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IBLIOTECA DE ADNC EN EL BACTERIOFAGO LAMBDA 267
BIBLIOTECA DE ADN C
EN EL BACTERIOFAGO LAMBDA
CLAUDIA SANTINI , ALESSANDRA LUZZAGO1
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Dipartimento di Biotecnologia, Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P. Angeletti
(IRBM), Pomezia, Roma, Italia.
INTRODUCCIN
En los ltimos aos, la tecnologa de presentacin de pptidos o protenas sobre
la superficie de bacterifagos ha mostrado ser muy til en el descubrimiento de
ligandos de un receptor especfico.
Una aplicacin muy interesante de esta tecnologa es la construccin de bi-
bliotecas de ADN complementario (ADNc). Las bibliotecas que expresan
ADNc se utilizan desde hace algunos aos para identificar antgenos o mol-
culas que interaccionan con una segunda molcula, la cual, a su vez, se utiliza
como sonda. Incluso en la actualidad, la utilizacin de las bibliotecas tradicio-
nales, construidas generalmente con vectores derivados del fago lambda, es
extremadamente trabajosa desde el momento en que la entera complejidad de
una biblioteca determinada, debe ser plaqueada e hbridarse con el ligando de
inters (por ejemplo, un anticuerpo), el cual, por ende, debe ser utilizado en
grandes cantidades.
La presentacin del producto de expresin del ADNc sobre la superficie del
fago, en vez de intracelularmente como en el caso de las bibliotecas tradiciona-
les, da la posibilidad de seleccionar la protena a partir de una mezcla de fagos
extremadamente compleja y con el empleo de cantidades mnimas del anticuer-
po o ligando de inters. Mltiples ciclos sucesivos de seleccin permitiran la
identificacin del dominio proteico de inters en poco tiempo y sin un gran gasto
de materiales.
Los vectores de presentacin ms comnmente utilizados se derivan de fagos
filamentosos (f1, M13), en los cuales los pptidos o protenas pueden ser fusio-
nados al extremo amino de la protena pIII o pVIII de la cpsida del fago [1].
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Aunque las protenas pIII y pVIII de los fagos filamentosos se han utilizado con
xito en numerosas aplicaciones, su uso para la construccin de repertorios
complejos de origen natural como las bibliotecas de ADNc ha sido muy limitado
hasta nuestros das. Esto se debe, probablemente, a limitaciones que presentan
ambas protenas de la cpsida para estas aplicaciones. El producto del gen III
tolera inserciones de dominios proteicos de un tamao considerable, pero est
presente en la cpsida del fago en un nmero reducido de copias, lo que no
permite una presentacin multivalente de tales dominios. Esta ltima caracte-
rstica hace que la presentacin mediante la protena III no sea adecuada para
la seleccin con ligandos cuya concentracin o afinidad no se conoce, como es
el caso de los anticuerpos presentes en el suero de pacientes. Por el contrario,
pVIII puede generar una exposicin multivalente, pero no se logra presentar los
dominios proteicos grandes de manera eficiente.
Otra limitacin comn a los dos sistemas surge del hecho de que las protenas
de fusin deben atravesar necesariamente la membrana plasmtica de la bac-
teria husped para poder ser presentada en la superficie del fago filamentoso.
Esto hace muy poco probable que las protenas sean presentadas con eficiencia
puesto que su plegamiento correcto ocurre normalmente en el citoplasma de la
bacteria. Para resolver esta limitacin, recientemente se desarrollaron varios
vectores de presentacin basados en diferentes sistemas de fagos filamentosos
[2-6]. El bacteriofago lambda es uno de los vectores de particular inters por su
utilizacin para la presentacin de protenas codificadas por ADNc.
En el caso del fago lambda, no es necesaria que la protena a presentar atravie-
se la membrana porque el virus se ensambla dentro de la bacteria. Este fago
est compuesto por una cabeza icosadrica que contiene dos protenas, gpE y
gpD, y una cola compuesta principalmente por otra protena denominada gpV.
La protena D, que forma parte de la cpsida, tiene un peso molecular de alre-
dedor de 12 kD y es esencial para la estabilidad de la partcula viral. Estudios de
microscopia electrnica han demostrado que la protena D, presente en alrede-
dor de 405 copias por fago, se ensambla en forma de trmeros que se muestran
como protuberancias en la superficie de la cpsida [7].
Se ha visto recientemente que la protena D tolera fusiones con protenas de
tamao considerable. Esta fusin se puede llevar a cabo tanto en el extremo
amino como en el extremo carboxilo de la protena [4, 5] y el producto de fusin
obtenido se ensambla en la cpsida del fago y es accesible a ligandos como los
anticuerpos.
En este captulo se expone la construccin y seleccin de bibliotecas de ADNc
mediante el uso de un sistema basado en la protena D del fago lambda.
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PROCEDIMIENTO 6. I NMUNOSELECCIN
1. Infectar 600 L de clulas BB4 con una dilucin adecuada de fagos, de
manera que se viertan alrededor de 103 UFP sobre un csped de clulas
BB4 en placas Petri de 150 mm. Incubar a 37 C durante toda la noche.
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PROCEDIMIENTO 7. ELISA
Este protocolo permite realizar el ensayo a partir de lisados fgicos no purifica-
dos y con el empleo de anticuerpos especficos contra el fago . Otra alterna-
tiva sera purificar las partculas virales mediante un gradiente de CsCl y unirlas
directamente a la placa de ELISA.
1. Adicionar a cada pocillo de la placa de ELISA (Nunc) 100 L de una solu-
cin de IgG especficas contra las protenas del fago obtenidas de
suero de un conejo inmunizado con el virus y purificadas mediante afinidad
por protena G a una concentracin de 1 g/mL en tampn NaHCO3
50 mM pH 9,6. Incubar a 4 C por 16 h.
2. Lavar varias veces con PBS 1X que contenga Tween 20 0,05 % (PBS/Tween).
3. Adicionar a cada pocillo 300 L de solucin de bloqueo (leche descremada
5 %, Tween 20 0,15 %, BSA 0,25 %, NaN3 0,1 % en PBS 1X). Incubar a
37 C por 1 h.
4. Eliminar la solucin de bloqueo y aadir a cada pocillo 100 L del lisado de
fagos con 109 UFP. Incubar a 37 C por 2 h.
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*El lisado de clulas BB4 se prepara a partir de un cultivo de clulas incubadas toda la noche en
medio LB con D-maltosa 0,2 %. Centrifugar las clulas y resuspenderlas en un volumen de PBS
correspondiente a 1/100 del volumen inicial. Lisar las clulas en una prensa francesa o por
sonicacin.
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Figura 15.1. Representacin esquemtica del vector pRH825. Genoma de un fago lambda que
presenta un codn de terminacin mbar en el gen de la protena D.
El plsmido pRH825 esta flanqueado por el sitio Lox P que permite la escisin del
genoma del fago en las bacterias que produzcan la recombinasa Cre. En el plsmido
hay una copia adicional del gen que codifica la protena D bajo el control del
promotor ptrc. El gen est modificado en el extremo 3 para permitir la clonacin de
los insertos (los sitios de restriccin SpeI y NotI se encuentran subrayados).
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