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ISSN: 1989-3620
Resumen: En la prctica que se plantea, el alumno realiza dos tipos de calibracin, una
absoluta y otra relativa que permiten cuantificar un analito cuya concentracin en la
muestra problema se desconoce. En la calibracin absoluta se emplean
concentraciones crecientes de cido p-hidroxibenzoico analizando la respuesta del
detector. En el caso de la calibracin relativa se emplean concentraciones crecientes
de cido glico en presencia de una concentracin fija de cido p-hidroxibenzoico que
acta como patrn interno.
INTRODUCCIN
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Reduca (Biologa). Serie Tcnicas y Mtodos. 4 (3): 33-47, 2011.
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Ecuacin de la recta
Ap Ap =K mp
Pendiente
K
mp
mp = Ap/K
Normalizacin de rea
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Ecuacin de la recta
Ax/Api
Ax/Api = K mx Pendiente
K
mx
rea de pico
Concentracin
original
mpe
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OBJETIVO DE LA PRCTICA
MATERIAL Y MTODOS
Fase estacionaria.
Columna: Mediterranea sea C18 (Teknokroma, S.C.L. Spain).
Tipo: Fase Reversa.
Longitud (L): 120 mm.
Dimetro de partcula (dp): 5m.
Dimetro interno (di): 4,6 mm.
Temperatura. 25oc.
Fase mvil.
Reservorio A: Acetonitrilo (ACN).
Reservorio B: 4% de cido actico en agua Milli-Q.
Fase mvil: 30% de A y 70% de B, en condiciones isocrticas.
Flujo de fase mvil: 1,0 mLmin 1.
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COOH COOH
HO OH
OH OH
RESULTADOS Y DISCUSIN
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-1
Figura 5. Espectro de absorbancia del cido p-hidroxibenzoico a una concentracin de 5 gmL
disuelto en 4% cido actico en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, el nmero 1 representa
el mximo principal de absorcin a 256 nm.
-1
Figura 6. Espectro de absorbancia del cido glico a una concentracin de 5 gmL disuelto en 4%
cido actico en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, el nmero 1 representa el mximo
principal de absorcin a 270 nm.
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glico disuelto en fase mvil (4% cido actico en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v) y de
sta se van haciendo tantas diluciones como puntos se quieran realizar en la recta de
calibracin. En este caso concreto, se preparar una disolucin madre de cido glico a
una concentracin 0,05 mgmL-1 y, diferentes diluciones, para conseguir
concentraciones de 0,005; 0,01; 0,02; 0,03; 0,04 y 0,05 mgmL-1. Cada una de estas
disoluciones se inyecta en el cromatgrafo en las condiciones descritas y se obtiene el
resultado de la respuesta del detector, expresada en cuentas de rea.
Tiempo (minutos)
-1 -1
Figura 7. Cromatograma de cido glico 0,005 mgmL y cido p-hidroxibenzoico 0,05 mgmL a un
-1
flujo de fase mvil de 1 mLmin .
Tabla 1. Resultados de la cuantificacin del cromatograma de cido glico 0,005 mgmL-1 y cido p-
-1 -1
hidroxibenzoico 0,05 mgmL a un flujo de fase mvil de 1 mLmin .
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El cido glico eluye con un tR de 3,22 0,2 min y el cido p-hidroxibenzoico con
un tR de 4,31 0,5 min. El pico (rea) del cido glico aumenta a medida que aumenta
la concentracin (masa inyectada en el loop de 20 L), mientras que el pico de cido
p-hidroxibenzoico se mantiene constante ya que su concentracin no vara en cada
una de las inyecciones. A continuacin se muestran estos resultados en las Figs. 7 a 12
y en las tablas 1 a 6. En este caso, todas las condiciones de anlisis se mantienen y lo
nico que vara es la concentracin inyectada del analito problema.
Unidades de Absorbancia
Tiempo (minutos)
-1 -1
Figura 8. Cromatograma de cido glico 0,01 mgmL y cido p-hidroxibenzoico 0,05 mgmL a un
-1
flujo de fase mvil de 1 mLmin .
-1
Tabla 2. Resultados de la cuantificacin del cromatograma de cido glico 0,01 mgmL y cido p-
-1 -1
hidroxibenzoico 0,05 mgmL a un flujo de fase mvil de 1 mLmin .
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Unidades de Absorbancia
Tiempo (minutos)
-1 -1
Figura 9. Cromatograma de cido glico 0,02 mgmL y cido p-hidroxibenzoico 0,05 mgmL a un
-1
flujo de fase mvil de 1 mLmin .
Tiempo (minutos)
-1 -1
Figura 10. Cromatograma de cido glico 0,03 mgmL y cido p-hidroxibenzoico 0,05 mgmL a un
-1
flujo de fase mvil de 1 mLmin .
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Unidades de Absorbancia
Tiempo (minutos)
-1 -1
Figura 11. Cromatograma de cido glico 0,04 mgmL y cido p-hidroxibenzoico 0,05 mgmL a un
-1
flujo de fase mvil de 1 mLmin .
Tiempo (minutos)
-1 -1
Figura 12. Cromatograma de cido glico 0,05 mgmL y cido p-hidroxibenzoico 0,05 mgmL a un
-1
flujo de fase mvil de 1 mLmin .
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Cuentas de rea (10 )
6
24
18 y = 604,97x - 0,2024
R2 = 0,9826
12
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Masa inyectada (g)
Figura 13. Variacin de las cuentas de rea en funcin de la concentracin de cido glico (en color
azul). En color rojo se muestra el ajuste, por regresin lineal, de esta curva as como la ecuacin de la
recta obtenida.
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1,2
1
Cuentas de rea relativas
0,8
0,6
y = 0,9321x + 0,0208
0,4 R2 = 0,9981
0,2
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Masa inyectada (g)
Figura 14. Variacin de las cuentas de rea relativas en funcin de la concentracin variable de cido
glico y fija de cido p-hidroxibenzoico, como patrn interno (en color azul). En color rojo se muestra
el ajuste, por regresin lineal, de esta curva as como la ecuacin de la recta obtenida.
BIBLIOGRAFA DE CONSULTA
Dong, M.W. 2006. Modern HPLC for Practicing Scientists. John Wiley and Sons, New
York.
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Lloyd, R., Snyder, L. R., Glajch, J. L. y Kirkland, J. J. 1997. Practical HPLC Method
Development, 2nd Ed. John Wiley and Sons, New York.
McMaster, M. C. 2005. LC/MS: Practical User's Guide, John Wiley and Sons, New York.
Miller, J.M. 1988. Chromatography: Concepts and Contrasts. John Wiley and Sons, New
York.
Snyder, L. R. 1997. HPLC Method Development. John Wiley and Sons, New York.
RECURSOS ELECTRNICOS
Shula Levin's WebSite of HPLC and LC-MS. Consultada: 3 septiembre 2011. Disponible
en: http://www.forumsci.co.il/HPLC/program.html
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