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UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARAN

FACULDADE DE CINCIAS AGRRIAS


CURSO DE MEDICINA VETERINRIA

TRABALHO DE CONCLUSO DO CURSO


(DIAGNSTICO VIROLGICO - TCNICAS)

CURITIBA
2003
TATIANE NASCIMENTO PETTERLE

TRABALHO DE CONCLUSO DO CURSO


(DIAGNSTICO VIROLGICO - TCNICAS)

Trabalho apresentado como requisito parcial


concluso do Curso de Medicina Veterinria,
setor de Cincias Agrrias, Universidade Tuiuti
do Paran.
Orientador: Prof. Aurelino Menarim Junor
Orientadora Profissional: Prof". Mara Eliza
Gasino Joineau

CURITIBA
2003
AGRADECIMENTOS

Aos meus pais pela oportunidade de realizar esse sonho.

Professora Mara Eliza Gasino Joineau, pela sua grande amizade, pacincia e
orientao.

professora Aosria Richartz, pelos ensinamentos e puxes de orelha.

Maria A. de Carvalho Patricio, pela pacincia e amizade.

Ao Djalma, por sua capacidade e eficincia, que torna possivel o trabalho dirio no
laboratrio de virologia do COME.

chefia do Centro de Diagnstico "Marcos Enriretti" pelo apoio para a realizao deste
trabalho e a todos os amigos do laboratrio.

Ao Roland pela pacincia e incentivo para obteno dessa profisso.

Agradecimento especial a Deus por tudo que sou hoje.


SUMRIO

LISTA DE FIGURAS vii


LISTA DE TABELAS viii
RESUMO .ix
1. INTRODUO 01

2. LOCAL DE ESTGIO 04
2.1. ATIVIDADES REALIZADAS .. . 07
3. CULTIVO CELULAR 10
3.1. MEIOS DE CULTIVO.. .. 11
3.2. PREPARAO DOS MEIOS.. .. 11
3.3. PASSAGEM DAS CELULAS E CULTIVO.. ..12
3.4. DESCONGELAMENTO DE CELULAS ...................................... 12
3.5. CONTAGEM CELULAR. ...... 13
3.6. ARMAZENAMENTO DAS CELULAS.. .. 14
4.TCNICAS DE DIAGNSTICO VIRAL MAIS UTILIZADA NO ESTGIO PARA
DETECO DE ANTICORPOS 15
4.1. ELISA ENZIME L1NKED IMMUNOSORBENT ASSAY ENSAIO
IMUNOENZIMTICO 15

4.1.1. Mlodo de Elisa para Peste Suna Clssica (PSC) utilizado no CDM 16
4.2. TESTE DE SORONEUTRALlZAO.. .. 18
4.2.1. Produo Viral . ....... 19
4.2.2. Titulao Viral .. .. 19
4.2.3. Soroneutralizao para PSC ou Cepas Virais no citopatognica . .. 22
4.2.3.a. Procedimentos 22
4.2.3.b. Prova direta com anticorpos conjugados com fluorescena ou IFO 23
4.2.3.c. Prova indireta com anticorpos conjugados com fluorescena ou IFI 23
4.2.3.d. Prova direta com anticorpos conjugados com peroxidase ou IPO... . 23
4.2.3.e. Prova indireta com anticorpos conjugados com peroxidase ou IPI 24
4.2.3,(. Validao, Leitura e Interpretao .. .. 24
4.2.4. Soro neutralizao p/ Estomatite Vesicular ou cepas Virais Citopatognicas 25
4.2.4.a. Diluio do Soro 26
4.2.4.b. Diluio Viral 26
4.3. IMUNODIFUSO EM GEL DE GAR .... . 27

4.3.1. Preparo do Agar .. ....... 28


4.3.2. Preparo do Diluente - Soluo Tampo .. .....28
4.3.3. Preparo do gel Agar .. .......... 28
4.3.4. Realizao da tcnica.. . . ..28
4.4. INIBiO DA HEMOAGLUTINAO (HIA) .. ...29
4.4.1. Parvovirus Suno - PVS . . 30
4.4.1.a. Tratamento das amostras de soro .... ...30
4.4.1.b. Produo da Suspenso de Hemcias .... ..31
4.4.1.c. Procedimento ... . 31
4.4.1.d. Controle das unidades hemaglutinantes da amostra teste 32
4.4.1.e. Validao.. . 32
4.4. 1.f. Leitura e Interpretao.. . 32
5. TCNICAS DE DIAGNSTICO VIRAL MAIS UTILIZADAS NO ESTGIO PARA
DETECO DE ANTGENO .33
5.1. DETECO DIRETA DO ANTGENO POR IMUNOMARCADORES . ..33

5.2. ISOLAMENTO VIRAL .. . 33


5.2.1. Preparo dos Inculos ...................................................................... 34
5.2.2. Inoculao em Cultivos ... . 34
5.2.2.a. Clulas em suspenso - microplaca de 96 poos 34
5.2.2.b. Clulas em camada pr-formada - microplaca de 96 poos .. . 35
5.2.2.c. Fixao das clulas .. ..35
5.2.2.d. Revelao das clulas .. ... 35
5.2.2.e. Validao .. . 36
5.2.2.1. Leitura e Interpretao.. . 36
6. TCNICAS DE DIAGNSTICO ESPECFICAS PARA A DOENA DE AUJESZKY
NO CDME 37
6.1. HISTRICO .. . 37
6.2. ETIOLOGIA .. . 38
6.3. PATOGENIA .. . 38
6.4. EPIDEMIOLOGIA - CIRCULAO DO VRUS NOS REBANHOS SUNOS ..41
6.4.1. Distino de anticorpos vacinais e anticorpos devidos infeco de
campo . .41
6.5. PROFILAXIA E CONTROLE .. ...42

6.6. DIAGNSTICO ..... . .43

6.6.1. Isolamento Virar .. ................. .43


6.6.2. Testes Sorolgicos - Soroneutralizao (SN).. ..46
7. TCNICAS DE DIAGNSTICO ESPECFICAS PARA A RAIVA NO
COME .49

7.1. HISTRICO .. ...49

7.2. ETIOLOGIA .. ..49

7.3. EPIDEMIOLOGIA .. . 50
7.4. PATOGENIA ... ...51

7.5. DIAGNSTICO, CONTROLE E PROFILAXIA ... .. 51


7.5.1. Imunofluorescncia Direta (IFO) . ...53
7.5.2. Imunofluorescncia Indireta (IFI).. ..... 57
7.5.3. Prova Biolgica (PB).. ....58
8. CONCLUSO 60
GLOSSRIO 61
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 63
ANEXO 01 - RELATRIO MENSAL DE DIAGNSTICO DE DOENAS 66
LISTA DE FIGURAS

1 - ORGANOGRAMA .. . 06
2 - SALA DO CULTIVO, REALIZANDO UMA PASSAGEM DE CLULA VERO 09
3 - EFEITO CITOPTICO DO VRUS DA DOENA DE AUJESZKY .46
4 - MONOCAMADA DE CLULA SK6 SEM EFEITO CITOPTICO .46
5 - ESQUEMA VRUS DA RAIVA . ....50
6 - REPRESENTAO DO CORPSCULO DE NEGRI INTRACITOPLASMTICOS EM
CLULAS NERVOSA E AUSNCIA DO MESMO._ ........... 53
7- REPRESENTAO DO RESULTADO POSITIVO EM CREBRO DECAMUNDONGO
DA TCNICA IFD - INSTITUTO PASTEUR, SP .. . 57
8 - REPRESENTAO DO MTODO DE INOCULAO INTRACEREBRAL EM
CAMUNDONGOS -INSTITUTO PASTEUR, SP .. .... 59
9 - REPRESENTAO DOS SINAIS DA RAIVA EM CAMUNDONGOS- INSTITUTO
PASTEUR, SP ... .... 59

vii
LISTA DE TABELAS

1 . DIAGNSTICOS VIROLGICOS DE ROTINA, TCNICAS E TEMPO MDIOPARA A

EMISSO DO LAUDO .. .. 03

viii
RESUMO

o desenvolvimento deste trabalho teve como objetivo descrever as tcnicas de


diagnstico virolgico realizadas no Centro de Diagnstico "Marcos Enrietti" durante o
perodo do estgio. Neste relatrio os diagnsticos virolgicos foram divididos em
Tcnicas para Deteco de Anticorpos e Tcnicas para Deteco de Antgenos. Para
deteco de anticorpos so citados as Tcnicas de ELISA para Peste Suna Clssica,
Soroneutralizao para cepas no citopatognicas, Soroneutralizao para cepas
citopatognicas como a Estomatite Vesicular, Imunodifuso em gel de gar, Inibio da
Hemoaglutinao para diagnstico da Parvovirose Suna. Para deteco de antgeno so
citadas as tcnicas de Isolamento Viral em Cultivo de Linhagens Celulares para cepas
citopatognicas ou no cito patognicas, mediante o uso de imunomarcadores conjugados
com enzima ou fluorocromos (peroxidase ou isotiocianato de fluorescena). que so
tambm empregados nas Tcnicas de Deteco de Antgeno em cortes histolgicos, onde
os fragmentos de rgos, especficos para cada agente, so realizados em micrtomo de
congelao (criostato). Est descrita a Tcnica de Cultivo de Linhagem Celular, que
substrato para as Provas de Soroneutralizao e Isolamento Viral. Tambm as Tcnicas
de Produo e Titulao Viral em Cultivos Celulares necessrias para a prova de
Soroneutralizao. As Tcnicas descritas mais detalhada mente foram as utilizadas para
Diagnstico da Doena de Aujeszky e da Raiva.

ix
1. INTRODUO

A deteco de anticorpos especficos no soro ou em secrees um mtodo de


diagnstico amplamente utilizado em virologia. As infeces vricas induzem uma

resposta imunolgica mediada por anticorpos (alm de clulas) que persiste por longo

tempo e pode ser detectada por uma variedade de tcnicas. Os anticorpos produzidos em

resposta a um determinado agente so estritamente especficos ao agente que os

induziu. Por isso, as tcnicas de deteco de anticorpos so bastante especficas,

permitindo distinguir a resposta sorolgica produzida em resposta a um vrus da resposta

a outro vrus. Da mesma forma, tcnicas capazes de detectar mnimas quantidades de

anticorpos foram desenvolvidas, aumentando a sensibilidade desses testes. A deteco

de anticorpos especficos como mtodo diagnstico tem sido amplamente utilizada,

sobretudo em estudos epidemiolgicos, nos quais populaes numerosas humanas ou

animais devem ser testados. Embora amplamente utilizada, a sorologia em infeces

vricas deve ser corretamente interpretada, sob o risco de levar a concluses errneas.

Por exemplo, para a grande maioria das infeces vricas, sorologia positiva (presena de

anticorpos especificas) indica apenas - e to somente - que o indivduo foi exposto no

passado ao agente em questo. Esse conceito aplica-se a todos os agentes virais e

bacterianos que no produzem infeces persistentes ou latentes. No entanto, em

algumas infeces vricas (retrovrus [BLV, HIV, FIV, AlE, CAEV], herpesvrus [HSV, VZV,

PRV, BHV-1, BHV-S, EHV]), o vrus estabelece infeces persistentes ou latentes aps a

infeco inicial. Nesses casos, sorologia positiva (com algumas excees) indica que o

animal portador do vrus (em retrovrus, infeco ativa com eliminao viral; em

herpesvrus, infeco latente, sem eliminao permanente do vrus). As excees

referem-se a animais que so soro positivos a esses vrus devido a anticorpos adquiridos

passivamente pela placenta e/ou colostro, alm de animais vacinados. Nesses casos,

mesmo para as viroses citadas acima. sorologia positiva no significa obrigatoriamente


infeco. Portanto, o significado de sorologia positiva varia muito com as viroses. Isso

requer que os resultados sorolgicos sejam interpretados independentemente, luz do


conhecimento da biologia e patogenia de cada infeco. As tcnicas utilizadas para a

deteco de anticorpos so denominadas genericamente de tcnicas sorolgicas, embora

possam ser utilizadas para detectar anticorpos em outros fluidos corporais.

(www.ufsll.brlsvlLccnic<ls.html )

A confirmao de uma virose pode ser realizada, portanto, em muitos casos,

apenas pela deteco do antgeno, seja por ELISA de captura de antgeno,

lmunofluorescncia (IF) ou Imunoperoxidase (IP), Isolamento viral em cultivos celulares

ou Prova Biolgica e ainda peR (Polimerase em cadeia).

Para exercer de forma eficiente o controle e a erradicao de uma doena,


imprescindvel realizar o diagnstico preciso e oportuno da mesma (C.Arroyo; 2000).

Para orientar um diagnstico, o primeiro passo a realizao de um histrico

clinico e um registro cuidadoso das leses observadas na necropsia, o que permitir

saber como as amostras foram coletadas e que tcnicas laboratoriais devem ser usadas

(C.Arroyo; 2000).

A escolha de uma tcnica para deteco direta de vrus depende da disponibilidade

de equipamentos, da experincia pessoal e do nmero de amostras a serem avaliadas

(Koneman et ai., 2001).

Neste relatrio sero citadas as tcnicas para diagnstico virolgico

acompanhadas durante o perodo de estgio no Centro de Diagnstico "Marcos Enrietti",

tais como: Cultivo de Linhagens Celulares, Soroneutralizao, Produo e Titulao Virar,

Imunodifuso em gel de gar, Inibio da Hemoaglutinao, Isolamento Viral,

ImunofJuorescncia Direta ou Indireta e Prova Biolgica, para as diversas viroses que

acometem os rebanhos do Estado.


TABELA 1: DIAGNSTICOS VIAOLGICOS DE ROTINA, TECNICAS E TEMPO MEDIO PARA A

EMISSO DO LAUDO.

Doena Tcnicas realizadas Tempo mdio de


anlise

Anemia Infecciosa Eqina Imunodifuso em gel de agar 48 horas

Diarria Bovina Viral ELISA 24 horas


Soroneutralizao 7a10dias
Isolamento viral
Doena de Aujeszky Soroneutralizao 7 a 10 dias
Isolamento viral
Encefalomielite Eqina Soroneutralizao 7 a 10 dias
Isolamento viral
Estomatite Vesicular Soroneutralizao 7 a 10 dias
Leucose Bovina Imunodifuso em gel de gar 48 horas
Lngua Azul Imunodifuso em gel de gar 48 horas

Parvovirose Suna Inibio da hemaglutinao (HI) 48 horas


Isolamento viral
(Hemaglutinao/HA)
Peste Suna Clssica ELISA 24 horas
Raiva Imunofluorescncia direta 24 a 72 horas
Prova biolgica at 30 dias

Rinopneumonia Eqina Soroneutralizao 7a10dias


Isolamento viral
Rinotraquete Infecciosa ELISA 24 horas
dos Bovinos Soroneutralizao 7a 10dias
Isolamento viral
Rotavrus Eletroforese em gel de 7 dias
poliacrilamida
Viroses dos Peixes Isolamento viral
.Isolamento vira] e caracterizao de cepas vlrals. no menos que duas semanas. Vlrus pouco adaptados em
cultivos de clulas, ou virus que no so isolados como rotina, este tempo ser de no minimo 30 dias
Fonte: COME
2. LOCAL DE ESTGIO

o eslgio foi realizado no CENTRO DE DIAGNSTICO "MARCOS ENRIETTI"


(COME), localizado na Rua: Jaime Balo, 575, Bairro: Juvev, Curiliba/PR, no periodo de
24/02103 at 30/04/03 totalizando 343 horas de estgio, na rea de Virologia orientado
pela Profissional Mdica Veterinria Msc Mara Elisa Gasino Joineau.
O COME um laboratrio oficial originado de um convnio entre o Governo do
Estado - representado pela Secretaria da Agricultura e do Abastecimento - SEAB, e a
Universidade Federal do Paran, em 1981.
Realiza exames laboratoriais para diagnstico de doenas, pragas e enfermidades
que acometem animais e vegetais, apoiando a Agropecuria do Paran e tambm do
Brasil, pois recebe material de vrios Estados.
Pela credibilidade de seu trabalho, o COME credenciado pelos Ministrios da
Sade e da Agricultura para a realizao de exames como Peste Suna, Anemia
Infecciosa Eqina, Micoplasmose, Virologia de Batata-Semente, lngua Azul, Aujeszky,
Raiva, entre outras.
O COME dividido em rea animal e vegetal. A rea animal subdividida em
Laboratrio de Patologia Animal (necropsia, histopatologia), Laboratrio de Parasitologia,
Laboratrio de Bacteriologia, Micologia, Microbiologia de Alimentos, Laboratrio de
Virologia e Cultivo Celular. A rea vegetal subdividida em Laboratrio de Fitopatologia e
Laboratrio de Parasitologia, Nematologia e Entomologia.
No Laboratrio de Virologia so realizados exames em soro, rgos, "swabs",
fezes, sangue total, materiais de aborto e envoltrios, fluido-vesiculares para diagnstico
de doenas causadas por vrus.
O setor de Virologia compreende trs laboratrios separados: o de diagnstico
sorolgico, o de Cultivo Celular e o de Isolamento Viral, alm do Infectrio. O laboratrio
de diagnstico sorolgico contm um espectrofotmetro para leitura de microplacas de
poliestileno (ELISA), um computador, pipetas automticas, bancadas, uma sala escura
para leitura das placas de Imunodifuso em gel de gar, alm de reagentes qumicos e
"kits" sorolgicos. Anexo ao laboratrio de sorologia, encontra-se o laboratrio de
Isolamento Viral, onde so realizadas as produes de vrus, preparo dos inculos,
lminas para imunofluorescncia, e testes de soroneutralizao e inibio da
hemoaglutinao. Este laboratrio conta com dois aparelhos de fluxo laminar linear
vertical, microscpio invertido, incubadoras com C02, estufas, pipetas automticas,
geladeiras, treezer, vidraria, alm de reagentes e anticorpos conjugados comerciais,
ultracentrfuga Beckman, duas centrfugas refrigerados e uma microcentrfuga. Para este
laboratrio, existe ainda uma cmara escura com dois microscpios de
imunofluorescncia para a leitura dos testes. O terceiro laboratrio o de Cultivo Celular,
onde realizado cultivo e manuteno de linhagens celulares, produo dos meios de
cultivo e armazenagem de clulas e vrus. Neste laboratrio temos dois fluxos laminares,
um microscpio invertido, trs botijes de nitrognio lquido, dois banhos-marias, estufas,
uma bancada, armrios com vidraria e um treezer - 80 C. O setor utiliza o infectrio, que
mantm camundongos para inoculao das amostras e provas "in vivo".
A rotina compreendeu o acompanhamento dirio do cultivo das linhagens celulares,
observando o crescimento, toxicidade, contaminaes, e a realizao de passagens
celulares com o Objetivo de manter o banco de clulas ou a produo em maior
quantidade para o uso nas tcnicas diagnsticas.
A rotina tambm envolveu a recepo das amostras, soro ou tecidos especficos,
condies de armazenamento e orientao para o teste diagnstico determinado. Devido

demanda de amostras enviadas para o COME foram realizadas as seguintes tcnicas:


Elisa para PSC, Soroneutralizao para Aujesky e Estomatite Vesicular, Imunodifuso em
gel de gar para diagnstico da Lngua Azul, Inibio da Hemoaglutinao para
Parvovirose suna e outros vrus hemaglutinantes e lmunofluorescncia Direta e Prova
Biolgica para Raiva e Imunofluorescncia Indireta para Diarria Viral Bovina (BVD). No
isolamento viral, as inoculaes de material biolgico em camundongos ou cultivos
celulares, eram realizadas periodicamente. Os animais e os cultivos foram acompanhados
diariamente para averiguao do diagnstico.
Os "kits"de ELISA e os anticorpos monoclonais para realizao dos testes de
imunofluorescncia so adquiridos comercialmente. Os meios de cultivo celular so
comprados liofilizados e so diludos e preparados no prprio laboratrio.
O laboratrio recebe amostras de todo O Estado do Paran, e eventualmente de
outras localidades. A Secretaria da Agricultura e do Abastecimento possui delegacias em
lodo o Estado, que dividido em ncleos regionais (conforme o organograma). Cada
ncleo possui Veterinrios que acompanham os rebanhos, colhem as amostras,
promovem colheita de dados epidemiolgicos, promovem sanidade animal, e controle de
abrigos de morcegos. Estes encaminham as amostras ao laboratrio pelos malotes do
ncleo regional. Os Veterinrios que no pertencem Secretaria da Agricultura e

Abastecimento tambm podem encaminhar amostras, bastando o preenchimento de uma


requisio no ncleo regional ou diretamente no laboratrio.
No COME so emitidos relatrios semanais e mensais para o Setor Epidemiolgico
da SEAB e para o MAPA (Ministrio da Agricultura Pecuria e Abastecimento).
A seguir, esto descritas as tcnicas acompanhadas referentes ao setor de

Virologia, como o Cultivo Celular, Deteco de anticorpos e antgenos e com mais nfase
as Tcnicas para diagnstico da Doena de Aujeszky e da Raiva. importante ressaltar
que todas as Tcnicas realizadas no COME seguem os protocolos do "Qffice International
des Epizooties" (OIE, 2000).

FIGURA 1 ORGANOGRAMA

Fonte: COME
2.1. ATIVIDADES REALIZADAS NO ESTGIO

Na primeira semana (24/02103 at 28/02103) foi apresentado o setor de Virologia


incluindo a chegada das amostras e a esterilizao do material utilizado. As amostras
devem chegar em caixas de isopor com gelo lacradas, seguidas por um requerimento de
laudo por um veterinrio e depois elas so protocoladas, abertas e colocado em banho-
rnaria a 56 C para ocorrer a descomplementao do soro para facilitar o diagnstico e
depois vo para a geladeira onde aguardam ser testadas e em seguidas so congeladas
para um possvel reteste se for necessrio. Todo o material utilizado no setor de Virologia
colocado em imerso em hipoclorito onde permanece por no mnimo 24h e depois
passa por um processo de lavagem e esterilizao em estufas. E as tcnicas de
diagnsticos feitos pelo COME. Os diagnsticos mais corriqueiros so da Raiva, Doena
de Aujeszky, PSC, IBR, BVD, Anemia Infecciosa e Lfngua Azul. Por escolha prpria
escolhi acompanhar os diagnsticos de Raiva, Doena de Aujeszky, PSC e Lfngua Azul.
Como algumas tcnicas dependem do banco de clulas para serem realizadas,
acompanhei todo O processo do Cultivo Celular e Produo Virar. Nessa semana foi
demostrado e explicado as tcnicas de ELISA para PSC, Soroneutralizao da Doena de
Aujeszky, lmunofluorescncia Direta para Raiva e Inoculao lntra-Cerebral em
Camundongos para a Prova Biolgica para confirmao da Raiva e como se realiza uma
passagem de clula, seu congelamento e descongelamento. Na segunda semana
(06/03/03 e 07/03/03) s acompanhei dois dias de estgio por causa do Carnaval. Nesses
dias foi explicado a tcnica de Imunodifuso em Gel de gar para diagnstico da lngua
Azul e foi realizado passagem de clulas vero (macaco) por mim atravs da orientao da
orientadora, ver figura 02. Foi acompanhado o teste de Soroneutralizao para Estomatite
Vesicular para aprender todo o processo desde a produo do vrus at a
Soroneutralizao passando pela Titulao Viral e a execuo do teste de IFO para Raiva
e Inoculao Intra-cerebral em camundongos, essas tcnicas s foram acompanhadas
por no possuir vacina. Na terceira semana (10/03/03 a 14/03/03) foi realizado vrias
passagem de clulas (SK6, EPC, Vero e BHK), foi mostrado como se realiza uma
contagem de clulas, pois para a realizao das tcnicas preciso no mnimo de 150.000
a 300.000 clulas por pocinho de cada placa. Alm de IFD para Raiva e rrc em
camundongos. Nessa semana foi pedido que se observa-se os camundongos no
lnfectrio para ver se apresentavam sinais caractersticos de Raiva obtendo um caso
Positivo. Ainda foi realizado Isolamento Viral do macerado de rgos para obter um
diagnstico de um co que veio para a necrspsia. Desse animal foi isolado um herpes
vrus canino que uma doena rara no Brasil. Esse animal veio da Europa atravs de um
criador e veio a bito 20 dias aps sua chegada. A identificao desse vrus foi feita
atravs de Microscopia Eletrnica. Na quarta semana (17/03103 a 21/03/03) foi realizado
passagens de clulas MDBK e SK6 utilizando a MDBK para inoculao e produo do
vrus da Diarria Bovina Viral (BVD) obtendo sua titulao. Foi descongelado clulas
MDCK (canino) para realizar passagens do herpes vrus canino. E ainda o
acompanhamento do teste de Imunofluorescncia Direta para Raiva sendo dois casos
Positivo, passagem de clulas MDCK, Vere e BHK, preparo de in6culo do crebro de um
bovino para Isolamento de BVD, realizao do teste de Imunodifuso em gel de gar para
Lngua Azul tendo resultados positivos e negativos e o acompanhamento da tcnica de
Imunoperoxidase para avo e sua revelao tendo resultado Positivo. Na quinta semana
(24/03/03 a 28/03103) foi observado os camundongos e a leitura do Isolamento para IBR
dando resultado Negativo, congelando essa placa para a realizao de uma nova
inoculao, participei da necr6psia de uma ovelha ajudando a realizar os cortes e
anotaes dos achados de necrpsia. Foi realizado ainda o congelamento e
descongelamento de uma placa com vrus de BVD para a realizao da Titulao desse
vrus. Foi acompanhado uma necrpsia de uma galinha, um teste de Soroneutralizao
para Doena de AUjeszky, e a tcnica de Inibio da Hemaglutinao para Parvovirose
Suna. Alm do incio da confeco do relatrio e passagem de clulas MDCK, Vero e
SK6 e a realizao do leste de ELISA para PSC. Na sexta semana (31/03/03 a 04/04/03)
foi realizado passagem de clulas SK6 para a realizao da Produo Viral de Estomatite
Vesicular, acompanhado o teste de Soroneutralizao para Doena de Aujeszky,
congelado clulas Vero e MDCK onde a linhagem foi melhorada pela minha pessoa,
observado os camundongos e anotado se apresentavam alguma alterao, feito
passagem de clulas MDCK, BHK, MDCK e SK6, troca do meio de manuteno de
clulas SK6, realizado teste de ELISA para PSC, inoculao do vrus da Estomatite
Vesicular na clulas SK6, e acompanhado testes de IFD e IIC em camundongos para o
diagnstico da Raiva tendo um caso Positivo. Alm da confeco do relatrio e Titulao
Viral da Estomatite Vesicular. Na stima semana (07/04/03 a 11/04/03) foi realizado vrias
pasagem de clulas Vero, SK6, BHK, MDCK, MDBK para realizao de teste ou
armazenagem no banco de clulas, acompanhado o teste de Soroneutralizao para
Aujeszky, IFD e IIC em camundongos para Raiva, alm da Inibio da Hemoaglutinao
para parvovirose suna (negativo), leitura da titulao do vrus da Estomatite Vesicular em
clulas SK6 obtendo um ttulo de 10 -6 e em clulas Vero o ttulo de 10 -7. Foi
acompanhado tambm a realizao do teste de ELISA para IBR e descongelamento
de linhagens de clulas Vero. Na oitava semana (14/04/03 a 18/04/03) foi realizado
teste de ELISA para PSC, Inibio da Hemoaglutinao para Parvovirose suina,
troca do meio dos inculos com protozorios e toxoplasma, acompanhado os teste
de IFD e IIC em camundongos para Raiva com a Cidinha (tcnica responsvel por
esses exames) e o teste de IFI para Encefalite Equina. Confeco do relatrio,
observao dos camundongos, passagem de clulas Vero (macaco), MDCK
(canino), MDBK (bovino) e SK6 (suino). Alm de realizar o teste de ELISA para PSC.
Na nona semana (21/04/03 a 25/04/03) foi realizado a confeco de relatrio,
observado os camundongos, passagem de clulas Vero, SK6, MDBK, BHK
(ramister) e MDCK. E acompanhado os testes de Imunofluorescncia Direta (IFD) e
Inoculao Intra-cerebral em Camundongos (IIC) para o diagnstico da Raiva tendo
dois casos Positivos. Na dcima e ltima semana (28/04/03 a 30/04/03) foi realizado
a confeco do relatrio, observao dos camundongos tendo um caso Positivo, o
teste de ELISA para PSC (Negativo), Imunodifuso em gel de gar para Lingua Azul
tendo resultados Positivos, congelamento de clulas Vero, BHK e MDCK, alm do
acompanhamento do teste de Soroneutralizao para Doena de Aujezky feito pela
tcnica responsvel Cidinha. Os resultados dos testes realizados a maioria foi
Positivo sendo Negativo exclusivo para ELISA para PSC e Soroneutralizao para
Doena de Aujeszky onde feito o controle do rebanho do Paran. Nos casos de
Raiva positiva avisado imediatamente os ncleos regionais para imediata
interveno.

FIGURA 2-SALA DO CULTIVO REALIZANDO UMA PASSAGEM DE CLULA VERO.

Fonte: A autora
10

3. CULTIVO CELULAR

As tcnicas de Cultivo Celular esto descritas nesta primeira etapa, pois servem
como substrato para vrias tcnicas citadas a seguir para deteco de anticorpos e
antgenos.
As culturas de clulas so bastante utilizadas em diagnsticos laboratoriais para
tcnicas como o isolamento viral, soroneutralizao, titulao e produo viral.
O cultivo celular um termo geral usado para designar os procedimentos que
permitem a manuteno e reproduo de clulas de animaisin vitro (CALVA, ARROYO;
2000).

Este mtodo de grande sensibilidade para alguns agentes virais, consiste em


colocar em contato o material suspeito com cultivos de clulas susceptveis, para que o
vrus se replique podendo detectar sua presena pelo efeito citoptico (ECP) ou outros
mlodos (FAO/RLAC; 1992).
Uma variedade de recipientes utilizada como suporte para as monocamadas de
clulas. Os frascos plsticos em forma de T substituram em geral, as garrafas de vidros
para propagao de linhagens celulares. As linhagens podem ser mantidas no laboratrio
por dissociao das clulas, as quais, so em seguidas, distribudas em novos recipientes
(KONEMAN el al.;2001).
As monocamadas estabelecidas so dissociadas por uma breve incubao com
uma soluo de tripsina. Pode ocorrer dano celular se a suspenso de tripsina estiver
muito concentrada ou se o contato for muito prolongado. A neutralizao da tripsina
realizada pelo soro presente no meio de crescimento, adicionado aps dissociao das
clulas. O desprendimento das clulas da superfcie pode ser intensificado fisicamente
por agitao ou por raspagem com um basto de vidro com uma extremidade coberta
com tubo de borracha. Em seguida as clulas dissociadas so colocadas em tubos para a
inoculao de amostras ou em novos frascos para continuar a propagao da linhagem
celular (KONEMAN el aI, 2001).
No COME no cultivo celular so realizadas passagens de clulas de vrias
espcies para diversos testes sorolgicos, descongelamento e congelamento celular e
produo de meios de crescimento e de manuteno.Todos esse processos ocorrem
dentro do fluxo laminar. As linhagens de celulares mais utilizadas so PK15 - suno, SK6-
suno, VER O - macaco, MOBK - bovino, BHK - hamster, CRFK - gato, MOCK - canino,
Ii

MA - macaco africano e EPC - peixe, todas segundo as exigncias da "Omes


International des pizaties" (OIE) quanto a linhagem respectiva a cada prova diagnstica
e enfermidade a ser trabalhada.

3.1 MEIOS DE CULTIVO

Para a maioria das linhagens os meios de cultivo esto constitudos por um meio
nutriente mnimo tamponado e isotnico que contm sais orgnicos uma fonte de energia
e aminocidos.
O Meio Bsico Eagle (MEM) foi um dos primeiros a ser utilizado e principalmente
para as clulas aderentes formadora de monocamada (Eagle, 1955).
Para permitir o crescimento celular, os meios bsicos necessitam da adio de
suplementos como glutamina, lisina, soro fetal bovino, bicarbonato de sdio e soluo
antibitica.
No COME o meio utilizado o MEM suplementado com soro fetal bovino,
glutamina, lisina, bicarbonato de Sdio e soluo antibitica e antifngica.
O meio Eagle comprado liofilizado, o premix dissolvido em gua estril
acrescentado de SFB (10%), antibitico (penicilina - 100 a 200 UI / mL, estreptomicina-

200 ~g / ml, enrofloxacina - 1O~g / mL) e antifngico (anfotericina B - 1,25 ~g /mL).

3.2 PREPARAO DO MEIO

o material a ser utilizado para o preparo do meio e para o cultivo celular deve ser
lavado atenciosamente retirando restos de material txico e contaminao da superfcie
interna, e esterilizado. Separase um volume total de gua estril num recipiente para a
diluio do premix filtrando. Depois adiciona soluo de bicarbonato at obter uma
concentrao final de 2,Ogll (0,2%), esta concentrao pode variar de acordo com o meio.
Em seguida deve adicionar soluo de 1 Molar de NaOH ou 1 Molar de HCL at alcanar
um pH de 7,0 - 7,2.
12

A preparao do meio pronto para uso a partir desse meio Base j filtrado
adicionado de soro fetal bovino (SFB), TPB (caldo triptose fosfato), glutamina, antibitico
e antifngico.

3.3 PASSAGEM DAS CLULAS E CULTIVO

o processo se inicia com a escolha de qual clula preciso ser passada. Depois
se liga o fluxo laminar e separa o material necessrio (garrafa para cultivo estril, meio de
Eagle, pipetas, vidraria para o descarte de material dentro do fluxo). Ento abre a garrafa
despreza o contedo e adiciona soluo Tampo Fosfato de Sdio (PBS) para lavar as
clulas, pois as protenas do SFB contidas no meio neutralizam a ao da Tripsina.
Despreza essa soluo e adiciona soluo de tripsina (lisa as ligaes peptdicas entre as
clulas) para separar as clulas (desmanchar a monocamada formada). Algumas clulas
necessitam ser colocada na estufa para acelerar a ao da tripsina como exemplo a SK6
de rim de suno. Despreza o excesso de tripsina quando as clulas comearem a se
individualizar. Ainda para ajudar a soltar as clulas pode usar ao fsica sobre a garrafa.
Observa no microscpio invertido se as clulas esto soltas. Aspira com uma pipeta o
sobrenadante da garrafa e solta para dissolver os grumos celulares. Coloca 10 ml de meio
de crescimento Eagle nessa garrafa e homogeneza. Com auxlio de uma pipeta divide
essa soluo de clulas em duas novas garrafas (5 ml em cada garrafa). Identifica ~se as
garrafas com O nome da clula, nmero da passagem e o dia que foi realizada. Observa
no microscpio e coloca na estufa mida a 370C com 5% de CO2.

3.4 DESCONGELAMENTO DE CLULAS

Para esse processo preciso separar e esterilizar as garrafas a serem usadas e o


meio de crescimento Eagle 10%. Retira~se a clula do nitrognio lquido a - 1960 C nesse
caso a MDBK 180 e coloca a ampola no banho~maria a 3f'C para descongelar
rapidamente. Enquanto isso coloca 8 mL de meio no tubo de centrfuga e 20 mL de meio
13

na garrafa mdia para o crescimento celular, no esquecendo de identificar a garrafa.

Retira-se a ampola do banho-maria e aspira o contedo adicionando ao tubo. Coloca esse


tubo na centrfuga a 2000 rpm por 10 minutos para retirar o crioprotetor da clula. Retira o
tubo da centrfuga desprezando o sobrenadante e com alguns mL de meio ressuspende-
se as clulas precipitadas no fundo do tubo. Coloca essa soluo na garrafa mdia e
observa no microscpio invertido. Coloca-se a garrafa na estufa mida a 37C e 5% de

CO,.

3.5 CONTAGEM CELULAR

Para esse processo se dilu urna ampola de clula em 5mL de meio. Nesse caso foi
feito com a clula MOBK. realizado esse processo para saber a quantidade de clulas
que se tem por garrafa (contagem) para realizar testes como saroneutralizao que
necessita de no mnimo 150.000 a 300.000 clulas por mL.
Separa num frasco 50 I-IL de corante Azul de Evans e adiciona 100 I-IL de clulas
mistura e coloca na Cmara de Fuchs - Rosenthal com lamnula e faz a leitura. A leitura
realizada em microscpio invertido lendo apenas os quatro quadrantes das extremidades
da Cmara subdivididos em 16 partes. Aps a contagem dessas clulas pertencentes a
esses quadrantes, utilizase a equao 1.

(1)
x+y+z+w = X.1,5x5000
4
Fonte:

Onde: x,y,z,w = so os nmeros da contagem por quadrante


4 = fator de diviso
X = mdia entre os quadrantes
1,5 = soma da diluio, ou seja, 100 I-IL + 50 iJL
5000 = fator da Cmara
14

Exemplo: clula CRFK - gato

Diluio 1 /100

x + y +z + w = X . 1,5 . 5000
4

4 + 4 +4 +4 = 4 . 1,5.5000
4

30.000 cls / ml x 100(pela diluio)


3.000.000 clulas por mL

3.6 ARMAZENAMENTO DE CLULAS

As clulas podem ser armazenadas atravs do congelamento em nitrognio lquido


para serem utilizadas em outra ocasio (banco de clulas), essa tcnica, porm usada
em clulas saudveis ou em fase exponencial de crescimento.
Depois da escolha da clula e verificao do seu perfeito estado inicia o processo
com a remoo do tapete celular como de fosse realizar uma passagem. Retira as clulas
j desprendidas da parede e coloca-as num tubo e centrfuga de 1000 a 2000 rpm durante
5 minutos. O sobrenadante deve ser cuidadosamente desprezado e as clulas
sedimentadas devem ser ressuspendidas em meio de crescimento com 10 % de soro fetal
bovino. O meio de congelamento consiste de 50% de suspenso celular, 40% de soro
fetal bovino e 10% de Sulfxido de Dimethil (DMSQ). Aps esse processo, distribuir a
soluo em criotubos de 1ml que iro congelar lentamente por 24 horas no freezer sooe
negativos e depois iro para os botijes de nitrognio podendo ficar armazenada por
tempo ilimitado.
15

4. TCNICAS DE DIAGNSTICO VIROLGICO MAIS UTILIZADAS DURANTE O


PERODO DE ESTGIO, PARA DETECO DE ANTICORPOS.

As tcnicas para deteco de anticorpos so realizadas a partir de amostras de


soro sangneo.
No COME as amostras de soro so colocadas em banho-maria a 56C por 30
minutos para descomplementar, ocorrendo a inativao do sistema complemento, o que
diminui reaes inespecficas e ento so mantidas sob refrigerao. Esse procedimento
realizado com todos os soros antes da realizao de qualquer tcnica. As amostras so
protocoladas e identificadas para facilitar a realizao dos testes solicitados.

4.1 ELISA ENZIME LlNKED IMMUNOSORBENT ASSAY ENSAIO


IMUNOENZIMTICO

um mtodo de diagnstico usado para detectar tanto antgeno como anticorpo


dependendo do seu mecanismo de atuao. Esses mecanismos podem ser ELISA por
competio, Elisa por Bloqueio (o qual utilizado pelo COME), direto ou indireto.
O fundamento do mtodo similar ao da imunofluorescncia. Antgenos e
anticorpos, um dos quais deve ser conhecido, so colocados para reagir. Ocorre
desenvolvimento de cor pela interao entre um substrato cromognico e uma enzima
unida ao anticorpo detetor. O mais utilizado o ELISA como ensaio direto em fase slida,
no qual esta fase coberta com anticorpos especficos para servir como camada de
captura, e o deteto r o anticorpo especfico conjugado com a enzima (KONEMAN et aI.;
2001).
Os ensaios imunoenzimticos so mais teis para avaliar grande nmero de
amostras ou amostras que podem ser colhidas e avaliadas em lotes. O ponto final pode
ser lido em um espectrofotmetro, o que elimina as interpretaes subjetivas.(Koneman et
ai.; 2001)
Esses testes so usados pela facilidade de realizao e clara visualizao dos
resultados positivos e negativos.
16

4.1.1 Mtodo de Elisa para Peste Suna Clssica (PSC) utilizado no COME

A Peste Suna Clssica (PSC) uma enfermidade viral contagiosa que acomete
somente sudeos. A doena causada por um vrus da famlia Flaviviridae, gnero

Pestivrus.
Cepas de alta virulncia determinam doena aguda com quadros de hemorragias
mltiplas, quando a mortalidade pode alcanar 100%. Cepas de baixa e moderada
virulncia determinam o aparecimento de formas atpicas, crnicas ou sub-clnicas da
doena.
O vrus da PSC antigenicamente relacionado ao vrus da Diarria Bovina e
Doena da Fronteira, Pestivrus de ruminantes que podem infectar sunos.

O diagnstico da PSC pode ser realizado atravs da deteco e isolamento do


antgeno viral ou pela deteco de anticorpos especficos por provas de neutralizao e
ensaios imunoenzimticos.
utilizado no COME o mtodo de ELISA por ser um teste rpido, menos 3 horas
para sua realizao, muito utilizado como triagem e possui alta sensibilidade e alta
especificidade (BLOEMRAAD, 1998).
Apresentam-se em forma de "kits", comercializados por laboratrios, os quais so
munidos de todos os ingredientes necessrios para a realizao da prova, s
necessitando do espectrofotmetro para a leitura das microplacas, pipetadores de

preciso, de 50 f..lL e de 100 ).lL, ponteiras descartveis, gua Milli-Q ou bi-destilada,

lavador automtico de placas, mas no COME usa-se recipientes com capacidade de at 2


litros e cmara mida ou selador de placa.
O "kit" utilizado para diagnstico da Peste Suna Clssica possui at 99% de
sensibilidade e at 98% de especificidade, evitando resultados falso positiVO por resposta
cruzada com o vrus da Diarria Viral Bovina (BVD), que pode acometer tambm sunos.
Esse teste pode ser realizado a partir de 7dias do percurso da doena, o que possibilita o
diagnstico precoce.
Em SUl nos realizado a cada 6 meses nas granjas certificadas para controle de
PSC. realizado atravs de um "kit" prprio para PSC. No COME o mtodo de ELISA
utilizado por bloqueio, chamado Kit de Deteco de Anticorpo do Vrus da Peste Suna
Clssica (VPSC), fabricado pelo laboratrio IDEXX - Sucia.
17

o ensaio um ELISA de Bloqueio que utiliza fileiras de microorifcios (microplacas


de poliestireno) impregnados com antgeno VPSC que constitui a chave de reao, ento
os anticorpos presentes nos soros testados iro ligar-se ao antgeno bloqueando a ligao
do conjugado especfico monoclonal anti-VPSC. Onde no ocorreu reao por ausncia
de anticorpos do soro animal, o anticorpo monoclonal conjugado do kit ir se ligar ao
antgeno no fundo da placa, esse ser detectado por um substrato que reage com a
peroxidase, enzima usada no conjugado do "kit". O resultado indicado por
desenvolvimento de cor. A densidade tica medida atravs de um leitor de microplacas
em um comprimento de onda simples de 450 nm, ou em um comprimento de onda duplo
de 450nm e 620nm, o qual usado no COME (HERO CHEK ELISA TEST KIT, 98).
O kit composto por 5 microplacas impregnadas com antgeno VPSC, soluo de
lavagem (10X) 480 ml, suficiente para 5 L, controle positivo (lml), controle negativo (1ml),
diluente de amostra (45ml), Conjugado Horseradish- Peroxidase (HAPO) anti VPSC
(60ml), soluo de substrato Tetrametil Benzidina (TMB) (60ml) e soluo de parada
(60ml) (CSFV-IOEXX).
Procede-se a Tcnica com O auxlio de micropipetadores colocando 50IJL de cada
amostra numa microplaca modelo para facilitar a passagem dos soros para a microplaca
do "kit". Com um pipetador multicanal os soros so repassados para a placa do ELISA. Os
4 primeiros pocinhos da primeira coluna da placa ficam reservados para os controles
positivos e negativos do teste. Nos 2 primeiros pocinhos da primeira coluna coloca 50 IJL
do Controle positivo (A e B) e nos 2 seguintes 50IJL do Controle negativo (C e O).
Adiciona-se o diluente em todos os pocinhos, agita e reserva por 2 horas a temperatura
ambiente. Passado esse tempo, despreza o contedo dos pocinhos e lava-os com a
soluo de lavagem por 3 vezes. Enxuga a placa e adiciona o anticorpo conjugado com
enzima peroxidase reservando por 30 minutos. Aps esse tempo lava-se novamente por 3
vezes, coloca-se a soluo de substrato TMB que reage na presena da enzima e
aguarda 10 minutos em local protegido da luz (a placa apresenta-se com colorao azul
claro). Depois adiciona a soluo de parada (colorao final amarelo-claro). Coloca a
placa no Espectrofotmetro de Absorbncia conectado ao computador e uma impressora,
expondo a leitura da placa e imprimindo o resultado. O resultado fornecido pela
equao 2.

(2 )
% Bloqueio = O O neg - O O amostra x 100
O O neg
18

o resultado da frmula informa a porcentagem de bloqueio que medida pela


absorbncia no espectrofotmetro. As amostras sero negativas quando o resultado for
menor ou igual a 30% e as positivas maior que 50% e os resultados que ficarem com
valores entre 30% - 50% so considerados duvidosos. Para os duvidosos se repete o

teste ou realiza um teste de Soro Neutralizao para confirmar o resultado.


O mtodo de ELISA baseia-se na ligao dos anticorpos presentes ou no no soro,
ao antgeno adsorvido a placa. Quando um soro do animal positivo, OS anticorpos se
ligam ao antgeno adsorvido placa impedindo a ligao anticorpo conjugado com
conseqente ausncia da enzima e, portanto ausncia de cor. O resultado positivo se d
pela ausncia de cor e o negativo pela colorao amarela que ocorre no final de todo o
processo. Isto ocorre porque o substrato TMB reage com a enzima do anticorpo
conjugado que se ligou ao antgeno adsorvido placa, onde o anticorpo do animal no se
ligou (no est presente no soro). No caso de animal negativo, a ausncia de anticorpos
do soro, vai permitir a ligao do anticorpo conjugado ao antgeno da placa, e quando se
adicionar o TMB vai reagir com a enzima peroxidase do anticorpo conjugado
desenvolvendo cor.

4.2. TESTE DE SORONEUTRALlZAO

o teste de soroneutralizao (SN), tambm chamado de soro-vrus-neutralizao


utilizado para detectar anticorpos que possuem capacidade de neutralizar a infectividade
do vrus (anticorpos neutralizantes).
A neutralizao viral se define como a medida da capacidade infectante do vrus
pela reao do mesmo com um anticorpo especfico, a neutralizao pode ser
demonstrada pela inoculao em sistema hospedeiro susceptvel, exemplo cultivo celular.

O teste de neutralizao uma tcnica para deteco de anticorpos neutralizantes


no soro sangneo. A amostra dever estar limpida e sem hemlise, j que a tcnica
utiliza cultivos celulares como substrato. Soros de m qualidade podem gerar toxidez e
contaminaes nos cultivos.
O soro deve ser mantido em banho-maria por 30 minutos a 56 2C. para inativar o
complemento e possveis inibidores no especficos. O teste realizado em microplacas
19

de poliestireno com 96 poos onde a amostra testada em duplicata nas diluies


recomendadas pelo Escritrio Internacional de Epizootias (OIE).
Na realizao das provas devero ser empregadas cepas de referncia do vrus. O
clculo do ttulo viral deve ser feito pelos mtodos de Reed & Muench ou pelo

Spearmann-Krber e a diluio de trabalho deve conter 100 TCIDso /50 1-lL.

Sero citados posteriormente como exemplos de soroneutralizao com cepa viral


citopatognica (causa dano celular) as tcnicas para diagnstico da Doena de Aujeszky
e Estomatite Vesicular. Logo aps a descrio da Produo e Titulao Viral est descrito
a soroneutralizao para cepas no citopatognicas (no ocorre dano celular).

4.2.1 Produo Viral

Descongela uma ampola de vrus e inocula em uma garrafa de cultivo celular.


Espera de 4 a 5 dias a 37C at ocorrer 90 % de efeito citoptico e congela rapidamente,
colocando no freezer a 800C negativos. Depois descongela lentamente para romper as
clulas e liberar as partculas virais. Logo aps centrfuga-se e colhe o sobrenadante
separando em alquotas de 0,8 a 1,0 mL guardando no freezer a 80C negativos e faz a
titulao dessa suspenso vira!.

4.2.2 Titulao Viral

a determinao da ltima diluio onde vrus capaz de infectar 50% dos


cultivos celulares, nos mesmos moldes de uma DL50 ou 50% da dose letal. Portanto,
toma-se o valor de 50% de atividade viral como ponto final de referncia, j que neste
caso os valores flutuaram ao redor de um ponto mdio. A dose mnima letal varia segundo
o sistema hospedeiro e se deve ter referncia do ttulo obtido. No caso dos cultivos
celulares denomina-se TCID50 (Tissue Culture Infeccious Dosis 50 - Dose capaz de
infectar 50% dos cultivos celulares).
O material viral em suspenso se inocula em distintas diluies em um certo
nmero de hospedeiros susceptveis observando a resposta. O melhor mtodo consiste
20

em usar grandes nmeros de unidades de tcnicas em diluies muito prximas entre si e


observar qual valor ocorre 50 % de reao. Este mtodo se baseia na estimativa do
nmero de respostas possveis, a resposta tudo ou nada (FAO/RLAC; 1992).
Para calcular o nmero de partculas infecciosas de uma determinada suspenso
viral se aplica o mtodo de Diluio Limite, onde a atividade viral mata ou infecta uma
porcentagem determinada (ponto final) pelos elementos inoculados (FAO/RLAC; 1992).

Titular dar a medida quantitativa da atividade duma suspenso vira!. E ser dada
pela maior diluio que mostrar atividade, por exemplo, 10.3,10-4 ou na diluio: 1:1000,

1:10000, etc. Representando 1000, 10000 unidades vricas (Mayr el ai, 1988).
Para a realizao da tcnica so separados 10 tubos de ensaio em uma bandeja
de gelo, cada um preenchido com 4,5 mL de meio de manuteno. Descongelar uma
ampola do vrus, a ser titulado, acrescentando 0,5 mL no primeiro tubo, agita-se e
repassado o volume de 0,5 mL para o segundo tubo e assim sucessivamente at o
dcimo tubo onde a diluio ser de 10-10 ou 1: 10.000.000.000. Separa-se trs
microplacas, coloca 50llL de meio em cada pocinho das trs placas. Coloca-se 50llL do
dcimo tubo na dcima coluna da placa, do nono tubo na nona coluna da placa e assim
sucessivamente, deixando a dcima primeira e dcima segunda coluna para controle de
clulas. Depois de colocar o ltimo tubo, reservar em geladeira.
Prepara a clula a ser usada ressuspendendo-a como se fosse fazer uma
passagem de clula. Acrescenta 100J1L dessa suspenso de clula em cada pocinho das
trs placas em uma concentrao de 150.000 a 300.000 clulas por ml. Faz-se a primeira
leitura com no mnimo 48 horas de incubao.
Interpretao do Resultado - Mtodo de Spearman Karber

A interpretao ocorre pelo resultado da equao 3:

(3 )
T=t+ t*

t* = efeito ou 100% = ltima coluna que foi observado efeito em todos os pocinhos.

"'1=~-1
8 8

x = nmero de pocinhos que ocorreu efeito aps a coluna dos 100%.


21

Exemplo: Placa 1 - Vrus da Estomatite Vesicular em clula Vero.

T=t>t +t' Llt=x+8-4


=
T 0.875 + 6 -8-
=
T 6,875
T = 10-6,875 f..lL

t>t = 11 - 4 = 7/ 8 = 0,875
8

t>t = 0,875

Placa 2 - Vrus da Estomatite Vesicular em clula Vero.

T=t>t+t'
T= 1 +6
T= 7
T=1O-7 ~L t>t = 4 + 8 - 4
-8- 8

t>t= 12-4
-8-

t>t =1

Ento tira-se a mdia entre os resultados das placas e obtm-se o Ttulo Viral para
nCID 50.

x = 6,875 + 7 = 13,875/ 2 = 6,9


X=10-6,9

1 TCID 50 = 10-<9
10 TCID 50 = 10-5,9
100 TCID 50 = 10-",9
22

Para realizar os testes usado 100 TCIO, ou seja, usa-se 10 -4,9 que significa uma
diluio do vrus a 1: 79.432 em meio de manuteno.

4.2.3. Soro neutralizao para PSC ou cepas virais no citopatognicas.

Com exceo da cepa viral e da linhagem celular utilizada, todos os reagentes, as


tcnicas de cultivo celular, produo e titulao viral, soroneutralizao e a revelao da
prova seguiram os mesmos padres das utilizadas nesse exemplo.

4.2.3.a Procedimentos

Distribuir 80 !J.L de MEM nos pocinhos da primeira fila e SOul nos demais da
microplaca;

Adicionar 20 !lL de amostras de soro, em duplicata, nos pocinhos da primeira fila.

Deste modo estabelecemos a diluio inicial do soro de 1:5;

A partir da primeira fila, realizar diluies seriadas de base 2, atravs da transferncia

de 50 ~L de amostra diluda para o pocinho da prxima fila;

Adicionar 50 ~I por pocinho da suspenso viral contendo 100 TCIDso. A mistura soro-

vrus incubada a 37C por 1 hora, quando ento so adicionados 100 ~L de

suspenso celular na concentrao de 150.000 a 300.000 clulas/ml;


Incubar o sistema em estufa 37C, com 5% de CO2 , por 72 horas.

Para a revelao das provas as clulas devem ser fixadas da seguinte maneira
aps o perodo de incubao, as placas devem ser invertidas para a retirada do meio
de cultivo, lavadas 1 vez com P8S ou salina 0,15 M com 0,05 % de Tween 80 e
colocadas invertidas para fixao em forno 80 C por 1 hora ou a 37 2C por 4 horas.
23

4.2.3.b. Prova direta com anticorpos conjugados com fluorescena ou IFD.

Devero ser adicionados 50 IJU poo da diluio de trabalho pr-determinada do


anticorpo antivrus da PSC conjugado com fluorescena e incubados em cmara
mida a 37 C por 30 minutos;
Aps o perodo de incubao, as placas so lavadas por 3 vezes em PBS (pH 7,2) ou
em soluo salina 0,15 M com 0,05 % de Tween 80;
Adicionar 30 I-lL de glicerina tampanada 50 %, por pacinho;
Realizar a leitura em microscpio de fluorescncia invertido.

4.2.3.c. Prova indireta com anticorpos conjugados com fluorescena ou IFI.

Devero ser adicionados 50 !-lU poo da diluio de trabalho pr-determinada do


anticorpo antivrus da PSC e incubados em cmara mida a 37 C por 30 minutos;
Aps O perodo de incubao, as placas so lavadas por 3 vezes em PBS (pH 7,2) ou
em soluo salina 0,15 M com 0,05 % de Tween 80;
A segunda incubao deve ser realizada com 50 I-lU poo de anticorpo anti espcie
conjugado a fluorescena na diluio de trabalho pr-determinada, por 30 minutos a
37'C;
Aps o perodo de incubao, as placas so lavadas por 3 vezes em PBS (pH 7,2) ou
em soluo salina 0,15 M com 0,05 % de Tween 80;
Adicionar 30 IJL de glicerina tamponada 50 % por pocinho;
Realizar a leitura em microscpio de fluorescncia invertido.

4.2.3.d. Prova direta com anticorpos conjugados com peroxidase ou IPD

Devero ser adicionados 50 IJU poo da diluio de trabalho pr-determinada do


anticorpo antivrus da PSC conjugado com peroxidase e incubados em cmara mida
a 37 C por 30 minutos;
24

Aps o perodo de incubao, as placas so lavadas por 3 vezes em PBS (pH 7,2) ou
em soluo salina 0,15 M com 0,05 % de Tween 80;
Para a revelao da prova utilizada a soluo de substrato cromognico, 3-amino-9-
etil-carbazol - AEC + H202 por 5 - 10 minutos a temperatura ambiente;
Realizar a leitura em microscpio tico comum.

4.2.3.8. Prova indireta com anticorpos conjugados com peroxidase ou IPI.

Devero ser adicionados 50 ~U poo da diluio de trabalho pr-determinada do


anticorpo antivrus da PSC e incubados em cmara mida a 37 2C por 30 minutos;
Aps o perodo de incubao, as placas so lavadas por 3 vezes em PBS (pH 7,2) ou

em soluo salina 0,15 M com 0,05 % de Tween 80;


A segunda incubao deve ser realizada com 50 !-lU poo de anticorpo antiespcie
conjugado peroxidase na diluio de trabalho pr determinada, por 30 minutos a
37'C;
Aps o perodo de incubao, as placas so lavadas por 3 vezes em PBS (pH 7,2) ou
em soluo salina 0,15 M com 0,05 % de Tween 80;
Para a revelao da prova utilizada a soluo de substrato cromognico, 3-amino-9-
etil-carbazol - AEC + H202, por 5 - 10 minutos a temperatura ambiente;
Realizar a leitura em microscpio tico.

4.2.3.f. Validao, Leitura e Interpretao.

As provas de neutralizao sero consideradas vlidas quando:


O soro controle positivo neutralizar a atividade viral, revelada pela ausncia de focos
fluorescentes ou de imunocolorao sobre o cultivo celular;
O soro controle negativo no dever neutralizar a atividade viral, revelada pela
presena de focos fluorescentes ou de imunocolorao sobre o cultivo celular;
25

o nmero de doses infectantes do vrus empregados na prova dever variar entre o

antilog 101.5 e anti-Iog de 102,5,

A presena de anticorpos na amostra contra o vrus da PSC traduzida pela

neutralizao da atividade virar revelada pela ausncia de focos especficos de

imunocolorao por reao da fluorescena ou peroxidase sobre o cultivo de clulas. Por

outro lado, a presena de tais focos indicar a ausncia de anticorpos especficos contra

o vrus da PSC na amostra examinada, portanto soro negativo.

4.2.4. Soroneutralizao para Estomatite Vesicular ou cepas virais citopatognicas.

Com exceo da cepa viral e da linhagem utilizada, todos os reagentes, as tcnicas

de cultivo celular, produo e titulao viral, soroneutralizao e a revelao da prova

seguiram os mesmos padres da dada como exemplo na Soroneutralizao para Peste

Suna Clssica que atualmente no mais realizada no COME porque o Estado Livre

da PSC sem vacinao e nessa tcnica manipulase o vrus.

Os sinais clnicos da Estomatite Vesicular podem confundirse com os causados

pelo vrus da Febre Aftosa e do Exantema Vesicular dos sunos. O vrus intecta bovinos,

eqinos, sunos, cobaios e camundongos novos (7 - 9 dias). Ele penetra em soluo de

continuidade da pele ou por picada de mosquitos. Como na Febre Aftosa, depois da

instalao ocorre um foco local de multiplicao, seguido de viremia com generalizao

de leses na membrana mucosa da boca e pele ao redor da boca e patas. muito

comum o vrus no produzir as clssicas vesculas nos animais afetados nos surtos, mas

aparecem leses secas e necrticas. s vezes essa constatao pode prejudicar o

diagnstico da virose (Mayr ei ai, 1988).

O diagnstico dessa doena importante porque o Paran considerado livre da

Febre Aftosa, como parecida pode complicar a situao do rebanho do Estado.


26

4.2.4.a. Diluio do Soro

Separa-se as placas e esteriliza-as. marcado divises nas placas para poder


usar o mesmo soro duas vezes obtendo duas diluies. Coloca-se nas primeiras fileiras
90 !JL de meio de manuteno Eagle 2% e nos demais pocinhos coloca 50 IJL de meio.

Adicionar os soroS. Nos primeiros coloca 10 jJL de soro, ficando 1:2 a diluio. Com uma
pipeta apropriada repassar os soros para os demais pocinhos diluindo at 1:320.

4.2.4.b. Diluio Vira/.

Num recipiente com gua e gelo, prepara-se 6 tubos para a diluio do vrus.
Coloca-se 4,5ml de meio Eagle 2% SFB em todos os tubos. No recipiente reservado para
a Diluio de Trabalho (DT) coloca 19,36 ml de meio Eagle 2% SFB adicionado de
antibitico e antifngico. Ento o vrus descongelado. Colocam-se 0,5 ml de soluo
viral nos trs primeiros tubos (-1,-2 e -3), repassando 0,5 para cada tubo. Depois se
pipeta 0,640 ml da diluio 1/1000 e coroca no DT agitando-o. Coloca 0.5 ml do DT nos 3
tubos restantes ( DT-1, DT-2 e DT-3) repassando de um para o outro, realizando assim

uma retrotitulao vira1. Aps isso coloca-se 50 I1L do tubo DT -3 na ltima coluna da

placa. Pega 50 ).l L do DT -2 e coloca na penltima coluna e o tubo OT-1 na

antepenltima coluna. Ento pega 50 J.lI do DT e coloca na quarta coluna de traz para

frente. Nos duas primeiras colunas deixa para controle de clula, no coloca vrus. Nas

placas com soro acrescenta 50 ).lL do DT em todos os pocinhos no encostando as


ponteiras para evitar contaminao entre os soros. Verificar se todos os pocinhos esto
com o mesmo volume. S nos de controle de clula que o volume menor. Reserva as
placas em estufa mida 3rC com 5% de C02 por 1 hora para ocorrer reao Ag - Ac.
Depois desse tempo adiciona as clulas e aguarda at o quinto dia para fornecer o
resultado final. Observando as placas durante esses dias.
27

4.3. IMUNODIFUSO EM GEL GAR

So reaes de precipitao realizadas em gel de gar em uma placa de Petri ou


em uma lmina de microscpio. Ocorre uma linha de precipitao visvel entre os orifcios
no ponto em que alcanada a relao tima entre antgeno e anticorpo (Tortora et ai,
2000).
Os gis mais utilizados tm como base pectina, al9inat05, poliacrilamida e inclusive
podem utilizarMse tiras de acetato de celulose gelatinizado. Os precipitados que se
originam so visualizados como bandas, que permanecem estveis enquanto o maior
fluxo de molculas de algum dos reagentes empregados no provoque sua redissoluo
(FAO/RLAC; 1992).
Utiliza-se normalmente o mtodo de Oucherlony ou de dupla difuso. Consiste em
colocar frente a frente em pequenos poos efetuados no gar, as solues de antgeno e
anticorpo. Ao difundir-se e colocar-se em contato, produzir uma banda de precipitao,
somente quando se encontram em concentraes timas. Se esta concentrao
corresponde a urna zona de equivalncia a banda de precipitao estar situada
aproximadamente em uma distncia mdia que separa os reagentes. Quando existe
excesso de antgeno ou anticorpo, a banda de precipitao formada estar prxima a do
poo do anticorpo ou do antgeno respectivamente (FAO/RLAC, 1992).
Pode-se observar trs tipos de reaes; reao de identidade, quando os dois
sistemas difundem em uma nica banda de precipitao, reao de no identidade,
quando cada sistema reage independentemente, originando bandas de precipitao que
se cruzam, e reao de identidade parcial, quando um dos antgenos tem menos de um
componente e capaz de dar uma reao cruzada com um anticorpo elaborado contra
um antgeno mais simples. Em cujo caso as linhas de precipitao de ambos sistemas se
unem e fundem parcialmente em uma banda, parecendo uma prolongao (FAO/RLAC;
1992).
Devido sua simplicidade, este mtodo pode ser realizado em qualquer laboratrio,
sem necessidade de grande infraestrutura, tem sido utilizado praticamente em todas as
viroses, como mtodo de diagnstico sorolgico.
Na virologia veterinria utilizado atualmente para identificao dos reagentes
para as seguintes infeces: Lngua Azul, Febre Aftosa, Anemia Infecciosa Eqina,
Leucose Bovina, etc.
28

4.3.1. Preparo do gar

Separa 137,5 mL de gua destilada, 2,5 grama de gar NobJe (p) num Becker e
coloca em banho-maria para dissolver. Depois despeja essa soluo em uma bandeja
que vai para a geladeira ocorrendo solidificao do gel. Corta-se esse gel em quadrados
com aproximadamente 2 x 2 reservando-os num recipiente com tampa numa soluo de
gua destilada + 0,1 % de Azida Sdica.

4.3.2. Preparo do Diluente - Soluo Tampo

Separa 500 mL de gua, 1 grama de Na OH (hidrxido de sdio), 4,6 gramas


H3B03 (cido brico) e 1 grama de NaN3 (azida sdica) num recipiente e depois filtra
essa soluo, reservando em geladeira.

4.3.3. Preparo do gel gar

Separa-se 10 ml de diluente e 10 9 de gel (gar) num Becker e coloca-se no


microondas por 3 minutos na potncia fraca. Depois pega a placa de Petri coloca sobre
uma plataforma plana e despeja 15 ml dessa soluo de gar, espera uns 30 minutos e
coloca na geladeira com a tampa virada para baixo para ocorrer a fixao do gel gar.

4.3.4. Realizao da tcnica

Prepara a placa de Petri com gar. Depois se fura o gel com uma roseta de 7 furos.
Aspira o gel dos furos da roseta com um maquinrio prprio para isso. Adiciona os soros
nos 4 furos laterais da roseta e no furo de cima soro positivo e no de baixo tambm, j no
furo do meio coloca~se o agente. Reserva a temperatura ambiente por 24 horas para
realizar a primeira leitura e com 48h libera o laudo.
29

o nmero de rosetas da placa depende da quantidade de amostras. colocado 2


soros por roseta.

4.4. INIBiO DA HEMAGLUTINAO (H IA)

A tcnica de Inibio da Hemoaglutinao Viral se baseia na unio de anticorpos a


hemaglutinina do vrus, resultando na inibio da hemoaglutinao. uma prova
altamente especfica e sensvel, alm de se adaptar facilmente a laboratrios de pouca
infraestrutura pelo baixo custo dos reagentes. simples e de rpida realizao (Calva e

Arroyo, 2000).
Existem dois mtodos para realizar esta prova, o primeiro se realiza diluies
decrescentes do vrus frente quantidades constantes do soro (mtodo alfa) e no outro se
realiza diluies do soro frente quantidades constante de vrus (mtodo beta).
O mtodo beta o mais comumente utilizado, o nmero de unidades

hemaglutinantes (UHA) empregado pode variar de 2, 4, 8 e 16, dependendo do propsito


da tcnica e do tcnico. Para realizao dessa prova, necessria a suspenso de
hemcias especficas.
importante ressaltar a possibilidade do soro inibir a hemaglutinao atravs de
um mecanismo no imunolgico, ou seja: no mediado por anticorpos. Esse fenmeno
provocado por substncias ditas "inibidores inespecficos da hemaglutinao", que
apresentam afinidade pela hemaglutinina viral.
Os inibi dores in especficos da hemaglutinao (ex. albumina bovina) podem ser
removidos do soro por diferentes mtodos, que variam de acordo com o sistema vira!.
Outro problema que pode ocorrer na reao de HIA a presena de hemaglutininas
contra as hemcias empregadas na reao. Nesse caso, embora o soro possa ter
anticorpos que bloqueiem a hemaglutinina viral, ocorre uma falsa hemaglutinao
mediada pelas aglutininas sricas. Isto induz a um resultado negativo no HIA. Esse
problema pode ser contornado atravs da adsoro prvia do soro com uma suspenso
de hemcias, retirando as aglutininas s ricas indesejveis.
30

4.4.1. Parvovrus Suno - PVS

A Parvovirose Suna urna infeco causada por um DNA-vrus, relacionado a


distrbios reprodutivos em fmeas jovens, eminentemente representada por morte
embrionria e fetal sem causar, contudo, quaisquer outros sinais clnicos em animais
adultos. A Parvovirose Suna desenvolve-se normalmente quando fmeas soronegativas
so expostas, por via oronasal, ao PVS durante a primeira metade do perodO de
gestao e seus embries ou fetos so infectados transplacentariamente antes de se
tornarem imunocompententes. Leites sobreviventes de porcas infectadas durante a
gestao, so igualmente fonte de infeco. podendo eliminar o vrus at as 9 semanas
de idade.
uma virose que causa morte embrionria, mumificao e leitegadas de tamanho
reduzido, quando atinge fmeas em gestao no imunes (Sobestiaresky et aI., 1993).
A sorologia permite a avaliao do estado imunitrio do rebanho e a presena de
diferentes nveis de anticorpos anti-PVS dentro de um mesmo planteI, pode ser indcio de
uma infeco em evoluo. Leites com imunidade passiva podero ter ttulos altos de
anticorpos que tendem a desaparecer em torno dos seis meses de idade.
O teste de Inibio da Hemoaglutinao (HIA) constitui-se no mtodo de eleio
para evidenciar anticorpos anti-PVS apresentando resultados similares ao teste de
soroneutralizao (Joo et aI., 1976).
O ttulo de anticorpos necessrios para que um animal seja considerado positivo
bastante divergente. MengeHng (1972) ao descrever pela primeira vez a presena do PVS
nos Estados Unidos, considerou positivos soros com ttulos superior a cinco, Zupancic
(1977) considerou positivos soros com ttulo superior a 32, enquanto que Hogg et
al.(1977) estabeleceram positividade em titulos superiores a oito. Somente foram
considerados positivos soros com ttulo igualou maior que 320, para evitar possveis
erros devido presena de inibidores in especficos da hemoaglutinao nos soros de
sunos.

4.4.1.a Tratamento das amostras de soro

Os soros de muitas espcies contm inibi dores inespecficos ou aglutininas


inespecficas que podem confundir os resultados, por isso devem ser destrudos antes de
realizar a tcnica de Inibio da Hemoaglutinao (IHA), para permitir a determinao do
nvel de anticorpos especficos no soro ou para a correta identificao do vrus isolado
(Calva e Arroyo, 2000).
31

Fracionar 0,2 ml de cada soro teste


Inativar a 56 C por 30 minutos
Q

Adicionar 0,6 ml de kaolin 25% em PBS


Agitar ocasionalmente durante 1 hora a temperatura ambiente
Centrifugar por 10 minutos a 2000 rpm
Recuperar o sobrenadante em outro tubo
Adicionar a cada amostra 0,1 ml de hemcias de cobaio 50% em PBS
Agitar ocasionalmente durante 1 hora a temperatura ambiente
Centrifugar durante 10 minutos a 2000 rpm ou deixar overnigth a 2-8C
Recuperar o sobrenadante e armazenar em geladeira ou no -20 C Q
at O momento da
prova.
No clculo do ttulo de anticorpos devem ser consideradas as pr-diluies.

4.4.1.b. Produo da Suspenso de Hemcias

Colhe 5 mL de sangue intracardiaca da cobaia, adiciona 5 mL de Alserver


(anticoagulante) e realiza lavagens com PBS at o sobrenadante ficar lmpido,
ressuspende em BSA a 0,4%, totalizando 10% de hemcias armazenando em geladeira
(vivel por uma semana).

4.4. l.c. Procedimento

Empregar microplacas de poliestireno de 96 poos com fundo em U


Adicionar 50 J.lL de PBS com 1% de albumina bovina em todos os poos da placa;
Adicionar 50 ~tL da amostra anteriormente tratada, em duplicata, na primeira fila da
microplaca. Deste modo, ser estabelecida a diluio inicial do soro de 1:2;
Homogeneizar a mistura 8 vezes com o uso de pipeta multicanal, e realizar diluies
seriadas com base 2 a partir desta atravs da transferncia de 50 l.tI para os poos das
filas subseqentes.
Adicionar 50 J.l1 de antgeno viral contendo 4 UHA em cada poo
Incubar O sistema por 1 hora 4 C ou a temperatura ambiente
Q

Aps a incubao adicionar aos poos, 50 J.l1 de hemcias de cobaia a 0,6% preparada
em PBS tratado com 0,4% de albumina bovina;
32

- Incubar a placa por 1 - 2 horas a temperatura ambiente


Incluir na prova o controle de hemcias e os soros controle de referncia negativo e
positivo

4.4.1.d. Controle das unidades hemaglutinantes da amostra teste

Adicionar 100 ~ILdo antgeno viral com 4UHA no primeiro poo de duas filas da
microplaca
A partir desses, transferir 50).l1 da suspenso para os poos subsequentes da fila, os
quais j devero conter 501-11PBS com 1% de albumina bovina. Deste modo,
estabelecida uma diluio com base 2, para a aferio do nmero de doses UHA do
antgeno viral
Aps a incubao adicionar aos poos, 50 ).lL de hemcias de cobaia a 0,6%
preparada em PBS tratado com 0,4% de albumina bovina;
Incubar a placa por 1 - 2 horas a temperatura ambiente

4.4.1.e. Validao

A prova ser vlida quando no controle de hemcias houver a formao de boto


de hemcias, ausncia de hemlise e atividade hemaglutinante.
Dever ser observada atividade hemaglutinante no soro controle negativo, e ausncia da
mesma no soro controle positivo. O controle do nmero de UHA do antgeno viral,
apresentar o valor de 4UHA.

4.4.1.1. Leitura e Interpretao.

o resultado ser considerado positivo quando a amostra testada inibir a atividade


hemaglutinante do antgeno viral, o que traduzido pela formao de um boto de
hemcias. A presena de hemaglutinao indicar ausncia de anticorpos inibi dores da
hemaglutinao na amostra testada.
33

5. TCNICAS DE DIAGNSTICO VIRAL MAIS UTILIZADAS NO ESTGIO PARA


DETECO DE ANTGENO

A alternativa mais rpida segura e fcil para pesquisa de antgeno a sua


deteco em cortes histolgicos, "imprint" de rgos empregando-se anticorpos marcados
com imunomarcadores como isotiocianato de fluorescena ou peroxidase (fluorocromo ou
enZima), isolamento em cultivos celulares ou ainda ELISA para deteco de antgenos

5.1 DETECO DIRETA DO ANTGENO POR IMUNOMARCADORES

Essa tcnica permite a imunodeteco de antgenos virais presentes em cultivos


celulares como tambm em cortes de tecidos de animais infectados.
Dado que o princpio da Imunoperoxidase (IP) e Imunofluorescncia (IF) o
mesmo, a IP possui algumas vantagens como a leitura dos resultados efetuada com
microscpio de campo claro, as preparaes so permanentes e possui maior
sensibilidade e especificidade.
Devem ser preparados cortes histoJgicos com espessura de 4 tJm, em lminas para
microscopia, utilizando o micrlomo de congelao (criostato) e seguir o protocolo descrito na
tcnica de Soroneutralizao para PSC no captulo anterior (3.2.2).

5.2. ISOLAMENTO VIRAL

o isolamento e identificao do vrus constituem o mtodo mais seguro para o


diagnstico das enfermidades. Ele realizado a partir da inoculao de suspenses de
tecido animal suspeito em cultivo de linhagens de clulas sendo sua identificao
alcanada por tcnicas de imunofluorescncia e imunoperoxidase com anticorpos
rnonoclonais das cepas virais que no causam Efeito Citoptico.
34

5.2.1. Preparo dos Inculos

Remover o excesso de tecido conjuntivo da amostra


Separar 2 9 da amostra, recortar e triturar em gral com o uso de um pistilo,

empregando-se um pouco de meio de cultivo e areia estril


Fazer uma suspenso a 20% (peso/volume) com meio essencial mnimo (MEM), e
adicionando antibitico para tratamento de inculos
Incubar a temperatura ambiente por 1 hora
Centrifugar a suspenso por 20 minutos de 5000 a 6000 rpm em centrfuga com
refrigerao e recolher o sobrenadante para inoculao em cultivos celulares.

5.2.2. Inoculao em Cultivos

Os cultivos podero ser inoculados ainda com as clulas em suspeno ou aravs da


adsoro dos inoculas em camadas pr-formadas.

5.2.2.a. Clulas em suspenso - microplacas de 96 poos.

Fazer uma diluio seriada do inculo anteriormente obtido de 10 -, e 10 -2;


Distribuir 100 I-lL de cada diluio em 8 pocinhos da microplaca;
Adicionar 100 IJL de suspenso celular na concentrao de 150.000 a 300.000
clulas/mL;

Incubar as placas em estufa mida a 37 C, com 5 % de CO2;


O procedimento de isolamento dever ser realizado em 3 placas simultaneamente,
para permitir as leituras com 24, 48 e 72 horas de incubao, nos casos de cepas
virais no citopatognicas que necessitam de fixao das clulas e uso de
imunomarcadores.
35

5.2.2.b. Clulas em camada pr-formada - microplacas de 96 poos.

Adicionar a microplaca 100 ~L por poo de suspenso celular contendo 150.000 a

300.000 clulas! mL e incubar por 24 horas em estufa mida a 37 oC, com 5 % de

CO,;

Aps o perodo de incubao, descartar o meio de cultivo e inocular 100 ~L do inculo

anteriormente obtido em 8 pocinhos para cada uma das diluies 10.1 e 10 -2;

Incubar as culturas a 370C por 1 hora e 30 minutos;

Descartar o inculo e lavar a monocamada 3 vezes com MEM ou PBS pH 7,2;

Adicionar 100 I-lL de MEM tratado com antibiticos e 2 % de soro fetal bovino, por

poo;

Incubar os cultivos em estufa mida a 37 2C com 5 % de C02;

O procedimento de isolamento dever ser realizado em 3 placas simultaneamente,

para permitir as leituras com 24, 48 e 72 horas de incubao, nos casoS de cepas

virais no citopatognicas que necessitam de fixao das clulas e uso de

imunomarcadores.

5.2.2.c. Fixao das clulas.

Aps o perodo de incubao, as placas devem ser invertidas para a retirada do meio

de cultivo, lavadas 1 vez com PBS ou salinas 0,15 M com 0,05 % de Tween 80 e

colocadas invertidas para fixao em forno 80 gc por 1 hora ou a 37 C por 4 horas;

5.2.2.d. A prova direta de revelao dessa prova segue os mesmos passos da colorao
de placas do item 3.2.3.b at 3.2.3.e.
36

5.2.2.e. Validao.

A prova de fluorescncia ser validada quando os cultivos ou cortes histolgicos

sabidamente infectados, apresentarem fluorescncia especfica (positivo) e ausncia de

fluorescncia nos cultivos ou cortes historgicos que no foram infectados (negativo).

A prova de peroxidase ser validada quando os cultivos ou cortes histolgicos

sabidamente infectados apresentarem imunocolorao especfica (positivo) e ausncia da

mesma nos cultivos ou cortes histolgicos que no foram infectados (negativo).

5.2.2.1. Leitura e interpretao.

Para a prova de fluorescncia a identificao do vrus nos cultivos ou cortes

histolgicos traduzida pela formao de focos especficos, apresentando as clulas

infectadas fluorescncia citoplasmtica. As amostras com resultado positivo devero ser

confirmadas com o emprego de anticorpos monoclonais especficos.

Sero consideradas negativas as amostras que no exibirem nenhuma fluorescncia.

Para a prova de peroxidase a identificao do vrus nos cultivos ou cortes

histolgicos traduzida pela formao de focos especficos, apresentando as clulas

infectadas imunocolorao citoplasmtica vermelha-carmin. As amostras com resultado

positivo devero ser confirmadas com o emprego de anticorpos monoclonais especficos.

Sero consideradas negativas as amostras com ausncia de imunocolorao

citoplasmtica.

No caso de cepas citopatognicas, obselVa-se o efeito citoptico e a confirmao

pode ser por neutralizao com anticorpos especficos ou com o uso de

imunomarcadores.
37

6. TCNICAS DE DIAGNSTICO ESPECiFICAS PARA DOENA DE AUJESZKY NO

COME.

Doena de Aujeszky tambm conhecida como pseudo raiva, causada por um


vrus que infecta o sistema nervoso central e outros rgos como o trato respiratrio de
praticamente todos 0$ mamferos exceto o homem e alguns primatas. Est associada
primariamente com sunos os quais possuem a infeco latente aps se recuperarem
clinicamente (Manual OIE, 1992).

6.1. HISTRICO

o vrus da Doena de Aujeszky (DA) foi diagnosticado pela primeira vez no Brasil
em 1947. Mas at 1978, poucos focos foram identificados, eles se replicaram entre 1979
e 1982, quando a doena se tornou relevante, com surtos principalmente nos Estados de
So Paulo, Paran e Santa Catarina. A partir de 1984, foi implantado um programa de
monitoramento sorolgico e erradicao da DA em granjas de reprodutores sunos, com
controle de comercializao e certificao de estabelecimentos livres da doena
(Brentano - Embrapa - CNPSA, 1992).

A DA provoca grande impacto econmico em plantis sunos. Os custos de um


surto so bastante altos em todas as fases da produo, o que torna importante a adoo
de medidas de controle ou de erradicao da doena (Brentano - Embrapa - CNPSA,
1992).
Hoje em dia essa doena controlada pelo ministrio de agricultura juntamente
com a secretaria, com isso as granjas recebem certificados de livres da doena, para isso
necessrio o controle por testes sorolgico a cada 6 meses da mesma. Como exemplo
cito um artigo publicado em janeiro de 2003 do Informe da ASCS sobre a situao do
Estado de Santa Catarina. "O programa de erradicao de Aujeszky deve concluir o abate
dos animais infectados com o vrus em Santa Catarina. Cerca de 80 mil animais devem
ser sacrificados. As indenizaes aos produtores atingidos vo chegar a R$ 6 milhes,
segundo a ACCS. Cada produtor receber um valor de acordo com a produo mensal
38

em quilos de sunos, conforme o preo do dia pago pelas agroindstrias. O objetivo


manter urna remunerao aos criadores durante o perodo que ficaro sem produzir,

devido a eliminao dos plantis".

6.2. ETIOLOGIA

um ADN - vrus pertence famlia Herpesviridae, enquadrando-se na subfamlia


Alphaherpes, gnero Poikilo. Possui a estrutura do capsideo em forma cbica, com
envelope. Dimetro do virian 150 a 200 nm (Mayr er aI, 1988).
Raros casos podem ser observados no homem, mas a virose no fatal. Assim, os
veterinrios devem ter cuidado nas necropsias, evitando ferimentos que podem ser a
porta de entrada da infeco (Mayr ef ai, 1988).
A porta de entrada do vrus a pele lesada ou a mucosa nasal intata. O vrus,
penetrando pela mucosa nasal, faz a seguir uma virem ia, localizando-se em diversas
vsceras e, seguindo depois atravs dos nervos olfativos, glossofaringeanos e trigmeos,
atinge o crebro, determinando encefalite. Quando o vrus penetra pela pele lesada,
rapidamente atinge os nervos perifricos locais, causando sinais de prurido e s mais
tarde ataca o sistema nervoso central, depois de progredir pelos nervos, causando ento
encefalomielite. Naturalmente o vrus ataca sunos e bovinos, e raramente ovinos, ces e
gatos.

6.3. PATOGENIA

Nas formas clssicas a doena se manifesta sob trs formas clnicas;


sintomatologia nervosa, sintomatologia nervosa e respiratria, e sintomas reprodutivos.
Afeta animais de todas as idades, embora com variaes de sinais. Em leites de 1
semana os sinais so poucos ntidos, leites de mais de 1 semana ocorrem sinais
nervosos como convulses, movimentos de pedalar, andar sem rumo. A doena pode
evoluir rapidamente com morte em at dois dias aps o aparecimento dos sinais. Em
39

animais de terminao, as perdas podem ser considerveis devido anorexia, com baixo
ganho de peso e retardo no crescimento. Cachaas e fmeas em lactao ocorre mamite
e agalaxia nas porcas, constipao, febre, depresso, sonolncia sinais respiratrios ou
paralisia do trem posterior. Porcas gestantes o vrus penetra atravs da placenta e causa
infeco fetal, acarretando sinais reprodutivos que dependem do perodo da gestao.
At os 30 dias, ocorrem reabsoro fetal e retorno ao cio. Entre 60 e 80 dias, ocorre morte
de um ou mais fetos e aborto. No final da gestao, pode haver parto prematuro ou
pario de fetos macerados, mumificados, fracos (Brentano - Embrapa - CNPSA, 1992).
Na forma respiratria o vrus da DA infecta a mucosa da nasofaringe e do trato
respiratrio. Multiplica-se e, posteriormente, vai infectar o sistema nervoso, disseminando-
se pelo organismo.
Essa forma respiratria tem sido atribuda tambm a certas amostras do vrus da
doena que teriam predileo pelo trato respiratrio, causando pneumonia. Em granjas
com problemas respiratrios crnicos, pode decorrer um longo perodo de tempo at que
a DA se manifeste sob a forma reprodutiva e nervosa. Deve-se salientar, porm, que as
infeces respiratrias bacterianas so comuns em plantis sunos. Elas ocorrem
independentemente da presena de infeco pelo vrus da DA (Brentano - Embrapa -
CNPSA,1992).
A forma subclnica aquela em que ocorre infeco, mas no se manifestam os
sinais caractersticos da doena. Apesar de ser um evento pouco relatado, a infeco
subclnica pode aparecer devido ocorrncia de cepas virais de menor virulncia.
Algumas delas j foram observadas e estudadas por pesquisadores da Irlanda do Norte
(exemplo: cepas NIA-4 e NIA-6). Existem indicaes da relao entre maior virulncia e
capacidade de estabelecimento do estado de latncia (Brentano - Embrapa -
CNPSA,1992).
O estado de latncia um equilbrio entre o vrus e a clula, que pode ser
modificado atravs de influncias tanto a favor do vrus como do hospedeiro (Mayr et
a1;1988).
"O mecanismo da infeco latente, no que concerne formao, ainda no est de
todo esclarecido. Certamente as causas so mltiplas e um dos fatores mais significativos
seria a tolerncia imunolgica. adquirida em estgio embrionrio" (Mayr et al.;1988)
Uma das causas mais importantes da infeco subclnica a capacidade do virus
de Aujeszky de causar infeco latente. Aps uma infeco aguda, os animais
40

desenvolvem imunidade e excretam o vrus infeccioso por um certo perodo. Depois,


param de elimin-lo, mas permanecem infectados com o vrus em estado latente. O vrus
est presente no organismo, mas expressa apenas parte de seu genoma {DNA viral}.
Pode, ainda, permanecer na clula sem expressar o seu genoma, no mais produzindo
partculas viTais completas. Dessa forma, no excretando o vrus infeccioso (Brentano -

Embrapa - CNPSA, 1992).


Os animais com infeco latente podem, contudo, vir a excretar o vrus, caso se
estabeleam certas condies especiais de "reativao". Est comprovado. porm, que
ocorrem "reativao" e eliminao viral em certas condies de stress dos sunos, como
ps-parto ou outras condies de imunodepresso, a exemplo da induzida por
tratamentos com corticides. Os suinos com infeco latente no apresentam nenhum
sinal da doena, mas so potencial fonte de infeco e, portanto, de disseminao do
virus (Brentano - Embrapa - CNPSA, 1992).
Para o diagnstico do estado de Latncia, como no eliminado o virus inteiro, a
infeco latente no detectada por tcnicas convencionais de isolamento vira!. Podese
faz-lo atravs de tcnicas de explante celular. Tm sido desenvolvidas tcnicas de
hibridizao in situ, usando sondas de DNA do vrus e de deteco do genoma viral em
tecidos como tonsilas e nervo trigmeo de animais suspeitos. O problema das tcnicas de
hibridizao a sua aplicao prtica em nosso meio, pois exige laboratrios muito bem
equipados, tornando-se pouco vivel como diagnstico de rotina, uma vez que
desenvolve-se o estado de latncia em animais infectados, seja por amostra virulenta ou
amostra vacinal viva atenuada, outra pelos prprios sunos que respondem
soroJogicamente e que a latncia ocorre mesmo na presena de anticorpos. Considera-se
todo animal soro logicamente positivo com um potencial portador do vrus em estado
latente e, assim, potencial fonte de disseminao vira!. As estratgias de erradicao do
vrus so baseadas em testes sorolgicos dos plantis e na eliminao dos sunos
positivos (Brentano - Embrapa - CNPSA, 1992).

A vacinao dos animais no estado de latncia previne o aparecimento e


desenvolvimento de sinais clnicos, mas no elimina a persistncia do vrus no plantei,
nem o estabelecimento de latncia, tambm no previne a reinfeco. A vacinao
previne o aparecimento da doena, mas animais no imunes introduzidos na granja
podem vir a se infectar e desenvolver os sinais (Brentano - Embrapa - CNPSA, 1992).
41

6.4. EPIDEMIOLOGIA - CIRCULAO DO VRUS NOS REBANHOS SUNOS

Denomina-se circulao do vrus a sua capacidade de disseminao e de,


gradativamente, infectar ou reinfectar animais imunes ou no. O vrus se espalha
rapidamente pelo contato nasal entre animais. Portanto, as chances de disseminao so
maiores quanto maiores forem o alojamento e o nmero de animais no local. O vrus

sobrevive mais tempo em ambientes frios, midos e escuros.

6.4.1. Distino de anticorpos vacinais de anticorpos devidos infeco de campo

A cepa Bartha - que vem sendo utilizada no Brasil em uma vacina inativada uma
amostra do vrus naturalmente atenuada devido a delees no seu genoma vira!. Isso
significa que o seu DNA no apresenta determinados segmentos e, portanto, o vrus no
sintetiza determinadas protenas, como a protena gl. Em contrapartida, isso ocorre em
amostras virulentas, cujo DNA no possui essas delees. Com base nessa diferena,
foram desenvolvidos testes de diagnsticos, como ELISA por competio, usando
anticorpos monoclonais especficos para protena gl. Animais vacinados com vacinas
deletadas em 91, como a cepa Bartha, no desenvolvem anticorpos para gl. J os animais
infectados com amostras virulentas de campo tero anticorpo para gl. Os testes ELISA
convencionais detectam todo o tipo de anticorpos, no permitindo a distino de
anticorpos vacinais dos de infeco natural. O ELISA competitivo para gl detectar
anticorpos 91 especficos, indicando infeco com cepa virulenta. No existe risco de
confundir o resultado do teste com imunidade vacinal (Brentano - Embrapa -
CNPSA,1992).

O suno o nico hospedeiro conhecido do vrus e tambm o nico que sobrevive


na idade adulta. Outras espcies de mamferos, domsticos ou selvagens, morrem
quando infectadas: bovino, ovino, coelhos, ratos, ces, gatos. Eles apresentam sinais
caractersticos de intenso prurido. Por exemplo, a morte de ces e gatos na granja com
sinais nervosos e coceira pode ser indicativa de Aujeszky (Brentano - Embrapa -
CNPSA,1992).
42

6.5. PROFILAXIA E CONTROLE

A doena de Aujeszky de notificao obrigatria. Assim, em caso de diagnstico


positivo da DA, as autoridades sanitrias do Ministrio da Agricultura Pecuria e

Abastecimento (MAPA) devem ser notificadas imediatamente.

proibida a comercializao de animais oriundos de granjas infectadas, mas eles


podem ser enviados para o abate e sua carne pode ser consumida. Animais ou smen
importados e os destinados a feiras e exposies devem se originar de plantis livres da
DA, portanto certificado pelo MAPA (Brentano - Embrapa - CNPSA, 1992)
Em casos de surto em plantis de terminao, pode ser realizada a vacinao,
como forma de reduzir as perdas econmicas. Ela deve ser autorizada, pelo MAPA,
sendo permitido o uso apenas de vacina inativada no Brasil.
proibida a vacinao em plantis de reprodutores. Se forem vacinados, esses
animais no podem ser comercializados, a no ser que se tornem, novamente, livres da
doena, de maneira comprovada, com sorologia negativa, conforme protocolo do MAPA
(Brentano - Embrapa - CNPSA, 1992).
Sobre o uso de vacinas, importante saber que a vacinao controla a doena
clnica, eliminando os sinais e reduzindo perdas econmicas, ela pode prevenir a infeco
do feto e transmisso do vrus pelo smen, mas no impede a disseminao do vrus via
contato, pela excreo nasal, mesmo com a vacinao, no se desenvolve imunidade
capaz de prevenir a infeco com replicao viral no trato respiratrio e excreo do vrus,
no bem definida a correlao entre ttulos de anticorpos neutralizantes no soro e o grau
de proteo contra a DA, em alguns pases, a vacinao combinada com mtodos de
segregao de leitegadas, como estratgia de erradicao do vrus do planteI. A vacina
d imunidade s porcas, que transferida como imunidade passiva aos leites. Eles so
separados das mes e os que se tornarem negativos, aps duas sorologias, repetidas em
intervalo de 30 dias, podero ser usados para repovoamento do plantei, aps o vazio
sanitrio e desinfeco (Brentano - Embrapa - CNPSA, 1992).
Em Santa Catarina, a partir de 1984, decidiu-se erradicar a DA de plantis
reprodutores. Foram realizados testes e eliminados os sunos soro logicamente positivos.
Todos os plantis de reprodutores sunos nesse Estado tm o certificado de "livres de
DA", de acordo com as normas do MAPA (Brentano - Embrapa - CNPSA, 1992).
43

o esquema de certificao do MAPA para a DA envolve duas fases. A primeira a


certificao inicial onde so realizadas duas sorologias que devero ser negativas 100%
dos animais, com intervalo de 30 a 60 dias. A outra fase o monitoramento a cada 6
meses, testando-se 10% dos reprodutores ou aplicando-se, no mnimo, 30 soros por
rebanho (Brentano - Embrapa - CNPSA,1992).
Esse monitoramento necessrio para manter o certificado e obter a autorizao
do MAPA para a comercializao dos animais. Caso se constate sorologia positiva em
mais de 20% dos reprodutores, pode ser recomendada a total eliminao do planteI. Se
essa medida no for possvel, por condies regionais especficas ou pela qualidade do
material gentico, podem ser recomendados os testes e eliminao dos sunos positivos,
com a repopulao por mtodo de segregao de leitegadas (Brentano - Embrapa -
CNPSA,1992).
A estratgia de controle a ser adotada deve ser definida pelas autoridades
sanitrias, levando-se em conta a situao epidemiolgica do rebanho e as caractersticas
regionais da DA (Brentano - Embrapa - CNPSA, 1992).

6.6. DIAGNSTICO

Os sunos desenvolvem anticorpos, detectados no soro, a partir dos 7 a 12 dias


aps a infeco natural ou vacinao. H levantamentos sorolgicos que indicam que os
ttulos de anticorpos permanecem estveis por perodos de 12 a 18 meses. Em leites de
porcas vacinadas, os anticorpos maternos podem persistir por perodos de 8 a 12
semanas em mdia, desaparecendo a partir da dcima sexta semana. Numa populao
de animais expostos ao vrus da DA, a imunizao ter um componente de variao de
indivduo para indivduo, com ttulos neutralizantes variando de baixos (1:2 ou 1:4) a altos
(1 :256). As provas mais comumente usadas para diagnstico sorolgico de Aujeszky so
a prova de soroneutralizao e ELISA.

6.6.1. Isolamento Viral

Em caso de suspeita de surto da DA, com sinais clnicos e excreo viral na fase
aguda, possvel isolar o vrus em laboratrio. O resultado positivo confirmatrio de
44

surto. Recomenda-se o envio de leites vivos com sinais ou de animais recm mortos
para a coleta do crebro. Esse mtodo no se aplica deteco de infeco latente.
Os rgos de eleio para o isolamento viral so: crebro, bao, tonsila pala tina e
pulmo. As amostras devero ser oriundas de mais de um animal com quadro agudo e
devem ser encaminhadas ao laboratrio o mais rpido possvel, em refrigerao. As
amostras somente devem ser congeladas quando no for possvel envia-Ias em gelo. As

amostras devem ser maceradas individualmente em um 9ral, utilizando-se areia estril e


meio de cultivo de clula com antibitico e sem soro fetal. Aps, o material deve ser
clarificado atravs de centrifugao baixa (900 g) por 10 minutos. O sobrenadante obtido
deve ser utilizado para inoculao em cultivo celular. O cultivo dever ser em clulas
susceptveis ao vrus da Doena de Aujeszky (VOA), como PK-15 ou SK-6 e ter uma

confluncia de aproximadamente 85%. Utilizando-se frascos de cultivo celular de 25 cm2,

inocula-se 500 ).lL do sobrenadante, para adsoro pelo perodo de 1 hora a 37C. Na
seqncia, feita a lavagem com meio de cultivo celular (MEM), sem soro fetal e retirada
do inculo. Posteriormente, coloca-se 8 mL de meio de cultivo celular (com soro fetal) e o
frasco incubado novamente a 3?OC.

O VOA geralmente produz efeito citoptico em torno de 24 a 72 horas. A


confirmao do vrus dever ser feita por imunofluorescncia, imunoperoxidase ou
virusneutralizao, utilizando-se anticorpo especfico. No caso da amostra ser negativa

at 72 horas, devemos fazer uma nova passagem viral at aparecer efeito citoptico ou
ser negativo na 3a passagem. Para fazer as passagens virais, o frasco com o cultivo
celular deve ser congelado e descongelado 3 vezes. Aps, retira-se o contedo e
centrifuga-se em velocidade baixa por 10 minutos. O sobrenadante coletado e posto em

um frasco estril. Utilizando 500 ).lI deste material, um novo frasco com cultivo celular

inoculado como descrito na 1a passagem.


Em laboratrios sem cultivo celular, o sobrenadante obtido aps a macerao do
material remetido poder ser inoculado em coelhos, pela via intramuscular nas patas
traseiras. Em amostras positivas para o VOA, no perodo de 48 a 96 horas, um intenso
prurido ir ocorrer no ponto de inoculao, levando muitas vezes o animal
automutilao.
Para o isolamento viral de sunos em fase de crescimento, terminao ou adultos,
que foram infectados sem haver mortalidade, podero ser remetidos para o laboratrio
"swabs" nasais, coleta dos em meio refrigerado de cultivo celular com antibitico. Caso
45

no seja possvel a utilizao deste meio, poder ser usada uma soluo salina normal
estril e tambm refrigerada. A amostra dever ser inoculada em frascos de 25 cm2 de
cultivo celular, seguindo os mesmos procedimentos mencionados para o isolamento de
rgos. Para os sunos citados acima, bem como para herbvoros ou carnvoros com
quadro de encefalite, o fludo orofaringeano tambm pode ser utilizado para o isolamento
viral. Em casos de infeco latente, o rgo de eleio para o isolamento viral o gnglio
trigmeo.
O efeito citoptico (ECP) pode ser definido como a infeco de uma clula do
hospedeiro por um vrus animal geralmente mata a clula. A morte pode ser causada pelo
acmulo de grande nmero de vrus em replicao, pelos efeitos das protenas virais
sobre a permeabilidade da membrana plasmtica da clula ou por inibio do DNA, RNA
oU mitose protica do hospedeiro. Os efeitos visveis que podem levar morte ou leso
de uma clula so conhecidos como efeito citoptico (ECP). Aqueles efeitos citopticos
que resultam em morte celular so denominados efeitos citocidas (exemplo: Aujeszky), os
que resultam em leso celular mas no em morte so denominados efeitos no citocidas.
Os ECPs so usados para diagnosticar muitas infeces virais (Tortora, et a', 2000).
Os efeitos citopticos variam com o vrus. A produo de ECP aps a inoculao
do material suspeito indicativo da presena de vrus no material. Uma diferena o
ponto no ciclo de infeco viral em que os efeitos ocorrem. Algumas infeces virais
resultam em alteraes precoces na clula do hospedeiro, em outras infeces as
alteraes so observadas em estgio muito tardio, ver figura 3. Um vrus pode produzir
um ou mais tipos de efeito citoptico. Exemplo: em algum estgio da sua replicao, o
vrus citocida interrompe a sntese macromolecular dentro da clula do hospedeiro (vrus
da herpes simplex), quando um vrus citocida infecta uma clula, faz com que os
lisossomos da clula liberem suas enzimas, outros formam grnulos no citoplasma ou
ncleo das clulas infectadas chamado de corpos de incluso, estes algumas vezes so
acmulos de partculas virais. Os grnulos variam em tamanho, forma e propriedades de
colorao, de acordo com o vrus. Os corpos de incluso so caracterizados pela sua
capacidade de colorao por corantes cidos e bsicos. Os corpos de incluso so
importantes, pois sua presena pode ajudar a identificar o vrus que est causando a
infeco. Exemplo; o vrus da Raiva produz corpos de incluso (Corpsculo de Negri) no
citoplasma das clulas nervosas, e sua presena no tecido cerebral de animais com
suspeita de estarem raivosos tem sido usada como instrumento diagnstico para a Raiva
(Tortora, et ai, 2000).
46

FIGURA 3 - EFEITO CITOPTICO DO VIRUS DA DOENA DE AUJESZKY

Fonte: COME

FIGURA 4 - MONOCAMADA DE CELULA SK6 SEM EFEITO CITOPTICO

Fonte: COME

6.6.2. Testes Sorolgicos - Soroneutralizao (SN)

Para as provas sorolgicas devero ser remetidas para os laboratrios amostras

de soro limpidas, sem hemlise e refrigeradas, caso sejam enviadas at 24 horas aps a
47

colheita. Sendo este perodo seja maior, as amostras devero ser mantidas congeladas
at o momento da sua remessa.
Detecta anticorpos neutralizantes no soro. Baseia-se no fato de o vrus provocar

um efeito de lise celular caracterstico. A eventual presena de anticorpos para o vrus da


DA no soro implica na neutralizao do vrus e a inibio da lise celular. O teste de SN
um dos testes de referncia para Aujeszky. A desvantagem a toxicidade de certos soros
para as clulas, impossibilitando o diagnstico, principalmente dos soros positivos em
baixa diluio, em que a toxicidade maior. O resultado do teste demora de 4 a 5 dias.
Esta dever ser a prova sorolgica padro e serve para verificar a presena ou
ausncia de anticorpos neutralizantes frente ao VOA. Esta prova no capaz de distinguir
anticorpo vacinal ou de infeco. Para esta prova as amostras devero ser inativa das

para o complemento (56e por 30 minutos). As clulas a serem utilizadas devero ser as

susceptveis a infeco do VOA. A amostra de vrus utilizada na prova dever ser uma
amostra padro a ser determinada pelo MAPA. A titulao desta amostra deve ser feita

pelo mtodo de Reed & Muench ou pelo mtodo de Krber e expresso por 50 ~IL ou por

mL. A prova dever contar com um soro controle positivo padro com ttulo conhecido e
um controle negativo tambm padronizado. A realizao da tcnica segue os passos:

1.1 colocar 50 fll de meio de cultivo celular (sem soro fetal) por poo, em duplicata

total de dois poos por amostra ex: amostra 1 poos A 1, A2.

1.2 colocar 50 !lI da amostra de soro nos poos das linhas mpares, misturar bem

e transferir 50 !lI para as linhas pares (diluio final de 1:4), misturar bem e

desprezar 50~1.

1.3 colocar 50 !lI de suspenso da amostra de vrus padro contendo 100

TCIDsoI50 MI em todos os poos da placa.

lA . incubar por 1 hora a 3rC (no necessrio utilizar estufa de CO2).


1.5 . colocar 50 !lI da suspenso de clula, em todos os poos, contendo em torno

de 150 a 300 mil clulas por mililitro.


1.6 . para cada grupo de placas a serem testadas/dia, dever constar os seguintes
controles:

a controle de vrus ou de 100 TCOIsol50 !lI:diluir a suspenso viral utilizada na


prova em meio de cultivo celular em l/la, 1/100 e l/lODO. Colocar 50 fll de
48

meio de cultivo celular utilizado nas diluies das amostras em pelo menos
quatro poos da placa, por diluio da suspenso do vrus a ser testada e
mais a prpria suspenso de vrus utilizada na prova (total de 16 poos). Aps

colocar 50 )lI de cada diluio em um poo correspondente. Incubar por 1

hora junto com a incubao descrita na fase 1.4. Depois dever ser feito como
descrito na fase 1.5.

b - controle de clulas: reservar dois poos da placa para colocar 100 )lI de

meio de cultivo celular e na fase 1.5 adicionar 50 ).lI da suspenso de clula.

c - controle de soro positivo e negativo: seguir os mesmos procedimentos dos


SOfOS a serem testados.
1.7 - cobrir as placas e incuba-Ias a 3rC em estufa com 3 a 5% de CO2, por um
perodo de 48 horas.

A leitura e interpretao dos resultados pela observao da presena de efeito


citoptico (ECP) utilizando-se um microscpio invertido. Leitura dos controles:

a- controle de vrus: nos poos com a 100 TCIDS<J501J,1


e com as diluies desta

dever ser observada a presena de ECP at a metade da diluio 1/100,


sendo aceitvel dois poos a mais ou a menos com ECP, correspondendo a um

titulo viral entre 30 a 300 TCDlsoI50 ~I.

b- controle de clula: o tapete de clula dever estar integro nos poos


correspondentes.
c- controle de soro positivo: a amostra dever apresentar um ttulo compatvel com
o pr - determinado.
d- controle de soro negativo: ECP dever ser observado em todos os poos
correspondentes.

Leitura das amostras: amostras negativas - ECP presente nos quatro poos, ver
figura 04, amostras positivas: sem ECP nos quatro poos ou nos poos, ver figura 05, da
diluio 1:2 e as demais situaes fora destes padres e no sendo efeito txico ou
contaminao da amostra, esta dever ser considerada como suspeita e ser repetida.
49

7. TCNICAS DE DIAGNSTICO ESPECFICAS PARA RAIVA REALIZADAS NO

COME

7.1. HISTRICO

Democrrtus, no ano 500, verificou a doena em animais e Celsus, no homem. A


doena existe na Europa desde 1271, na Amrica do Norte desde 1753 e na Amrica do
Sul desde 1803. Zink, 1804, conseguiu peja primeira vez transmitir a virose de um co
doente para um so. Gartier, 1879, usou o coelho nos estudos rbicos. Os estudos de
Pasteur, 1884 - 1888, trouxeram o incio da pesquisa em base mais modernas,
penetrando no terreno da imunidade. Pasteur e seus colaboradores modificaram a
patogenicidade do vrus atravs de uma srie de inoculaes intracerebrais em coelhos,
que mais tarde foi possvel usar a vacina, e da em diante esta foi usada como rotina no
tratamento do homem aps exposio ao vrus. Em 1903, Negri descobriu caractersticos
corpsculos de incluso intracitoplasmticos em neurnios de animais e homens
infectados pelo vrus rbico, que possibilitou um imediato diagnstico da virose, por isso
que se constitui num sinal patognomnico (Mayr el ai, 1988).

7.2. ETIOLOGIA

o agente etiolgico da raiva um RNA vrus da famlia Rhabdoviridae, gnero


Lyssavrus. fcil de realizar o isolamento viral, principalmente por inoculao
intracerebral em camundongo, causando paralisia e morte, comumente entre 10 a 15
dias, havendo amostras mais rpidas e mais lentas no desenvolvimento das leses. O
vrus rbico natural, varia muito em sua virulncia e patogenicidade, se inoculado em
srie por via intracerebral, diminui seu perodo de incubao, at que passa a um perodo
constante.
50

Este virus, ver figura 05, com patogenicidade constante e mxima, quando

introduzido intracerebralmente, recebe o nome de ~vrus fixo" que j no mais


infectante por outra rea que no seja a intracerebral (Correa et ai, 1992).

FIGURA 5 - ESQUEMA ViRUS DA RAIVA

Fonte: USP.

7.3. EPIDEMIOLOGIA

A raiva uma doena que acomete mamferos, e que pode ser transmitida
aos homens, sendo portanto, urna ZQOnOS8. causada por um vrus mortal, tanto
para os homens quanto para os animais. Em alguns pases desenvolvidos, a raiva
humana est erradicada e a raiva nos animais domsticos est controlada, mas
ainda efetuada vigilncia epidemiolgica em funo dos animais silvestres.

Transmitida pelo co, gato, rato, bovinos, eqinos, sunos, macaco, morcego
e animais silvestres, atravs da mordedura ou lambedura da mucosa ou pele

lesionada por animais raivosos.

Os animais silvestres so reservatrio primrio para a raiva na maior parte do


mundo, mas os animais domsticos de estimao so as principais fontes de
transmisso da raiva para os seres humanos.
51

7.4. PATOGENIA

A raiva pode apresentar vrios sinais clnicos, tornandose difcil diferenciar de

outras sndromes nervosas aguda progressivas. Os sinais podem incluir alteraes de

comportamento, de depresso, demncia ou agresso, dilatao da pupila, fotofobia

(medo da luz), incoordenao muscular, mordidas no ar, salivao excessiva, dificuldade

para engolir devido a paralisia da mandbula, dficit mltiplos de nervos cranianos, ataxia

e paresia dos membros posteriores progredindo para paralisia.

Neste estgio o animal pra de comer e beber. O estgio paraltico pode durar de

um a dois dias, seguido de morte por parada respiratria. O perodo de incubao, partir
da mordida at o incio dos sinais clnicos, varivel podendo ser de duas semanas a

seis meses. Mas a partir do momento que sejam vistos os sinais neurolgicos, a doena
rapidamente progressiva, com a morte acorrendo dentro de sete dias, na maioria dos

animais. Mordidas na face, cabea e pescoo resultam em perodos de incubao mais

curtos

7.5. DIAGNSTICO, CONTROLE E PROFILAXIA

o diagnstico da raiva deve ser rpido e preciso j que os resultados laboratoriais

influenciam no s a deciso mdica de se instituir o tratamento em humanos, como

tambm na elaborao de medidas de controle de uma possvel epizootia. Na maioria dos

laboratrios do mundo todo, o diagnstico em amostras animais e humanas realizado

pela tcnica de imunofluorescncia direta (IFD). Um resultado positivo neste teste, desde

que seja efetuado em laboratrios de referncia, considerado prova conclusiva da

existncia de infeco. Nem sempre, no entanto, corpsculos de Negri, patognomnicos

para a doena, podem ser evidenciados em amostras de sistema nervoso de animais

infectados, tornando-se necessrio que amostras negativas sejam testadas em provas

confirmatrias.
52

No Brasil, a inoculao intracerebral em camundongos (1Ie) a tcnica mais

realizada. Aps inoculados com material suspeito, os camundongos devem ser

observados por perodos muito longos e desta forma, esta prova geralmente no auxilia

as decises mdicas. Desde o desenvolvimento de linhagens celulares susceptveis


infeco pelo vrus rbico, novas tcnicas foram propostas, no somente para o

isolamento do virus mas tambm para estudos de diferentes aspectos da infeco e para

produo de vacinas.

O controle e profilaxia visa vacinar os animais de estimao a partir de 3 meses de

idade e depois anualmente; capturar ces de rua; controlar os transmissores (morcegos),

evitando, porm, contato direto com o mesmo. Caso seja detectada a presena de

morcegos em alguma regio deve-se: procurar iluminar reas externas nas residncias;

colocar telas nos vos, janelas e buracos e fechar ou vedar pores, pisos falsos e

cmodos pouco utilizados que permitam o alojamento de colnias.

O animal com suspeita de raiva deve ser isolado e ficar em observao ou sofrer

eutansia (no recomendavl) para ser realizado um exame do crebro e tronco cerebral

em busca do vrus. Se houve exposio humana ou animal, a um outro animal com sinais

cllnicos sugestivos de raiva e que venha a bito, dever ocorrer inoculao em

camundongos para verificar a presena do vrus.

Algumas viroses so caracterizadas pelo aparecimento de corpsculos de incluso

(CI) nas clulas dos rgos doentes. Os CI so bem maiores que as partculas virais e

podem ser facilmente observados com auxilio de microscpio comum.

Sob corpsculo de incluso compreendem-se modificaes tpicas, reproduzveis

no citoplasma e ncleo de determinadas clulas, ver figura 06. Formam-se atravs da

replicao ou ao de um vrus ou componentes do mesmo por influncias ffsico-

qumicas ou atravs de processos at agora desconhecidos (Mayr et a/;1988).

CI citoplasmticos Feulgen-positivos aparecem nas seguintes viroses; Raiva,

Varola, EctromeJia, Psitacose e Mixornatose.

Quase todos os corpsculos de incluso citoplasmticos mostram acidofiJia, razo

pela qual podem aparecer estruturas internas basfilas (corpsculo de Negri na Raiva)

(Mayr et ai; 1988).


53

FIGURA 6 - REPRESENTAO DO CORPSCULO DE NEGRI INTRACITOPLASMTICOS EM

CELULAS NERVOSA E AUSNCIA DO MESMO NA OUTRA FIGURA

Fonte :Unicamp.

7.5.1. Imunofluorescncia Direta (IFD)

Uma reao imunolgica do tipo de unio antgeno-anticorpo pode ser

colocada em evidncia pela emisso da fluorescncia se utilizar nela anticorpos

unidos a radicais orgnicos com propriedades fluorescentes e com uso e

microscpio de fluorescncia para vizualiz-Ia.


Consiste, principalmente, em usar um soro ao qual se conjuga uma

substncia fluorescente, como a fluorescena. Esse anticorpo conjugado no perde a


sua capacidade imunolgica e quando em contato com o vrus homlogo, se une

especificamente.
54

Essa fluorescncia consiste em uma propriedade de certas substncias,

denominadas fluorocromos, que emitem luz de maior comprimento de onda durante a

exposio da luz que incide (FAO/RLAC, 1992).

O corante mais utilizado na Virologia o Isotiocianato de Fluorescena por ser mais

estvel, se combina com 05 grupos aminas das protenas por unies carbamidas.
excitado por luz azul de 490 nm de comprimento de onda e emite fluorescncia de

colorao verde maa de 520 nm de comprimento de onda (FAO/RLAC,1992).

As vantagens que a tcnica possui so de extraordinria sensibilidade, fcil e

rpida realizao. Pode ser utilizada para localizar antgeno em rgo que possui muita

contaminao, o qual no serve para outras determinaes porque o antgeno no

vivel e no se pode cultivar.

As desvantagens so de requer um equipamento de alto custo e existem autores

que tem comparado a sua sensibilidade com a fixao do complemento, dizendo que a

sua por vez menor que a da aglutinao e maior que a da precipitao, existindo

excees. Permite localizar com preciso antgeno em concentraes de 1O ~lg/mL (FAO,

1992).

Existe o mtodo direto - procedimento original de Coons e Col, se aplica uma

soluo de anticorpos especficos com fluorocromo sobre o preparado que possui o

antgeno. Assim se forma um complexo antgeno~anticorpo marcado, que observado no

microscpio de fluorescncia se v fluorescente. Essa tcnica usada para diagnosticar a

raiva atravs da observao dos Corpsculos de Negri que se apresentam esverdeados.

E o mtodo indireto - se trata do preparado que contm o antgeno com o

anticorpo no marcado e este complexo visualizado aplicando antigamaglobulina

marcada com o fluorocromo. Esta tcnica utilizada para identificar e localizar antgeno e

para detectar e titular anticorpo de uma mesma espcie animal. a mais sensvel, mas

aumenta a possibilidade de reaes inespecficas. Dentro desse mtodo pOderamos

incluir a colorao do complemento, idealizada por Goldwasser e Shepard - se tem

participao do complemento na reao antgeno~anticorpo inicial e logo se visualiza com

um soro anticomplemento de cobaia marcado, os autores indicam que mais sensvel

que pelo mtodo sem o complemento.


55

A realizao da Tcnica (IFD) segue os procedimentos:


1. Efetuar a impresso de partes do encfalo, amostrando preferencialmente cornos de

Ammon, crtex e cerebelo, em lmina, em dois campos isolados; pressiona-Ia em


papel pouco absorvente; secar ao ambiente; preparar no mnimo 4 repeties por
material suspeito; caso o material estiver conservado em lquido de Vall, aplicar calor
fraco (secador de cabelos) sobre a lmina;
2. Em outra lmina, efetuar a impresso do encfalo controle positivo para raiva, em dois
campos isolados; pressiona-la em papel pouco absorvente; caso o material estiver
conservado em liquido de Vall, aplicar calor fraco (secador de cabelos) sobre a

lmina;

3. Fixar as lminas em acetona por dez minutos a -20C;


4. Secar as lminas em temperatura ambiente;
5. Delimitar os dois campos na lmina, utilizando caneta marcadora ou esmalte de

unhas;
6. Dispor duas gotas de CCN (suspenso de encfalo de camundongo normal) no campo
junto marcao da lmina e duas gotas de CVS (suspenso de encfalo de
camundongo infectado por vrus padro de desafio) no campo distai; com movimentos
suaves, espalhar as suspenses nos respectivos campos;

7. Incubar as lminas a 37C por 30 minutos, em cmara mida;


8. Lavar as lminas com PBS - pH 8,5;
9. Coloca-Ias em um recipiente contendo PBS - pH 8,5, durante 10 minutos;
9. Lavar as lminas em gua destilada, afim de retirar o excesso de cristais;
10. Deixar escorrer e secar as lminas, em posio vertical;
11. Dispor uma gota de glicerina tamponada sobre cada campo e cobri-Ias com lamnulas
(espessura menor que 0,2 mm);
12. Ler as lminas em microscpio para imunofluorescncia.

A interpretao da prova utiliza microscpio com lmpada ultravioleta e filtro que


evite o excesso de luz do mesmo comprimento de onda no olho do observador. Primeiro
examinar a lmina com a impresso do encfalo positivo no campo incubado com CCN.
Como a suspenso usada apresenta apenas encfalo normal, o conjugado estar livre
para fixar-se ao antgeno rbico presente na amostra evidenciando incluses de
colorao fluorescente esverdeada (controle positivo), ver figura 07. Examinar ento, na
56

mesma lmina, o campo incubado com CVS. Como o antgeno rbico encontra-se na
suspenso celular, o conjugado anti-rbico ir ligar-se ao mesmo e no ao antgeno
presente na impresso. Conseqentemente, no ser observada a fluorescncia
esverdeada (controle negativo). Caso os controles positivos e negativos estejam bem
definidos, examinar as lminas para diagnstico. A positividade s deve ser aceita quando
a colorao verde caracterstica for visuaJizada na impresso incubada com CCN e no

for vista naquela incubada com CVS.


O CVS um vrus padro de laboratrio ("Challenge Vrus Standart"). uma
suspenso com conjugado diludo em liquido de inculos para Raiva preparado com
crebro de camundongos que possuem partculas vricas do Lyssavirus. O preparo do
CVS conforme o protocolo a seguir:
1. Preparar uma diluio 10.3 da amostra padro de CVS;

2. Inocular via intracerebral um nmero apropriado de camundongos de 3 a 4 semanas;


3. Quando os camundongos estiverem prostrados, pouco antes da morte, em torno de 6
a 7 dias aps a inoculao, coletar assepticamente os encfalos e disp-los em placa
de Petri;
4. Pesar os encfalos;
5. Adicionar 4 volumes de soro eqino a 2% em gua destilada (o diluente deve conter
1000 UI de penicilina e 2 mg de estreptomicina por mililitro);
6. Triturar em liquidificador, mantendo a suspenso resfriada;
7. Centrifugar (1.000 r.p.m. / 10 minutos), preferencialmente em centrfuga resfriada;
8. Decantar o sobrenadante e fracion-lo em alquotas;
9. Manter a suspenso congelada ou liofilizada.

A preparao do CCN: crebro de camundongo normal, idntica ao CVS,


inclusive com a diluio do conjugado na mesma proporo determinada no CVS, porm
feita a partir de crebro de camundongos que no inoculados com o Lyssavirus. Seguir os
passos 5 a 9 do protocolo acima.
08S: para a utilizao do CCN e do CVS dever ser adicionado aos mesmos o conjugado

marcado com isotiocianato de fluorescena, na proporo de 1:4, incubando-os a 3rC por


30 minutos.
57

o preparo do VR: vrus referncia. uma lmina que possui impresso de um


crebro de animal sabidamente positivo, que serve como controle positivo para cada
prova realizada.
O vrus referncia um crebro controle positivo. A partir deste crebro,
realizam-se vrias impresses em lminas, que so armazenadas em acetona

absoluta temperatura de _200 C. Estas lminas sempre sero analisadas


juntamente com as amostras.
Preparar a impresso do crebro sabidamente positivo em vrias lminas,
secar ao ar, colocar em acetona absoluta a _200 C por 20 minutos, secar ao ar e
armazenar por at uma semana em acetona absoluta at o uso do prximo

diagnstico.

FIGURA 7 - REPRESENTAO DO RESULTADO POSITIVO EM CREBRO DE CAMUNDONGO

DA TCNICA IFD - INSTITUTO PASTEUR, SP.

Fonte: Instituto Pasteur, SP.

7.5.2. Imunofluorescncia Indireta

Neste lipo de colorao, prepara-se uma antigamaglobulina de uma espcie


animal (exemplo, coelho) e faz-se um conjugado desta (antigamaglobulina +
fluorescena). Assim, com esse elemento sorolgico, podem-se fazer testes com
diversos lipos de vrus que tiverem seus soros preparados em coelhos (pode-se
preparar tambm com soros de outras espcies animais). Realizao da Tcnica:
1- Prepara nos tubos de Leighton as monocamadas de clulas susceptveis para
enfermidade desejada, atravs de passagem celular.
58

2- Inocula no cultivo o vrus para o diagnstico e observa.


3- Aps 72 a 96 horas no ocorreu EPC retira as lamnulas, despreza o meio e as lava
com PBS colocando-as num suporte.
4- Fixa-Ias em acetona a-20 C por 10 minutos e depois deixar secar ao ar.
5- Coloca uma diluio do soro sobre cada preparado. Incuba por 37 C, 45 minutos ou
por uma noite a 4 C em cmara mida.
6- Lava com PBS trs vezes por 10 minutos.
7- Coloca uma gota de antigamaglobulina marcada nas lamnulas. Incubar a 37 C, 45
minutos em cmara mida.
8- Lava-as novamente por trs vezes com P8S e por ltimo com gua destilada por 5
minutos.
9- Coloca a glicerina e observa no microscpio de fluorescncia.

Para a interpretao do resultado considera-se positivo todo o material em que se


visualiza clulas ou grupos de clulas fluorescentes.

7.5.3. Prova Biolgica (PB)

Apesar da confiabilidade da IFO para o diagnstico de Raiva, recomendvel


efetuarse a inoculao das amostras suspeitas, especialmente aquelas negativas na IFO,
em camundongos lactentes com 3 dias de vida.
Para a PB, preparase o inculo a partir da amostra recebida macerandose o
encfalo em gral e dissolvendoo em soro eqino a 5% em gua destilada. Esta
suspenso centrifugada em baixa velocidade por 10 minutos, coletando-se o
sobrenadante, que por sua vez diludo, na razo de 1:4, no mesmo diluente.
Posteriormente, efetuase a inoculao intracerebral dos camundongos, atravs de

seringa de insulina, aplicandose 100).11 por lactente.

A mortalidade diria dos animais inoculados dever ser observada por um perodo
de 21 dias. At o terceiro dia ps-inoculao, as mortes podem ser consideradas como
devidas a infeces outras ou traumatismo; aps este perodo, realiza-se a IFO dos
crebros dos animais mortos, para confirmar a infeco por raiva.
59

A prova Biolgica tem como finalidade isolar e identificar o vrus rbico, pelo
mlodo de Inoculao Inlracerebral, ver figura 8, de inculos preparados com os
crebros, em camundongos recm nascidos ou com 21 dias de idade. A morte do
animal antes do 5 dia se considera inespecifica devido ao traumatismo ocasionado
duranle a inoculao ou al por uma infeco bacleriana (Calva e Arroyo, 2000). Por
isso se considera positivo os animais que apresentam sinais aps 10 dias de
inoculao, ver figura 9.

FIGURA 8 REPRESENTAO DO MTODO DE INOCULAO INTRACEREBRAL EM

CAMUNDONGOS

Fonte: Instituto Pasteur. SP

FIGURA 9 REPRESENTAO DOS SINAIS DA RAIVA EM CAMUNDONGOS

Fonte:lnstiluto Pasteur. SP.


60

8. CONCLUSO

Durante o perodo que estive estagiando no Centro de Diagnstico "Marcos


Enrietti" tive alguns objetivos para atingir, dentre eles: aprendizagem de tcnicas e
diagnstico virolgicos das principais doenas que afetam o rebanho do Estado,
realizao das mesmas e a importncia deste diagnstico para a auxlio na clnica

mdica. Foi excelente o conhecimento obtido atravs da realizao deste estgio, em


alguns momentos superando minhas expectativas. A possibilidade de aplicar na prtica
conceitos adquiridos no curso me fez ver a importncia da obteno destes diagnsticos.
Pude constatar que para o sucesso dos diagnsticos necessrio trabalharmos em
equipe, pois diversas reas possuem o mesmo objetivo e com isto precisam trabalhar
juntas, como a esterilizao do material a ser utilizado, a coleta das amostras e a
colaborao das reas que utilizam da mesma amostra para realizar outros exames
seguindo uma ordem de importncia (exemplo; o diagnstico para DA o primeiro a ser
realizado para evitar contaminao ou toxidada da amostra). Esse estgio me fez concluir
que o diagnstico virolgico a principal arma que o mdico veterinrio tem para
solucionar casos de doenas epizoticas, principalmente para o controle sanitrio do
rebanho do Paran. Para a minha formao profissional asse estgio contribuiu muito,
pois no dava muita importncia para este tipo de diagnstico.
61

GLOSSRIO

ABCS - Associao Brasileira de Criadores de Suno


BHK - Clula de ramster
BVD - Diarria Bovina Viral
BVDV - Vrus da Diarria Bovina Viral
CCN - Crebro de camundongo normal
CDME - Centro de Diagnstico "Marcas Enrieltj"
CI - Corpsculo de Incluso
CRFK - Clula de gato
CSFV - Classical Swine Fevar ou Peste Suna Clssica
CVS - Challeng9 Vrus Standart - vrus padro de laboratrio
DA - Doena de Aujeszky
DMSO - Dimetil Sulfoxido
DT - Diluio de trabalho
ECP - Efeito Citoptico
ELISA - Enzime Linked lmmuno Sorbent Assay
EPC - Clula de Peixe
HIA - Inibio da Hemoaglutinao
IIC - Inoculao Intra-cerebral
IF - lmunofluorescncia
IFD - Imunofluorescncia direta
IFI - Imunofluorescncia indireta
IP - Imunoperoxidase
MA - Clula de Macaco Africano
MAPA - Ministrio da Agricultura e Abastecimento
MDBK - Madin Darby Bovine Kidney - clula de bovino
MDCK - Clula de co
MEM - Minimum Essential Media - meio essencial bsico
OIE - Oflice International des Epizooties
PB - Prova Biolgica
PBS - Soluo tampo de fosfato
62

PCR - Polimerase em Cadeia


PK15 - Porcine Kidney
PSC - Peste Suna Clssica
PVS - Parvovirus Suno

SEAB - Secretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento


SFB - Soro fetal bovino

SK6 - Clula Suna


SN - Soro neutralizao
TCIOso - Dose capaz de infectar 50% dos cultivos celulares
TMB - Tetrametil benzidina
TPB - Caldo triptose fosfato
UHA - Unidade Hemaglutinante
VOA - Vrus da Doena de Aujeszky
VERO - Clula de Macaco
VPSC - Vrus da Peste Suna Clssica
VR - Vrus Referncia
63

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66

ANEXO 01
RELATRIO MENSAL DE DIAGNSTICO DE DOENAS

2003
OIAGNSTICOS JANEIRO FEVEREIRO MARO ABRIL TOTAL

1.AIE 240 88 87 101 516

2. F. AFTOSA

3. E.VESICULAR

4. D.AUJESZKY 685 481 689 397 2252

5. PSC/RGOS

6. PSC/SORO/ELlSA 461 707 388 511 2067

7. PSC!SORO!NPLA

8. RAIVA 31 40 38 70 179

9. LEUCOSE 12 1 22 35

10. PARVOVIAOSE 2 10 12

11. BVD/RGO/SuiNO

12. BVD/SORO/SuiNO

13. ENCEFALOMIELlTE.E. 15 15

14. LlNGUA AZUL 10 14 11 35

15.1 B R 69 154 175 48 446

16. BVO BOVINO 74 54 87 242 457

17. RINOPNEUMONITE E.

18. DOENA DE N.CASTLE

19. VIROLG1CO(PRRS)

20. VIAOLGICO 9 9

TOTAL 1572 1543 1481 1427 6023

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