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CURITIBA
2003
TATIANE NASCIMENTO PETTERLE
CURITIBA
2003
AGRADECIMENTOS
Professora Mara Eliza Gasino Joineau, pela sua grande amizade, pacincia e
orientao.
Ao Djalma, por sua capacidade e eficincia, que torna possivel o trabalho dirio no
laboratrio de virologia do COME.
chefia do Centro de Diagnstico "Marcos Enriretti" pelo apoio para a realizao deste
trabalho e a todos os amigos do laboratrio.
2. LOCAL DE ESTGIO 04
2.1. ATIVIDADES REALIZADAS .. . 07
3. CULTIVO CELULAR 10
3.1. MEIOS DE CULTIVO.. .. 11
3.2. PREPARAO DOS MEIOS.. .. 11
3.3. PASSAGEM DAS CELULAS E CULTIVO.. ..12
3.4. DESCONGELAMENTO DE CELULAS ...................................... 12
3.5. CONTAGEM CELULAR. ...... 13
3.6. ARMAZENAMENTO DAS CELULAS.. .. 14
4.TCNICAS DE DIAGNSTICO VIRAL MAIS UTILIZADA NO ESTGIO PARA
DETECO DE ANTICORPOS 15
4.1. ELISA ENZIME L1NKED IMMUNOSORBENT ASSAY ENSAIO
IMUNOENZIMTICO 15
4.1.1. Mlodo de Elisa para Peste Suna Clssica (PSC) utilizado no CDM 16
4.2. TESTE DE SORONEUTRALlZAO.. .. 18
4.2.1. Produo Viral . ....... 19
4.2.2. Titulao Viral .. .. 19
4.2.3. Soroneutralizao para PSC ou Cepas Virais no citopatognica . .. 22
4.2.3.a. Procedimentos 22
4.2.3.b. Prova direta com anticorpos conjugados com fluorescena ou IFO 23
4.2.3.c. Prova indireta com anticorpos conjugados com fluorescena ou IFI 23
4.2.3.d. Prova direta com anticorpos conjugados com peroxidase ou IPO... . 23
4.2.3.e. Prova indireta com anticorpos conjugados com peroxidase ou IPI 24
4.2.3,(. Validao, Leitura e Interpretao .. .. 24
4.2.4. Soro neutralizao p/ Estomatite Vesicular ou cepas Virais Citopatognicas 25
4.2.4.a. Diluio do Soro 26
4.2.4.b. Diluio Viral 26
4.3. IMUNODIFUSO EM GEL DE GAR .... . 27
7.3. EPIDEMIOLOGIA .. . 50
7.4. PATOGENIA ... ...51
1 - ORGANOGRAMA .. . 06
2 - SALA DO CULTIVO, REALIZANDO UMA PASSAGEM DE CLULA VERO 09
3 - EFEITO CITOPTICO DO VRUS DA DOENA DE AUJESZKY .46
4 - MONOCAMADA DE CLULA SK6 SEM EFEITO CITOPTICO .46
5 - ESQUEMA VRUS DA RAIVA . ....50
6 - REPRESENTAO DO CORPSCULO DE NEGRI INTRACITOPLASMTICOS EM
CLULAS NERVOSA E AUSNCIA DO MESMO._ ........... 53
7- REPRESENTAO DO RESULTADO POSITIVO EM CREBRO DECAMUNDONGO
DA TCNICA IFD - INSTITUTO PASTEUR, SP .. . 57
8 - REPRESENTAO DO MTODO DE INOCULAO INTRACEREBRAL EM
CAMUNDONGOS -INSTITUTO PASTEUR, SP .. .... 59
9 - REPRESENTAO DOS SINAIS DA RAIVA EM CAMUNDONGOS- INSTITUTO
PASTEUR, SP ... .... 59
vii
LISTA DE TABELAS
EMISSO DO LAUDO .. .. 03
viii
RESUMO
ix
1. INTRODUO
resposta imunolgica mediada por anticorpos (alm de clulas) que persiste por longo
tempo e pode ser detectada por uma variedade de tcnicas. Os anticorpos produzidos em
vricas deve ser corretamente interpretada, sob o risco de levar a concluses errneas.
Por exemplo, para a grande maioria das infeces vricas, sorologia positiva (presena de
algumas infeces vricas (retrovrus [BLV, HIV, FIV, AlE, CAEV], herpesvrus [HSV, VZV,
PRV, BHV-1, BHV-S, EHV]), o vrus estabelece infeces persistentes ou latentes aps a
infeco inicial. Nesses casos, sorologia positiva (com algumas excees) indica que o
animal portador do vrus (em retrovrus, infeco ativa com eliminao viral; em
referem-se a animais que so soro positivos a esses vrus devido a anticorpos adquiridos
passivamente pela placenta e/ou colostro, alm de animais vacinados. Nesses casos,
(www.ufsll.brlsvlLccnic<ls.html )
saber como as amostras foram coletadas e que tcnicas laboratoriais devem ser usadas
(C.Arroyo; 2000).
EMISSO DO LAUDO.
Virologia, como o Cultivo Celular, Deteco de anticorpos e antgenos e com mais nfase
as Tcnicas para diagnstico da Doena de Aujeszky e da Raiva. importante ressaltar
que todas as Tcnicas realizadas no COME seguem os protocolos do "Qffice International
des Epizooties" (OIE, 2000).
FIGURA 1 ORGANOGRAMA
Fonte: COME
2.1. ATIVIDADES REALIZADAS NO ESTGIO
Fonte: A autora
10
3. CULTIVO CELULAR
As tcnicas de Cultivo Celular esto descritas nesta primeira etapa, pois servem
como substrato para vrias tcnicas citadas a seguir para deteco de anticorpos e
antgenos.
As culturas de clulas so bastante utilizadas em diagnsticos laboratoriais para
tcnicas como o isolamento viral, soroneutralizao, titulao e produo viral.
O cultivo celular um termo geral usado para designar os procedimentos que
permitem a manuteno e reproduo de clulas de animaisin vitro (CALVA, ARROYO;
2000).
Para a maioria das linhagens os meios de cultivo esto constitudos por um meio
nutriente mnimo tamponado e isotnico que contm sais orgnicos uma fonte de energia
e aminocidos.
O Meio Bsico Eagle (MEM) foi um dos primeiros a ser utilizado e principalmente
para as clulas aderentes formadora de monocamada (Eagle, 1955).
Para permitir o crescimento celular, os meios bsicos necessitam da adio de
suplementos como glutamina, lisina, soro fetal bovino, bicarbonato de sdio e soluo
antibitica.
No COME o meio utilizado o MEM suplementado com soro fetal bovino,
glutamina, lisina, bicarbonato de Sdio e soluo antibitica e antifngica.
O meio Eagle comprado liofilizado, o premix dissolvido em gua estril
acrescentado de SFB (10%), antibitico (penicilina - 100 a 200 UI / mL, estreptomicina-
o material a ser utilizado para o preparo do meio e para o cultivo celular deve ser
lavado atenciosamente retirando restos de material txico e contaminao da superfcie
interna, e esterilizado. Separase um volume total de gua estril num recipiente para a
diluio do premix filtrando. Depois adiciona soluo de bicarbonato at obter uma
concentrao final de 2,Ogll (0,2%), esta concentrao pode variar de acordo com o meio.
Em seguida deve adicionar soluo de 1 Molar de NaOH ou 1 Molar de HCL at alcanar
um pH de 7,0 - 7,2.
12
A preparao do meio pronto para uso a partir desse meio Base j filtrado
adicionado de soro fetal bovino (SFB), TPB (caldo triptose fosfato), glutamina, antibitico
e antifngico.
o processo se inicia com a escolha de qual clula preciso ser passada. Depois
se liga o fluxo laminar e separa o material necessrio (garrafa para cultivo estril, meio de
Eagle, pipetas, vidraria para o descarte de material dentro do fluxo). Ento abre a garrafa
despreza o contedo e adiciona soluo Tampo Fosfato de Sdio (PBS) para lavar as
clulas, pois as protenas do SFB contidas no meio neutralizam a ao da Tripsina.
Despreza essa soluo e adiciona soluo de tripsina (lisa as ligaes peptdicas entre as
clulas) para separar as clulas (desmanchar a monocamada formada). Algumas clulas
necessitam ser colocada na estufa para acelerar a ao da tripsina como exemplo a SK6
de rim de suno. Despreza o excesso de tripsina quando as clulas comearem a se
individualizar. Ainda para ajudar a soltar as clulas pode usar ao fsica sobre a garrafa.
Observa no microscpio invertido se as clulas esto soltas. Aspira com uma pipeta o
sobrenadante da garrafa e solta para dissolver os grumos celulares. Coloca 10 ml de meio
de crescimento Eagle nessa garrafa e homogeneza. Com auxlio de uma pipeta divide
essa soluo de clulas em duas novas garrafas (5 ml em cada garrafa). Identifica ~se as
garrafas com O nome da clula, nmero da passagem e o dia que foi realizada. Observa
no microscpio e coloca na estufa mida a 370C com 5% de CO2.
CO,.
Para esse processo se dilu urna ampola de clula em 5mL de meio. Nesse caso foi
feito com a clula MOBK. realizado esse processo para saber a quantidade de clulas
que se tem por garrafa (contagem) para realizar testes como saroneutralizao que
necessita de no mnimo 150.000 a 300.000 clulas por mL.
Separa num frasco 50 I-IL de corante Azul de Evans e adiciona 100 I-IL de clulas
mistura e coloca na Cmara de Fuchs - Rosenthal com lamnula e faz a leitura. A leitura
realizada em microscpio invertido lendo apenas os quatro quadrantes das extremidades
da Cmara subdivididos em 16 partes. Aps a contagem dessas clulas pertencentes a
esses quadrantes, utilizase a equao 1.
(1)
x+y+z+w = X.1,5x5000
4
Fonte:
Diluio 1 /100
x + y +z + w = X . 1,5 . 5000
4
4 + 4 +4 +4 = 4 . 1,5.5000
4
4.1.1 Mtodo de Elisa para Peste Suna Clssica (PSC) utilizado no COME
A Peste Suna Clssica (PSC) uma enfermidade viral contagiosa que acomete
somente sudeos. A doena causada por um vrus da famlia Flaviviridae, gnero
Pestivrus.
Cepas de alta virulncia determinam doena aguda com quadros de hemorragias
mltiplas, quando a mortalidade pode alcanar 100%. Cepas de baixa e moderada
virulncia determinam o aparecimento de formas atpicas, crnicas ou sub-clnicas da
doena.
O vrus da PSC antigenicamente relacionado ao vrus da Diarria Bovina e
Doena da Fronteira, Pestivrus de ruminantes que podem infectar sunos.
(2 )
% Bloqueio = O O neg - O O amostra x 100
O O neg
18
Titular dar a medida quantitativa da atividade duma suspenso vira!. E ser dada
pela maior diluio que mostrar atividade, por exemplo, 10.3,10-4 ou na diluio: 1:1000,
1:10000, etc. Representando 1000, 10000 unidades vricas (Mayr el ai, 1988).
Para a realizao da tcnica so separados 10 tubos de ensaio em uma bandeja
de gelo, cada um preenchido com 4,5 mL de meio de manuteno. Descongelar uma
ampola do vrus, a ser titulado, acrescentando 0,5 mL no primeiro tubo, agita-se e
repassado o volume de 0,5 mL para o segundo tubo e assim sucessivamente at o
dcimo tubo onde a diluio ser de 10-10 ou 1: 10.000.000.000. Separa-se trs
microplacas, coloca 50llL de meio em cada pocinho das trs placas. Coloca-se 50llL do
dcimo tubo na dcima coluna da placa, do nono tubo na nona coluna da placa e assim
sucessivamente, deixando a dcima primeira e dcima segunda coluna para controle de
clulas. Depois de colocar o ltimo tubo, reservar em geladeira.
Prepara a clula a ser usada ressuspendendo-a como se fosse fazer uma
passagem de clula. Acrescenta 100J1L dessa suspenso de clula em cada pocinho das
trs placas em uma concentrao de 150.000 a 300.000 clulas por ml. Faz-se a primeira
leitura com no mnimo 48 horas de incubao.
Interpretao do Resultado - Mtodo de Spearman Karber
(3 )
T=t+ t*
t* = efeito ou 100% = ltima coluna que foi observado efeito em todos os pocinhos.
"'1=~-1
8 8
t>t = 11 - 4 = 7/ 8 = 0,875
8
t>t = 0,875
T=t>t+t'
T= 1 +6
T= 7
T=1O-7 ~L t>t = 4 + 8 - 4
-8- 8
t>t= 12-4
-8-
t>t =1
Ento tira-se a mdia entre os resultados das placas e obtm-se o Ttulo Viral para
nCID 50.
1 TCID 50 = 10-<9
10 TCID 50 = 10-5,9
100 TCID 50 = 10-",9
22
Para realizar os testes usado 100 TCIO, ou seja, usa-se 10 -4,9 que significa uma
diluio do vrus a 1: 79.432 em meio de manuteno.
4.2.3.a Procedimentos
Distribuir 80 !J.L de MEM nos pocinhos da primeira fila e SOul nos demais da
microplaca;
Adicionar 50 ~I por pocinho da suspenso viral contendo 100 TCIDso. A mistura soro-
Para a revelao das provas as clulas devem ser fixadas da seguinte maneira
aps o perodo de incubao, as placas devem ser invertidas para a retirada do meio
de cultivo, lavadas 1 vez com P8S ou salina 0,15 M com 0,05 % de Tween 80 e
colocadas invertidas para fixao em forno 80 C por 1 hora ou a 37 2C por 4 horas.
23
Aps o perodo de incubao, as placas so lavadas por 3 vezes em PBS (pH 7,2) ou
em soluo salina 0,15 M com 0,05 % de Tween 80;
Para a revelao da prova utilizada a soluo de substrato cromognico, 3-amino-9-
etil-carbazol - AEC + H202 por 5 - 10 minutos a temperatura ambiente;
Realizar a leitura em microscpio tico comum.
outro lado, a presena de tais focos indicar a ausncia de anticorpos especficos contra
Suna Clssica que atualmente no mais realizada no COME porque o Estado Livre
pelo vrus da Febre Aftosa e do Exantema Vesicular dos sunos. O vrus intecta bovinos,
comum o vrus no produzir as clssicas vesculas nos animais afetados nos surtos, mas
Adicionar os soroS. Nos primeiros coloca 10 jJL de soro, ficando 1:2 a diluio. Com uma
pipeta apropriada repassar os soros para os demais pocinhos diluindo at 1:320.
Num recipiente com gua e gelo, prepara-se 6 tubos para a diluio do vrus.
Coloca-se 4,5ml de meio Eagle 2% SFB em todos os tubos. No recipiente reservado para
a Diluio de Trabalho (DT) coloca 19,36 ml de meio Eagle 2% SFB adicionado de
antibitico e antifngico. Ento o vrus descongelado. Colocam-se 0,5 ml de soluo
viral nos trs primeiros tubos (-1,-2 e -3), repassando 0,5 para cada tubo. Depois se
pipeta 0,640 ml da diluio 1/1000 e coroca no DT agitando-o. Coloca 0.5 ml do DT nos 3
tubos restantes ( DT-1, DT-2 e DT-3) repassando de um para o outro, realizando assim
uma retrotitulao vira1. Aps isso coloca-se 50 I1L do tubo DT -3 na ltima coluna da
antepenltima coluna. Ento pega 50 J.lI do DT e coloca na quarta coluna de traz para
frente. Nos duas primeiras colunas deixa para controle de clula, no coloca vrus. Nas
Separa 137,5 mL de gua destilada, 2,5 grama de gar NobJe (p) num Becker e
coloca em banho-maria para dissolver. Depois despeja essa soluo em uma bandeja
que vai para a geladeira ocorrendo solidificao do gel. Corta-se esse gel em quadrados
com aproximadamente 2 x 2 reservando-os num recipiente com tampa numa soluo de
gua destilada + 0,1 % de Azida Sdica.
Prepara a placa de Petri com gar. Depois se fura o gel com uma roseta de 7 furos.
Aspira o gel dos furos da roseta com um maquinrio prprio para isso. Adiciona os soros
nos 4 furos laterais da roseta e no furo de cima soro positivo e no de baixo tambm, j no
furo do meio coloca~se o agente. Reserva a temperatura ambiente por 24 horas para
realizar a primeira leitura e com 48h libera o laudo.
29
Arroyo, 2000).
Existem dois mtodos para realizar esta prova, o primeiro se realiza diluies
decrescentes do vrus frente quantidades constantes do soro (mtodo alfa) e no outro se
realiza diluies do soro frente quantidades constante de vrus (mtodo beta).
O mtodo beta o mais comumente utilizado, o nmero de unidades
Aps a incubao adicionar aos poos, 50 J.l1 de hemcias de cobaia a 0,6% preparada
em PBS tratado com 0,4% de albumina bovina;
32
Adicionar 100 ~ILdo antgeno viral com 4UHA no primeiro poo de duas filas da
microplaca
A partir desses, transferir 50).l1 da suspenso para os poos subsequentes da fila, os
quais j devero conter 501-11PBS com 1% de albumina bovina. Deste modo,
estabelecida uma diluio com base 2, para a aferio do nmero de doses UHA do
antgeno viral
Aps a incubao adicionar aos poos, 50 ).lL de hemcias de cobaia a 0,6%
preparada em PBS tratado com 0,4% de albumina bovina;
Incubar a placa por 1 - 2 horas a temperatura ambiente
4.4.1.e. Validao
CO,;
anteriormente obtido em 8 pocinhos para cada uma das diluies 10.1 e 10 -2;
Adicionar 100 I-lL de MEM tratado com antibiticos e 2 % de soro fetal bovino, por
poo;
para permitir as leituras com 24, 48 e 72 horas de incubao, nos casoS de cepas
imunomarcadores.
Aps o perodo de incubao, as placas devem ser invertidas para a retirada do meio
de cultivo, lavadas 1 vez com PBS ou salinas 0,15 M com 0,05 % de Tween 80 e
5.2.2.d. A prova direta de revelao dessa prova segue os mesmos passos da colorao
de placas do item 3.2.3.b at 3.2.3.e.
36
5.2.2.e. Validao.
citoplasmtica.
imunomarcadores.
37
COME.
6.1. HISTRICO
o vrus da Doena de Aujeszky (DA) foi diagnosticado pela primeira vez no Brasil
em 1947. Mas at 1978, poucos focos foram identificados, eles se replicaram entre 1979
e 1982, quando a doena se tornou relevante, com surtos principalmente nos Estados de
So Paulo, Paran e Santa Catarina. A partir de 1984, foi implantado um programa de
monitoramento sorolgico e erradicao da DA em granjas de reprodutores sunos, com
controle de comercializao e certificao de estabelecimentos livres da doena
(Brentano - Embrapa - CNPSA, 1992).
6.2. ETIOLOGIA
6.3. PATOGENIA
animais de terminao, as perdas podem ser considerveis devido anorexia, com baixo
ganho de peso e retardo no crescimento. Cachaas e fmeas em lactao ocorre mamite
e agalaxia nas porcas, constipao, febre, depresso, sonolncia sinais respiratrios ou
paralisia do trem posterior. Porcas gestantes o vrus penetra atravs da placenta e causa
infeco fetal, acarretando sinais reprodutivos que dependem do perodo da gestao.
At os 30 dias, ocorrem reabsoro fetal e retorno ao cio. Entre 60 e 80 dias, ocorre morte
de um ou mais fetos e aborto. No final da gestao, pode haver parto prematuro ou
pario de fetos macerados, mumificados, fracos (Brentano - Embrapa - CNPSA, 1992).
Na forma respiratria o vrus da DA infecta a mucosa da nasofaringe e do trato
respiratrio. Multiplica-se e, posteriormente, vai infectar o sistema nervoso, disseminando-
se pelo organismo.
Essa forma respiratria tem sido atribuda tambm a certas amostras do vrus da
doena que teriam predileo pelo trato respiratrio, causando pneumonia. Em granjas
com problemas respiratrios crnicos, pode decorrer um longo perodo de tempo at que
a DA se manifeste sob a forma reprodutiva e nervosa. Deve-se salientar, porm, que as
infeces respiratrias bacterianas so comuns em plantis sunos. Elas ocorrem
independentemente da presena de infeco pelo vrus da DA (Brentano - Embrapa -
CNPSA,1992).
A forma subclnica aquela em que ocorre infeco, mas no se manifestam os
sinais caractersticos da doena. Apesar de ser um evento pouco relatado, a infeco
subclnica pode aparecer devido ocorrncia de cepas virais de menor virulncia.
Algumas delas j foram observadas e estudadas por pesquisadores da Irlanda do Norte
(exemplo: cepas NIA-4 e NIA-6). Existem indicaes da relao entre maior virulncia e
capacidade de estabelecimento do estado de latncia (Brentano - Embrapa -
CNPSA,1992).
O estado de latncia um equilbrio entre o vrus e a clula, que pode ser
modificado atravs de influncias tanto a favor do vrus como do hospedeiro (Mayr et
a1;1988).
"O mecanismo da infeco latente, no que concerne formao, ainda no est de
todo esclarecido. Certamente as causas so mltiplas e um dos fatores mais significativos
seria a tolerncia imunolgica. adquirida em estgio embrionrio" (Mayr et al.;1988)
Uma das causas mais importantes da infeco subclnica a capacidade do virus
de Aujeszky de causar infeco latente. Aps uma infeco aguda, os animais
40
A cepa Bartha - que vem sendo utilizada no Brasil em uma vacina inativada uma
amostra do vrus naturalmente atenuada devido a delees no seu genoma vira!. Isso
significa que o seu DNA no apresenta determinados segmentos e, portanto, o vrus no
sintetiza determinadas protenas, como a protena gl. Em contrapartida, isso ocorre em
amostras virulentas, cujo DNA no possui essas delees. Com base nessa diferena,
foram desenvolvidos testes de diagnsticos, como ELISA por competio, usando
anticorpos monoclonais especficos para protena gl. Animais vacinados com vacinas
deletadas em 91, como a cepa Bartha, no desenvolvem anticorpos para gl. J os animais
infectados com amostras virulentas de campo tero anticorpo para gl. Os testes ELISA
convencionais detectam todo o tipo de anticorpos, no permitindo a distino de
anticorpos vacinais dos de infeco natural. O ELISA competitivo para gl detectar
anticorpos 91 especficos, indicando infeco com cepa virulenta. No existe risco de
confundir o resultado do teste com imunidade vacinal (Brentano - Embrapa -
CNPSA,1992).
6.6. DIAGNSTICO
Em caso de suspeita de surto da DA, com sinais clnicos e excreo viral na fase
aguda, possvel isolar o vrus em laboratrio. O resultado positivo confirmatrio de
44
surto. Recomenda-se o envio de leites vivos com sinais ou de animais recm mortos
para a coleta do crebro. Esse mtodo no se aplica deteco de infeco latente.
Os rgos de eleio para o isolamento viral so: crebro, bao, tonsila pala tina e
pulmo. As amostras devero ser oriundas de mais de um animal com quadro agudo e
devem ser encaminhadas ao laboratrio o mais rpido possvel, em refrigerao. As
amostras somente devem ser congeladas quando no for possvel envia-Ias em gelo. As
inocula-se 500 ).lL do sobrenadante, para adsoro pelo perodo de 1 hora a 37C. Na
seqncia, feita a lavagem com meio de cultivo celular (MEM), sem soro fetal e retirada
do inculo. Posteriormente, coloca-se 8 mL de meio de cultivo celular (com soro fetal) e o
frasco incubado novamente a 3?OC.
at 72 horas, devemos fazer uma nova passagem viral at aparecer efeito citoptico ou
ser negativo na 3a passagem. Para fazer as passagens virais, o frasco com o cultivo
celular deve ser congelado e descongelado 3 vezes. Aps, retira-se o contedo e
centrifuga-se em velocidade baixa por 10 minutos. O sobrenadante coletado e posto em
um frasco estril. Utilizando 500 ).lI deste material, um novo frasco com cultivo celular
no seja possvel a utilizao deste meio, poder ser usada uma soluo salina normal
estril e tambm refrigerada. A amostra dever ser inoculada em frascos de 25 cm2 de
cultivo celular, seguindo os mesmos procedimentos mencionados para o isolamento de
rgos. Para os sunos citados acima, bem como para herbvoros ou carnvoros com
quadro de encefalite, o fludo orofaringeano tambm pode ser utilizado para o isolamento
viral. Em casos de infeco latente, o rgo de eleio para o isolamento viral o gnglio
trigmeo.
O efeito citoptico (ECP) pode ser definido como a infeco de uma clula do
hospedeiro por um vrus animal geralmente mata a clula. A morte pode ser causada pelo
acmulo de grande nmero de vrus em replicao, pelos efeitos das protenas virais
sobre a permeabilidade da membrana plasmtica da clula ou por inibio do DNA, RNA
oU mitose protica do hospedeiro. Os efeitos visveis que podem levar morte ou leso
de uma clula so conhecidos como efeito citoptico (ECP). Aqueles efeitos citopticos
que resultam em morte celular so denominados efeitos citocidas (exemplo: Aujeszky), os
que resultam em leso celular mas no em morte so denominados efeitos no citocidas.
Os ECPs so usados para diagnosticar muitas infeces virais (Tortora, et a', 2000).
Os efeitos citopticos variam com o vrus. A produo de ECP aps a inoculao
do material suspeito indicativo da presena de vrus no material. Uma diferena o
ponto no ciclo de infeco viral em que os efeitos ocorrem. Algumas infeces virais
resultam em alteraes precoces na clula do hospedeiro, em outras infeces as
alteraes so observadas em estgio muito tardio, ver figura 3. Um vrus pode produzir
um ou mais tipos de efeito citoptico. Exemplo: em algum estgio da sua replicao, o
vrus citocida interrompe a sntese macromolecular dentro da clula do hospedeiro (vrus
da herpes simplex), quando um vrus citocida infecta uma clula, faz com que os
lisossomos da clula liberem suas enzimas, outros formam grnulos no citoplasma ou
ncleo das clulas infectadas chamado de corpos de incluso, estes algumas vezes so
acmulos de partculas virais. Os grnulos variam em tamanho, forma e propriedades de
colorao, de acordo com o vrus. Os corpos de incluso so caracterizados pela sua
capacidade de colorao por corantes cidos e bsicos. Os corpos de incluso so
importantes, pois sua presena pode ajudar a identificar o vrus que est causando a
infeco. Exemplo; o vrus da Raiva produz corpos de incluso (Corpsculo de Negri) no
citoplasma das clulas nervosas, e sua presena no tecido cerebral de animais com
suspeita de estarem raivosos tem sido usada como instrumento diagnstico para a Raiva
(Tortora, et ai, 2000).
46
Fonte: COME
Fonte: COME
de soro limpidas, sem hemlise e refrigeradas, caso sejam enviadas at 24 horas aps a
47
colheita. Sendo este perodo seja maior, as amostras devero ser mantidas congeladas
at o momento da sua remessa.
Detecta anticorpos neutralizantes no soro. Baseia-se no fato de o vrus provocar
para o complemento (56e por 30 minutos). As clulas a serem utilizadas devero ser as
susceptveis a infeco do VOA. A amostra de vrus utilizada na prova dever ser uma
amostra padro a ser determinada pelo MAPA. A titulao desta amostra deve ser feita
pelo mtodo de Reed & Muench ou pelo mtodo de Krber e expresso por 50 ~IL ou por
mL. A prova dever contar com um soro controle positivo padro com ttulo conhecido e
um controle negativo tambm padronizado. A realizao da tcnica segue os passos:
1.1 colocar 50 fll de meio de cultivo celular (sem soro fetal) por poo, em duplicata
1.2 colocar 50 !lI da amostra de soro nos poos das linhas mpares, misturar bem
e transferir 50 !lI para as linhas pares (diluio final de 1:4), misturar bem e
desprezar 50~1.
meio de cultivo celular utilizado nas diluies das amostras em pelo menos
quatro poos da placa, por diluio da suspenso do vrus a ser testada e
mais a prpria suspenso de vrus utilizada na prova (total de 16 poos). Aps
hora junto com a incubao descrita na fase 1.4. Depois dever ser feito como
descrito na fase 1.5.
b - controle de clulas: reservar dois poos da placa para colocar 100 )lI de
Leitura das amostras: amostras negativas - ECP presente nos quatro poos, ver
figura 04, amostras positivas: sem ECP nos quatro poos ou nos poos, ver figura 05, da
diluio 1:2 e as demais situaes fora destes padres e no sendo efeito txico ou
contaminao da amostra, esta dever ser considerada como suspeita e ser repetida.
49
COME
7.1. HISTRICO
7.2. ETIOLOGIA
Este virus, ver figura 05, com patogenicidade constante e mxima, quando
Fonte: USP.
7.3. EPIDEMIOLOGIA
A raiva uma doena que acomete mamferos, e que pode ser transmitida
aos homens, sendo portanto, urna ZQOnOS8. causada por um vrus mortal, tanto
para os homens quanto para os animais. Em alguns pases desenvolvidos, a raiva
humana est erradicada e a raiva nos animais domsticos est controlada, mas
ainda efetuada vigilncia epidemiolgica em funo dos animais silvestres.
Transmitida pelo co, gato, rato, bovinos, eqinos, sunos, macaco, morcego
e animais silvestres, atravs da mordedura ou lambedura da mucosa ou pele
7.4. PATOGENIA
para engolir devido a paralisia da mandbula, dficit mltiplos de nervos cranianos, ataxia
Neste estgio o animal pra de comer e beber. O estgio paraltico pode durar de
um a dois dias, seguido de morte por parada respiratria. O perodo de incubao, partir
da mordida at o incio dos sinais clnicos, varivel podendo ser de duas semanas a
seis meses. Mas a partir do momento que sejam vistos os sinais neurolgicos, a doena
rapidamente progressiva, com a morte acorrendo dentro de sete dias, na maioria dos
curtos
pela tcnica de imunofluorescncia direta (IFD). Um resultado positivo neste teste, desde
confirmatrias.
52
observados por perodos muito longos e desta forma, esta prova geralmente no auxilia
isolamento do virus mas tambm para estudos de diferentes aspectos da infeco e para
produo de vacinas.
evitando, porm, contato direto com o mesmo. Caso seja detectada a presena de
morcegos em alguma regio deve-se: procurar iluminar reas externas nas residncias;
colocar telas nos vos, janelas e buracos e fechar ou vedar pores, pisos falsos e
O animal com suspeita de raiva deve ser isolado e ficar em observao ou sofrer
eutansia (no recomendavl) para ser realizado um exame do crebro e tronco cerebral
em busca do vrus. Se houve exposio humana ou animal, a um outro animal com sinais
(CI) nas clulas dos rgos doentes. Os CI so bem maiores que as partculas virais e
pela qual podem aparecer estruturas internas basfilas (corpsculo de Negri na Raiva)
Fonte :Unicamp.
especificamente.
54
estvel, se combina com 05 grupos aminas das protenas por unies carbamidas.
excitado por luz azul de 490 nm de comprimento de onda e emite fluorescncia de
rpida realizao. Pode ser utilizada para localizar antgeno em rgo que possui muita
que tem comparado a sua sensibilidade com a fixao do complemento, dizendo que a
sua por vez menor que a da aglutinao e maior que a da precipitao, existindo
1992).
marcada com o fluorocromo. Esta tcnica utilizada para identificar e localizar antgeno e
para detectar e titular anticorpo de uma mesma espcie animal. a mais sensvel, mas
lmina;
unhas;
6. Dispor duas gotas de CCN (suspenso de encfalo de camundongo normal) no campo
junto marcao da lmina e duas gotas de CVS (suspenso de encfalo de
camundongo infectado por vrus padro de desafio) no campo distai; com movimentos
suaves, espalhar as suspenses nos respectivos campos;
mesma lmina, o campo incubado com CVS. Como o antgeno rbico encontra-se na
suspenso celular, o conjugado anti-rbico ir ligar-se ao mesmo e no ao antgeno
presente na impresso. Conseqentemente, no ser observada a fluorescncia
esverdeada (controle negativo). Caso os controles positivos e negativos estejam bem
definidos, examinar as lminas para diagnstico. A positividade s deve ser aceita quando
a colorao verde caracterstica for visuaJizada na impresso incubada com CCN e no
diagnstico.
A mortalidade diria dos animais inoculados dever ser observada por um perodo
de 21 dias. At o terceiro dia ps-inoculao, as mortes podem ser consideradas como
devidas a infeces outras ou traumatismo; aps este perodo, realiza-se a IFO dos
crebros dos animais mortos, para confirmar a infeco por raiva.
59
A prova Biolgica tem como finalidade isolar e identificar o vrus rbico, pelo
mlodo de Inoculao Inlracerebral, ver figura 8, de inculos preparados com os
crebros, em camundongos recm nascidos ou com 21 dias de idade. A morte do
animal antes do 5 dia se considera inespecifica devido ao traumatismo ocasionado
duranle a inoculao ou al por uma infeco bacleriana (Calva e Arroyo, 2000). Por
isso se considera positivo os animais que apresentam sinais aps 10 dias de
inoculao, ver figura 9.
CAMUNDONGOS
8. CONCLUSO
GLOSSRIO
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
Elizabeth dei Castillo Calva e Fabiola Gmez Arroyo; Manual de Laboratrio Prcticas
de Viro/agia, Universidad Nacional Autnoma de Mxico, Facultad de Medicina
Veterinaria y Zootecnia, 2000 - p. 41 - 43,53,73 -74
Mara Eliza Gasino Joineau; Avaliao das Tcnicas de Diagnstico, utilizadas como apoio
ao programa de Controle e Erradicao da Peste Suna Clssica no Estado do PR. -
Curitiba, 2000 - Monografia
65
Mengeling W. L" 1972. Porcine parvovirus, properties and prevalence of a strain isolated
in lhe USA. Am. J. Vet. Res 33 (4): 2239 - 2248.
OIE, Manual of Standards for Diagnostic Tests na Vaccines. Offiee International des
Epizooties - World Organisation for Animal Health, 2 edio, Paris, France, 1992.
ANEXO 01
RELATRIO MENSAL DE DIAGNSTICO DE DOENAS
2003
OIAGNSTICOS JANEIRO FEVEREIRO MARO ABRIL TOTAL
2. F. AFTOSA
3. E.VESICULAR
5. PSC/RGOS
7. PSC!SORO!NPLA
8. RAIVA 31 40 38 70 179
9. LEUCOSE 12 1 22 35
10. PARVOVIAOSE 2 10 12
11. BVD/RGO/SuiNO
12. BVD/SORO/SuiNO
13. ENCEFALOMIELlTE.E. 15 15
17. RINOPNEUMONITE E.
19. VIROLG1CO(PRRS)
20. VIAOLGICO 9 9