ADNss y luego a ADNds es mediada por la
enzima viral transcriptasa reversa. El ADNds resultante, llamado ADN
provirus, es en ltima instancia integrado en el cromosoma del
hospedero por la enzima viral integrasa.
Una vez integrado en el cromosoma del hospedero, el ADNds
permanece latente hasta que es "disparado" a produccin activa de
viriones. Entonces el provirus es transcrito a ARNm por la ARN
polimerasa celular II.

Glosario

Ambisense:
Se refiere a un genoma de ARN que contiene informacin en su
secuencia tanto en sentido positivo (que puede ser usada directamente
como ARNm) como en sentido negativo (que debe ser transcrita a la
forma de ARNm).
Replicacin conservadora:
Replicacin de ADNds o ARNds de tal forma que las cadenas originales
no forman parte de la progenie recin formada de ADNds o ARNds.
Vescula endoctica:
Una vescula formada en el proceso de endocitosis, el "englobamiento"
del virus, que puede ser mediada por receptores de superficie o
interacciones de la membrana celular.
Membrana de Golgi:
Membrana asociada con el aparato de Golgi de una clula eucaritica.
El aparato de Golgi recibe los lpidos y protenas recin sintetizados del
retculo endoplsmico, los modifica qumicamente y los transfiere al
lugar apropiado de la clula.
Cuerpos de inclusin:
Estos representan las "fbricas" de virus en las que los cidos nucleicos
virales o las protenas virales estn siendo sintetizadas.
Ligasa:
Enzima del hospedero que crea uniones covalentes en los cidos
nucleicos asociadas con cortes en el esqueleto de azcares y fosfatos
de la molcula.
Monocistrnico:
Que contiene informacin para un solo gene o para un solo producto
gentico.
Monopartita:
Genoma viral que contiene un solo segmento.
Genomas multi-componentes:
Genomas integrados por ms de una molcula de cido nucleico
constituyendo el total de su genoma.
Mutgenos:
Agentes fsicos o qumicos que incrementan la frecuencia de mutacin
del ADN de un organismo.
ADN sentido negativo:
ADN cuya transcripcin no produce una molcula de ARN que pueda ser
usada directamente como ARNm. Es el molde para la creacin de
genomas de ARN sentido negativo.
Policistrnico:
Que contiene informacin para varios genes o productos genticos.
ADN sentido positivo:
ADN cuya transcripcin produce el genoma de los ARN sentido positivo,
o que puede ser usado directamente como ARN mensajero.
Transcriptasa reversa:
Enzima viral que usa un molde de ARN para sintetizar ADN.
Replicacin semiconservadora:
Replicacin de ADNds o ARNds en la que las cadenas originales (una
original y una recin sintetizada) forman parte de la progenie de ADNds
o ARNds recin formada.
Genomas de un solo componente:
Genomas que tienen una sola molcula de cido nucleico y esta
constituye el total de su genoma.
Tautmeros:
Formas isomtricas de compuestos orgnicos. Cuando dos de estas
formas existen en equilibrio se conoce como tautomerismo.
Transcriptasa:
Enzima viral capaz de usar una molcula de ARN como molde para la
transcripcin.
Tipo silvestre:
El virus natural. Estos virus se usan como cepas de referencia para la
comparacin de mutantes y variantes de un virus en particular.

Cultivo y caracterizacin de virus

Se han desarrollado mtodos para el almacenamiento, visualizacin, cuantificacin


(directa e indirecta) y propagacin de virus. Tambin hay mtodos para el diagnstico
de laboratorio de enfermedades virales, muchos de los cuales son mtodos
serolgicos, basados en la deteccin de la respuesta del hospedero a la infeccin.
Estos mtodos diagnsticos sern discutidos en el captulo 7.
A lo largo del tiempo, fue posible observar que el contagio de ciertas enfermedades
era capaz de pasar a travs de filtros que las bacterias no podan pasar. Los filtrados
obtenidos no eran capaces de crecer en medios de cultivos para bacterias, y
eventualmente se demostr experimentalmente que eran infectivos y que contenan
virus. A excepcin de los virus de viruela, los virus no pueden ser observados con
microscopio ptico. Eventualmente los virus fueron observados con microscopio
electrnico. Algunos de los mtodos importantes usados en los estudios bsicos de
virus se describen a continuacin.
Tal como se mencion en el captulo anterior, los virus animales presentan una
considerable diversidad en sus caractersticas fsicas. La caracterstica que ms refleja
las propiedades del virin es la presencia o ausencia de la envoltura viral. Como se
seala en la tabla 2.1, los virus no envueltos son, en general, sensibles a las
radiaciones ultravioleta, relativamente termoestables y susceptibles al dao por los
cristales de hielo. Debido principalmente a la presencia de la envoltura de membrana,
los virus envueltos se inactivan con solventes lipdicos (como cloroformo y ter) y
detergentes (como el desoxicolato), son sensibles a la radiacin gama y ultravioleta,
relativamente termolbiles y el dao que les produce la formacin de cristales de hielo
es ms extenso que el que se produce en los virus no envueltos o desnudos.

Cuadro 2.1. Principales propiedades fisicoqumicas y biolgicas de viriones envueltos


y desnudos

Caractersticas Virus desnudos Virus envueltos

Radiacin ultravioleta Sensible Sensible

Radiacin gama Sensible Sensible

Termoestabilidad Termoestable Termolbil

Susceptibilidad a dao por


Si Extenso
cristales de hielo

Inactivacin por solventes


No Si
lipdicos y detergentes

Mtodos de propagacin viral


Para aislar, caracterizar e identificar virus, as como para producir vacunas virales, se
necesita una cantidad considerable de partculas virales. Esto se logra a travs de
diferentes mtodos de propagacin, los cuales se enlistan a continuacin:

Hospederos animales
En el pasado, la propagacin de virus en organismos hospederos susceptibles no
infectados era la nica manera de obtener grandes cantidades de virus. Actualmente el
uso de animales experimentales como hospederos para propagacin viral est limitado
por razones ticas. La propagacin viral en animales es ms til para aquellos virus
que no crecen fcilmente en cultivos celulares. Por ejemplo: cepas vacunales del virus
de la enteritis hemorrgica de pavo pueden ser propagadas tanto en aves vivas como
en cultivos celulares. Sin embargo los productos propagados en bazo (de aves vivas)
parecen ser ms usados que los propagados en cultivo. Para fines diagnsticos la
inoculacin de animales es un medio para detectar virus en muestras clnicas, como el
virus de la rabia en ratones lactantes.

Huevos embrionados
Antes del desarrollo de las tcnicas de cultivo de clulas y de tejidos, el uso de huevo
embrionado para propagacin viral fue una de las primeras alternativas al uso de
organismos animales hospederos. El huevo embrionado es an el mtodo preferido
para la propagacin de virus de influenza tipo A y para muchos otros virus aviares. El
huevo embrionado tambin es til en la diferenciacin de algunos virus que producen
lesiones similares, como los virus de la viruela de la vaca y los virus de la pseudo
viruela de la vaca. Aunque el virus de la enfermedad de la lengua azul (BTV) es un
virus de mamferos, se replica bien en huevo embrionado, por lo que este sistema se
usa para propagacin viral con fines diagnsticos y de investigacin. Cuando se usa
huevo embrionado, uno debe considerar la posible presencia de anticuerpos maternos
(IgY) en el saco vitelino del huevo. Por lo tanto, frecuentemente es preferible obtener
huevo embrionado de parvadas libres de patgenos especficos (SPF). El dar pases
en embrin de pollos es til en la atenuacin de ciertos virus para vacunas de virus
vivo modificado.

Cultivo de clulas/tejidos
El cultivo de tejidos se refiere al crecimiento y mantenimiento de clulas de tejidos
vivos in vitro. Hay bsicamente dos tipos: cultivo de explantes y cultivo de clulas. Los
explantes son pequeos fragmentos de tejidos del hospedero que se mantienen en
cultivo, mientras que el cultivo de clulas se obtiene mediante de la disgregacin de
diferentes tejidos del hospedero en clulas individuales. La mayora de los sistemas
usados en virologa son en realidad cultivos celulares y no cultivos de tejidos, aunque
ambos trminos se usan de manera indistinta. Los cultivos celulares se subdividen a
su vez en cultivos primarios, cultivos semi-continuos y cultivos continuos.
Figura 2.1. Cultivo celular normal.

Cultivo de explantes
Estos son cultivos de pequeos fragmentos de tejidos especficos, tomados
directamente del hospedero animal. Los cultivos de explantes son tiles para el
aislamiento viral y se requieren para el aislamiento de algunos coronavirus. La
demostracin de latencia de algunos alfa herpesvirus humanos y animales puede
requerir explantes de ganglio nervioso sensitivo (por ejemplo, trigmino).
Cultivos celulares primarios
Estos se derivan de tejidos frescos que han sido digeridos enzimticamente con
tripsina u otras proteasas, para liberar clulas individuales. Como resultado, con
frecuencia los cultivos primarios estn compuestos de muchos tipos celulares
diferentes. En condiciones in vitro las clulas de los cultivos primarios raramente
pueden dividirse, o se dividen a una velocidad muy baja. Es por esto que tienen un
tiempo de vida limitado, conocido como lmite de Hayflick. A pesar del tiempo de vida
limitado de los cultivos primarios, son ideales para el aislamiento de algunos virus. Los
cultivos primarios raramente sobreviven ms all del vigsimo pase in vitro.

Cultivos semi-continuos
Son tambin conocidos como lneas celulares diploides, debido a que contienen el
cromosoma diploide normal caracterstico de la especie de la que ellos se derivan. Los
cultivos semi-continuos son cultivos primarios que tienen algunas clulas que pueden
ser cuidadas para sobrevivir ms all del lmite de Hayflick. Los cultivos semi-
continuos tienden a morir entre el 30 y el 50 pase in vitro. A pesar de esta limitante,
los cultivos semi-continuos son tiles en la propagacin de una gran variedad de virus.
Los cultivos semi-continuos son por lo general de fibroblastos.

Cultivos celulares continuos


Se les conoce tambin como lneas celulares heterodiploides, debido a que poseen un
nmero anormal de cromosomas. Estos cultivos se derivan de tejidos normales o
neoplsicos y se caracterizan por su habilidad para ser propagados in vitro
indefinidamente. De manera general, las lneas celulares continuas no son tan
sensibles como las otras para propagacin viral. Sin embargo, facilitan la propagacin
a gran escala de algunos virus para vacunas e investigacin. Muchas lneas continuas
estn disponibles de proveedores como la Coleccin Americana de Cultivos Tipo
(ATCC por sus siglas en ingls). La mayora de los laboratorios de virologa almacenan
en congelacin alcuotas iniciales de sus cultivos continuos, debido a que las lneas
celulares que estn continuamente en cultivo pueden sufrir cambios en sus
caractersticas celulares. Las causas de estos cambios pueden ser infeccin
por Micoplasma spp., o virus contaminantes (por ejemplo, circovirus porcino y virus de
la diarrea viral bovina).

Concentracin y purificacin de virus


Una vez que un virus ha sido propagado adecuadamente, necesita ser recuperado de
las clulas hospederas y los restos de stas, y luego ser purificado. Esto se logra por
varios procesos que involucran centrifugacin diferencial (a diferentes velocidades),
dilisis, precipitacin, cromatografa y gradiente de densidad. El paso inicial de este
proceso es la centrifugacin diferencial; se usa una velocidad baja (~2,000 x g) para
quitar restos celulares y a para concentrar se usa a continuacin, en el caso de
volmenes pequeos, una velocidad alta de centrifugacin (40K a 80K x g) y en el
caso de volmenes mayores, se usa dilisis y precipitacin o precipitacin con metanol
fro (-70C) o con polietilenglicol. La purificacin se lleva a cabo mediante
cromatografa o centrifugacin usando gradiente de densidad. Los virus envueltos
pueden ser purificados aprovechando su velocidad de sedimentacin en gradientes de
sacarosa. Los virus desnudos pueden ser purificados por centrifugacin a travs de
gradientes de cloruro de cesio.

Visualizacin de los virus


Los dos mtodos principales usados para visualizar la estructura / morfologa de los
virus son: la microscopa electrnica y la microscopa de fuerza atmica. Otros tipos de
microscopa se usan para observar cambios inducidos por la replicacin viral en las
clulas infectadas. Sin un medio para visualizar los virus es difcil obtener informacin
acerca de la estructura o las interacciones clula-virus. Ms an, el visualizar las
partculas virales le permite a uno estimar directamente el nmero de partculas
(virales) presentes en una suspensin. Hay otros mtodos que le permiten a uno
estimar el nmero de virus indirectamente. En cualquier caso, la cuantificacin directa
o indirecta es siempre un estimado. Este estimado numrico es importante al preparar
vacunas, al determinar el nmero mnimo de viriones necesarios para producir una
enfermedad y en procedimientos virales de investigacin.
Microscopa ptica
Si bien la microscopa ptica no es til para la examinacin directa de los virus (con
excepcin de los virus de la viruela), es til para observar los efectos de la infeccin
viral en la clula hospedera. El dao celular o la destruccin causada por el virus es
conocida como efecto citoptico (CPE por sus siglas en ingls). Los efectos citopticos
que pueden observarse incluyen:
1. Clulas redondeadas y agregados en forma de racimo de uvas, como se observa
con adenovirus;
2. Clulas redondeadas, encogidas, lisadas, dejando gran cantidad de restos
celulares, como se observa con los enterovirus;
3. Clulas agrandadas y redondeadas en reas focales, como con herpesvirus; y
4. Fusin de clulas que se convierten en clulas multinucleadas (sinsicios) como en el
caso de paramyxovirus.

Adems es posible observar cuerpos de inclusin, caractersticos de algunos virus.

Figura 2.2. Efecto citoptico del herpes virus "lento" equino.

Microscopa de fluorescencia
La microscopa de fluorescencia puede ser usada para visualizar clulas o tejidos
infectados por virus, usando anticuerpos antgeno-especficos marcados con
fluorocromos. El anticuerpo se une especficamente a los antgenos virales presentes
dentro de las clulas o tejidos y los marca con la molcula fluorescente (generalmente
fluorescena). La marca fluorescente se observa posteriormente con un microscopio de
luz ultravioleta que excita a la molcula del fluorocromo, lo que uno observa como una
zona coloreada sobre un fondo relativamente oscuro. De manera alternativa, la
visualizacin puede llevarse a cabo de forma indirecta usando anticuerpos sin marca
(como los de sueros convalecientes) seguidos de la aplicacin de anticuerpos
marcados con fluorescena que se unen al primer anticuerpo. Los ensayos basados en
el uso de anticuerpos fluorescentes son usados comnmente en el diagnstico viral y
la investigacin.
Microscopa electrnica
La microscopa electrnica involucra la aceleracin de electrones a un estado de alta
energa y el enfoque magntico de los mismos hacia la muestra. Los electrones de alta
energa tienen longitudes de onda muy cortas, proporcionando as una mejor
resolucin de estructuras muy pequeas. La microscopa electrnica tiene suficiente
poder de resolucin para observar polmeros grandes como ADN y ARN, as como
protenas grandes. Para facilitar la visualizacin, las muestras pueden ser cubiertas
con metales pesados como osmio, antes de la examinacin con el microscopio
electrnico. Los electrones impactan el metal pesado y posteriormente son
visualizados en una pantalla fluorescente. La microscopa electrnica proporciona
imgenes tridimensionales de viriones y de su localizacin (nuclear o citoplasmtica)
dentro de la clula hospedera en un momento dado durante la infeccin. La
observacin de viriones en clulas vivas no es posible, debido a que las muestras
tienen que ser tratadas con metales pesados.

Microscopa de fuerza atmica


La microscopa de fuerza atmica trabaja a travs de la medicin de una propiedad
local (tal como altura, absorcin ptica, magnetismo, etc.) de una sonda puesta muy
cerca de la muestra. Esto hace posible tomar mediciones en un rea muy pequea de
la muestra. Los electrones son capaces de "atravesar por tnel" entre los tomos,
provocando una fuerza pequea pero cuantificable. El resultado de estas mediciones
es un mapa detallado del contorno o la superficie de la estructura. La ventaja de la
microscopa de fuerza atmica es que la preparacin de la muestra es mnima y
pueden usarse especmenes vivos. Este mtodo ha sido til para obtener imgenes
detalladas de estructuras de cpsides y de interacciones virus-clula.

Microscopa inmunoelectrnica
Esta tcnica permite la visualizacin de complejos antgeno / anticuerpo que son
especficos para un virus en particular. En este mtodo se obtienen cortes ultra finos
(de la muestra) y se incuban con un anticuerpo especfico para el virus. Despus de un
paso de lavado, el corte se incuba con Protena A conjugada con partculas de oro (de
un rango de 5 a 20 nm). Este conjugado se une a la porcin Fc del anticuerpo y se
detecta por microscopa electrnica.

Enumeracin directa de virus


Estimar el nmero de virus tiene una cantidad importante de usos, incluyendo
produccin de vacunas e investigacin. La microscopa electrnica se usa para
cuantificar las partculas virales en una solucin libre de clulas. Se examina un
volumen conocido de la muestra y se cuenta el nmero de viriones. Este nmero se
usa para calcular el nmero de virus. Una limitante es que las cpsides vacas, es
decir, partculas no infectantes, tambin son contadas. En investigacin, se compara el
nmero de partculas infectantes y el nmero total, y se establece una relacin de
partculas totales / partculas infecciosas para un virus dado.

Enumeracin indirecta de virus


Los mtodos indirectos de cuantificacin viral son aquellos que usan factores
asociados con la infectividad (actividad biolgica). Los tres mtodos principales usados
para determinar indirectamente concentraciones virales son: ensayos de
hemoaglutinacin, ensayos de formacin de placas y el mtodo de la dilucin limitante.

Hemoaglutinacin
Este ensayo se basa en la propiedad que tienen muchos virus envueltos para aglutinar
glbulos rojos (RBCs) o (GR). El ensayo se lleva a cabo en una microplaca, aadiendo
glbulos rojos a diluciones de la muestra que contiene virus, y observando
posteriormente la hemoaglutinacin. Son necesarias muchas partculas virales para
cubrir los glbulos rojos y producir hemoaglutinacin. Por ejemplo: se necesitan
aproximadamente 104 viriones de influenza por unidad hemoaglutinante (1 unidad de
HA). Una unidad de HA se define como la mxima dilucin de la muestra viral que
causa hemoaglutinacin completa. La hemoaglutinacin es til en la concentracin y
purificacin de algunos virus, y como prueba presuntiva rpida para la presencia de
este tipo de virus en fluidos de cultivos celulares infectados y de embriones de pollo.
Es especialmente til para probar actividad viral en cultivos celulares infectados con
virus hemoaglutinantes que producen un efecto citoptico (CPE) mnimo o no
detectable. Tambin pueden ser examinados directamente especmenes clnicos como
heces, para buscar actividad hemoaglutinante de partculas virales (se discutir
posteriormente en el captulo 7). Otros ensayos del mismo tipo, en los que se prueba
una actividad enzimtica de un virus en particular (como aquellos que producen
transcriptasa reversa), pueden ser llevados a cabo de manera similar.

Ensayo de formacin de placas


Este ensayo involucra la inoculacin de clulas hospederas susceptibles con un virus,
y usar su actividad biolgica para estimar el nmero de viriones presentes.
En este procedimiento se usan diluciones decimales seriadas del virus para inocular
monocapas de clulas hospederas. Despus de un periodo de incubacin en el que se
permite la adsorcin del virus a la superficie de las clulas hospederas, la monocapa
es cubierta por una capa de un gel compuesto por medio de cultivo para clulas
hospederas y agarosa. La presencia del agar evita la diseminacin a gran escala del
virus en el cultivo celular, pero permite la diseminacin localizada de clula a clula.
Con los virus citopticos, la destruccin de las clulas lleva a la formacin de zonas
desocupadas llamadas placas, que pueden ser vistas entre las 24 y 72 horas de
incubacin. Un clculo que involucra el nmero de placas observadas, el factor de
dilucin de la muestra y el volumen de muestra diluida utilizada, da como resultado las
unidades formadoras de placa (PFU) por mililitro de muestra.

El mtodo de dilucin limitante


Este ensayo basado en titulacin mide un efecto in vitro sobre las clulas, como el
CPE, cuando stas se expone a varias diluciones de la solucin que contiene el virus.
Si es posible, se usa una concentracin conocida de un virus de referencia como
control positivo. Dependiendo del virus, se hacen diluciones seriadas dobles o
diluciones seriadas decimales del material viral y se ponen en contacto con las clulas.
El ttulo infectivo (el recproco de la dilucin ms alta que provoca el 50% de CPE en el
cultivo infectado) se expresa como TCID50/ml (dosis infectiva 50 cultivo celular). Este
ensayo puede usarse con clulas en cultivo, embriones de pollo o incluso con
animales de laboratorio.

Mtodos miscelneos usados para caracterizacin


Hay algunos mtodos en virologa que son tiles en la identificacin y clasificacin de
virus desconocidos. Algunas de esas tcnicas sern mencionadas brevemente aqu,
pero si se usan en el diagnstico de laboratorio de un virus en particular, se explicarn
con detalle posteriormente.

Sensibilidad a solventes lipdicos


La sensibilidad de los virus a solventes lipdicos como cloroformo y ter es til en la
taxonoma de ciertos virus. Cualquier virus que posea envoltura es susceptible a
solventes lipdicos. Todos los virus envueltos de animales, excepto algunos virus de la
viruela, son sensibles al ter.

Identificacin del tipo de cido nucleico


Esto se lleva a cabo examinando la sntesis de cido nucleico en la clula, en
presencia de inhibidores de la sntesis de ADN, como la 5-bromo-2-desoxiuridina
(BRU). Si se inhibe la sntesis viral como consecuencia disminuir la multiplicacin
viral. En el caso de que el crecimiento viral no sea inhibido se presume que al virus
contiene ARN.

Anlisis con enzimas de restriccin


Las enzimas de restriccin (RE) son endonucleasas que cortan el ADN de doble
cadena en sitios de reconocimiento especficos que son secuencias palindrmicas que
van desde cuatro hasta ocho pares de bases de longitud. El anlisis con enzimas de
restriccin es particularmente til en la clasificacin de "subserotipos" virales, en la
diferenciacin de virus vivos modificados vacunales de virus virulentos y en el rastreo
epidemiolgico de brotes de enfermedades. Metodolgicamente esta tcnica consiste
en tratar el ADN viral con una o varias enzimas de restriccin y luego separar los
fragmentos resultantes por medio de electroforesis en geles de poliacrilamida.
Los virus de ARN pueden ser analizados de una manera similar haciendo primero el
ADN complementario (ADNc) al ARN viral usando la enzima transcriptasa reversa, y
luego amplificando este ADNc por el mtodo de PCR.

Hemoadsorcin
Virus envueltos como los ortomixovirus y paramixovirus adquieren su envoltura
externa por protrusin de yemas a travs de la membrana celular. Antes de la
protrusin, se incorporan a la membrana celular protenas codificadas por el virus
(hemoaglutininas). Esas clulas (aquellas a las se incorporaron hemoaglutininas a su
membrana) adsorben eritrocitos a su superficie, lo que trae como consecuencia la
formacin de focos de hemoadsorcin que pueden ser detectados microscpicamente.

Mtodos inmunolgicos
Los animales infectados con virus responden produciendo anticuerpos especficos. La
deteccin y cuantificacin de estos anticuerpos, que reflejan el estado de la
enfermedad, son tiles en la planeacin de programas de salud para el hato y estudios
epidemiolgicos de los brotes de enfermedades. Si bien la deteccin de anticuerpos es
til en el diagnstico de enfermedades tambin, con frecuencia es un proceso tardado
que requiere la comparacin de los niveles de anticuerpos en sueros de la fase aguda
de la enfermedad y de la convalecencia, sueros que se colectan con 10 a 14 das de
diferencia unos de otros. Una estrategia ms rpida es usar anticuerpos especficos
anti-virus para detectar antgenos virales directamente en especmenes clnicos. Estos
anticuerpos generalmente se obtienen por hiperinmunizacin de conejos o cabras con
un virus especfico. De manera alternativa pueden usarse anticuerpos monoclonales,
si hay disponibles. Los anticuerpos monoclonales (mAbs) se preparan en ratones
primero exponiendo al ratn al antgeno viral, que sensibiliza a las clulas B del bazo.
Estas clulas se colectan y se fusionan qumicamente con una lnea celular de
plasmocitoma de ratn que secreta IgG. Posteriormente estas clulas hbridas son
clonadas y los hibridomas resultantes, que son derivados de una sola clula, se
analizan para buscar secrecin de la IgG antiviral especfica. Las clulas del hibridoma
seleccionado son inyectadas de regreso por va intraperitoneal al ratn, donde las
clulas se multiplican rpidamente y causan la acumulacin de un fluido asctico que
contiene una alta concentracin de anticuerpos monoclonales.
La figura 2.1 muestra los pasos involucrados en la preparacin de los anticuerpos
monoclonales.

Los anticuerpos monoclonales son especialmente tiles en la tipificacin y


subtipificacin de virus. Cuando son acoplados a fluorocromos, los mAbs son muy
usados para la deteccin de virus en tejidos. Tambin son usados para la identificacin
de virus en muchos estuches diagnsticos comerciales de ELISAs.
Las pruebas ms comnmente usadas en virologa clnica o diagnstica sern
discutidas en el captulo 7.

Figura 2.3. Pasos asociados al desarrollo de anticuerpos monoclonales


especficos. Para ver oprima la figura

Glosario
Virus citopticos:
Son aquellos que alteran la apariencia microscpica de clulas en cultivo.
Estos cambios pueden incluir redondeo de las clulas, fusin celular,
desprendimiento celular, produccin de cuerpos de inclusin, etc.
Gradientes de densidad:
Procedimiento para separar clulas o macromolculas como protenas y cidos
nucleicos, generalmente usando centrifugacin a travs de un gradiente de
densidad. Este ltimo consiste en una solucin en la que hay un rango de
densidades del soluto (generalmente sacarosa o cloruro de cesio), menos
concentrado en la superficie y ms concentrado en el fondo. Como resultado
de la centrifugacin las clulas o macromolculas se desplazan a travs del
gradiente y forman una banda que se ubica donde su gravedad especfica es
igual a la densidad del medio.
Palndromos:
Secuencias que se leen igual en ambas direcciones. La mayora de los sitios
de reconocimiento de las endonucleasas de restriccin son palndromos, por
ejemplo la secuencia de reconocimiento de EcoR1 (E.coli) es:
5' GAATTC 3' 3' CTTAAG 5'

Procedimientos diagnsticos en las infecciones virales

Procedimientos diagnsticos
Los procedimientos bsicos para el diagnstico de laboratorio de virus, son el
aislamiento del virus, la demostracin del virus o algn producto viral en las muestras
clnicas (mtodo directo), y la deteccin y medicin de los anticuerpos especficos
contra un virus (mtodo indirecto). Cada procedimiento tiene sus mritos, pero la
demostracin directa del virus y/o de los productos virales es el mtodo ms eficaz y
til en el diagnstico de rutina.

Procedimientos de demostracin
Los mtodos directos incluyen la visualizacin de los viriones al microscopio
electrnico, detectando el genoma viral empleando sondas de referencia de AADN y
detectando antgenos virales por inmunofluorescencia. Este ltimo mtodo ha sido el
ms til en el diagnstico por laboratorio.

Mtodos de serologa general


Durante los estados tardos de la enfermedad, la prueba del suero de los animales
infectados, en busca de anticuerpos para virus especficos puede ser el nico medio
de diagnstico. Esto puede lograrse mediante varias pruebas serolgicas.
Las pruebas serolgicas ms comnmente empleadas en los laboratorios de
diagnstico veterinario para el diagnstico de infecciones virales son: prueba de
seroneutralizacin (SN); prueba de inhibicin de la hemoaglutinacin (IH); prueba de la
inmunodifusin en gel de agar (AGID por sus siglas en ingles) y prueba de ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Estas pruebas se basan en el hecho de
que la actividad viral puede ser inhibida y/o las protenas virales se ligan a un
anticuerpo especfico. Se prueban las diluciones del suero y se comunican los
resultados como el reciproco de la dilucin mas elevada en la cual se observa
actividad antiviral. De manera ideal, se compararan los resultados del suero colectado
durante la fase aguda de la enfermedad con los resultados del suero colectado
durante la convalecencia (dos colecciones de suero 14 - 21 das aparte). El
diagnstico se confirma si se observa un incremento cuatro veces mayor de los ttulos
de anticuerpos entre estos dos pares de muestras. Los resultados de una sola muestra
de suero (no pareada) son ms difciles de interpretar. Para los virus que causan una
infeccin aguda y se limitan as mismos, los resultados positivos solamente indican
que el animal ha estado expuesto, ya sea naturalmente o a travs de una vacunacin.
La interpretacin se hace ms fcil al muestrear un porcentaje de aquellos animales
que estuvieron enfermos versus aquellos que no lo estuvieron, pues los ttulos ms
altos generalmente indican una infeccin reciente. Para los virus que causan una
infeccin persistente o latente (ejemplo los herpesvirus o retrovirus), una serologa
positiva indica que el animal es un portador potencial del virus.
Los resultados positivos de pruebas reguladoras son siempre significativos sin
importar el ttulo de anticuerpo. Por sta razn, se han desarrollado otras pruebas
serolgicas ms estandarizadas y en forma de estuche de muestreo (kit). Por ejemplo
la prueba de inmunodifusin en gel de agar (AGID), conocida tambin como prueba de
Coggins, para la anemia equina infecciosa y la prueba de ELISA y aglutinacin de
ltex (LA) para seudorrabia. Los resultados de estas pruebas son comunicados como
positivos o negativos. A continuacin una discusin sobre los diferentes procesos de
diagnstico empleados.

Aislamiento del virus


Empleo: aislamiento e identificacin del virus. Durante la fase aguda de la enfermedad
es el mejor momento para demostrar y aislar virus. A medida que la enfermedad
avanza, se desarrollan los anticuerpos, se reduce la excrecin de virus y el virus es
despejado de los tejidos. Las manifestaciones clnicas de la enfermedad generalmente
encausan la seleccin de la muestra clnica apropiada, tales como hisopos nasales y
oculares en las infecciones de las vas respiratorias altas, heces de infecciones
entricas, sangre de infecciones sistmicas, etc. Los virus requieren de clulas vivas
para poderse replicar. En el laboratorio, se proporcionan clulas vivas como cultivos
celulares, cuyas clulas han sido obtenidas por digestin enzimtica de tejidos
animales. Las clulas son cultivadas en superficies de vidrio o plstico. Cuando las
muestras clnicas que contienen virus son inoculadas en cultivos celulares
susceptibles, el virus (si est viable) se replica y a menudo produce un
comportamiento caracterstico de patologa celular, caracterizado por cambios en la
apariencia celular, llamado efecto citoptico (CPE por sus siglas en ingles). En algunos
casos, el virus se replica sin ningn efecto apreciable sobre las clulas y debe ser
demostrado mediante pruebas de tinciones especiales que revelan cuerpos de
inclusin viral o anticuerpos fluorescentes (AF), para detectar antgenos virales. El
tiempo requerido para el aislamiento del virus flucta entre menos de 24 horas y hasta
varias semanas.

Anticuerpo fluorescente
Empleo: Para detectar antgeno viral en materiales clnicos o en cultivos celulares
infectados.
La prueba de anticuerpos fluorescentes (AF) detecta antgenos virales en clulas
infectadas con anticuerpos antivirales especficos que han sido marcados con un
colorante fluorescente (isotiocianato de fluorescena). Las pruebas de AF se efectan
en secciones de tejidos congelados, frotis de sangre, impresiones tisulares, raspados
o en cultivos celulares. Los resultados estn disponibles en menos de una hora y son
exactos a condicin de que el anticuerpo sea especfico y las muestras estn en
condiciones moderadamente buenas. Hay dos tipos bsicos de tcnicas de AF: directa
(DFA) e indirecta (IFA). En la prueba directa se marca el antgeno antiviral. Este
antgeno marcado se emplea para detectar los antgenos virales en secciones
congeladas de tejidos, raspados, frotis sanguneos, etc. La tcnica IFA es un
procedimiento en dos pasos: La muestra a ser examinada se hace reaccionar con un
anticuerpo antiviral no marcado. Despus de proporcionar un perodo de incubacin
suficiente para que haya una interaccin antgeno-anticuerpo (generalmente una hora
o menos), se lava la muestra y se incuba con un anticuerpo marcado dirigido contra
IgG de la muestra en la cual se prepar el anticuerpo antiviral no marcado. Este anti-
anticuerpo marcado se anclar al anticuerpo no marcado anclado al virus, y si esto
ocurre, se observa la fluorescencia y la prueba se considera positiva.
Ambas pruebas FA tienen ventajas y desventajas. La tcnica DFA se lleva a cabo ms
rpidamente y se emplea ms a menudo debido a la disponibilidad de los conjugados
DFA. La tcnica IFA, por otra parte, generalmente es ms sensible y especfica (si se
emplean anticuerpos monoclonales); se tarda ms tiempo pero solo requiere un
anticuerpo marcado si todos los anticuerpos antivirales son preparados en una sola
especie.

La prueba de inmunofluorescencia o anticuerpo fluorescente (FA) es la prueba ms til


empleada rutinariamente en el diagnstico viral. Comercialmente est disponible un
buen nmero de conjugados AF para la deteccin de virus. Los conjugados que
detectan virus en perros y gatos estn disponibles comercialmente.
Se emplea un mtodo indirecto llamado prueba de inmunofluorescencia para detectar
y medir anticuerpos. Esto involucra el infectar un cultivo de clulas con un virus y
despus prepararpuntos en lminas de microscopio con estas clulas infectadas. El
suero puede entonces ser examinado para un anticuerpo especfico hacindolo
reaccionar con las clulas infectadas seguido de una reaccin con el conjugado anti-
especie IgG. Los "puntos" que fluorescen (resultantes de la unin anticuerpo srico
ms conjugado anti-especie IgG) indica que el suero es positivo para la presencia de
anticuerpos especficos.

Inmunoperoxidasa
Empleo: para detectar antgeno viral en materiales clnicos y cultivos celulares.
La tcnica de inmunoperoxidasa es similar en principio al proceso de anticuerpo
fluorescente. La diferencia est en que el anticuerpo es conjugado a una enzima
(peroxidasa de rbano o fosfatasa alcalina), ms que a un compuesto fluorescente.
Aunque la enzima est ligada al anticuerpo, esta permanece activa y cuando se le
suministra su substrato, reacciona y da una reaccin en color. Esta tcnica tiene la
ventaja sobre la AF de que no requiere de microscopio fluorescente y es
especficamente til para localizar antgenos virales en lesiones histopatolgicas.

Prueba de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)


Empleo: Para detectar antgeno o anticuerpo. La sensibilidad de ELISA es comparable
con el radioinmunoensayo (RIA), el cual es similar en principio a la prueba de ELISA.
Se emplea un sistema de fase slida para la mayora de las pruebas ELISA. Para la
deteccin de virus, primero se adsorbe un anticuerpo especfico a la superficie de un
tubo de poliestireno, placa de microttulo, etc. y se aade la muestra que contiene el
virus sospechoso. Si el virus est presente, este se une al anticuerpo adsorbido.
Despus de lavado, se adiciona un anticuerpo antiviral especfico marcado con una
enzima (generalmente fosfatasa alcalina o peroxidasa de rbano). El anticuerpo
marcado reacciona con el complejo, creando un "efecto Sndwich". Luego del lavado,
se adiciona el substrato para la enzima, producindose una reaccin de coloracin.
Algunas pruebas se interpretan visualmente, pero se obtiene una mayor sensibilidad
mediante el anlisis espectrofotomtrico. Un proceso indirecto de ELISA es empleado
para la deteccin de anticuerpos. El antgeno es primero adsorbido a una fase slida,
seguido por la adicin del suero a analizar. Despus del lavado, se adiciona una anti-
gamaglobulina marcada con una enzima, seguida de la adicin de substrato
enzimtico. Las variaciones de la prueba corriente de ELISA incluye la competitividad
de ELISA para detectar el anticuerpo, en el cual la anti-gamaglobulina marcada con
una enzima es reemplazada con un anticuerpo antiviral marcado con una enzima. El
desarrollo de la coloracin posterior despus de la adicin del substrato enzimtico es
inversamente proporcional al nivel de anticuerpo presente en la muestra analizada. En
otras palabras, si el anticuerpo especfico ha sido ligado, el anticuerpo marcado con
una enzima no se ligar. As, las pruebas positivas son aquellas que no presentan una
reaccin de color o una reaccin menor que aquella de los controles apropiados. Otra
variacin es la cintica por ELISA, la cual se emplea para detectar anticuerpos contra
la borreliosis canina (enfermedad de Lyme), virus de la leucemia felina, peritonitis
infecciosa felina, toxoplasmosis felina y herpes virus bovino 1. En la cintica por
ELISA, la reaccin se monitorea continuamente durante cierto perodo de tiempo, en
lugar de pararla despus de un tiempo predeterminado. La prueba de ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y los sistemas de aglutinacin de ltex
(LA) detectan antgenos virales mediante la "captura" de los mismos con anticuerpos
especficos adsorbidos a un substrato apropiado. Estas tcnicas proporcionan un
diagnstico rpido y estn a menudo disponibles para su uso en "la oficina". Los
estuches disponibles comercialmente incluyen los estuches de ELISA y LA para
detectar rotavirus en heces de una gran variedad de especies animales, y estuches de
ELISA rpidos para detectar parvovirus canino en las heces y antgeno de la leucemia
viral felina en sangre.
Aglutinacin de ltex (LA)
Empleo: Para detectar antgeno o anticuerpo. Las pruebas de LA son similares en
principio a la aglutinacin bacterial ya que las partculas de ltex cubiertas con
anticuerpo, se aglutinarn cuando se mezclen con el antgeno correspondiente y as lo
identificarn. A la inversa, las partculas de ltex pueden ser cubiertas con antgenos y
emplearlas para detectar anticuerpos. Estas pruebas son fciles de efectuar y
producen resultados en pocos minutos. Los estuches comerciales empleados "en la
oficina" estn disponibles para detectar anticuerpos de algunas enfermedades y para
detectar algunos virus.

Microscopio electrnico (ME)


Empleo: Para demostrar virus en muestras clnicas. En la tcnica de microscopia
electrnica con tincin negativa, las muestras clnicas lisadas con agua destilada, se
"tien" con una solucin de tomos pesados. Esta tcnica se emplea principalmente
para el examen de aquellas muestras clnicas en las que se espera contengan un gran
nmero de partculas virales, tales como heces (coronavirus, rotavirus y parvovirus) y
lesiones vesiculares y similares a la viruela (herpesvirus y virus de la viruela). La
preparacin de la muestra y el examen ME generalmente puede completarse en 30
minutos.

Microscopio inmunoelectrnico
Empleo: Demostracin e identificacin de virus. La tcnica de tincin negativa del
microscopio electrnico mencionada anteriormente para la demostracin de virus, es
tambin til para la identificacin. El virus se hace reaccionar con el suero inmune,
produciendo una agrupacin que puede ser vista cuando se observa bajo el
microscopio electrnico.

Neutralizacin del virus (NV)


Empleo: para detectar y medir anticuerpos. La neutralizacin del virus es el mtodo
ms ampliamente empleado para detectar y medir anticuerpos virales de importancia
en veterinaria. Esta prueba es considerada como la ms exacta de todos los procesos
serolgicos, siendo menos propensa a variaciones y menos subjetiva en su
interpretacin. El principio de sta prueba se basa en el hecho de que la replicacin y
actividad del virus, ya sea el efecto citoptico (EC) en el cultivo celular, signos clnicos,
lesiones o muerte en huevos embrionados y en animales, que pueden ser inhibidos
por un anticuerpo viral especfico. Las pruebas De NV son casi siempre desarrolladas
empleando cultivos celulares. La cepa de virus para utilizar en las pruebas se cultiva,
se alcuota y se almacena a temperaturas ultra-bajas. Estos virus son dosificados
varias veces para determinar la cantidad de virus presente. Las diluciones del suero de
prueba se hacen en placas microtituladoras, seguido de la adicin de un volumen igual
de una suspensin viral diluida para contener aproximadamente 100 a 300 dosis
infectantes (una dosis infectante es el nmero mnimo de partculas virales necesarias
para establecer una infeccin). Despus de incubar el suero + virus durante 1 - 2
horas a temperatura ambiente (algunos sistemas utilizan 37C o an 4C), se
adicionan indicadores de cultivos celulares. Las placas se sellan, se incuban a 37C, y
se observan diariamente para ver el desarrollo del efecto citoptico viral. La presencia
de anticuerpo especfico en el suero a analizar inhibe la produccin de este efecto
citoptico.

La prueba de NV se emplea tambin para identificar un virus desconocido, aislado de


la misma manera descrita anteriormente. La nica diferencia es que el anticuerpo es
conocido y el virus es desconocido. Si el anticuerpo especfico inhibe el desarrollo de
EC del virus desconocido, se realiza la identificacin.
Prueba de inhibicin de la hemoaglutinacin
Empleo: Para detectar y medir anticuerpos. La prueba de inhibicin de la
hemoaglutinacin (IH) es similar en principio a la prueba NV, excepto que la actividad
viral inhibida es la hemoaglutinacin. Las pruebas IH son muy sensibles y altamente
especficas, y particularmente tiles para medir anticuerpos contra aquellos virus
hemoaglutinantes que se replican mal en cultivos celulares o producen poco o ningn
efecto citoptico. Los ejemplo s de tales virus son el virus de la influenza Tipo A en la
mayora de las especies, el virus de Newcastle de las aves y el parvovirus porcino. Las
pruebas IH se efectan en placas microtituladoras. Se hacen las diluciones del suero a
analizar, seguido de la adicin de un volumen igual de suspensin viral diluida que
contenga aproximadamente 4 a 8 unidades HA (una unidad HA es la dilucin ms alta
de la muestra viral que produce una hemoaglutinacin completa). Se aade una
suspensin apropiada de glbulos rojos y las placas se mezclan suavemente y se
dejan en incubacin por 1 - 2 horas a 4C (para la mayora de los virus). Si esta
presente el anticuerpo especfico en el suero a analizar, se inhibir la aglutinacin de
los glbulos rojos y estos se posarn en un "botn" bien definido. Las clulas
aglutinadas, en contraste, se posarn completamente en una capa delgada sobre todo
el fondo del pozo de la placa o formarn un botn de borde desigual e irregular.
El suero a analizar contiene frecuentemente inhibidores no especficos de la
aglutinacin y debe primero ser adsorbido con glbulos rojos antes de hacer la prueba.

Prueba de fijacin de complemento


Empleo: Deteccin y medicin de anticuerpos. Las pruebas de fijacin de
complemento (FC) son ms tiles como ayuda en el diagnstico de una infeccin viral
aguda o reciente, porque estas detectan primero IgM, la primera clase de
inmunoglobulinas en responder a la infeccin. La prueba impone el empleo de
antgenos virales, complemento de cobayo y un sistema indicador de CRS de oveja
sensibilizadas. Al reaccionar directamente al anticuerpo dirigido contra los antgenos
virales, sensibiliza los CRS de oveja. Este anticuerpo anti-CRS de oveja se refiere
como hemolisina y se prepara en conejos. El antgeno y el complemento son
dosificados y diluidos. Si no hay presencia de anticuerpos especficos en el suero
problema, el complemento queda libre para reaccionar con los CRS sensibilizados
produciendo lisis. Si estn presentes suficientes anticuerpos, el complejo antgeno-
anticuerpo especfico habr fijado al complemento y no se presentar lisis de los CRS.

Inmunodifusin
Empleo: Para detectar anticuerpos y antgenos especficos. Las dos tcnicas ms
empleadas de inmunodifusin son el sistema de placa de doble-difusin y la
imunoelectroforesis. Ambas pruebas se realizan en medio semislido generalmente
agar o agarosa. La diferencia esencial entre estos mtodos es que en la
imunoelectroforesis el antgeno es previamente fraccionado electroforticamente antes
de ser cubierto por el anticuerpo. En ambos mtodos, el antgeno y el anticuerpo se
funden uno contra otro formando una lnea de precipitacin en donde ellos reaccionan.
El sistema de placa de doble-difusin es la prueba de diagnostico ms comnmente
empleada. El ejemplo ms conocido es la "Prueba de Coggins" para la anemia equina
infecciosa.

La prueba de inmunodifusin se puede hacer ms sensible empleando un marcador


radioactivo, el cual permitir la deteccin de reacciones antgeno-anticuerpo no
visibles al ojo humano. El marcador radioactivo generalmente es el yodo ( 125I),tanto el
antgeno el anticuerpo pueden ser marcados. El marcaje ocurre por el acoplamiento
de 125I al aminocido tirosina. Las pruebas se leen cubriendo las placas o laminillas
con una pelcula de rayos x (radiografa) que registran las lneas radioactivas
(precipitacin).
Pruebas de proteccin
Empleo: identificacin de virus. Las pruebas de proteccin se emplean para la
identificacin de virus cuando no se dispone de otros mtodos menos engorrosos.
Estas pruebas involucran la produccin de una inmunidad activa o pasiva en un animal
o animales seguidos por desafos por el agente en cuestin. Un ejemplo de la prueba
de proteccin empleada anteriormente, es para la identificacin del virus del clera
porcino. La prueba se llevo a cabo mediante la inyeccin de suero de anti-clera
porcino simultneamente con sangre o suspensin de bazo de animales sospechosos
de tener clera porcino. Si el agente era el virus del clera porcino, la inmunidad
pasiva aportada por el suero anti-clera porcino podra proteger al cerdo de la dosis de
desafo. El control, un cerdo no protegido, padecera el clera porcino.

Hibridacin del cido nucleico


Empleo: Para detectar secuencias de AADN o ARN viral en el cido nucleico extrado
de muestras clnicas.
La hibridacin del cido nucleico consiste en lo siguiente:
La doble cadena del cido nucleico de un virus es desnaturalizado con un lcali par
separar las cadenas.
Las cadenas sencillas del cido nucleico se unen a un soporte slido, generalmente
nylon o membrana de nitrocelulosa, para prevenir que las cadenas se vuelvan a
unir. El cido nucleico se une a la membrana por medio de su columna vertebral de
azcar-fosfato; de esta forma las bases de nitrgeno estn proyectadas hacia el
exterior.
Unas sondas de referencia (molcula de ADN o ARN de cadena sencilla de origen
conocido conteniendo la secuencia de nucletidos especfica del virus blanco
marcada con una enzima o tomo radioactivo) es aadida a la membrana.
Ocurre la formacin de uniones de hidrgeno entre las bases complementarias. Las
sondas de referencia que no reaccionaron son removidas mediante lavado y se
detecta la hibridacin mediante un ensayo para detectar a la sondas de referencia.

Se emplean diferentes formas de ensayos de hibridacin de fase slida:


Hibridacin de Southern. Es una tcnica empleada para identificar la presencia de un
fragmento especfico de ADN. Hibridacin de Northern. Se emplea para detectar
secuencias especficas de RNA. Hibridacin de mancha (Dot Blot). Es un proceso
similar al Southern y al Northern y puede emplearse para detectar tanto AADN como
ARN. La diferencia es que el cido nucleico es colocado dentro de la nitrocelulosa en
un aparato que se enfoca sobre los puntos individuales en reas de concentracin,
parecido a las placas microtituladoras. Hibridacin in situ. El principio de estas tcnicas
es similar a la hibridacin de Southern y de Northern (deteccin de secuencias
especificas de nucletidos mediante una sondas de referencia marcada) excepto en
que ms que la extraccin del cido nucleico y su transferencia a una membrana de
nitrocelulosa, se prueban las clulas intactas o secciones de tejido al microscopio.
Esta tcnica se emplea poco en el diagnostico rutinario, sin embargo es muy valiosa
en estudios de investigacin y patognesis.
Las tcnicas de anlisis de restriccin enzimtica, reaccin en cadena de la
polimerasa y anlisis de datos obtenidos de microarreglos de ADN, son
particularmente tiles y se discutirn enseguida.

Anlisis de restriccin de enzimas


Empleo: identificacin de virus especficos. El anlisis de restriccin de enzimas utiliza
las enzimas llamadas endonucleasa de restriccin para "perfilar" la secuencia del
genoma de los virus. La presencia de mutaciones y/o variaciones genticas en los
sitios potenciales de clivaje en algunas cepas virales, producen diferentes modelos de
fragmentos cuando son separados en un gel de agarosa. Este anlisis es llamado
polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP) y se ha empleado
para caracterizar y comparar entre muestras aisladas en el campo de un virus dado.
La tcnica requiere gran cantidad de ADN viral purificado o parcialmente purificado, un
juego de enzimas restrictivas para clivar el ADN, la capacidad para separar los
fragmentos de ADN resultantes por electroforesis y un mtodo para documentar los
resultados.

El clivaje por restriccin del genoma de virus con genomas grandes, tales como los
citomegalovirus, puede producir 20 a 50 bandas ADN, mientras que los virus con
genomas ms pequeos como los adenovirus, generalmente producen solo cinco a
diez bandas ADN. No hay una forma fcil, ni es por lo general necesario, para
correlacionar el modelo (bandas faltantes o extras) con mutaciones de localizaciones
especficas en el genoma sin un estudio amplio de hibridacin molecular o an de
secuencias del genoma que se est comparando. Una limitacin distinta del mtodo es
que la presencia de una mutacin no puede ser detectada a menos que esa mutacin
se encuentre dentro de la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de
restriccin que se esta empleando la digestin del ADN. El empleo de diferentes
enzimas de restriccin optimizar la probabilidad de deteccin mutaciones en un
genoma en particular o en una porcin de genoma.

Reaccin de cadena de la polimerasa


Empleo: identificacin/ deteccin de virus especficos o secuencias especificas de un
gen.
La reaccin de cadena de la polimerasa (PCR) un mtodo in vitro de replicacin de
ADN, es capaz de amplificar segmentos de ADN por ms de un milln de veces. Una
sola copia del genoma viral se ampla - si est presente en el material clnico-
produciendo millones de copias que pueden ser fcilmente detectadas por
electroforesis. Esto es logrado al crear una reaccin mixta que, adems de la muestra
de ADN (conteniendo potencialmente el genoma blanco), contiene dos sondas de
referencia de oligonucletidos que complementan los extremos opuestos de cada
cadena de la secuencia blanco, deoxinucleosidos trifosfatos y una polimerasa
termoestable de ADN (polimerasa Taq ).
La mezcla de reaccin est entonces sujeta a un ciclo de temperatura con el fin de
facilitar la replicacin ADN y as aumentar la cantidad de ADN. Lo siguiente representa
un ciclo tpico:
El primer paso del ciclo PCR es la desnaturalizacin de la muestra ADN mediante
calentamiento de la mezcla de reaccin a 95C.
Segundo, la mezcla es enfriada para permitir que los fragmentos se unan al ADN
blanco.
Tercero, la mezcla es calentada a 72C para permitir la polimerizacin del ADN por
la polimerasa Taq ADN. Se repite el ciclo de temperatura del PCR, tpicamente 35 a
40 ciclos. De esta manera se pueden obtener ms de un milln de copias del ADN.

Una vez completado el nmero de ciclos deseados, se separa el ADN blanco por
electroforesis en gel y se analiza midiendo las bandas ADN o mediante la hibridacin
de Southern con sondas de referencia especficas. En la actualidad se dispone
comercialmente de cierto nmero de pruebas diagnosticas basadas en PCR. La PCR
es aplicable al estudio de virus ARN si se emplea primero la transcriptasa reversa para
hacer un cADN a partir del ARN blanco; denominado PCR transcriptasa reversa. Otras
alternativas de PCR son la PCR "en tiempo real", la cual analiza simultneamente las
muestras espectrofotometricamente para visualizar la polimerizacin y la PCR
anidada, la cual emplea un segundo equipo de sondas de referencia dentro de la
regin amplificada por el primer grupo. Cualquier tcnica es til cuando los niveles de
cido nucleico viral son bajos. La eficacia del PCR "en tiempo real" en diagnostico
clnico todava tiene que ser establecido.

Radioinmunoanlisis
Empleo: Para detectar antgeno o anticuerpo. En la actualidad, los sistemas de
radioinmunoanlisis se utilizan rara vez en los laboratorios de diagnostico veterinario.
Hay dos sistemas bsicos de radioinmunoanlisi (RIA), fase lquida y fase slida. En el
sistema de fase lquida, los complejos antgeno-anticuerpo son precipitados por la
subsiguiente adicin de anti-gammaglobulina. El precipitado se recolecta por
centrifugacin y secado. La cantidad de radioactividad en el precipitado comparado
con el total de radioactividad es una medida cuantitativa de la reaccin antgeno-
anticuerpo. El marcaje se hace con I125 (ver inmunodifusin) y cualquiera de los tres
componentes puede ser marcado. En el sistema de fase slida, se cubre el interior de
un tubo de poliestireno con el anticuerpo y entonces reacciona con el antgeno.
Brevemente, la muestra se adiciona al tubo de poliestireno previamente cubierto con
un anticuerpo antiviral. Si el antgeno est presente, este se fijara al anticuerpo que
cubre el tubo. Despus del lavado, se adiciona el anticuerpo antiviral marcado con 125 I,
el cual reacciona con el complejo produciendo un "efecto Sndwich". Se lava el tubo y
se determina la cantidad de radioactividad. Mientras que las tcnicas mencionadas
para la deteccin de antgeno se emplean como la primera aproximacin para el
diagnostico viral, en muchos casos estas tcnicas no son aplicables porque
frecuentemente las muestras apropiadas de animales vivos no estn disponibles.
Adems, los sistemas de deteccin rpida del antgeno no estn disponibles para
muchas enfermedades virales. En estos casos, se intenta el aislamiento del virus.

Anlisis de datos obtenidos de microarreglos de ADN


Empleo: identificacin de virus especficos o secuencias virales especficas.
El desarrollo de los microarreglos ha sido propulsado por la aplicacin de la tecnologa
robtica de rutina en la biologa molecular, ms que por cualquier descubrimiento
fundamental. Las tcnicas de hibridacin de Southern y de Northern para la deteccin
de ADN especfico y especies de mARN aporta la tecnologa bsica para la hibridacin
de microarreglos. La construccin de microarreglos implica el ver secuencias
especficas de ADN sobre una lmina de vidrio o contenedor de slice con la ayuda de
tecnologa robtica. La lmina de vidrio puede contener ms de 50 000 genes. Las
lminas son expuestas a una fuente de ADN marcado fluorescentemente. Un
computador monitorea la fluorescencia sobre la lmina, indicando en done el ADN
marcado se ha unido a la secuencia de ADN sobre la lmina.
Puesto que muchas de las secuencias ADN pueden presentarse sobre una lmina, es
posible para el anlisis de microarreglos el muestrear mltiples patgenos
simultneamente. Esto es particularmente importante para la determinacin de armas
biolgicas y en el diagnostico de enfermedades. Se dispone comercialmente de varias
microarreglos, tales como el sistema de deteccin Capital Bio_ SARSarrayTM-1.8 para
identificar estados iniciales de infeccin con el virus de SARS. Adems de los
microarreglos de cidos nucleicos, tambin se esta llevando a cabo el anlisis de
microarreglo de protenas. En este caso, uno est buscando la presencia de una
protena en particular.

Coleccin y remisin de especmenes


El diagnostico de laboratorio de enfermedades clnicas depende en gran parte de la
clase y condiciones de las muestras remitidas. Tambin depende de que el veterinario
y laboratorio trabajen en estrecha colaboracin. Puesto que muchas de las pruebas de
laboratorio son para agentes especficos de enfermedad, todas las remisiones deben ir
acompaadas de una historia clnica adecuada. Esto permitir al personal del
laboratorio el hacer pruebas adicionales si es necesario. Las guas generales para la
coleccin y remisin de muestras se presentan abajo. La mayora de los laboratorios
proporcionan un formulario de remisin de las muestras que puede ser completado
con la informacin pertinente disponible. En ausencia de un formulario, el veterinario
podr proporcionar una historia clnica tan completa como sea posible. Los
veterinarios deben contactar al laboratorio de diagnostico si tienen cualquier pregunta.

Animales
Se prefieren animales vivos o enfermos a animales muertos. Siempre que sea posible,
los animales deben ser remitidos directamente al laboratorio de diagnostico para una
necropsia completa. Si hay problema de hato, se debe remitir ms de un animal. Se
puede emplear el servicio de correo para embarcar animales pequeos, siempre y
cuando sean empacados en contenedores hermticos aislados con suficiente hielo o
"paquetes fros". No congelar animales que sern remitidos para necropsia.

Tejidos
Para minimizar la contaminacin durante la necropsia, es mejor recolectar
rutinariamente un grupo de tejidos, antes del examen completo. Los tejidos
recomendados son pulmn, rin, hgado, bazo, intestino delgado, intestino grueso y
ndulos linfticos mesentricos. Tejido cerebral o la cabeza deben tambin ser
colectados si se sospecha de enfermedad del sistema nervioso central. Deben
recolectarse otros tejidos que presenten anormalidades notadas durante el examen
completo. Una porcin de estos tejidos debe colocarse en bolsas plsticas hermticas
y colocarlas en refrigeracin. Mientras que se recomienda que cada tejido sea
colocado en una bolsa separada, es absolutamente esencial que el intestino est
separado de otros tejidos, de otra manera el examen bacteriolgico estar
comprometido.
Los tejidos deben ser llevados directamente al laboratorio o enviados en refrigeracin
por correo certificado servicio de noche, autobs, o por servicio de mensajera. Los
tejidos recolectados durante la segunda parte de la semana deben congelarse y
enviarse el lunes. Puesto que muchos virus producen lesiones microscpicas
caractersticas, pequeos trozos de cada tejido (1/4 de pulgada de grueso) deben
colocarse en formalina buferada al diez por ciento para examen histopatolgico. Debe
remitirse una mitad longitudinal completa del cerebro. Estas muestras no deben
congelarse.

Heces
Las heces pueden ser recolectadas de animales con enfermedad aguda y colocadas
en recipientes hermticos. Mientras los hisopos bien saturados son adecuados para
muchos de los exmenes virolgicos individuales, algunos mililitros o gramos de heces
permiten un trabajo de diagnostico ms completo, incluyendo el examen bacteriolgico
y parasitario. Las muestras deben ser remitidas al laboratorio empleando "paquetes
fros" como refrigerantes.

Hisopos
Se emplean hisopos nasales u oculares para el aislamiento de virus de animales con
infecciones del tracto respiratorio superior. Las infecciones genitales tambin pueden
diagnosticarse por el examen de hisopos recolectados del tracto reproductivo (vagina,
pene, mucosa etc.). Estos hisopos deben recolectarse de animales con enfermedad
aguda y deben ser colocados directamente en tubos con tapa de rosca que contienen
un medio de transporte viral. El muestreo de varios animales en diferentes estados de
la enfermedad incrementa la posibilidad de aislar el agente causal. Los hisopos
tambin son tiles para el muestreo de lesiones vesiculares. Las vesculas frescas
deben romperse y saturar el hisopo con el lquido exudado. Se deben recolectar dos
hisopos, uno para el aislamiento de virus y uno para microscopa electrnica. Los
hisopos para el aislamiento de virus deben ser colocados en medios de transporte viral
y los hisopos para microscopa electrnica deben colocarse en un tubo con tapa de
rosca que contenga una o dos gotas de agua destilada. Tambin se debe remitir el
material de costras de lesiones ms avanzadas.

Laminillas
Un nmero de enfermedades infecciosas puede diagnosticarse mediante el examen
de laminillas preparadas con sangre y tejidos. Los frotis de sangre se emplean para el
diagnostico de leucemia felina, mientras que los frotis de sangre y raspados
conjuntivales se emplean en el diagnostico de distemper canino. Los raspados
conjuntivales en particular son tiles para el diagnostico de infecciones por herpesvirus
y clamidia en gatos. Impresiones hechas del hgado, bazo y pulmones son
especialmente tiles para el diagnostico de infecciones por clamidias y herpes virus en
psitacinos.
Las laminillas deben tener suficiente cantidad de clulas para permitir un examen
completo y no ser demasiado gruesas lo cual podra causar dificultades a la tincin. El
raspador conjuntival o algn otro implemento (extremo romo de una hoja de bistur)
debe emplearse para raspar la conjuntiva; los hisopos de algodn no son adecuados.
Los ojos con secrecin deben limpiarse y enjuagarse antes de raspar la conjuntiva.
Las impresiones de tejido deben hacerse mediante ligeros toques sobre la laminilla de
microscopio con cortes frescos de tejido previamente secados con una toalla de papel
para absorber algo de sangre. Las laminillas deben secarse al aire y ser enviadas al
laboratorio en cajas para laminillas para prevenir que se rompan. Algunas laminillas
permiten un trabajo de diagnostico ms completo, incluyendo los exmenes
citolgicos.

Suero o plasma
Las muestras de sangre deben ser recolectadas en tubos estriles sin anticoagulantes.
Estos deben remitirse al laboratorio en recipientes de poliestireno especialmente
diseados para evitar que se rompan. Las muestras de sangre no deben congelarse o
permitir su sobre-calentamiento. Si las muestras no pueden ser enviadas al laboratorio
dentro de un tiempo razonable, puede removerse el suero y refrigerarlo o congelarlo.

Glosario
Alcuota:
Dividir en partes iguales (como una solucin)
Sondas de referencias:
Estos son pequeas extensiones de ADN o ARN empleadas para iniciar la
sntesis de cido nucleico. Una sonda de referencia se hibridiza con una
cadena modelo de cido nucleico y suministra la terminacin 3 hidroxlica para
la iniciacin de la sntesis. Estas sondas de referencia s delimitan la regin que
ser amplificada. En PCR, dos (a veces ms) sondas de referencia s sintticos
de oligonucletidos (con cerca de 20 nucletidos cada uno) que son
complementarios a las regiones en cadenas opuestas flanqueando la
secuencia blanco; la terminacin 3 hidroxlica es orientada una a otra. En PCR
la secuencia blanco de una muestra tiene entre 100 y 2000 bp de longitud. Se
emplean sondas de referencia diseadas y los sondas de referencia arbitrarias
("directamente de la repisa").
Pruebas regulatorias:
Estas son pruebas se llevan a cabo bajo el auspicio de agencias oficiales de
control de enfermedades, con el fin de controlar importantes enfermedades
animales infecciosas.
Endonucleasas de restriccin:
Son enzimas derivadas de bacterias que reconocen y clivan secuencias
especficas ADN.
Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin:
Estos revelan muchas diferencias en las secuencias ADN entre individuos de
una especie. RFLPs son producto del clivaje de ADN por enzimas de
restriccin (ver arriba), separacin de los fragmentos por electroforesis en gel y
visualizacin de las bandas (fragmentos de ADN) por tincin con bromuro de
etidio fluorescente.
Polimerasa Taq:
Esta es la polimerasa de ADN empleada en PCR. Es derivada de la
bacteria Thermus aquaticus que vive en riachuelos de agua caliente; la termo-
estabilidad de la polimerasa hace posible el PCR.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
ABBAS, A. K; LICHTMAN, A. H cellular and molecular immunology 5a edicin saunders
288 pag
BROOKS, G. F; BATEL, J S; MORSE, S.A 2002. Microbiologa Medica de Jawest,
Melnick y Aldelberg 17a ed manual moderno
FENNER, R; BACHMANN, P. A; GIBBS, E. P J; MURPHY, F; STUDDERT, M.J; WHITE
D 1992. Virologa veterinaria ed. Acribia S.A 691 p
KAYSER, F.H; BIENZ, K. A, ECKERT, J, ZINKERNAGEL, R.M 2005. Medical
Microbiology. Thieme Stuttgart New York. 724 p
MADIGAN, M.T; MARTINKO, J. M; PARKER, J. Brock biologa de los
a
microorganismos. 10 edicin Pearson Prentice Hall 1089 pg.
MURRAY, P. R, KABOYASHI G S, PFALLER M A, ROSENTHAL K S. 2001.
Microbiologa Mdica 2a ed. Harcourt Brace.
PUMAROLA A, RODRIGUEZ T. A, GARCIA R.J.A, PIEDROLA A.G. microbilogia y
parasitologa medica 2 edicin Salvat editores s.a 926 pg.
PRESCOTT LANSING M. 2002. Microbiology 5a Edicin Hardcover 1147 pag
SCHEGEJ HANS 1997. Microbiologa general 9a edicin, ediciones Omega 669 pg.

You might also like