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SELVA
FACULTAD DE ZOOTECNIA
MICROBIOLOGA ANIMAL
VIROLOGA BSICA
AUTOR
2016
Caractersticas generales, estructura y taxonoma viral
Generalidades
Estructura viral
Genoma viral
El genoma viral est compuesto por ADN o ARN. Un virus no contiene ADN y
ARN simultneamente. El ADN puede ser de una sola cadena (ss por sus
siglas en ingls) (parvovirus y circovirus), de doble cadena (ds por sus siglas en
ingls) (polyomavirus, adenovirus, herpesvirus), o parcialmente de doble
cadena (hepadnavirus). El genoma de ADN puede tener sus extremos
covalentemente ligados el uno al otro (circular = polyomavirus, circovirus) o no
estar unido por sus extremos (lineal = adenovirus, herpesvirus, parvovirus). El
genoma de los virus de viruela (poxvirus) es ssADN cuyos extremos estn
covalentemente unidos uno al otro.
Todos los genomas virales de ARN son lineales. La mayora de estos son
cadena sencilla y unos pocos son de cadena doble (reovirus, bornavirus). La
mayora de los virus de ARN tienes sus genomas en una sola pieza
(monopartita) mientras que otros lo tienen dividido en 10 segmentos (reovirus),
7 u 8 segmentos (ortomyxovirus), tres segmentos (bunyavirus) y dos
segmentos (arenavirus). En cuanto a ssARNs, hay dos posibilidades
importantes de secuencia:
Los genes contenidos dentro del genoma pueden codificar desde unos pocos
productos gnicos diferentes (Polyomavirus, 6 - 7 genes, 5000 nucletidos de
longitud) hasta ms de 70 - 100 productos gnicos diferentes (Herpesviridae,
60 a 120 genes, 120,000-220,000 pares de bases de nucletidos de longitud).
En general, los genomas de los virus ARN son ms pequeos, con un tamao
mximo de 30,000 nucletidos como se ve en los Coronavirus. Una hiptesis
para esto es que las polimerasas ARN virales tienden a cometer ms errores
que las polimerasas ADN. As, la fidelidad de la replicacin puede limitar el
tamao. En contraste, los genomas de virus de ADN pueden alcanzar un
tamao de hasta 300,000 nucletidos, como se ve en algunas especies de
Herpesvirus.
La cpside
Estructurales bsicas
Envolturas virales
Protenas Virales
Hay dos tipos bsicos de protenas codificadas por los virus: estructurales y no
estructurales. Las protenas estructurales son aquellas que son parte de la
estructura fsica del virin (cpside, envoltura), mientras que las protenas no
estructurales se producen dentro de la clula infectada y juegan diferentes
papeles en los pasos de replicacin viral. El nmero de protenas codificadas
por los genomas virales vara enormemente, desde tan pocas como dos
protenas, hasta cientos de ellas. Tpicamente las protenas estructurales son
aquellas que componen la cpside y que empaquetan el cido nucleico del
genoma viral. En algunos virus envueltos hay una capa proteica entre la
cpside y la envoltura (el tegumento). Las protenas que forman el tegumento
tambin son protenas estructurales. Las protenas de la estructura externa de
la cpside o envoltura son ligandos, que interactan con receptores en la
superficie de la clula blanco. Algunas de estas protenas (glicoprotenas) se
procesan en el lumen del retculo endoplsmico rugoso, donde se aaden
oligosacridos a la cadena polipeptdica. Estas protenas son enviadas al
aparato de Golgi, a las vesculas secretoras, y finalmente se fusionan con la
membrana plasmtica hacindose presentes sobre la superficie de la clula
infectada. Esto es especialmente importante para los virus envueltos. Las
glicoprotenas de la envoltura juegan papeles en la mediacin de la interaccin
entre los viriones y las clulas (anclaje, penetracin, fusin, diseminacin de
una clula a otra) y son los blancos principales de los anticuerpos
neutralizantes.
Lpidos
Carbohidratos
Taxonoma viral
Simetra de la cpside
Familia y tamao del virin Subfamilia Gneros Especies representativas
(nm)
Simetra de la cpside
Familia y tamao del virin Subfamilia Gneros Especies representativas
(nm)
Simetra de la cpside
Familia y tamao del virin Subfamilia Gneros Especies representativas
(nm)
Virus de la viruela de la
Capripoxvirus
oveja
Alfaherpes-virinae
Mareks disease-like
Gallid herpesvirus 2
viruses
Infectious laryngo-
Gallid herpesvirus 1
tracheitis-like viruses
Simetra de la cpside
Familia y tamao del virin Subfamilia Gneros Especies representativas
(nm)
Muromegalovirus Cytomegalovirus M1
Virus de la enteritis
Siadenovirus
hemorrgica del pavo
Simetra de la cpside
Familia y tamao del virin Subfamilia Gneros Especies representativas
(nm)
Simetra de la cpside y
Familia Subfamilia Gneros Especies representativas
tamao del virin (nm)
Simetra de la cpside y
Familia Subfamilia Gneros Especies representativas
tamao del virin (nm)
Virus de la inmunodeficiencia
Lentivirus
felina
Aquareovirus Aquareovirus A
Simetra de la cpside y
Familia Subfamilia Gneros Especies representativas
tamao del virin (nm)
Helicoidal;
150-200
Paramyxoviridae Henipavirus Virus Hendra
a
1000-10,000
Virus de la enfermedad de
Avulavirus
Newcastle
Virus de la estomatitis
Vesiculovirus
vesicular de Indiana
Virus de la hematopoyesis
Novirhabdovirus
necrtica infecciosa
Simetra de la cpside y
Familia Subfamilia Gneros Especies representativas
tamao del virin (nm)
Helicoidal;
Bunyaviridae
80-100 Virus de la enfermedad de las
Nairovirus
ovejas de Nairobi
Virus de la coriomeningitis
Arenavirus
linfoctica
Arenaviridae Helicoidal; 50-300
Virus de la hepatitis humana
Deltavirus
D
Simetra de la cpside y
Familia Subfamilia Gneros Especies representativas
tamao del virin (nm)
Simetra de la cpside y
Familia Subfamilia Gneros Especies representativas
tamao del virin (nm)
Virus defectuosos
Los virus defectuosos son aquellos cuyo genoma carece de un gen o genes
especficos, debido a mutacin. Como resultado de lo anterior, los virus
defectuosos no son capaces de llevar a cabo un ciclo de vida productivo en las
clulas. Sin embargo, si la clula infectada con el virus defectuoso est co-
infectada con un "virus ayudante" el producto del gen que carece el virus
defectuoso es complementado por el virus ayudante, y el virus defectuoso
puede replicarse. Es interesante que, para algunos virus, durante la infeccin
se produce una mayor cantidad de viriones defectuosos que de viriones
infecciosos (tanto como 100:1). La produccin de partculas defectuosas es
caracterstica de algunas especies virales y se cree que modera la severidad
de la infeccin/enfermedad in vivo. Los virusoides, que son ejemplo de virus
defectuosos, se discutirn ms adelante en esta seccin.
Pseudoviriones
Priones
Viroides
Virusoides
Los virusoides (tambin llamados ARN satlites) son similares a los viroides en
el sentido de que son cidos nucleicos desnudos, de bajo peso molecular,
extremadamente resistentes al calor y a las radiaciones ultravioletas y
ionizantes. Sin embargo, dependen de un virus ayudante para la replicacin.
Los virusoides se replican en el citoplasma de la clula a travs de una
polimerasa ARN dependiente de ARN.
Glosario
Bacterifago:
Un virus que infecta clulas procariontes y tiene muchos de los atributos
de los virus de plantas y animales. Requiere una bacteria viva para llevar
a cabo su ciclo reproductivo.
Protrusin de yemas:
A travs de este proceso los virus envueltos adquieren su envoltura. Es
precedido por la insercin de glicoprotenas virus-especficas en la
membrana celular del hospedero. Este proceso ocurre ms
frecuentemente en la membrana plasmtica y confiere infectividad.
Mucopolisacrido:
Una clase de polisacrido (glucoaminoglicanos) como heparina, cido
hialurnico y sulfato de condroitina, que absorben agua para formar un
material espeso mucoide, gelatinoso.
Oligosacrido:
Una azcar que contiene un nmero pequeo y conocido de unidades
de monosacridos.
Replicacin viral
Glosario
Ambisense:
Se refiere a un genoma de ARN que contiene informacin en su
secuencia tanto en sentido positivo (que puede ser usada directamente
como ARNm) como en sentido negativo (que debe ser transcrita a la
forma de ARNm).
Replicacin conservadora:
Replicacin de ADNds o ARNds de tal forma que las cadenas originales
no forman parte de la progenie recin formada de ADNds o ARNds.
Vescula endoctica:
Una vescula formada en el proceso de endocitosis, el "englobamiento"
del virus, que puede ser mediada por receptores de superficie o
interacciones de la membrana celular.
Membrana de Golgi:
Membrana asociada con el aparato de Golgi de una clula eucaritica.
El aparato de Golgi recibe los lpidos y protenas recin sintetizados del
retculo endoplsmico, los modifica qumicamente y los transfiere al
lugar apropiado de la clula.
Cuerpos de inclusin:
Estos representan las "fbricas" de virus en las que los cidos nucleicos
virales o las protenas virales estn siendo sintetizadas.
Ligasa:
Enzima del hospedero que crea uniones covalentes en los cidos
nucleicos asociadas con cortes en el esqueleto de azcares y fosfatos
de la molcula.
Monocistrnico:
Que contiene informacin para un solo gene o para un solo producto
gentico.
Monopartita:
Genoma viral que contiene un solo segmento.
Genomas multi-componentes:
Genomas integrados por ms de una molcula de cido nucleico
constituyendo el total de su genoma.
Mutgenos:
Agentes fsicos o qumicos que incrementan la frecuencia de mutacin
del ADN de un organismo.
ADN sentido negativo:
ADN cuya transcripcin no produce una molcula de ARN que pueda ser
usada directamente como ARNm. Es el molde para la creacin de
genomas de ARN sentido negativo.
Policistrnico:
Que contiene informacin para varios genes o productos genticos.
ADN sentido positivo:
ADN cuya transcripcin produce el genoma de los ARN sentido positivo,
o que puede ser usado directamente como ARN mensajero.
Transcriptasa reversa:
Enzima viral que usa un molde de ARN para sintetizar ADN.
Replicacin semiconservadora:
Replicacin de ADNds o ARNds en la que las cadenas originales (una
original y una recin sintetizada) forman parte de la progenie de ADNds
o ARNds recin formada.
Genomas de un solo componente:
Genomas que tienen una sola molcula de cido nucleico y esta
constituye el total de su genoma.
Tautmeros:
Formas isomtricas de compuestos orgnicos. Cuando dos de estas
formas existen en equilibrio se conoce como tautomerismo.
Transcriptasa:
Enzima viral capaz de usar una molcula de ARN como molde para la
transcripcin.
Tipo silvestre:
El virus natural. Estos virus se usan como cepas de referencia para la
comparacin de mutantes y variantes de un virus en particular.
Hospederos animales
En el pasado, la propagacin de virus en organismos hospederos susceptibles no
infectados era la nica manera de obtener grandes cantidades de virus. Actualmente el
uso de animales experimentales como hospederos para propagacin viral est limitado
por razones ticas. La propagacin viral en animales es ms til para aquellos virus
que no crecen fcilmente en cultivos celulares. Por ejemplo: cepas vacunales del virus
de la enteritis hemorrgica de pavo pueden ser propagadas tanto en aves vivas como
en cultivos celulares. Sin embargo los productos propagados en bazo (de aves vivas)
parecen ser ms usados que los propagados en cultivo. Para fines diagnsticos la
inoculacin de animales es un medio para detectar virus en muestras clnicas, como el
virus de la rabia en ratones lactantes.
Huevos embrionados
Antes del desarrollo de las tcnicas de cultivo de clulas y de tejidos, el uso de huevo
embrionado para propagacin viral fue una de las primeras alternativas al uso de
organismos animales hospederos. El huevo embrionado es an el mtodo preferido
para la propagacin de virus de influenza tipo A y para muchos otros virus aviares. El
huevo embrionado tambin es til en la diferenciacin de algunos virus que producen
lesiones similares, como los virus de la viruela de la vaca y los virus de la pseudo
viruela de la vaca. Aunque el virus de la enfermedad de la lengua azul (BTV) es un
virus de mamferos, se replica bien en huevo embrionado, por lo que este sistema se
usa para propagacin viral con fines diagnsticos y de investigacin. Cuando se usa
huevo embrionado, uno debe considerar la posible presencia de anticuerpos maternos
(IgY) en el saco vitelino del huevo. Por lo tanto, frecuentemente es preferible obtener
huevo embrionado de parvadas libres de patgenos especficos (SPF). El dar pases
en embrin de pollos es til en la atenuacin de ciertos virus para vacunas de virus
vivo modificado.
Cultivo de clulas/tejidos
El cultivo de tejidos se refiere al crecimiento y mantenimiento de clulas de tejidos
vivos in vitro. Hay bsicamente dos tipos: cultivo de explantes y cultivo de clulas. Los
explantes son pequeos fragmentos de tejidos del hospedero que se mantienen en
cultivo, mientras que el cultivo de clulas se obtiene mediante de la disgregacin de
diferentes tejidos del hospedero en clulas individuales. La mayora de los sistemas
usados en virologa son en realidad cultivos celulares y no cultivos de tejidos, aunque
ambos trminos se usan de manera indistinta. Los cultivos celulares se subdividen a
su vez en cultivos primarios, cultivos semi-continuos y cultivos continuos.
Figura 2.1. Cultivo celular normal.
Cultivo de explantes
Estos son cultivos de pequeos fragmentos de tejidos especficos, tomados
directamente del hospedero animal. Los cultivos de explantes son tiles para el
aislamiento viral y se requieren para el aislamiento de algunos coronavirus. La
demostracin de latencia de algunos alfa herpesvirus humanos y animales puede
requerir explantes de ganglio nervioso sensitivo (por ejemplo, trigmino).
Cultivos celulares primarios
Estos se derivan de tejidos frescos que han sido digeridos enzimticamente con
tripsina u otras proteasas, para liberar clulas individuales. Como resultado, con
frecuencia los cultivos primarios estn compuestos de muchos tipos celulares
diferentes. En condiciones in vitro las clulas de los cultivos primarios raramente
pueden dividirse, o se dividen a una velocidad muy baja. Es por esto que tienen un
tiempo de vida limitado, conocido como lmite de Hayflick. A pesar del tiempo de vida
limitado de los cultivos primarios, son ideales para el aislamiento de algunos virus. Los
cultivos primarios raramente sobreviven ms all del vigsimo pase in vitro.
Cultivos semi-continuos
Son tambin conocidos como lneas celulares diploides, debido a que contienen el
cromosoma diploide normal caracterstico de la especie de la que ellos se derivan. Los
cultivos semi-continuos son cultivos primarios que tienen algunas clulas que pueden
ser cuidadas para sobrevivir ms all del lmite de Hayflick. Los cultivos semi-
continuos tienden a morir entre el 30 y el 50 pase in vitro. A pesar de esta limitante,
los cultivos semi-continuos son tiles en la propagacin de una gran variedad de virus.
Los cultivos semi-continuos son por lo general de fibroblastos.
Microscopa de fluorescencia
La microscopa de fluorescencia puede ser usada para visualizar clulas o tejidos
infectados por virus, usando anticuerpos antgeno-especficos marcados con
fluorocromos. El anticuerpo se une especficamente a los antgenos virales presentes
dentro de las clulas o tejidos y los marca con la molcula fluorescente (generalmente
fluorescena). La marca fluorescente se observa posteriormente con un microscopio de
luz ultravioleta que excita a la molcula del fluorocromo, lo que uno observa como una
zona coloreada sobre un fondo relativamente oscuro. De manera alternativa, la
visualizacin puede llevarse a cabo de forma indirecta usando anticuerpos sin marca
(como los de sueros convalecientes) seguidos de la aplicacin de anticuerpos
marcados con fluorescena que se unen al primer anticuerpo. Los ensayos basados en
el uso de anticuerpos fluorescentes son usados comnmente en el diagnstico viral y
la investigacin.
Microscopa electrnica
La microscopa electrnica involucra la aceleracin de electrones a un estado de alta
energa y el enfoque magntico de los mismos hacia la muestra. Los electrones de alta
energa tienen longitudes de onda muy cortas, proporcionando as una mejor
resolucin de estructuras muy pequeas. La microscopa electrnica tiene suficiente
poder de resolucin para observar polmeros grandes como ADN y ARN, as como
protenas grandes. Para facilitar la visualizacin, las muestras pueden ser cubiertas
con metales pesados como osmio, antes de la examinacin con el microscopio
electrnico. Los electrones impactan el metal pesado y posteriormente son
visualizados en una pantalla fluorescente. La microscopa electrnica proporciona
imgenes tridimensionales de viriones y de su localizacin (nuclear o citoplasmtica)
dentro de la clula hospedera en un momento dado durante la infeccin. La
observacin de viriones en clulas vivas no es posible, debido a que las muestras
tienen que ser tratadas con metales pesados.
Microscopa inmunoelectrnica
Esta tcnica permite la visualizacin de complejos antgeno / anticuerpo que son
especficos para un virus en particular. En este mtodo se obtienen cortes ultra finos
(de la muestra) y se incuban con un anticuerpo especfico para el virus. Despus de un
paso de lavado, el corte se incuba con Protena A conjugada con partculas de oro (de
un rango de 5 a 20 nm). Este conjugado se une a la porcin Fc del anticuerpo y se
detecta por microscopa electrnica.
Hemoaglutinacin
Este ensayo se basa en la propiedad que tienen muchos virus envueltos para aglutinar
glbulos rojos (RBCs) o (GR). El ensayo se lleva a cabo en una microplaca, aadiendo
glbulos rojos a diluciones de la muestra que contiene virus, y observando
posteriormente la hemoaglutinacin. Son necesarias muchas partculas virales para
cubrir los glbulos rojos y producir hemoaglutinacin. Por ejemplo: se necesitan
aproximadamente 104 viriones de influenza por unidad hemoaglutinante (1 unidad de
HA). Una unidad de HA se define como la mxima dilucin de la muestra viral que
causa hemoaglutinacin completa. La hemoaglutinacin es til en la concentracin y
purificacin de algunos virus, y como prueba presuntiva rpida para la presencia de
este tipo de virus en fluidos de cultivos celulares infectados y de embriones de pollo.
Es especialmente til para probar actividad viral en cultivos celulares infectados con
virus hemoaglutinantes que producen un efecto citoptico (CPE) mnimo o no
detectable. Tambin pueden ser examinados directamente especmenes clnicos como
heces, para buscar actividad hemoaglutinante de partculas virales (se discutir
posteriormente en el captulo 7). Otros ensayos del mismo tipo, en los que se prueba
una actividad enzimtica de un virus en particular (como aquellos que producen
transcriptasa reversa), pueden ser llevados a cabo de manera similar.
Hemoadsorcin
Virus envueltos como los ortomixovirus y paramixovirus adquieren su envoltura
externa por protrusin de yemas a travs de la membrana celular. Antes de la
protrusin, se incorporan a la membrana celular protenas codificadas por el virus
(hemoaglutininas). Esas clulas (aquellas a las se incorporaron hemoaglutininas a su
membrana) adsorben eritrocitos a su superficie, lo que trae como consecuencia la
formacin de focos de hemoadsorcin que pueden ser detectados microscpicamente.
Mtodos inmunolgicos
Los animales infectados con virus responden produciendo anticuerpos especficos. La
deteccin y cuantificacin de estos anticuerpos, que reflejan el estado de la
enfermedad, son tiles en la planeacin de programas de salud para el hato y estudios
epidemiolgicos de los brotes de enfermedades. Si bien la deteccin de anticuerpos es
til en el diagnstico de enfermedades tambin, con frecuencia es un proceso tardado
que requiere la comparacin de los niveles de anticuerpos en sueros de la fase aguda
de la enfermedad y de la convalecencia, sueros que se colectan con 10 a 14 das de
diferencia unos de otros. Una estrategia ms rpida es usar anticuerpos especficos
anti-virus para detectar antgenos virales directamente en especmenes clnicos. Estos
anticuerpos generalmente se obtienen por hiperinmunizacin de conejos o cabras con
un virus especfico. De manera alternativa pueden usarse anticuerpos monoclonales,
si hay disponibles. Los anticuerpos monoclonales (mAbs) se preparan en ratones
primero exponiendo al ratn al antgeno viral, que sensibiliza a las clulas B del bazo.
Estas clulas se colectan y se fusionan qumicamente con una lnea celular de
plasmocitoma de ratn que secreta IgG. Posteriormente estas clulas hbridas son
clonadas y los hibridomas resultantes, que son derivados de una sola clula, se
analizan para buscar secrecin de la IgG antiviral especfica. Las clulas del hibridoma
seleccionado son inyectadas de regreso por va intraperitoneal al ratn, donde las
clulas se multiplican rpidamente y causan la acumulacin de un fluido asctico que
contiene una alta concentracin de anticuerpos monoclonales.
La figura 2.1 muestra los pasos involucrados en la preparacin de los anticuerpos
monoclonales.
Glosario
Virus citopticos:
Son aquellos que alteran la apariencia microscpica de clulas en cultivo.
Estos cambios pueden incluir redondeo de las clulas, fusin celular,
desprendimiento celular, produccin de cuerpos de inclusin, etc.
Gradientes de densidad:
Procedimiento para separar clulas o macromolculas como protenas y cidos
nucleicos, generalmente usando centrifugacin a travs de un gradiente de
densidad. Este ltimo consiste en una solucin en la que hay un rango de
densidades del soluto (generalmente sacarosa o cloruro de cesio), menos
concentrado en la superficie y ms concentrado en el fondo. Como resultado
de la centrifugacin las clulas o macromolculas se desplazan a travs del
gradiente y forman una banda que se ubica donde su gravedad especfica es
igual a la densidad del medio.
Palndromos:
Secuencias que se leen igual en ambas direcciones. La mayora de los sitios
de reconocimiento de las endonucleasas de restriccin son palndromos, por
ejemplo la secuencia de reconocimiento de EcoR1 (E.coli) es:
5' GAATTC 3' 3' CTTAAG 5'
Procedimientos diagnsticos
Los procedimientos bsicos para el diagnstico de laboratorio de virus, son el
aislamiento del virus, la demostracin del virus o algn producto viral en las muestras
clnicas (mtodo directo), y la deteccin y medicin de los anticuerpos especficos
contra un virus (mtodo indirecto). Cada procedimiento tiene sus mritos, pero la
demostracin directa del virus y/o de los productos virales es el mtodo ms eficaz y
til en el diagnstico de rutina.
Procedimientos de demostracin
Los mtodos directos incluyen la visualizacin de los viriones al microscopio
electrnico, detectando el genoma viral empleando sondas de referencia de AADN y
detectando antgenos virales por inmunofluorescencia. Este ltimo mtodo ha sido el
ms til en el diagnstico por laboratorio.
Anticuerpo fluorescente
Empleo: Para detectar antgeno viral en materiales clnicos o en cultivos celulares
infectados.
La prueba de anticuerpos fluorescentes (AF) detecta antgenos virales en clulas
infectadas con anticuerpos antivirales especficos que han sido marcados con un
colorante fluorescente (isotiocianato de fluorescena). Las pruebas de AF se efectan
en secciones de tejidos congelados, frotis de sangre, impresiones tisulares, raspados
o en cultivos celulares. Los resultados estn disponibles en menos de una hora y son
exactos a condicin de que el anticuerpo sea especfico y las muestras estn en
condiciones moderadamente buenas. Hay dos tipos bsicos de tcnicas de AF: directa
(DFA) e indirecta (IFA). En la prueba directa se marca el antgeno antiviral. Este
antgeno marcado se emplea para detectar los antgenos virales en secciones
congeladas de tejidos, raspados, frotis sanguneos, etc. La tcnica IFA es un
procedimiento en dos pasos: La muestra a ser examinada se hace reaccionar con un
anticuerpo antiviral no marcado. Despus de proporcionar un perodo de incubacin
suficiente para que haya una interaccin antgeno-anticuerpo (generalmente una hora
o menos), se lava la muestra y se incuba con un anticuerpo marcado dirigido contra
IgG de la muestra en la cual se prepar el anticuerpo antiviral no marcado. Este anti-
anticuerpo marcado se anclar al anticuerpo no marcado anclado al virus, y si esto
ocurre, se observa la fluorescencia y la prueba se considera positiva.
Ambas pruebas FA tienen ventajas y desventajas. La tcnica DFA se lleva a cabo ms
rpidamente y se emplea ms a menudo debido a la disponibilidad de los conjugados
DFA. La tcnica IFA, por otra parte, generalmente es ms sensible y especfica (si se
emplean anticuerpos monoclonales); se tarda ms tiempo pero solo requiere un
anticuerpo marcado si todos los anticuerpos antivirales son preparados en una sola
especie.
Inmunoperoxidasa
Empleo: para detectar antgeno viral en materiales clnicos y cultivos celulares.
La tcnica de inmunoperoxidasa es similar en principio al proceso de anticuerpo
fluorescente. La diferencia est en que el anticuerpo es conjugado a una enzima
(peroxidasa de rbano o fosfatasa alcalina), ms que a un compuesto fluorescente.
Aunque la enzima est ligada al anticuerpo, esta permanece activa y cuando se le
suministra su substrato, reacciona y da una reaccin en color. Esta tcnica tiene la
ventaja sobre la AF de que no requiere de microscopio fluorescente y es
especficamente til para localizar antgenos virales en lesiones histopatolgicas.
Microscopio inmunoelectrnico
Empleo: Demostracin e identificacin de virus. La tcnica de tincin negativa del
microscopio electrnico mencionada anteriormente para la demostracin de virus, es
tambin til para la identificacin. El virus se hace reaccionar con el suero inmune,
produciendo una agrupacin que puede ser vista cuando se observa bajo el
microscopio electrnico.
Inmunodifusin
Empleo: Para detectar anticuerpos y antgenos especficos. Las dos tcnicas ms
empleadas de inmunodifusin son el sistema de placa de doble-difusin y la
imunoelectroforesis. Ambas pruebas se realizan en medio semislido generalmente
agar o agarosa. La diferencia esencial entre estos mtodos es que en la
imunoelectroforesis el antgeno es previamente fraccionado electroforticamente antes
de ser cubierto por el anticuerpo. En ambos mtodos, el antgeno y el anticuerpo se
funden uno contra otro formando una lnea de precipitacin en donde ellos reaccionan.
El sistema de placa de doble-difusin es la prueba de diagnostico ms comnmente
empleada. El ejemplo ms conocido es la "Prueba de Coggins" para la anemia equina
infecciosa.
El clivaje por restriccin del genoma de virus con genomas grandes, tales como los
citomegalovirus, puede producir 20 a 50 bandas ADN, mientras que los virus con
genomas ms pequeos como los adenovirus, generalmente producen solo cinco a
diez bandas ADN. No hay una forma fcil, ni es por lo general necesario, para
correlacionar el modelo (bandas faltantes o extras) con mutaciones de localizaciones
especficas en el genoma sin un estudio amplio de hibridacin molecular o an de
secuencias del genoma que se est comparando. Una limitacin distinta del mtodo es
que la presencia de una mutacin no puede ser detectada a menos que esa mutacin
se encuentre dentro de la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de
restriccin que se esta empleando la digestin del ADN. El empleo de diferentes
enzimas de restriccin optimizar la probabilidad de deteccin mutaciones en un
genoma en particular o en una porcin de genoma.
Una vez completado el nmero de ciclos deseados, se separa el ADN blanco por
electroforesis en gel y se analiza midiendo las bandas ADN o mediante la hibridacin
de Southern con sondas de referencia especficas. En la actualidad se dispone
comercialmente de cierto nmero de pruebas diagnosticas basadas en PCR. La PCR
es aplicable al estudio de virus ARN si se emplea primero la transcriptasa reversa para
hacer un cADN a partir del ARN blanco; denominado PCR transcriptasa reversa. Otras
alternativas de PCR son la PCR "en tiempo real", la cual analiza simultneamente las
muestras espectrofotometricamente para visualizar la polimerizacin y la PCR
anidada, la cual emplea un segundo equipo de sondas de referencia dentro de la
regin amplificada por el primer grupo. Cualquier tcnica es til cuando los niveles de
cido nucleico viral son bajos. La eficacia del PCR "en tiempo real" en diagnostico
clnico todava tiene que ser establecido.
Radioinmunoanlisis
Empleo: Para detectar antgeno o anticuerpo. En la actualidad, los sistemas de
radioinmunoanlisis se utilizan rara vez en los laboratorios de diagnostico veterinario.
Hay dos sistemas bsicos de radioinmunoanlisi (RIA), fase lquida y fase slida. En el
sistema de fase lquida, los complejos antgeno-anticuerpo son precipitados por la
subsiguiente adicin de anti-gammaglobulina. El precipitado se recolecta por
centrifugacin y secado. La cantidad de radioactividad en el precipitado comparado
con el total de radioactividad es una medida cuantitativa de la reaccin antgeno-
anticuerpo. El marcaje se hace con I125 (ver inmunodifusin) y cualquiera de los tres
componentes puede ser marcado. En el sistema de fase slida, se cubre el interior de
un tubo de poliestireno con el anticuerpo y entonces reacciona con el antgeno.
Brevemente, la muestra se adiciona al tubo de poliestireno previamente cubierto con
un anticuerpo antiviral. Si el antgeno est presente, este se fijara al anticuerpo que
cubre el tubo. Despus del lavado, se adiciona el anticuerpo antiviral marcado con 125 I,
el cual reacciona con el complejo produciendo un "efecto Sndwich". Se lava el tubo y
se determina la cantidad de radioactividad. Mientras que las tcnicas mencionadas
para la deteccin de antgeno se emplean como la primera aproximacin para el
diagnostico viral, en muchos casos estas tcnicas no son aplicables porque
frecuentemente las muestras apropiadas de animales vivos no estn disponibles.
Adems, los sistemas de deteccin rpida del antgeno no estn disponibles para
muchas enfermedades virales. En estos casos, se intenta el aislamiento del virus.
Animales
Se prefieren animales vivos o enfermos a animales muertos. Siempre que sea posible,
los animales deben ser remitidos directamente al laboratorio de diagnostico para una
necropsia completa. Si hay problema de hato, se debe remitir ms de un animal. Se
puede emplear el servicio de correo para embarcar animales pequeos, siempre y
cuando sean empacados en contenedores hermticos aislados con suficiente hielo o
"paquetes fros". No congelar animales que sern remitidos para necropsia.
Tejidos
Para minimizar la contaminacin durante la necropsia, es mejor recolectar
rutinariamente un grupo de tejidos, antes del examen completo. Los tejidos
recomendados son pulmn, rin, hgado, bazo, intestino delgado, intestino grueso y
ndulos linfticos mesentricos. Tejido cerebral o la cabeza deben tambin ser
colectados si se sospecha de enfermedad del sistema nervioso central. Deben
recolectarse otros tejidos que presenten anormalidades notadas durante el examen
completo. Una porcin de estos tejidos debe colocarse en bolsas plsticas hermticas
y colocarlas en refrigeracin. Mientras que se recomienda que cada tejido sea
colocado en una bolsa separada, es absolutamente esencial que el intestino est
separado de otros tejidos, de otra manera el examen bacteriolgico estar
comprometido.
Los tejidos deben ser llevados directamente al laboratorio o enviados en refrigeracin
por correo certificado servicio de noche, autobs, o por servicio de mensajera. Los
tejidos recolectados durante la segunda parte de la semana deben congelarse y
enviarse el lunes. Puesto que muchos virus producen lesiones microscpicas
caractersticas, pequeos trozos de cada tejido (1/4 de pulgada de grueso) deben
colocarse en formalina buferada al diez por ciento para examen histopatolgico. Debe
remitirse una mitad longitudinal completa del cerebro. Estas muestras no deben
congelarse.
Heces
Las heces pueden ser recolectadas de animales con enfermedad aguda y colocadas
en recipientes hermticos. Mientras los hisopos bien saturados son adecuados para
muchos de los exmenes virolgicos individuales, algunos mililitros o gramos de heces
permiten un trabajo de diagnostico ms completo, incluyendo el examen bacteriolgico
y parasitario. Las muestras deben ser remitidas al laboratorio empleando "paquetes
fros" como refrigerantes.
Hisopos
Se emplean hisopos nasales u oculares para el aislamiento de virus de animales con
infecciones del tracto respiratorio superior. Las infecciones genitales tambin pueden
diagnosticarse por el examen de hisopos recolectados del tracto reproductivo (vagina,
pene, mucosa etc.). Estos hisopos deben recolectarse de animales con enfermedad
aguda y deben ser colocados directamente en tubos con tapa de rosca que contienen
un medio de transporte viral. El muestreo de varios animales en diferentes estados de
la enfermedad incrementa la posibilidad de aislar el agente causal. Los hisopos
tambin son tiles para el muestreo de lesiones vesiculares. Las vesculas frescas
deben romperse y saturar el hisopo con el lquido exudado. Se deben recolectar dos
hisopos, uno para el aislamiento de virus y uno para microscopa electrnica. Los
hisopos para el aislamiento de virus deben ser colocados en medios de transporte viral
y los hisopos para microscopa electrnica deben colocarse en un tubo con tapa de
rosca que contenga una o dos gotas de agua destilada. Tambin se debe remitir el
material de costras de lesiones ms avanzadas.
Laminillas
Un nmero de enfermedades infecciosas puede diagnosticarse mediante el examen
de laminillas preparadas con sangre y tejidos. Los frotis de sangre se emplean para el
diagnostico de leucemia felina, mientras que los frotis de sangre y raspados
conjuntivales se emplean en el diagnostico de distemper canino. Los raspados
conjuntivales en particular son tiles para el diagnostico de infecciones por herpesvirus
y clamidia en gatos. Impresiones hechas del hgado, bazo y pulmones son
especialmente tiles para el diagnostico de infecciones por clamidias y herpes virus en
psitacinos.
Las laminillas deben tener suficiente cantidad de clulas para permitir un examen
completo y no ser demasiado gruesas lo cual podra causar dificultades a la tincin. El
raspador conjuntival o algn otro implemento (extremo romo de una hoja de bistur)
debe emplearse para raspar la conjuntiva; los hisopos de algodn no son adecuados.
Los ojos con secrecin deben limpiarse y enjuagarse antes de raspar la conjuntiva.
Las impresiones de tejido deben hacerse mediante ligeros toques sobre la laminilla de
microscopio con cortes frescos de tejido previamente secados con una toalla de papel
para absorber algo de sangre. Las laminillas deben secarse al aire y ser enviadas al
laboratorio en cajas para laminillas para prevenir que se rompan. Algunas laminillas
permiten un trabajo de diagnostico ms completo, incluyendo los exmenes
citolgicos.
Suero o plasma
Las muestras de sangre deben ser recolectadas en tubos estriles sin anticoagulantes.
Estos deben remitirse al laboratorio en recipientes de poliestireno especialmente
diseados para evitar que se rompan. Las muestras de sangre no deben congelarse o
permitir su sobre-calentamiento. Si las muestras no pueden ser enviadas al laboratorio
dentro de un tiempo razonable, puede removerse el suero y refrigerarlo o congelarlo.
Glosario
Alcuota:
Dividir en partes iguales (como una solucin)
Sondas de referencias:
Estos son pequeas extensiones de ADN o ARN empleadas para iniciar la
sntesis de cido nucleico. Una sonda de referencia se hibridiza con una
cadena modelo de cido nucleico y suministra la terminacin 3 hidroxlica para
la iniciacin de la sntesis. Estas sondas de referencia s delimitan la regin que
ser amplificada. En PCR, dos (a veces ms) sondas de referencia s sintticos
de oligonucletidos (con cerca de 20 nucletidos cada uno) que son
complementarios a las regiones en cadenas opuestas flanqueando la
secuencia blanco; la terminacin 3 hidroxlica es orientada una a otra. En PCR
la secuencia blanco de una muestra tiene entre 100 y 2000 bp de longitud. Se
emplean sondas de referencia diseadas y los sondas de referencia arbitrarias
("directamente de la repisa").
Pruebas regulatorias:
Estas son pruebas se llevan a cabo bajo el auspicio de agencias oficiales de
control de enfermedades, con el fin de controlar importantes enfermedades
animales infecciosas.
Endonucleasas de restriccin:
Son enzimas derivadas de bacterias que reconocen y clivan secuencias
especficas ADN.
Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin:
Estos revelan muchas diferencias en las secuencias ADN entre individuos de
una especie. RFLPs son producto del clivaje de ADN por enzimas de
restriccin (ver arriba), separacin de los fragmentos por electroforesis en gel y
visualizacin de las bandas (fragmentos de ADN) por tincin con bromuro de
etidio fluorescente.
Polimerasa Taq:
Esta es la polimerasa de ADN empleada en PCR. Es derivada de la
bacteria Thermus aquaticus que vive en riachuelos de agua caliente; la termo-
estabilidad de la polimerasa hace posible el PCR.
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